DE102020119332B3

DE102020119332B3 - Optisches nachweisverfahren

Info

Publication number: DE102020119332B3
Application number: DE102020119332.7A
Authority: DE
Inventors: Pavel Levkin; Lei Wenxi; Anna Popova
Original assignee: Aquarray GmbH
Current assignee: Aquarray GmbH
Priority date: 2020-07-17
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2021-12-02
Anticipated expiration: 2040-07-23
Also published as: WO2022013457A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein optisches Nachweisverfahren, aufweisend die folgenden Schritte:- Bereitstellen eines lichtdurchlässigen/transparenten Tropfenmikroarrays (DMA), aufweisend eine Mehrzahl von Tropfen,- Durchführen einer Reaktion in der Mehrzahl von Tropfen, die eine Änderung einer optischen Eigenschaft des Tropfens zur Folge hat,- Scannen einer optischen Eigenschaft der Mehrzahl von Tropfen des Tropfenmikroarrays, insbesondere der Farbe oder Turbidität, und- Schließen auf die in den Tropfen abgelaufenen Reaktion.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie eine Verwendung nach Anspruch 15.
Beschreibung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein schnelles und kostengünstiges Verfahren bereitzustellen, mit dem beispielsweise Stoffe oