DE69720248T2

DE69720248T2 - Schneller mikrobieller test

Info

Publication number: DE69720248T2
Application number: DE69720248T
Authority: DE
Inventors: Eli Sahar; Amir Schorr; Roni Aharon
Original assignee: Trek Diagnostic Systems Ltd Israel; Trek Diagnostic Systems LLC
Current assignee: Trek Diagnostic Systems Ltd Israel; Trek Diagnostic Systems LLC
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2017-11-19
Also published as: JP3398960B2; EP0944733A1; AU4963797A; IL119644A0; JP2001509008A; WO1998022618A1; DE69720248D1; IL119644A; EP0944733B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet mikrobiologischer Assays und betrifft ein Verfahren und ein System zur raschen Bestimmung der Anwesenheit und des Gehalts an Mikroorganismen in einer flüssigen Probe. Darüber hinaus betriff die Erfindung auch ein Verfahren und ein System zur raschen Bestimmung der Identität der Mikroorganismen sowie der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen antimikrobielle Arzneimittel. Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Bestimmung einer Mikroorganismen-Infektion in einer Körperflüssigkeit.
Stand der Technik
Die folgende Liste des Stands der Technik wird als relevanter Hintergrund der Erfindung angesehen. Auf die Veröffentlichungen wird durch die Nummern in der Liste hingewiesen.

1 . Isenberg et al., 1985. In: Manual of Clinical Microbiology, Edwin N. Lennette, Albert Balows, William J. Hausler, J.R., M. Jean Shadomy, (eds.) 4th Ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. pp. 73–98.
2. Washington, et al., Ibid, pp. 967–987.
3. Pezzlo et al., 1982, J. Clin, Microbiol, 15: 468–474.
4. Bates, 1982. Lab. Manag., 20: 7–13.
5. Donta et al., 1981 , N. England J. Med., 304: 939–943.
6. Kass, 1978, J. Infect. Dis., 138: 546–557.
7. D'Amato et al., 1985, In: Manual of Clinical Microbiology, Leunette C.H., Balows, A., Hauslower, W.J., Jr., Shadomy, H.J. (eds.) American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp. 52–65.
8. Thornsberg et al., 1985, Ibid., pp, 1015–1018.
9. Baird-Parker, 1 989. In: Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, Brixia Academic Press, Brescia, Italy, 276–281 , Balows, A., Tilton, R.C., Turano, A. (eds.).
10. Isenberg, 1989, Ibid., 320–326.
11. Vincent et al., 1989, Ibid., 326–333.
12. Sanbolle et al., 1989, Ibid., 333–341.
13. Thabaut, 1989, Ibid., 342–352.
14. Johnston, 1989, Ibid., 353–359.
15. Kelly et al., 1981 , J. Clin. Microbiol., 13: 677–680.
16. Hale et al., 1981 , J. Clin. Microbiol., 13: 147–150.
17. Aldrige et al., 1977, J. Clin. Microbiol., 6: 406–413.
18. Pfaller, 1985, J. Clin. Microbiol., 21: 783–787.
19. Bixler-Forell et al., 1985, J. Clin. Microbiol., 22: 62–67.
20. Cady et al., 1978, J. Clin. Microbiol., 7: 273–278.
21. Morgan et al., 1983, J. Clin. Microbiol., 18: 384–388.
22. Wu et al., 1981 , J. Clin. Microbiol., 21: 796–799.
23. Wallis et al., 1981 , J. Clin. Microbiol., 14: 342–346.
24. Perry et al., 1982, J. Clin. Microbiol., 15: 852–854.
25. Marr et al., 1975, Am. J. Dis. Child., 129: 940–943.
26. Atkinson, et al., 1984. In: Anti-microbial Therapy, A.M. Ristuccia und B.A. Cunha (eds.) Rowen Press, New York, pp. 23–36.
27. Greenwood, 1985. In: Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, K.O. Habermehe (cds.), Springer Verlag, Berlin, pp, 479–509.
28. PCT-Anmeldung WO 93/21511.

Hintergrund der Erfindung
Mikrobiologische Tests haben ein breites Anwendungsgebiet, wie in der Medizin, bei der Überwachung der Qualität von Wasser, der Sicherstellung der Sicherheit von Nahrungsmitteln usw. In der klinischen Praxis sind mikrobiologische Assays von besonderer Wichtigkeit und spielen eine Hauptrolle bei der Diagnose von Infektionen und/oder der Bestimmung einer geeigneten Arzneimittelbehandlung im Falle einer Infektion. Bei derartigen Assays werden die Anwesenheit von pathologischen Mikroorganismen in klinischen Proben, ihre Anzahl, ihre Identität sowie ihre Empfindlichkeit gegen antibiotische Arzneimittel bestimmt.
Die am weitesten verbreiteten mikrobiologischen Assays umfassen das Inkubieren einer biologischen Probe auf verschiedenen Wachstumsmedien und die Bestimmung des Wachstums der Mikroorganismen darauf (1). Um die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen ein Arzneimittel zu bestimmen wird das Wachstum der Mikroorganismen (oder dessen Mangel) in Anwesenheit des zu untersuchenden Mittels bestimmt (2). Der Hauptnachteil derartiger Assays liegt darin, dass sie eine beträchtliche Zeit zur Durchführung benötigen, gewöhnlich 24 bis 48 Stunden und daher keine rasche Diagnose ermöglichen, die in Fällen, bei denen eine sofortige Behandlung notwendig ist, erforderlich ist. Daher sind Ärzte häufig gezwungen, die Behandlung zu beginnen, ohne die klinische Ergebnisse abzuwarten, die dann lediglich einen bestätigenden Wert haben. Dementsprechend ist die Behandlung nicht immer geeignet und dies kann häufig zu ernsten Konsequenzen führen, Darüber hinaus kann häufig auch eine Behandlung von nicht-infizierten Individuen erfolgen, Darüber hinaus zwingt die Tatsache, dass der Arzt den zugrundeliegenden Organismus nicht kennt, ihn dazu Breitspektrum-Antibiotika zu verwenden, was in der Praxis zur Entwicklung von resistenten Mikroorganismen führt, Darüber hinaus ist die unnötige Verabreichung von Antibiotika an Patienten eine starke finanzielle Belastung des Gesundheitswesens.
Darüber hinaus sind derartige Assays arbeitsaufwendig und erfordern einen beträchtlichen Raum an Laboratorium und dies beschränkt die breite Anwendung derartiger Assays bei dem Screening empfindlicher Bevölkerung auf das Auftreten von Infektionen. Beispielsweise können Symptome des Harntrakts (3) und ältere Leute, für die asymptomatische Infektionen gefährlich sein können (4-6) nicht routinemäßig untersucht werden.
Es versteht sich somit, dass ein großes Bedürfnis nach Methoden besteht, die keine langen Inkubationszeiten benötigen und bei denen die Feststellung, Identifizierung und Bestimmung der Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber Antibiotika rasch erfolgt.
Es gibt eine Anzahl von raschen Methoden und Systemen zur Feststellung von Mikroorganismen und Bestimmung ihrer Empfindlichkeit gegen Antibiotika, die gegenwärtig verfügbar sind (siehe beispielsweise 7–14). Bei einem Typ derartiger Methoden und Systeme erfordert die Feststellung der Mikroorganismen und der Bestimmung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika eine bestimmte Anfangsinkubationszeit von bis zu etwa 24 Stunden. Zu der benötigten Zeit leiden derartige Methoden und Systeme an großen Nachteilen, da sie zu einer großen Anzahl von falschen positiven sowie falschen negativen Ergebnissen führen. Darüber hinaus sind diese Methoden und Systeme häufig nicht empfindlich gegenüber Konzentrationen von Mikroorganismen die unter etwa 10⁴ oder manchmal sogar 10⁵ Mikroorganismen/ml liegen. Beispiele für Assays, die zu dieser Gruppe gehören, sind das Autobac-System (15–16), das Auto-Microbic-System (17–19), das Impedance-System (20) und das Bactec-System (21).
Eine andere Gruppe derartiger Methoden erfordert keine einleitende Inkubationsperiode und ist daher rascher. Jedoch haben alle diese Methoden den großen Nachteil, dass sie die Bestimmung der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen Antibiotika nicht ermöglichen und dass sie, wie vorstehend, das Problem einer hohen Rate von falschen positiven und falschen negativen Ergebnissen aufweisen und ungeeignet sind, zur Bestimmung von Mikroorganismen in Konzentrationen von weniger als etwa 10⁴–10⁵ Mikroorganismen/ml. Beispiele für derartige Assays sind Bac-t-Screen^EUR(18–23), der Leucocyten-Esterase-Aktivitäts-Assay (18, 22, 25), der Nitrit-Test (18, 22, 25) und das ATP-Assay (25, 22, 26). Ein Überblick über rasche automatisierte Assays lässt sich bei Greenwood (1-985) (27) finden.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 92/21511 (28) beschreibt ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen einem Mikroorganismus und einem Nicht-Mikroorganismen-Objekt in einer Probe, basierend auf der räumlichen Verteilung der Helligkeit auf jedem der Objekte, bei der Ansicht im Mikroskop. Eine besondere Anwendung dieser darin beschriebenen Methode ist die Bestimmung der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen antimikrobielle Mittel. Für diese Bestimmung werden die Mikroorganismen mit dem antimikrobiellen Mittel während eines relativ kurzen Zeitraums inkubiert und anschließend wird die Empfindlichkeit gegenüber einem speziellen Mittel auf der Basis einer Anzahl von Parametern bestimmt, die den Vergleich der Bakterienzählung im Anschluss an die Inkubation mit dem Arzneimittel mit einer Kontrolle, sowie die Bestimmung verschiedener morphologischer Veränderungen der Mikroorganismen nach der Inkubation einschließen.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein rasches Diagnose-Assay zur Bestimmung der Anwesenheit und des Gehalts an Mikroorganismen in einer flüssigen Probe, sowie auch zur Bestimmung des Typs der Mikroorganismen sowie ihrer Empfindlichkeit gegen antimikrobielle Mittel,
Die vorliegende Erfindung umfasst das Inkubieren einer Probe der getesteten Flüssigkeit unter verschiedenen Bedingungen, anschließend das Filtrieren der Probe durch eine Filterbahn mit Poren einer derartigen Größe, die die Permeation der Mikroorganismen nicht erlauben, die somit auf dem Filter zurückgehalten werden. Anschließend an die Filtration wird die Filterbahn unter einem Mikroskop untersucht, das typischerweise eine integrale elektronische Bildaufnahme-Einrichtung aufweist, die mit einer computerisierten Bildanalyse-Einheit verbunden ist. Um die Betrachtung des Mikroorganismus zu erleichtern, werden die zu untersuchenden Proben mit Farbstoff enthaltenden Reagenzsystemen inkubiert, wobei die Farbstoffe vorzugsweise fluoreszierende Farbstoffe sind. Wird eine computerisierte Bildanalysemethode zur Analyse der mikroskopischen Bilder verwendet, erfolgt eine Unterscheidung zwischen den Mikroorganismen und Nicht-Mikroorganismen-Objekten, sowie zwischen verschiedenen Typen von Mikroorganismen untereinander und von anderem Zellmaterial unter Anwendung eines Algorithmus, der zwischen einem Mikroorganismus und einem Nicht-Mikroorganismen-Objekt, basierend auf einer Anzahl von morphologischen Parametern, unterscheiden kann. Ein derartiger Algorithmus kann beispielsweise der sein, der in der PCT-Anmeldung WO 93/2151 1 beschrieben wird,
Außerdem werden, um besser zwischen verschiedenen Arten von Mikroorganismen unterscheiden zu können, zwischen toten und lebenden Mikroorganismen zu unterscheiden usw., verschiedene Färbungsprotokolle verwendet, von denen Beispiele später beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung stellt gemäß einer ihrer Ausführungsformen ein Verfahren zur Identifizierung des Typs von in einer flüssigen Probe enthaltenen Mikroorganismen dar, umfassend

(a) die Bereitung mehrerer Exemplare der Probe;
(b) die Beschaffung mehrerer für Mikroorganismen spezifischer Färbemittel und Zusatz jedes dieser Mittel zu mindestens einem Probenexemplar und anschließend ausreichend langes Inkubieren, um die Einführung des für den Mikroorganismus spezifischen Mittels in die Mikroorganismen oder das Binden an die Mikroorganismen zu ermöglichen;
(c) das Filtrieren der Probenexemplare durch ein Filter mit Poren in einer derartigen Größe, dass die Mikroorganismen auf dem Filter zurückgehalten werden;
(d) das Aufbringen des Filters auf die Bühne eines Mikroskops zur Betrachtung durch das Mikroskop und
(e) das Feststellen und gegebenenfalls Zählen der auf dem Filter zurückgehaltenen gefärbten Mikroorganismen, wobei die Anwesenheit eines gefärbten Mikroorganismus die Anwesenheit eines speziellen Mikroorganismus für den die Färbung spezifisch ist, in der Probe anzeigt.

Zwar kann die Zählung der Mikroorganismen in der Stufe (e) per Hand erfolgen, gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bildet das Mikroskop jedoch den Teil eines computerisierten Bildanalysesystems, Typischerweise umfasst ein derartiges System eine Bildaufnahmeeinheit, die an dem Mikroskop befestigt ist, bei der es sich um eine Videokamera oder eine CCD-Vorrichtung handeln kann; diese Bildaufnahmeeinheit ist mit einer computerisierten Bildanalyseeinheit verbunden, was allgemein an sich bekannt ist.
Die zu untersuchende Probe kann eine flüssige Probe sein, Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die flüssige Probe eine Körperflüssigkeit und die Methode dient dann als klinisches Assay zur Bestimmung des Auftretens einer Infektion in der untersuchten Körperflüssigkeit. Ein spezielles Beispiel für die Körperflüssigkeit ist Urin, obwohl andere Körperflüssigkeiten ebenfalls getestet werden können, wie Blut, Lymphe, Cerebrospinalflüssigkeiten (CSF), Peritonealflüssigkeit (PF), Sputum, Mundspülungen usw, Zusätzlich zu den Körperflüssigkeiten kann die untersuchte flüssige Probe jegliche Flüssigkeit sein, in der die Anwesenheit und Konzentration von Mikroorganismen gewünscht wird, wobei Beispiele Milch, Nahrungsmittelprodukte, Wasserproben aus Wasserbehältern und viele andere sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bewertung der Empfindlichkeit von Mikroorganismen in einer flüssigen Probe gegenüber einem antimikrobiellen Mittel bereit, wobei die Methode umfasst:

(a) Erstellen der Daten des Typs des Mikroorganismus in der Probe nach einer Methode wie vorstehend definiert;
(b) Herstellen mehrerer flüssiger Exemplare der Probe;
(c) Zusatz des antimikrobiellen Mittels zu mindestens einem Probenexemplar und Inkubieren während einer Zeit die ausreicht, dass das antimikrobielle Mittel auf den dafür empfindlichen Mikroorganismen einwirkt; wobei mindestens ein anderes Probenexemplar das als Kontrolle dient unter identischen Bedingungen ohne Zusatz eines antimikrobiellen Mittels inkubiert wird;
(d) Zusatz eines Färbemittels, basierend auf diesen Daten, derart dass wenn diese Daten die Anwesenheit einer einzigen Mikroorganismenpopulation in der Probe anzeigen, ein allgemeiner Mikroorganismenfarbstoff zugesetzt wird und wenn diese Daten die Anwesenheit von mehr als einer Mikroorganismenpopulation anzeigen, ein allgemeiner Farbstoff und ein spezifischer Farbstoff für jeden Mikroorganismentyp in den Proben mit Ausnahme einer zugefügt wird;
(e) Filtrieren der Proben durch ein Filter mit Poren, die die Mikroorganismen auf dem Filter zurückhalten;
(f) Überführen des Filters mit den zurückgehaltenen Mikroorganismen auf die Bühne eines Mikroskops zur Betrachtung durch das Mikroskop und
(g) Feststellen der Mikroorganismen auf dem Filter und Bewerten ihrer Empfindlichkeit für das antimikrobielle Mittel basierend auf einer Änderung von einer oder mehreren Eigenschaften der Mikroorganismen, umfassend: (ga) die Anzahl der lebenden Mikroorganismen; (gb) die morphologischen Parameter der Mikroorganismen; und (gc) die biochemischen Eigenschaften die sich durch die Farbe oder das Farbmuster in den Mikroorganismen manifestieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehenden Bewertungsmethode werden die Mikroorganismen auf ihre Empfindlichkeit für eine Anzahl von antimikrobiellen Mitteln untersucht, wobei in der Stufe (c) jede Probe, mit Ausnahme der Kontrollprobe mit einem dieser Anzahl von antimikrobiellen Mitteln inkubiert wird.
Wie ersichtlich erlauben die vorstehenden Methoden eine Zählung, Identifizierung und Bestimmung der Empfindlichkeit der Mikroorganismen für antimikrobielle Mittel. So kann beispielsweise zuerst die Identität des in einer flüssigen Probe vorhandenen Mikroorganismus durch die vorstehende Identifizierungsmethode bestimmt werden. Die Entscheidung, welche antimikrobiellen Mittel an den in der Probe vorhandenen Mikroorganismen beim Empfindlichkeitstest untersucht werden sollen, kann dann statt zufällig zu erfolgen auf den Identifizierungsergebnissen basieren.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus gemäß einer weiteren Ausführungsform ein System zur Durchführung eines mikrobiologischen Assays bereit, das geeignet ist, zur Darstellung der vorstehenden Methoden, welches umfasst:

(a) eine Einrichtung zur Ausnahme von Proben zur Einführung der zu untersuchenden Proben;
(b) eine oder mehrere Einrichtungen, die mehrere flüssige Reagenzien enthaltende Gefäße umfassen oder zu deren Halterung geeignet sind;
(c) eine Vorrichtung zur Halterung mehrerer Probenexemplar-Platten, wobei jede mehrere Abschnitte zur Halterung von Probenexemplaren aufweist, sowie eine Vorrichtung zur Halterung mehrerer Filtereinheiten, wovon jede einen gestreckten Filterbogen umfasst;
(d) eine Filtereinheit, umfassend eine Vakuumstufe zur Filtration von Probenexemplaren, die in der Probenexemplar-Platte enthalten sind, durch den Filterbogen der Filtereinheit;
(e) eine Inkubatoreinheit, geeignet zur Halterung mehrerer Probenexemplar-Platten;
(f) eine Mikroskopeinheit, umfassend ein Mikroskop, eine Bühne geeignet zur Halterung einer Filtereinheit zur Betrachtung von teilchenförmigem Material, das auf dem Filterbogen enthalten ist, durch das Mikroskop, wobei das Mikroskop eine integrale Bildaufnahmeeinrichtung aufweist, die mit einem computerisierten Bildanalysesystem verbunden ist; und
(g) eine Roboter-Manipulationseinheit mit Greifern zur Halterung und Manipulation von Proben enthaltenden Gefäßen, Probenexemplare enthaltenden Platten und Filtereinheiten und mit Verteiler-Einrichtungen zur Aufnahme von flüssigen Proben, Probenexemplare und Reagenzien und deren Verteilung in Abschnitten der Probenexemplar-Platten.

Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf den Test von Körperflüssigkeiten, insbesondere Urin beschrieben. Es ist ersichtlich, dass dies lediglich ein Beispiel darstellt und dass die erfindungsgemäße Methode mutatis mutandis auf einer breiten Varietät anderer flüssiger Proben durchgeführt werden kann.
I. Screeing von Proben (Zählung von Mikroorganismen)
Die klinische Diagnose von Körperflüssigkeiten, bei der es sich um eine spezielle Ausführungsform der Erfindung handelt, umfasst als erste Stufe das Screening von Körperflüssigkeiten als solchen, die als infiziert klassifiziert werden und von anderen, die als Infektionsfrei klassifiziert werden. Diese Klassifizierung hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, einschließlich:

i. Dem Typ der untersuchten Körperflüssigkeit; Wenn die Körperflüssigkeit Blut ist, muss es völlig frei von Mikroorganismen sein und die Anwesenheit von selbst wenigen und zeitweise selbst einem einzigen Mikroorganismus kann gefährlich sein. Dies gilt auch für CSF, PF sowie Lymphflüssigkeit, Im Falle vom Urin, Mundspülflüssigkeit oder Sputum sind die Erfordernisse nicht so rigoros, da eine natürliche Mikroorganismen-Flora selbst bei gesunden Individuen existiert. In derartigen Fällen ist ein gewöhnlich akzeptierbarer Standard das „Grenzwert-Niveau", bei dem der Gehalt an Mikroorganismen über diesem Niveau bei einem Individuum dieses als infiziert klassifiziert. Beispielsweise ist im Falle von E. coli in einer Urinprobe der Grenzwertgehalt im allgemeinen etwa 10⁵ Bakterien/ml und ein Individuum, bei dem mehr als dieser Gehalt an Mikroorganismen im Urin gefunden wird, wird als infiziert betrachtet.
ii. Dem Typ des Individuums; Im Falle von Urin, Sputum, Mundwäsche usw; hängt das Grenzwertniveau auch von dem Typ des Individuums ab. Beispielsweise wird bei Kindern sowie auch älteren Individuen das Grenzwertniveau niedriger angesetzt als bei jungen Individuen oder solchen mittleren Alters.
iii. Der Art, wie die klinische Probe erhalten wird; Im Falle einer Körperflüssigkeit hängt das Grenzwert-Niveau auch davon ab, wie die klinische Probe von dem Individuum erhalt wurde. Beispielsweise hängen im Falle von Urin die Ergebnisse davon ab, ob die Urinprobe eine Mittelstromprobe war (Untersuchung der Mittelstromprobe ist der gewöhnliche Standard bei der Urinuntersuchung) oder ob die Urinprobe auf anderem Wege erhalten wurde, z. B. durch Aspiration direkt aus der Blase, In diesem Falle ist das Grenzwert-Niveau niedriger als im Falle einer Mittelstrom-Urinprobe.

So wird normalerweise eine zum Test vorgelegte Körperflüssigkeit durch Daten begleitet, die die verschiedenen Parameter wiedergeben und diese Daten können in einen Computer eingespeist werden zur Bestimmung des Grenzwert-Niveaus, das dann mit dem Gehalt an Mikroorganismen verglichen wird, der für das spezifische Individuum bestimmt wurde. Dies erlaubt eine genauere Klassifizierung des Individuums als gesund im Vergleich mit infiziert.
Um die Betrachtung der Mikroorganismen zu erleichtern, wird die getestete Probe mit Farbstoffen inkubiert, die den Mikroorganismus anfärben. Derartige Farbstoffe sind allgemein an sich bekannt und der Fachmann hat keine Schwierigkeiten, den richtigen Farbstoff für ein spezielles diagnostisches Assay zu wählen.
Eine Probe, insbesondere die Probe einer klinischen Körperflüssigkeit, enthält sowohl tote als auch lebende Mikroorganismen und beide werden durch das Mikroskop beobachtet, da zusätzlich zu den lebenden Zellen auch tote Zellen absorbieren und somit mit vielen Farbstoffen gefärbt werden. Um die Mikroorganismenbeladung der Probe korrekt zu bestimmen, ist es bevorzugt, die Anzahl der toten Zellen von der Gesamtanzahl der Zellzählung zu subtrahieren und aus diesem Grunde sollte ein Reagenzsystem verwendet werden, das die Identifizierung von toten Zellen ermöglicht. Dies kann typischerweise durch unterschiedliche Färbung erzielt werden. Beispielsweise kann eine zu untersuchende Probe mit einem Reagenzsystem inkubiert werden, welches einen ersten Farbstoff enthält, der sowohl die lebenden als auch die toten Mikroorganismen färbt und einen zweiten Farbstoff, der den Zellen eine unterschiedliche Farbe verleiht, der lediglich tote Mikroorganismen färbt (d. h, ein Farbstoff für den die Membran der lebenden Mikroorganismen nicht permeabel ist, der jedoch in die toten Mikroorganismen eintritt und sie färbt, da ihre Membran für den Farbstoff permeabel geworden ist). Dementsprechend werden die lebenden Mikroorganismen nur mit dem ersten Farbstoff gefärbt, wohingegen die toten Mikroorganismen mit beiden Farbstoffen gefärbt werden.
Wenn die beiden Farbstoffe den Zellen die gleiche Farbe verleihen, werden alternativ, obwohl dies nicht bevorzugt ist, zwei Proben gleichzeitig inkubiert, eine mit einem Reagenzsystem, das den ersten Farbstoff enthält und eine andere mit einem Reagenzsystem, das den zweiten Farbstoff enthält; die Zählung der lebenden Bakterien wird anschließend durch Subtraktion der Zählung der toten Mikroorganismen von einer Probe der gesamten Mikroorganismenzählung, die in der anderen erhalten wurde, bestimmt.
Die Farbstoffe in dem Reagenzsystem sind typischerweise fluoreszierende Farbstoffe, und zwar deshalb, da die meisten Filterbögen nicht voll transparent sind und es daher schwierig ist, die Zellen durch Beleuchtung vom Boden her zu betrachten. Dementsprechend umfasst das Mikroskop vorzugsweise ein Lichtsystem, das für die Fluoreszenz-Mikroskopie geeignet ist.
Infektiöse Bakterien, umfassen, wie im Stand der Technik bekannt, eine große Varietät von Mikroorganismen, einschließlich Gram-negativer (Gram^–) und Gram-positiver (Gram⁺) Bakterien, Pilze, insbesondere Hefen und andere. Bekanntlich werden stabförmige Gram⁺-Bakterien, wie Lactobacilli, Corynebacteria, etc, im allgemeinen in Urinproben als nicht-pathologisch betrachtet, Um daher eine Messung der pathologischen Bakterienbelastung in einer Urinprobe zu erhalten, ist es notwendig, zwischen den stabförmigen Gram⁺-Bakterien und dem Rest zu unterscheiden. Dementsprechend werden eine oder mehrere Probenexemplare der gleichen Probe gleichzeitig verarbeitet und inkubiert mit einem Reagenzsystem, das die Unterscheidung zwischen Gram⁺- und Gram^–-Bakterien ermöglicht. Beispielsweise kann eine einzige Probeneinheit mit einem Reagenzsystem inkubiert werden, das einen nicht-spezifischen Farbstoff enthält und einen anderen für Gram⁺-Bakterien spezifischen, wobei jeder den Zellen eine unterschiedliche Färbung gibt, und als Ergebnis dieser Differenzialfärbung können gleich wie vorstehend in Bezug auf die Färbung von toten/lebenden Bakterien die Gram⁺- und Gram^–-Bakterien voneinander unterschieden werden, Ebenfalls wie vorstehend können, wenn die beiden Farbstoffe die gleiche Farbe haben, zwei Probeneinheiten gleichzeitig bearbeitet werden und die Zählung der Gram^–- und Gram⁺-Bakterien kann durch Kombination der Ergebnisse der beiden Probeneinheiten erzielt werden. Wenn die stabförmigen Gram⁺-Bakterien durch ihre Morphologie identifiziert werden, können sie gezählt werden und diese Anzahl kann dann von der Gesamtzählung der lebenden Bakterien subtrahiert werden, um die Zählung der pathogenen Bakterien zu erhalten. Dies gibt ein korrekteres Maß der pathologischen Belastung der Urinprobe.
Es versteht sich, dass, falls die Probe der Körperflüssigkeit beispielsweise Blut oder CSF ist, diese völlig frei von Mikroorganismen sein muss und hier werden auch stabförmige Gram+-Bakterien als pathogen angesehen. Dementsprechend klassifiziert jegliche Feststellung von Mikroorganismen in diesem Falle, einschließlich stabförmiger Gram+-Bakterien die Probe als infiziert.
Ein Farbstoff, der spezifisch für Gram⁺-Bakterien ist, dringt häufig auch in tote Bakterien ein, einschließlich toter Gram^–-Bakterien; dementsprechend werden die Ergebnisse dieser Probe, die inkubiert ist mit einem Reagenzsystem, das zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Bakterienzellen geeignet ist, kombiniert mit dem Ergebnis, das mit dem Reagenzsystem zur Unterscheidung zwischen den Gram⁺- und Gram^–-Zellen erhalten wurde, um eine genauere Zählung der lebenden Gram⁺-Zellen zu ermöglichen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist es auch möglich, die Probe mit einem Reagenzsystem zu inkubieren, das mehrere Farbstoffe enthält, wobei jeder eine unterschiedliche Art von Zellspezifität aufweist, wobei jeder Farbstoff eine unterschiedliche Färbung hat, so dass umfassende Daten mit einer einzigen Probe erhalten werden.
Ein Hauptproblem, das mit der mikroskopischen Zählung von Mikroorganismen einhergeht, ist die Unterscheidung zwischen Mikroorganismen und teilchenförmigen Nicht-Mikroorganismen-Objekten. Derartige Objekte können festes teilchenförmiges Material sein oder im Falle einer klinischen Probe auch Körperzellen. Die WO 93/21511 beschreibt eine computerisierte Bildanalysemethode, die die Unterscheidung zwischen Mikroorganismen und Nicht-Mikroorganismen-Objekten ermöglicht. Allgemein basiert, ohne in der vorliegenden Schrift auf Details einzugehen, diese Unterscheidung auf der Messung des räumlichen Abstands der Helligkeit über das gesamte jedes dieser Objekte, Verschiedene Parameter können daraus abgeleitet werden, die als Basis für die Entscheidung dienen, ob ein Objekt ein Mikroorganismus oder ein Nicht-Mikroorganismus-Objekt ist. Dies umfasst den sogenannten „optical slope", der eine Helligkeitsänderung über die Kante des Objekts ist, den sogenannten „moment", bei dem es sich um ein Produkt der Lichtintensität an jedem Punkt des Objekts und seiner Entfernung von dem Mittelpunkt des Objekts handelt, sowie die Objektlänge, Breite und Fläche und ihre Gesamtform.
Basierend auf der Kombination von Parametern können Mikroorganismen von Nicht-Mikroorganismen-Objekten unterschieden werden. Zusätzlich können einige dieser Parameter auch dazu dienen, verschiedene Arten von Mikroorganismen voneinander zu unterscheiden, so wie verschiedene Nicht-Mikroorganismen-Objekte zu klassifizieren. Beispielsweise sind Cocci-Bakterien und Hefen ähnlich, da sie grundlegend zirkulär sind und im allgemeinen gleiches Aussehen aufweisen, obwohl sie voneinander unterschieden werden können, beispielsweise basierend auf ihrer Größe (Hefen sind größer als Cocci-Bakterien).
Manchmal kann es zur Bestimmung der Anwesenheit und des Ausmaßes einer Infektion in einer klinischen Körperflüssigkeits-Probe wichtig sein, den Gehalt an anderen Nicht-Mikroorganismen-Zellen zu bestimmen, die darin vorhanden sind, beispielsweise einschließlich roter Blutkörperchen, Lymphozyten, Epithelzellen usw. Der Gehalt an Epithelzellen kann wichtig sein, um die Qualität einer klinischen Proben zu bestimmen; Beispielsweise ist in Urin die Anzahl von Epithelzellen in einer Probe ein Anzeichen für die Qualität der Probe, d. h, ob sie in geeigneter Weise dem Individuum entnommen wurde.
Wenn gefunden wird, dass eine flüssige Probe eine infektiöse Belastung von pathogenen Mikroorganismen über einem Grenzwertniveau enthält, ist es häufig auch notwendig, die Mikroorganismen hinsichtlich ihres genauen Typs zu bestimmen, sowie auf ihre Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Mitteln zu bestimmen, um eine Behandlung zur Ausrottung der Mikroorganismen zu erstellen. Dies ist insbesondere so im Falle der Probe einer Körperflüssigkeit, bei der eine derartige Information vom Arzt gefordert wird, um ihm die geeignete Behandlung mit einem Arzneimittel zu ermöglichen, das dem Individuum verabreicht werden soll, um die mikrobielle Infektion zu behandeln.
II. Identifizierung von Mikroorganismen
Um den Typ der in einer flüssigen Probe festgestellten Mikroorganismen zu identifizieren, werden Probenexemplare dieser Proben mit Reagenzsystemen inkubiert, die für den Mikroorganismus spezifische Mittel enthalten, die an eine spezielle Klasse von Mikroorganismen gebunden oder in diese eingeführt werden können, Diese Mittel sind entweder a priori an einen Label gebunden oder können an einen solchen Label gebunden werden nachdem sie an die Zellen des Mikroorganismus gebunden oder davon absorbiert werden, wobei es sich bei dem Label um einen Farbstoff oder ein anderes Färbemittel (z. B. ein Enzym, das zu einem gefärbten Produkt führt) handeln kann. Spezielle Beispiele von für Mikroorganismen spezifischen Mitteln sind monoklonale Antikörper, Das Label kann beispielweise ein fluoreszierender Farbstoff sein. Das Label kann a priori an den monoklonalen Antikörper gebunden sein oder kann das Label alternativ an ein Trägermolekül gebunden werden, das dann spezifisch an den für den Mikroorganismus spezifischen Antikörper bindet. Das Trägermolekül kann beispielsweise ein Antikörper sein, der spezifisch an den für den Mikroorganismus spezifischen Antikörper bindet; alternativ kann der Antikörper an Biotin konjugiert sein und das Trägermolekül kann dann Avidin sein, Wie für den Fachmann ersichtlich, sind diese Markierungs-Ausführungsformen nur Beispiele zahlreicher anderer Labelling-Techniken, die die Identifizierung durch Bindung des für den Mikroorganismus spezifischen Mittels an die Zellen des Mikroorganismus ermöglichen.
Typischerweise werden zahlreiche Probenexemplare der gleichen Probe getrennt und gleichzeitig mit allgemeinen Reagenzsystemen inkubiert, wobei jedes ein unterschiedliches für den Mikroorganismus spezifisches Mittel enthält, z. B. unterschiedliche für Mikroorganismen spezifische monoklonale Antikörper. Die Inkubation erfolgt während eines Zeitraums der ausreicht, um die Färbung der Zellen zu ermöglichen oder im Falle der monoklonalen Antikörper ausreicht, um die Bindung der monoklonalen Antikörper an die Zellen der Mikroorganismen zu ermöglichen. Bei der Ausführungsform, bei der Biotin tragende monoklonale Antikörper verwendet werden, ist es bevorzugt, das Avidin-Label-Konjugat nur nach der Inkubation zuzusetzen.
Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemäßen Methode- besteht darin, dass die Markierungsreaktion eine homogene Reaktion ist und es ist nicht notwendig, anschließend die Probenexemplare zu waschen, um nicht festgestellten Label zu entfernen. Dies resultiert daraus, dass im Anschluss an die Inkubation, die flüssige Probe filtriert wird, um den Mikroorganismus zu betrachten, wodurch nichtgebundene Farbstoffe oder Färbemittel abfiltriert werden.
Manchmal ist es auch möglich, die Anzahl der gleichzeitig inkubierten Probenexemplare zu verringern, wenn man ein Reagenzsystem verwendet, dass mehrere monoklonale Antikörper umfasst, die jeweils spezifisch für verschiedene Mikroorganismen sind und wobei jeder mit einem Farbstoff oder Färbemittel assoziierte ist, der bzw, das zu einer unterschiedlichen Farbe führt.
Nach dem Inkubieren und Färben werden die Mikroorganismen durch ein Filter filtriert und anschließend werden die Filter mit den zurückgehaltenen Mikroorganismen zur Betrachtung auf ein Mikroskop überführt, in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben.
III. Untersuchung der Empfindlichkeit gegen antimikrobielle Arzneimittel
Um die Empfindlichkeit des in einer flüssigen Probe identifizierten Mikroorganismus gegen antimikrobielle Arzneimittel zu testen, werden mehrere Probenexemplare der Proben gleichzeitig inkubiert, wobei ein Probenexemplar als Kontrolle dient und die anderen gleichzeitig und unter den gleichen Bedingungen jeweils mit einem unterschiedlichen antimikrobiellen Mittel inkubiert werden, Im Falle der Probe einer Körperflüssigkeit werden die Probenexemplare typischerweise in einem Inkubator bei 37°C inkubiert, Die Inkubationszeit beträgt dann im allgemeinen etwa 1–3 Stunden, vorzugsweise etwa 2 Stunden.
Um optimale Ergebnisse zu erhalten, werden die Probenexemplare zuerst verdünnt, so dass sie eine optimale Anfangszahl aufweisen. Die Verdünnung erfolgt auf der Basis der vorstehend erhaltenen Zählungsergebnisse.
Basierend auf den Identifizierungsergebnissen der Mikroorganismen, können grundliegend zwei Situationen auftreten:

i. Die getestete Flüssigkeitsprobe enthält vorwiegend eine einzige Mikroorganismenart;
ii. Die getestete Flüssigkeitsprobe enthält eine gemischte Flora von zwei oder mehreren Arten von Mikroorganismen.

Im ersten Falle wird nach der Inkubation mit dem antibiotischen Arzneimittel das flüssige Probenexemplar mit einem Reagenzsystem inkubiert, das einen Farbstoff enthält, der alle Mikroorganismen nichtspezifisch färbt. Im letzteren Falle, in dem die flüssige Probe eine gemischte Flora enthält, wird das Probenexemplar auch mit für Mikroorganismen spezifischen Farbstoffen inkubiert, Es ist zwar möglich, einen spezifischen Farbstoff für jeden Mikroorganismus zuzusetzen, jedoch ist es gewöhnlich bevorzugt, einen für Mikroorganismen nichtspezifischen Farbstoff zuzufügen, d. h, einen Farbstoff, der sämtlichen Mikroorganismen färbt und einen Farbstoff, der lediglich eine spezifische Klasse von Mikroorganismen färbt, i. e. ein für Mikroorganismen spezifischer Farbstoff), z. B. Mikroorganismen-spezifische monoklonale Antikörper, Die Gesamtanzahl der für Mikroorganismen spezifischen Farbstoffe ist um eins geringer als die Anzahl der unterschiedlichen Mikroorganismen in den Probenexemplaren. Wenn beispielsweise die gemischte Flora aus zwei Mikroorganismen besteht, („Mikroorganismus A und Mikroorganismus B") kann ein allgemeiner Farbstoff, der sämtliche Mikroorganismen, d. h, sowohl Mikroorganismus A als auch Mikroorganismus B, färbt, zugesetzt und anschließend kann ein weiterer spezifischer Farbstoff, beispielsweise für Mikroorganismus A (z. B. ein Antimikroorganismus A markierter monoklonaler Antikörper) zugefügt werden. Eine derartige Differenzial-Färbung ermöglicht die Unterscheidung zwischen den unterschiedlichen Mikroorganismus-Populationen und ermöglicht die spezielle Prüfung der Empfindlichkeit der verschiedenen Mikroorganismen in der gemischten Flora für das antimikrobielle Mittel.
Die Empfindlichkeit des Mikroorganismus für das antimikrobielle Mittel wird bestimmt durch eine Kombination einer Anzahl von Parametern, einschließlich des Ausmaßes der Proliferation des Mikroorganismus, der in Anwesenheit des antimikrobiellen Mittels kultiviert wurde, im Vergleich mit dem Kontrollprobenexemplar (gleichzeitig ohne Zusatz jeglichen antimikrobiellen Mittels kultiviert) sowie einer Änderung der morphologischen oder biochemischen Parameter des Mikroorganismus. Dies kann durch eine computerisierte Bildanalysen-Methode wie in WO 93/21511 beschrieben, durchgeführt werden.
Die Manifestation der Empfindlichkeit gegen das antimikrobielle Arzneimittel unterscheidet sich für verschiedene Arzneimittel und für verschiedene Mikroorganismus-Spezies, Beispielsweise führt die Inkubation von Mikroorganismen mit Cephalosporin im allgemeinen zu deren Verlängerung, wohingegen die Inkubation des gleichen Mikroorganismus mit Aminoglykosiden eine Verkürzung und Verdickung bewirken kann; Augmentin als ein weiteres Beispiel bewirkt die Bildung von „Tupfen" in dem Septum der empfindlichen Bakterien, Diese Spezifität für antimikrobielle Mittel oder Speziesspezifität sollte in Betracht gezogen werden, wenn die Empfindlichkeit des antimikrobiellen Mittels bewertet wird.
Mikroorganismen in Kultur neigen dazu, Antigene abzugeben, die dann nicht-spezifisch in andere Mikroorganismen eingeführt werden können, Dies ist ein wichtiges Merkmal, das im Falle einer gemischten Kultur in Betracht gezogen werden sollte; Von Mikroorganismen ausgeschüttete Antigene einer Spezies können nicht-spezifisch durch Mikroorganismen einer anderen Spezies adsorbiert werden und dies kann dann zu einer Verschleierung der Ergebnisse führen, Um eine derartige nicht-spezifische Bindung zu vermeiden, können Mittel, die die nicht-spezifische Absorption von Antigenen inhibieren, zu dem Medium jedes Probenexemplars während der Inkubation gegeben werden, Ein Beispiel für ein derartiges Mittel ist Rinderserum-Albumen (BSA), Tween EUR, usw.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf eine spezielle Ausführungsform erläutert, die die klinische Untersuchung von Urinproben betrifft, um deren Belastung mit Mikroorganismen zu zählen, die darin festgestellten Mikroorganismen zu identifizieren und die Sensibilität der Mikroorganismen gegen antimikrobielle Arzneimittel zu testen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine Methode nach dem Stand der Technik zur Zählung von Mikroorganismen in einer klinischen Probe und anschließenden Identifizierung und Bewertung auf die Empfindlichkeit von positiven Proben für antimikrobielle Arzneimittel;
2 ist ein schematischer Überblick über die erfindungsgemäße Methode zur Zählung, Identifizierung von Mikroorganismen und Bewertung der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen antimikrobielle Mittel;
3 ist eine schematische Darstellung der Zählung der Mikroorganismen gemäß der Erfindung;
4 ist eine schematische Veranschaulichung einer Photomikrographie von Probenexemplaren, die wie in 3 gezeigt verarbeitet wurden, wobei 4A die Ergebnisse einer Differential-Färbemethode für tote und lebende Mikroorganismen zeigt und 4B die Ergebnisse einer Differential-Färbung für Gram+ und Gram Mikroorganismen zeigt;
5 zeigt echte Proben von Mikrographien von Probenexemplaren, die wie im Beispiel 1 beschrieben, verarbeitet wurden;
5A und 5B zeigen zwei Ansichten des gleichen Probenexemplars, inkubiert mit einem Reagenzgemisch (identifiziert als SRM-1 in Beispiel 1 ) für die Differential-Färbung der gesamten Mikroorganismenpopulation durch eine Färbung und toter Zellen durch eine andere Färbung, wobei 5A die Ergebnisse aus einer allgemeinen Färbung darstellt, die sämtliche Zellen in der Probe zeigt und 5B nur die toten Zellen zeigt;
5C und 5D zeigen ein Probenexemplar, das mit einem Reagenzsystem zur Differential-Färbung der gesamten Bakterienpopulation und Gram⁺-Bakterien (identifiziert als SRM-2 im Beispiel 1) inkubiert wurde, wobei 5C die gesamte Mikroorganismenpopulation darstellt und 5D die unterschiedlich gefärbten Gram+-Bakterien zeigt;
6 ist eine schematische Darstellung der Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen in einer flüssigen Probe unter Verwendung von n Mikroorganismen-spezifischen Antikörpern, von denen jeder spezifisch für eine unterschiedliche Mikroorganismenart ist (diese Untersuchung testet die Anwesenheit der Gesamtheit von n unterschiedlichen Mikroorganismen);
7 ist eine schematische Darstellung der Methode zur Untersuchung der Empfindlichkeit der Mikroorganismen in einer Probe für antimikrobielle Mittel (in diesem Falle sechs verschiedene Mittel, markiert als „A_a", „A_f"); und
8 ist eine isometrische Ansicht einer Vorrichtung, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist.
Beschreibung von speziellen Ausführungsformen
Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die speziellen Ausführungsformen erläutert, die sich auf den klinischen Test von Urinproben zum Zwecke der Diagnose von Infektionen des Harntraktes beziehen. Für den Fachmann ergibt sich, dass es sich hier lediglich um ein Beispiel handelt und die Erfindung mutatis mutandis auch mit anderen Arten von biologischen flüssigen Proben durchgeführt werden kann.
Zunächst wird Bezug genommen auf 1 , die die Methode des Stands der Technik zum Screening von Urinproben zeigt, um das Auftreten einer Infektion zu bestimmen und die anschließende Identifizierung des Typs der infizierenden Mikroorganismen sowie ihre Empfindlichkeit gegen antimikrobielle Arzneimittel, Diese Standardmethode des Stands der Technik basiert auf der Kultur einer Urinprobe auf Kulturplatten, Inkubieren der Platten während ausreichender Zeit, um die Bildung von Kolonien zu ermöglichen und anschließendes Zählen der Kolonien. In einer ersten Stufe wird eine Urinprobe 20, typischerweise eine Mittelstrom-Urinprobe gesammelt und anschließend auf eine Anzahl von Kulturplatten 22 aufgebracht. Im Anschluss an die Inkubation, die typischerweise etwa 24 Stunden dauert, werden Kolonien 26, die auf Platten 22 gebildet wurden, betrachtet und die Anzahl der Kolonien wird gezählt. Die Anzahl von Kolonien unter einem bestimmten kritischen Wert wird als negatives Ergebnis angesehen; wenn die Anzahl der Kolonien diesen Grenzwert überschreitet, wird die Probe als positiv angesehen, was bedeutet, dass eine Infektion vorliegt. Im Falle eines positiven Ergebnisses wird der Test typischerweise weiter geführt, um die Art der Mikroorganismen und ihre Empfindlichkeit gegen antimikrobielle Arzneimittel zu bestimmen.
Zu diesem Zweck werden Proben der entwickelten Kolonien entnommen und auf mehrere andere Kulturplatten 26 aufgebracht. Einige der Platten können verschiedene selektive Wachstumsmedien oder verschiedene Farbindikatoren aufweisen, um eine Identifizierung der Mikroorganismen zu ermöglichen, basierend auf ihrem Wachstumsmuster auf verschiedenen Wachstumsmedien und andere Wachstumsmedien enthalten antimikrobielle Arzneimittel und dienen zum Test der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen derartige Mittel. Nach dem Aufbringen auf die Platten werden die Kulturen typischerweise etwa 24 Stunden weiter inkubiert, wobei sich Kolonien 28 auf den das Wachstum zulassenden Medien entwickeln. Das Wachstum der Mikroorganismen, die erneut durch die Bildung von Kolonien 28 betrachtet werden können, kann als Charakterisierung des Typs der Mikroorganismen sowie zur Bestimmung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteln dienen.
Ein Nachteil dieser konventionellen Methode liegt darin, dass die Ergebnisse verzögert erhalten werden, da sie von der Bildung von Kolonien abhängen, wobei es sich typischerweise bei einem rasch wachsendem Mikroorganismus um einen Prozeß handelt, der mindestens etwa 24 Stunden dauert. So benötigt man etwa 48 Stunden, um die Arzneimittelempfindlichkeit der Mikroorganismen zu finden. Zu einem derart späten Zeitpunkt hat die Behandlung im allgemeinen bereits begonnen und manchmal hat die Erkrankung dem Patienten bereits großen Schaden zugefügt. Ferner sei festgestellt, dass einige Mikroorganismen wesentlich langsamer wachsen und eine beträchtlich längere Zeit zur Erzielung der Ergebnisse notwendig ist.
Andere Nachteile einer derartigen Methode liegen darin, dass sie laborintensiv ist, geschultes Personal erfordert und darüber hinaus die Handhabung der in jeder Stufe erforderlichen Platten zu einer Verunreinigung durch äußere Quellen führen kann, die die Ergebnisse verschleiern kann.
Zusätzlich tritt, wie vorstehend erwähnt, bei einer derartigen bekannten Methode ein weiteres Problem auf, wenn eine Infektion durch eine gemischte Flora von Mikroorganismen, typischerweise zwei, bewirkt wird. Um ihre Empfindlichkeit für antimikrobielle Arzneimittel zu testen, ist es notwendig, zwischen den Kolonien der verschiedenen Bakterien zu trennen und die Empfindlichkeit für jede Population separat zu testen. Dies erschwert offensichtlich die Verfahrensweise, Darüber hinaus können selbst Mikroorganismen in einer einzigen Mikroorganismen-Population verschiedene Unterpopulationen von Mikroorganismen umfassen, die sich hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit für antimikrobielle Mittel voneinander unterscheiden. So kann beispielsweise, obwohl die Population insgesamt gegen ein spezielles Arzneimittel empfindlich ist, ein geringer Anteil, z. B. 5–10 %, relativ resistent sein. Bei bekannten Methoden ist es gewöhnlich sehr schwierig, wenn nicht unmöglich, derartige Variationen der Empfindlichkeit, zu identifizieren, da die Ergebnisse von einer einzigen, zufällig gewählten, Kolonie stammen. Dies kann dazu führen, dass der Arzt eine Empfehlung für die Behandlung mit einem bestimmten Arzneimittel erhält, das nicht wirksam gegen eine bestimmte Unterpopulation von Mikroorganismen ist, die sich unter denen, die die Infektion bewirkten, befindet.
Im folgenden wird auf die 2 Bezug genommen, die einen schematischen Gesamtüberblick über eine Methode zur Untersuchung einer Urinprobe auf die Zählung, Identifizierung und den Test für die Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Mitteln, liefert, Eine Urinprobe 30 wird gesammelt, bei der es sich vorzugsweise um eine Mittelstromprobe handelt, und diese mit Daten versehene Probe (die Art und Weise des Sammelns der Probe, der Typ des Individuums usw,) wird anschließend untersucht. Die erste Stufe 32 besteht in einer relativ raschen Zählungsstufe zum Screening von Individuen auf solche, die infiziert sind und solche, die gesund sind, unter Einbeziehung, wie später detaillierter erläutert, des Zusatzes von Farbstoffen und anschließendes Unterziehen einer Probe nach dem Filtrieren einer mikroskopischen Analyse, die die Zählung der Anzahl von infektiösen Mikroorganismen in der Probe ermöglicht, Wenn das Ergebnis der Zählungsstufe 32 negativ ist, d. h, dass die Anzahl der Bakterien geringer ist als ein gewisser kritischer Wert (dieser kritische Wert hängt von der Art des Sammelns der Probe, dem Typ des Individuums usw, ab), wird das getestete Individuum als gesund eingestuft und die Untersuchung wird hier abgebrochen, Das Ergebnis dieser Screening-Stufe kann innerhalb etwa 20–30 Minuten verfügbar sein. Im Falle eines positiven Ergebnisses werden Probenexemplare der Proben weiter in einem Assay 33 untersucht, das dazu bestimmt ist, die Identität der infektiösen Mikroorganismen zu bestimmen und in einem weiteren Assay 34, das dazu bestimmt ist, die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen antimikrobielle Arzneimittel festzustellen, Die Assays 33 und 34 werden typischerweise gleichzeitig durchgeführt, Die Ergebnisse der Identifizierung 35 werden auch in dem Assay 34 auf die Empfindlichkeit gegen das antimikrobielle Mittel verwertet, was durch den Pfeil 36 dargestellt wird und nachstehend weiter erläutert wird, Schließlich wird basierend auf dem Empfindlichkeits-Assay eine Liste von empfohlenen Arzneimitteln erstellt, die es dem Arzt ermöglicht eine optimale Behandlungsmethode für die Infektion zu entwerfen. Im Gegensatz zu der vorstehenden bekannten Methode können Ergebnisse, die eine derartige Arzneimittelliste ermöglichen, innerhalb etwa 3 Stunden erzielt werden.
Darüber hinaus liegen zusätzlich zu den Mikroorganismen auch weitere Infektionsanzeichen vor, wie beispielsweise die Anzahl von polymorphonuklearen Zellen (PMN), die bei einer Standard-Diagnosemethode nicht routinemäßig bestimmt werden kann. Durch die Erfindung, deren Methode auf der mikroskopischen Betrachtung unter Messung einer Kombination von Parametern an individuellen Zellen basiert, können einige dieser Nachteile überwunden werden.
Im folgenden wird auf die 3 Bezug genommen, die einen schematischen Umriss der Methode zur Zählung von Mikroorganismen (Block 32 in der 2) gemäß der Erfindung darstellt, In einer ersten in der 3A dargestellten. Stufe werden mehrere Probenexemplare, z. B. jeweils von etwa 30 μl einer Urinprobe 40 gesammelt, z. B, durch Einweg-Mikrotips 42, die an einer Verteilereinheit eines Roboter-Manipulatorsystems (nicht dargestellt) befestigt sind und anschließend in jede der Kammern 46 einer Platte 48 mit zahlreichen Kammern überführt werden. Die Platte kann beispielsweise eine Multikammerplatte sein, wie die in der WO 97/41955 beschriebene, Ohne ins Detail zu gehen, wird kurz aufgeführt, dass jede Kammer 46 in der Platte 48 eine Öffnung 50, einen Inkubationsraum 52 für eine Flüssigkeit und eine Düse 54, die sich von einer Seitenwand der Kammer zur oberen Oberfläche 56 der Platte erstreckt, aufweist. Diese Struktur der Kammer ermöglicht sowohl die Inkubation einer flüssigen Probe, als auch die anschließende Filtration durch einen Filterbogen (vergleiche WO 97/41955). Typischerweise werden zwei Probenexemplare der Probe 40 gesammelt und jeweils in eine unterschiedliche Kammer 46 überführt.
In der nächsten, in der 3B dargestellten Stufe, werden zwei flüssige Reagenzsysteme R₁ und R₂ gesammelt, wieder unter Verwendung von Einweg-Mikrotips 42' und jedes dieser Reagenzsysteme R₁ und R₂ wird anschließend in eine unterschiedliche Kammer 46 eingebracht, Das Reagenzsystem R₁ umfasst zwei Farbstoffe, von denen einer sämtliche Zellen in der Probe anfärbt und der andere nur tote Zellen färbt. Reagenz R₂ umfasst einen Farbstoff, der sämtliche Zellen färbt (wobei es sich um den gleichen Farbstoff wie den ersten Farbstoff in dem Reagenzsystem R, handeln kann) und einen zweiten Farbstoff, der lediglich Gram+-Bakterien färbt (es sollte beachtet werden, dass einige Gram⁺-Farbstoffe manchmal tote Zellen färben).
Im Anschluss an die Inkubation, die typischerweise während etwa 20 Minuten bei 37°C erfolgt, wird eine Filtereinheit 60, die eine Filterbahn 62 enthält, auf die Oberseite der Platte 48 aufgebracht, wie aus 3C ersichtlich, und die Anordnung, die die Platte 48 und die Filtereinheit 60 umfasst, wird anschließend umgekehrt und einer Vakuumfiltration unterzogen, wobei die flüssige Phase durch das Filter 62 filtriert wird und teilchenförmiges Material 64 auf dem Filter 62 zurückgehalten wird. Die Filtereinheit 60 mit dem Filter 62 wird anschließend auf ein Mikroskop überführt, wo das teilchenförmige Material betrachtet und die Mikroorganismen gezählt werden. Das Mikroskop weist typischerweise eine integrale Bildaufnahmeeinrichtung auf, die gekuppelt ist mit einem computerisierten Bildanalysesystem zur Analyse des Bildes und zur Erzielung der Zählung der Mikroorganismen.
Im folgenden wird auf die 4 Bezug genommen, um zu erläutern, wie eine Mikroorganismen-Zählung erhalten wird. Eine klinische Probe umfasst typischerweise sowohl tote als auch lebende Mikroorganismen, sowie auch Mikroorganismen, die nicht pathogen sind. Wie allgemein bekannt, werden Gram^–, stäbchenartige Bakterien, im Urin typischerweise als nicht-pathogene Mikroorganismen angesehen, Bei bekannten Methoden war es gewöhnlich schwierig zwischen nicht-pathogenen Bakterien und pathogenen zu unterscheiden, da nicht-pathogene Bakterien ebenfalls geeignet sind in einem Kulturmedium zu wachsen und somit letztlich mitgezählt werden. So kann bei bekannten Methoden diese Tatsache manchmal zu einem falschen positiven Ergebnis geführt haben.
Die 4A zeigt ein mikroskopisches Feld eines Probenexemplars, das im Anschluss an die Inkubation mit dem Reagenzsystem R₁ erhalten wurde, Dieses Reagenzsystem umfasst, wie vorstehend erwähnt, einen ersten Farbstoff, der sämtliche Zellen (sowohl tote als auch lebende Zellen) färbt und einen weiteren Farbstoff, der nur die toten Zellen färbt. Diese Farbstoffe sind typischerweise fluoreszierende Farbstoffe und das Mikroskop ist dementsprechend auf eine fluoreszierende Beleuchtung angepasst, (Zwar ist es im Prinzip auch möglich nicht-fluoreszierende Farbstoffe zu verwenden, jedoch sind fluoreszierende Farbstoffe bevorzugt, wenn man in Betracht zieht, dass die Filterbahn gewöhnlich nicht transparent genug für eine Beleuchtung vom Boden her ist). Wie ersichtlich, umfasst das Probenexemplar sowohl stäbchenförmige Bakterien als auch Cocci (sphärische) -Bakterien. Darüber hinaus enthält das Probenexemplar auch einiges unregelmäßig geformtes nichtzellulares Material. Sämtliche Bakterien werden durch den ersten fluoreszierenden Farbstoff gefärbt und dies ermöglicht die Zählung sämtlicher Zellen in dem Mikrographen. Wie ersichtlich, dunkeln einige Zellen ab (6 in der spezifischen Probe, bestehend aus zwei stäbchenförmigen und 2 Cocci-Bakterien), was bedeutet, dass sie mit dem für tote Zellen typischen Farbstoff gefärbt sind. Die Gesamtanzahl der Bakterien in dieser Darstellung beträgt 50 und abgeleitet daraus sind 6 Zellen tot, was zu einer Gesamtanzahl von 44 lebenden Mikroorganismenzellen führt. Hieraus ist es möglich die Konzentration der lebenden Zellen in der Probe zu berechnen.
Von den lebenden Zellen sind einige pathogen und einige, die Gram+ stäbchenförmige Bakterien sind, nicht-pathogen und somit ist es zur Erzielung einer bessern Einschätzung der infektiösen Belastung der Probe notwendig, die Anzahl derartiger nicht-pathogener Bakterien von der Gesamtanzahl abzuziehen. Dies wird durchgeführt durch Bewertung des inkubierten Probenexemplars mit einem Reagenzsystem R₂ die Darstellung einer Mikrographik eines derartigen Urinprobenexemplars wird in der 4B dargestellt, Hier wird ebenfalls eine Gesamtanzahl von 50 Zellen dargestellt, von denen 12 dunkler sind, was Mikroorganismen anzeigt, die durch den Gram⁺-Farbstoff gefärbt sind (Gram⁺-Bakterien), Von diesen sind 8 Stäbchen und sind somit nicht pathogene Bakterien. Die dunkel gefärbten Mikroorganismen umfassen tote Mikroorganismenzellen, sowie Gram⁺-stäbchenförmige und Cocci-Bakterien. Somit sind sämtliche hell gefärbten Mikroorganismen pathogen, da sie alle Gram^–-Bakterien sind (die pathogen sind). Alle dunkel gefärbten und stäbchenförmigen Bakterien sind nicht-pathogen, da sie entweder aus Gram⁺ oder toten Zellen bestehen. Im Gegensatz hierzu sind einige der dunkel gefärbten Cocci-Bakterien pathogen und einige sind tote Zellen. Die Anzahl der toten Cocci kann anschließend aus einem Mikrograph des Typs, erhalten in der 4A (4 im speziellen Beispiel) ermittelt werden, was zu einer Gesamtzählung an pathogenen Mikroorganismen von 38 führt.
Es ist offensichtlich, dass die Zahlen als solche nicht repräsentativ sind, sondern die Konzentration der Bakterien in der Originalprobe angeben. Typischerweise werden mehrere Felder für jedes Probenexemplar getestet, um ein genaueres Durchschnittsergebnis zu erzielen.
Die vorstehend umrissene Zählungsmethode, die verwendet wird, um eine Zählung der pathogenen lebenden Zellen zu ermöglichen, kann am besten mit Hilfe der folgenden Formeln (I) und (II) verstanden werden;
Das mit dem Reagenzsystem R₁ inkubierte Probenexemplar im vorliegenden Beispiel, worin die Probe lediglich aus Bakterien besteht, kann die Unterscheidung zwischen 4 Bakteriengruppen ermöglichen:
Lebende Cocci – L_C
Lebende Stäbchen – L_R
Tote Cocci – D_C
Tote Stäbchen – D_R
Die Anzahl der lebenden Bakterienzellen kann nach folgender Formel (I) berechnet werden:
Lebende Zellen = LC + LR (I)
Es ist offensichtlich, dass, falls das Probenexemplar andere Mikroorganismentypen umfasst, z. B, Hefe, diese ebenfalls addiert werden müssen.
Das mit dem Reagenzsystem R₂ inkubierte Probenexemplar ermöglicht die Unterscheidung zwischen 4 Bakteriengruppen.

Gram^–-Stäbchen: G_R

Gram^–-Cocci (gewöhnlich sehr selten in Urin): G_C

Gefärbte Cocci (sowohl Gram⁺ als auch tote Zellen): S_C

Gefärbte Stäbchen (sowohl Gram⁺ als auch tot): S_R
Die Anzahl der pathogenen lebenden Zellen kann anschließend nach folgender Formel (II) berechnet werden:
Pathogene lebende Zellen = GR + GC + SC – DC (II)
In dem vorstehenden Beispiel wird das Probenexemplar so dargestellt, als ob es nur aus Bakterien (sowohl stäbchenförmig als auch Cocci) bestehen würde, Eine klinische Probe enthält aber sehr häufig andere Zellen, wie Epithelzellen, PMN-Zellen, andere Blutzellen usw. die ebenfalls identifiziert und separat gezählt werden können,
Im folgenden wird auf 5 Bezug genommen, die ein aktuelles Beispiel für wie vorstehend gefärbte Probenexemplare zeigt. Die 5A und 5B zeigen ein Probenexemplar, das mit einem allgemeinen Farbstoff gefärbt ist, um eine allgemeine Bakterienzählung zu ermöglichen und mit einem anderen Farbstoff, der lediglich tote Zellen färbt, Dies ermöglicht die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen und das durch den Computer verarbeitete Bild des Probenexemplars wird in den 5A und 5B dargestellt, worin die 5A sämtliche Zellen und die 5B nur die toten Zellen zeigt. (Tatsächlich können die toten. Zellen von den lebenden Zellen aufgrund der Tatsache unterschieden werden, dass sie eine unterschiedliche Farbe haben; um die Betrachtung dieser Zellen zu erleichtern, ist es auch möglich geeignete Filter zu verwenden).
Im folgenden wird auf die 5C und 5D Bezug genommen, wobei die 5C die gesamte Zellpopulation zeigt, wovon alle durch einen allgemeinen Mikroorganismen-Farbstoff gefärbt sind, und in der 5D die Gram⁺-Bakterien sichtbar sind (gefärbt durch einen Gram⁺spezifischen Farbstoff).
Im Anschluss an ein positives Ergebnis für die Infektion wird die Probe dann weiter verarbeitet, um zunächst die Art der Mikroorganismen zu identifizieren und anschließend ihre Empfindlichkeit für antimikrobielle Arzneimittel zu bestimmen (Blöcke 33 und 34 in 2). Zunächst wird auf die 6 Bezug genommen, die eine schematische Darstellung der Methode zur Identifizierung des Typs der Mikroorganismen in der Probe ist. Im Anschluss an die Zählungsstufe wird eine Zählung der Mikroorganismen-Konzentration in der Originalprobe erhalten. Zur Identifizierung, sowie zur Bewertung der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen antimikrobielle Arzneimittel ist es bevorzugt mit einer bestimmten optimalen Konzentration von Mikroorganismen in einer Probe zu beginnen, z. B, etwa 10⁵ Zellen/ml. Zu diesem Zweck wird die Originalprobe 70 zuerst verdünnt unter Erzielung einer verdünnten Probe 71 , wobei das Ausmaß der Verdünnung von den Zählungsergebnissen abhängt. Mehrere Probenexemplare, z. B, von jeweils etwa 30 μl, werden anschließend in jeweils eine von mehreren Kammern 82 einer Mehrkammerplatte 84 eingefüllt (die Platte 84 kann die gleiche Platte wie 48 in 3 sein). In jede Kammer wird anschließend einer von mehreren monoklonalen; Antikörpern, Ab₁... Ab_n, eingebracht, die jeweils spezifisch für eine Mikroorganismen-Klasse sind. Beispielsweise gehören fast sämtliche Mikroorganismen, die in Urin gefunden werden, zu einer von etwa 15 Spezies und zur Identifizierung ob die Mikroorganismen in einer Probe zu einer dieser Spezies gehören, wird anschließend eine entsprechende Anzahl von 15 verschiedenen monoklonalen Antikörpern jeweils in eine der Kammern eingeführt (wobei in diesem Falle n = 15). Die monoklonalen Antikörper können ursprünglich mit einem Marker konjugiert sein, z. B, einem fluoreszierenden Farbstoff jedoch sind die Antikörper vorzugsweise an ein Glied eines Bindungspaares, z. B. Biotin konjugiert und können dann spezifisch an ein anderes Glied des Paares, z. B. Avidin, binden.
Die Platte mit dem Probenexemplar wird anschließend ausreichend lang inkubiert, um die spezifische Bindung der monoklonalen Antikörper an die Mikroorganismen zu ermöglichen, z. B, etwa 30–60 Minuten bei 37°C, worauf, falls die Antikörper nicht ursprünglich markiert waren, der Markierungskomplex, z. B. Avidin, konjugiert an eine Fluoreszenz-Markierstelle, z. B. Fluorescein-iso-thiocyanat (FITC) zugesetzt wird. Nach einer kurzen Inkubationsperiode von einigen Minuten wird die Probe filtriert, wobei die nicht an Mikroorganismen gebundenen Antikörper, sowie der fluoreszierende Markierungskomplex durch die Membranen filtriert werden und die Mikroorganismen auf dem Filter 86 zurückgehalten werden (das Filter kann hier wieder Teil einer Filtereineit ähnlich wie in 3 sein). Das Filter wird anschließend einer mikroskopischen Analyse, ähnlich der wie für die Zählung (3) unterzogen, um die gefärbten Mikroorganismen zu identifizieren. Die Identifizierung der gefärbten Mikroorganismen in einem Probenexemplar bedeutet dann das Vorhandensein dieser Mikroorganismen in der Originalprobe, Die 5 veranschaulicht die erhaltenen positiven Ergebnisse für Ab₁ und Ab_n–1 , was bedeutet, dass die entsprechenden Mikroorganismen in der Originalprobe existieren, hier identifiziert als M.O.₁ und M.O._n–1, (Beispielsweise kann M.O.₁ E. coli und M.O._n–1 Staphylococcus sein).
Im folgenden wird auf 7 Bezug genommen, die erneut schematisch die Methode zur Bestimmung der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen antimikrobielle Mittel zeigt. In diesem speziellen Beispiel wird die Empfindlichkeit gegen eine Reihe derartiger Mittel (6 im speziellen Beispiel), markiert als A_a–A_f, getestet.
In einer ersten Stufe wird die Originalprobe 90 verdünnt unter Bildung einer verdünnten Probe 92 aus der Probenexemplare dann in sieben Kammern 94 einer Mehrkammerplatte 96 verteilt werden, (Die Platte 96 kann wieder ähnlich der Platte 48 in 3 sein). Die erste Kammer, 94', dient als Kontrolle und in diese Kammer wird ein Kontrollmedium gefügt, dem keinerlei antimikrobielles Arzneimittel zugefügt wurde. Zu jeder der anderen sechs Kammern 94" wird ein Medium gefügt, das jedes der sechs zu untersuchenden antimikrobiellen Mittel, A_a–A_f enthält.
Die Mehrkammerplatte mit den Proben wird anschließend inkubiert, z. B. etwa 90–120 Minuten bei 37°C. Zu diesem Zeitpunkt erhält man die Ergebnisse aus dem Identifizierungsverfahren (erhalten wie in 4 dargestellt), das gleichzeitig mit Probenexemplaren erhalten aus der gleichen verdünnten Probe durchgeführt wurde. Diese Ergebnisse geben unter anderem eine Information darüber, ob die erhaltene Probe vorwiegend eine einzige Mikroorganismen-Population enthielt oder ob eine gemischte Population vorlag, die mehr als einen Mikroorganismustyp enthielt. In diesem speziellen veranschaulichenden Beispiel zeigen, wie bereits vorstehend erwähnt, die Ergebnisse die Anwesenheit einer gemischten Kultur, die die Mikroorganismen M.O₁ und M.O_n–1 enthielt.
Falls die Ergebnisse zeigen, dass die Probe eine Population einer einzigen Mikroorganismen-Spezies enthält, wird ein Reagenzsystem, das einen Farbstoff, der allgemein Mikroorganismen färbt, in jede der Kammern verteilt. Wenn allerdings, wie dies in diesem Beispiel der Fall ist, gefunden wird, dass die Probe eine gemischte Population von Mikroorganismen enthält, werden sowohl ein allgemeiner Farbstoff (G-MO) und ein Spezies-spezifischer Farbstoff, z. B. ein monoklonaler Antikörper, in jede der Kammern 94' und 94'' gefügt. Wenn die Probe mehr als zwei Mikroorganismen-Spezies enthält, werden weitere Mikroorganismen-spezifische Farbstoffe zugesetzt, wobei die Anzahl der für Mikroorganismen spezifischen Farbstoffe um eines weniger ist als die Gesamtanzahl der Mikroorganismen in der Probe (im Falle von beispielsweise drei Mikroorganismen werden zwei für Mikroorganismen spezifische Farbstoffe und ein allgemeiner Farbstoff zugefügt).
In der nächsten Stufe werden anschließend an die Inkubation während ausreichender Zeit, um eine Färbung der Mikroorganismen zu ermöglichen, die Probenexemplare durch das Filter 98 filtriert, in gleicher Weise wie die in den 3 und 6 beschriebenen Filtration und das auf dem Filter enthaltene teilchenförmige Material, welches die gefärbten Mikroorganismen darstellt, wird anschließend einer mikroskopischen Analyse unterzogen.
Das Reagenziengemisch kann nunmehr einzeln jede Mikroorganismen-Population identifizieren und klassifizieren, In dem speziellen Beispiel werden sowohl MO₁ als auch MO_n–1 die in der Probe vorhanden sind, durch den allgemeinen Farbstoff, G-MO, gefärbt, wohingegen die Mikroorganismus-Population MO₁ auch durch den für Mikroorganismen spezifischen Farbstoff gefärbt wird. So gehören Mikroorganismen, die beide Farbstoffe aufweisen, zu einer Klasse und die Mikroorganismen, die lediglich einen Farbstoff aufweisen, gehören zu einer anderen Klasse. In gleicher Weise ist es auch möglich auf diese Weise mehr als zwei Klassen von Mikroorganismen zu identifizieren, Es ist jedoch ersichtlich, dass es für eine derartige differentielle Färbung notwendig ist, dass jedes Färbemittel vom allgemeinen Färbemittel verschieden ist und eine unterschiedliche Farbe an den Mikroorganismus verleiht. Typischerweise können 4–5 verschiedene Reagenzien gleichzeitig verwendet werden.
Die Mikrographie jedes Probenexemplars wird anschließend analysiert und mit der Kontrollprobe verglichen. Ein Parameter, der analysiert wird, ist die Veränderung der Bakterienzählung nach der Inkubation. In vielen Fällen werden die Mikroorganismen, die einem antimikrobiellen Mittel gegen das sie empfindlich sind, ausgesetzt wurden, ihre Proliferation reduzieren oder einstellen. Somit zeigt der Unterschied der Anzahl der Mikroorganismen einer spezifischen Population im Verglich mit der Kontrollprobe die Empfindlichkeit an. Dies kann jedoch aus einer Anzahl von Gründen nicht ausreichend sein. Beispielsweise kann die Wirkung des antimikrobiellen Mittels zeitabhängig sein und kann lediglich nach einer späteren Stufe einen nennenswerten Effekt ausüben, Außerdem kann die Mikroorganismus-Zellkultur Subpopulationen enthalten, die eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegen ein spezielles antimikrobielles Mittel im Vergleich mit der Hauptpopulation aufweisen, sowie Unterschiede der biochemischen Eigenschaften, die sich in Farbänderungen und Farbmustern reflektieren. Somit zieht die Bewertung der Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegen ein spezielles antimikrobielles Mittel auch Betrachtungen verschiedener morphologischer Parameter, wie die Länge, Breite und Gesamtform, ein. Dies wird typischerweise durch ein computerisiertes Analysesystem durchgeführt, wie es in WO 93/21511 beschrieben wird, Allgemein wird, ohne hier ins Detail zu gehen, den verschiedenen Parametern eine Bewertungsskala zugeordnet, z. B. 0,5 für das Ausmaß der Proliferation und 0,5 gleich aufgeteilt in das Ausmaß der Änderung der morphologischen Parameter und die Änderung dieser Bewertung wird anschließend mit einer Kontrolle verglichen und ermöglicht die Bewertung der Empfindlichkeit.
Der Bewertungsmaßstab der jedem Parameter zugeordnet wird, ist bis zu einem gewissen Ausmaß empirisch und hängt von der Art des antimikrobiellen Mittels, von der speziellen Spezies des Mikroorganismus ab und kann dementsprechend eingestellt werden.
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann manuell durchgeführt werden, jedoch ist dies offensichtlich nicht praktisch, Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird sie in einer Vorrichtung durchgeführt, die ein Robotersystem für die Manipulation der Proben, Probenexemplare und Reagenzien umfasst und ein Analysensystem auf Computerbasis, gekoppelt mit einem Mikroskop, umfasst, Eine für die Durchführung der erfindungsgemäßen Methoden geeignete Vorrichtung wird in der 8 dargestellt, Diese allgemein als 100 bezeichnete Vorrichtung umfasst einen Trägerrahmen 102, der ein elektronisches Kontrollmodul 104 aufnimmt, einen Computer 106 und einen Vakuumbehälter 110. Der Trägerrahmen stützt darüber hinaus ein vierachsiges Robotersystem, das allgemein als 112 bezeichnet wird, das einen Manipulierkopf 114 umfaßt, der eine Bewegungsfreiheit in den Richtungen X, Y und Z mittels Führungsschienen 116, 118 bzw. 120 aufweist. Der Roboter-Manipulierkopf 114 enthält vier Flüssigkeitsverteiler und Effektoreinheiten 122, die angepasst sind, um mit Einweg-Mikrotips zur Sammlung und anschließenden Verteilung von Probenexemplaren und flüssigen Reagenzien zu kooperieren, Zusätzlich enthält der Roboterkopf auch einen Mehrzweck-Rotationsgreifer 124, der geeignet ist Proben oder Probenexemplare, die Röhrchen sowie Mehrkammerplatten enthalten, zu greifen.
Der Stützrahmen stützt einen Tisch 126, der drei Lagerkästen 128, 130 und 132 hält, die jeweils Einwegtips verschiedener Größen enthalten, von denen einige zur Sammlung und Verteilung von Proben und andere zur Sammlung und Verteilung von Reagenzien dienen. Auf dem Tisch werden auch ein Kasten 134, der zahlreiche Glasfläschchen für die Herstellung und Aufnahme von verdünnten Urinproben hält, sowie Kästen 136 und 138 gehalten, die Glasfläschchen enthalten, die flüssige Reagenzsysteme enthalten, Auf den Tisch wird auch eine Box 140 gehalten, die mehrere Glasfläschchen enthält, die ihrerseits die gesammelten Urinproben enthalten, Die Vorrichtung umfasst darüber hinaus einen Abfalleimer 142 für die Aufnahme von gebrauchten Tips, Fläschchen, Platten usw.
Die Vorrichtung hat außerdem eine Bühne 144, die mehrere Mehrkammerplatten 146, einen auf etwa 37°C eingestellten Inkubator 148, eine Reihe von Medium-Verteilern 149, die von dem Roboterkopf zur Verteilung des Mediums manipuliert werden können, eine Bühne 150 zum Halten der Filtereinheiten 151 , eine Filtrationsstation 152 zum Filtern der in den Platten 146 erhaltenen Proben durch das Filter der Filtereinheiten 151 und eine Mikroskopeinheit 154, welche ein Fluoreszenz-Beleuchtungssystem 156 und eine Proben-Besichtigungsstufe 158 aufweist, mit einer integralen Bildaufnahmeeinrichtung, die bei dieser speziellen Ausführungsform eine Videokamera darstellt, die mit dem Computer verbunden ist, der die Bildanalyse durchführt, hält, Auf dem Tisch 126 wird darüber hinaus eine Kassetten-Füllstation 160 gehalten.
Beim Betrieb entnimmt der Roboterkopf 114 mittels seiner Greifer 124 eine der Platten 146 und bringt sie in die Kassetten-Füllstation 160 ein, Anschließend füllt der Roboterkopf mittels der Verteiler 122 flüssige Proben und Reagenzien in die verschiedenen Kammern der Platte 146 ein und anschließend an ihr Auffüllen wird die Platte typischerweise in den Inkubator 148 eingesetzt. Nach der Inkubation entnimmt der Roboterkopf 114, wiederum mittels seiner Greifer 124, die Platte 146 aus dem Inkubator, plaziert sie auf einen Träger 160 und zieht anschließend eine Filtereinheit 151 heraus und setzt sie auf die Oberseite der Platte 146. Der Greifer, der auch um seine horizontale Achse rotieren kann, ergreift dann die Anordnung, die die Platte und die Filtereinheit enthält und dreht sie und plaziert diese Anordnung in die Filtrationseinheit zur Filtration. Die verbrauchte Platte 146 wird anschließend in den Abfalleimer 142 verworfen und das Filter wird zum Mikroskop 154 zur Betrachtung transportiert. Anschließend an das Betrachten wird die Filtereinheit ebenfalls verworfen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung
BEISPIELE
Beispiel 1: Screening einer Urinprobe zur Feststellung von Mikroorganismen-Zählung
Materialien:
Alle fluoreszierenden Materialien, die in den nachstehend beschriebenen Färbemischungen enthalten sind, wurden von der Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon, USA) erhalten. Glycerol GR (99,5% minimale Reinheit) wurde von Merck erhalten. Fluoreszierende Perlen (Fluoresbrite plain YG 1,0 μm Mikrosphären) wurden von Polysciences, Inc, (Warrington, PA, USA) erhalten. Fluoreszierende Perlen wurden hergestellt mit einer Endkonzentration von 2,5 × 10^–6% in 0,02% Na-Azid, 10% Glycerin. Zwei Färbereagenzgemische wurden hergestellt, das Färbereagenzgemisch 1 (SRM-1 ) und das Färbereagenzgemisch 2 (SRM-2). SRM-1 ist ein Gemisch, das Endkonzentrationen an Glycerin, SYTO13 und Propidiumiodid von 34,3%, 14,3 μM bzw. 9 μg/ml enthält. SRM-2 ist ein Gemisch, das Endkonzentrationen von Glycerin, SYTO13 und Hexidiumiodid von 34,3 %, 9,9 μM bzw. 7,3 μg/ml enthält.
Zählungsverfahren:
Eine Mittelstrom-Urinprobe wurde in einem Becher erhalten und 180 Sekunden geschüttelt.
2 ml der Urinprobe wurden aus dem Originalprobenbecher entnommen und 30 μl Duplikat-Probenexemplare der Urinprobe wurden jeweils in eine Kammer einer Mikrotiter-Kulturplatte eingeführt.
In die Kammer Nr. 1 , die ein Probeexemplar der Urinprobe enthielt, wurden 70 μl SRM-1 (siehe vorstehend) gefügt und in die Kammer Nr. 2, die das Duplikat-Probeexemplar enthielt, wurden 70 μl SRM-2 (siehe vorstehend) gefügt, 100 μl fluoreszierende Perlen (hergestellt wie vorstehend beschrieben) wurden in jede Vertiefung eingefüllt und die Mikroplatte wurde 60 Sekunden geschüttelt. Anschließend an das Schütteln der Platte wurde der Boden der Kulturplatte, der die Filtermembran trug, auf den Hauptkörper der Kulturplatte aufgesetzt, die Platte wurde umgedreht und es wurde 15 Minuten lang ein Vakuum angelegt, während dem die gesamte Flüssigkeit in der Kulturplatte durch die Membran geführt wurde, wohingegen die gefärbten Mikroorganismen auf der Membranoberfläche zurückgehalten wurden, Der die Membran tragende Boden der Kulturplatte wurde dann einer optischen Analyse in einem Fluoreszenz-Mikroskop unterzogen.
Vier mikroskopische Felder wurden für jeden Ort des Filters analysiert. Die Gesamtanzahl der Mikroorganismen, sowie , die Anzahl der toten Mikroorganismen wurde aus den Probenexemplaren bewertet, die mit dem Färbereagenzsystem Nr. 1 inkubiert waren, Die Anzahl der Gram⁺und Gram^–-Organismen wurde durch Analyse der Ergebnisse von Probenexemplaren bewertet, die mit dem SRM-2 inkubiert wurden, in Kombination mit den Ergebnissen der Kammer Nr. 1 (Anzahl der toten Zellen). Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde die Anzahl der pathogenen Mikroorganismen in der ursprünglichen Urinprobe berechnet. Die Zählungsergebnisse, von 399 Urinprobeexemplaren, die wie vorstehend beschrieben analysiert wurden, wurden mit den Ergebnissen verglichen, die nach Standardmethoden erhalten wurden, die routinemäßig in Kliniken verwendet werden (wie beschrieben von Henry D. Isenberg (Ed.), Clinical Microbiology Procedures Handbook, ASM Press, 1992). Alle Urinproben, die verglichen wurden, enthielten einen Grenzwert von 10⁵ Bakterien/ml und 5 × 10⁵ polymorphonuklearer (PMN) Zellen/ml, Von den 399 Proben, die analysiert wurden, wurden 22,8% der Probeexemplare als positiv mit pathogenen Mikroorganismen infiziert klassifiziert.
Der Vergleich der in den beiden vorstehenden Methoden erhaltenen Ergebnisse ist in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich, bestand eine hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen der erfindungsgemäßen Analysenmethode zur Zählung und der Standardanalysenmethode.
Beispiel 2: Identifizierungsverfahren für Mikroorganismen
In den folgenden Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:
TSB – tryptische Sojabrühe
EDTA – Ethylendiamin-tetraacetat (Natriumsalz)
PBS – 0,1 M Na-Phosphatpuffer pH 7,4, 0,1 5 M NaCl
BSA – Rinderserumalbumin
FITC – Fluorescein-isothiocyanat
TM – Perstorp Biotech Company
PI – Propidiumiodid
Identifizierungsverfahren:
60 μl wurden von jeder untersuchten Urinprobe entnommen und in TSB-Wachstumsmedium entsprechend der Bakterienzählung, bestimmt durch das Zählungsverfahren (Beispiel 1 ) verdünnt, unter Erzielung einer Ausgangs-Bakterienkonzentration von weniger oder gleich 5 × 105 Mikroorganismen/ml, Jedes der verdünnten Urinprobeexemplare wurde in zwei Vertiefungen von Mikrotiter-Kulturplatten eingebracht und die Kulturplatten wurden anschließend bei 37°C 45 Minuten inkubiert.
Nach dem Inkubieren wurde ein Permeabilisierungsmittel (Triton X-100, 0,040%), EDTA (20 mM)) in sämtliche Vertiefungen bzw. Kammern in einem Volumen von 20 μl/Kammer gefügt und die Mikrokulturplatten wurden anschließend 15 Sekunden bei 600 Upm gemischt, Die Mikroplatten wurden anschließend 15 Minuten auf 82°C erwärmt, worauf sie 5 Minuten bei Raumtemperatur gekühlt wurden.
Die Duplikat-Probenexemplare, die von jeder Urinprobe erhalten wurden, wurden so aufgeteilt, dass zu einem Probenexemplar in einer Kammer ein Volumen von 20 μl eines Anti-E. coli monoklonalen Antikörpers, konjugiert an Biotin (50 μg/ml, verdünnt in PBS und 5% BSA) zugefügt wurden. Zu dem zweiten Duplikat-Probenexemplar in einer zweiten Kammer wurden 20 μl eines Anti-Klebsiella spp. spezifischen monoklonalen Antikörpers, konjugiert an Biotin (50 μg/ml, verdünnt in PBS, 5% BSA) gefügt.
Die Mikrokulturplatten wurden anschließend erneut wie vorstehend gemischt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Nach Entfernen der Kulturplatten aus dem Inkubator wurden 20 μl eines Gemischs aus spezifischen und allgemeinen Färbemitteln, die FITC-Nutravidin^TM (50 μg/ml in PBS, 5% BSA) enthielten und PI (18,75 μg/ml) zu jedem der Probenexemplare gefügt.
Die Mikroplatten wurden anschließend erneut wie vorstehend gemischt, 30 Minuten bei 37°C inkubiert, worauf ein Volumen von 100 μl 48 Glycerin, 0,1% Triton X-100 zu jeder Kammer gefügt wurde und die Mikroplatten erneut wie vorstehend beschrieben gemischt wurden,
Die Filtermembran wurde anschließend auf die Mikroplatte aufgesetzt, die dann umgedreht und einem Vakuum während 15 Minuten ausgesetzt wurde, wobei die Flüssigkeit von den Mikroplatten durch die Polycarbonatmembranen (0,2 μ) filtriert wurden und die gefärbten Mikroorganismen an der Membranoberfläche gehalten wurden.
Die Membranen wurden anschließend auf ein Fluoreszenz-Mikroskop für die optische Analyse transferiert. Ein positives fluoreszierendes Signal an einer Stelle der Membran, an der ein Probenexemplar mit einem spezifischen Anti-E. coli monoklonalen Antikörper inkubiert wurde, zeigte die Anwesenheit von E. coli-Bakterien in der ursprünglichen getesteten Urinprobe an. In gleicher Weise zeigte ein positives fluoreszierendes Signal an einer Stelle der Membran an der mit einem spezifischen Anti-Klebsiella spp. monoklonalen Antikörper inkubiert wurde, die Anwesenheit derartiger Mikroorganismen in der ursprünglich getesteten Urinprobe an.
Auf der Basis dieser Ergebnisse wurden verschiedene Charakteristika des vorstehenden Identifizierungsverfahrens berechnet und in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt.
Tabelle 2
Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich, korrelierten die nach der vorstehenden Methode erhaltenen Werte mit den Ergebnissen, die für die gleichen Proben durch Standardmethoden erhalten wurden.
Beispiel 3: Empfindlichkeit der identifizierten Mikroorganismen in einer Probe für antimikrobielle Mittel
Materialien:
Alle in dem nachstehend beschriebenen Assay verwendeten Reagenzien waren filtrations-sterilisiert unter Verwendung von 0,2 μm Membranfiltern.
Nährmedium
MHX2 Times 2, Mueller Hinton-Brühe (BBL), hergestellt nach den Instruktionen des Herstellers, eingestellt auf die endgültige empfohlene Kationenkonzentration.
Tryptische Sojabrühe (TSB) wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben.
Antimikrobielle Mittel
Lagerlösungen für die Bearbeitung wurden hergestellt durch Auflösen in Wasser entsprechend den Instruktionen des Herstellers, Die Lagerlösungen zur Bearbeitung und die endgültigen Konzentrationen (in μg/ml) sind im folgenden angegeben:
Fluoreszierender Farbstoff
Der Arbeitslagervorrat des nicht-spezifischen Farbstoffs (NSS) enthielt (in Wasser): Glycerin 40% (Vol/Vol); Propidiumiodid 12,5 μg/ml; Triton X 100 0,01%; 10 mM EDTA-NaCl.
Destilliertes Wasser
Es wurde im Autoklaven sterilisiertes, doppelt destilliertes Wasser (DDW) verwendet.
Empfindlichkeits-Verfahren:
Urinproben von Patienten, die an Infektionen des Harntrakts litten, wurden auf Ausgangskonzentrationen von 5 × 10⁵ Zeilen/ml in sterilem Wasser verdünnt, Ein geeignetes Volumen jeder Urinprobe wurde anschließend mit MHX2 Wachstumsmedium in einem Verhältnis von 3/5 vermischt und 80 μl der resultierenden Suspension wurden in jede separate Kammer von Mikrokulturplatten eingebracht, Jede Probe wurde in vier derartige Probenexemplare aufgeteilt. Zwei Probenexemplare jeder Probe dienten als Kontrollprobenexemplare, denen kein antimikrobielles Mittel zugesetzt wurde. Den beiden anderen Probenexemplaren jeder Probe wurde ein zu untersuchendes antimikrobielles Mittel zugesetzt, in niedriger Konzentration in eine Kammer und in hoher Konzentration in eine zweite Kammer. Der Inhalt jeder Kammer ist in der folgenden Tabelle 3 aufgezeigt.
Tabelle 3
Die Identität jedes der in der Urinprobe enthaltenen Mikroorganismen wurde durch das allgemein in der vorstehenden Beschreibung und speziell im vorstehendeh Beispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt. Basierend auf den Identitätsergebnissen, die nach der vorstehenden Methode erhalten wurden, wurden verschiedene Arten von antimikrobiellen Mitteln zu jeder Probe, wie nachstehend in der Tabelle 4 beschrieben, gefügt.
Tabelle 4
Die Mikrokulturplatten wurden anschließend bei 600 Upm während 1 Minute zentrifugiert, worauf sie 2 Stunden bei 37°C inkubiert wurden,
Im Anschluss an die Inkubation wurden 100 μl des Färbemittels – NSS zu jeder Kammer gefügt und die Mikroplatten wurden erneut 1 Minute bei 600 Upm zentrifugiert und 12 Minuten bei 82°C inkubiert.
Im Anschluss an die letzte Inkubation wurde der flüssige Inhalt der Mikroplatten auf einem 0,2 μm Membranfilter filtriert durch Anwendung eines Vakuums während 5 Minuten, wie vorstehend in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, wobei die Flüssigkeit durch das Filter filtriert wurde und die gefärbten Mikroorganismen auf der Membranoberfläche zurückgehalten wurden.
Die die gefärbten Mikroorganismen enthaltende Membran wurde anschließend einer Analyse unter einem Fluoreszenz-Mikroskop unterzogen. An jeder Stelle der Membran wurden vier verschiedene Mikroskopfelder analysiert und die Empfindlichkeit jedes Mikroorganismus in der Urinprobe gegen jedes antimikrobielle Mittel wurde bestimmt, Die Mikroorganismen wurden als empfindlich, mittel oder beständig gegen jedes getestete antimikrobielle Mittel charakterisiert,
Diese Charakterisierung zog sowohl die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen nach der Inkubation mit dem antimikrobiellen Mittel sowie die Veränderung verschiedener morphologischer Parameter der Mikroorganismen in Betracht.
Die nach der vorstehenden Methode erhaltenen Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen für die gleichen Proben verglichen, die durch Standard-Mikroverdünnungs-Empfindlichkeits-Tests (durchgeführt gemäß den Richtlinien NCCLS) erhalten wurden, Der Prozentsatz der Ergebnisse bei denen eine vollständige Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden vorlag, lag zwischen etwa 80% bis etwa 90% und der Prozentsatz der Ergebnisse, die unter die Definition von sehr großen Abweichungen fallen, lag bei 2% bis etwa 6%.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung des Typs eines in einer flüssigen Probe enthaltenen Mikroorganismus, umfassend: a) die Bereitung mehrerer Exemplare der Probe; b) die Beschaffung mehrerer für Mikroorganismen spezifischer Färbemittel und Zusatz jedes dieser Mittel zu mindestens einem Probenexemplar und anschließend ausreichend langes Inkubieren, um die Einführung des für der Mikroorganismus spezifischen Mittels in die Mikroorganismen oder das Binden an die Mikroorganismen zu ermöglichen; c) das Filtrieren der Probenexemplare durch ein Filter mit Poren in einer derartigen Größe, dass die Mikroorganismen auf dem Filter zurückgehalten werden; d) das Aufbringen des Filters auf die Bühne eines Mikroskops zur Betrachtung durch das Mikroskop; und e) das Feststellen der auf dem Filter zurückgehaltenen Mikroorganismen, wobei die Anwesenheit eines gefärbten Mikroorganismus die Anwesenheit eines speziellen Mikroorganismus für den die Färbung spezifisch ist, in der Probe anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem die für Mikroorganismen spezifischen Färbemittel monoklonale Antikörper umfassen,

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die monoklonalen Antikörper jeweils an einen Teil eines Bindungspaares konjugiert sind, das zur spezifischen Bindung an einen anderen Teil eines Paares geeignet ist, und vor dem Filtrieren der Probenexemplare ein färbender Komplex zugefügt wird, der den anderen Teil eines Bindungspaares, konjugiert an ein Färbemittel, umfasst.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die monoklonalen Antikörper an Biotin konjugiert sind und der färbende Komplex Avidin, konjugiert an einen fluoreszierenden Marker, umfasst.

5. Verfahren zur Bewertung der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus in einer flüssigen Probe gegen ein antimikrobielles Mittel, umfassend: a) Erstellen der Daten des Typs des Mikroorganismus in der Probe nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 4, b) Herstellen mehrerer flüssiger Exemplare der Probe c) Zusatz des antimikrobiellen Mittels zu mindestens einem Probenexemplar und Inkubieren während einer Zeit die ausreicht, dass das antimikrobielle Mittel auf den dafür empfindlichen Mikroorganismus einwirkt, wobei mindestens ein anderes Probenexemplar, das als Kontrolle dient, unter identischen Bedingungen ohne Zusatz eines antimikrobiellen Mittels inkubiert wird; d) Zusatz eines Färbemittels, basierend auf diesen Daten, derart dass wenn diese Daten die Anwesenheit einer einzigen Mikroorganismenpopulation in der Probe anzeigen, ein allgemeiner Organismenstamm zugesetzt wird und wenn diese Daten die Anwesenheit von mehr als einer Mikroorganismenpopulation anzeigen, ein allgemeiner Stamm und ein spezifischer Stamm für jeden Mikroorganismentyp in den Proben, mit Ausnahme von einer, zugefügt wird; e) Filtrieren der Proben durch ein Filter mit Poren, die die Mikroorganismen auf dem Filter zurückhalten; f) Überführen des Filters mit den zurückgehaltenen Organismen auf die Bühne eines Mikroskops zur Betrachtung durch das Mikroskop; und g) Feststellen der Mikroorganismen auf dem Filter und Bewertung ihrer Empfindlichkeit für das antimikrobielle Mittel basierend auf einer Änderung von einer oder mehreren Eigenschaften der Mikroorganismen, umfassend: (ga) die Anzahl der lebenden Mikroorganismen (gb) die morphologischen Parameter der Mikroorganismen; und (gc) die biochemischen Eigenschaften, die sich durch die Farbe oder das Farbmuster in den Mikroorganismen manifestieren.

Verfahren nach Anspruch 5, umfassend das Inkubieren mehrerer Probeexemplare, wobei mindestens eines davon als Kontrolle dient und die anderen jeweils mit einem unterschiedlichen antimikrobiellen Mittel aus einer Reihe von antimikrobiellen Mitteln inkubiert werden, wobei jedes der mikrobiellen Mittel aus der Reihe zu mindestens einem Probenexemplar gefügt wird,

Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, bei dem die untersuchten antimikrobiellen Mittel ausgewählt werden auf der Basis von Daten, die von der Identität des Mikroorganismus in der Probe abhängen.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die flüssige Probe eine Körperflüssigkeit ist.

Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Körperflüssigkeit Urin ist.

System (100) zur Durchführung eines mikrobiologischen Essays, wobei das System (100) umfasst: a) eine Einrichtung zur Aufnahme von Proben (140) zur Einführung der zu untersuchenden Proben; b) eine oder mehrere Einrichtungen (136, 138), die mehrere flüssiges Reagens enthaltende Gefäße umfassen oder zu deren Halterung geeignet sind; c) eine Vorrichtung (144) zur Halterung mehrerer Probenexemplar-Platten (146), wobei jede mehrere Abschnitte zur Halterung von Probenexemplaren aufweist, sowie eine Vorrichtung (150) zur Halterung mehrerer Filtereinheiten (151), wovon jede einen gestreckten Filterbogen umfasst; d) eine Filtriereinheit (152), umfassend eine Vakuumstufe zur Filtration von Probenexemplaren, die in der Probenexemplar-Platte (146) enthalten sind, durch den Filterbogen der Filtereinheit (151); e) eine Inkubatoreinheit (148), geeignet zur Halterung mehrerer Probenexemplar-Platten (146); f) eine Mikroskopeinheit (154), umfassend ein Mikroskop, eine Bühne, geeignet zur Halterung einer Filtereinheit zur Betrachtung von teilchenförmigem Material, das auf dem Filterbogen enthalten ist, durch das Mikroskop, wobei das Mikroskop eine integrale Bildaufnahmeeinrichtung aufweist, die mit einem computerisierten Bildanalysesystem verbunden ist; und g) eine Roboter-Manipulationseinheit (112) mit Greifern (122) zur Halterung und Manipulation von Proben enthaltenden Gefäßen, Probenexemplare halternden Platten und Filtereinheiten und mit Verteilereinrichtungen zur Aufnahme flüssiger Proben, Probenexemplare und Reagentien, und deren Verteilung in Abschnitten der Probenexemplar-Platten.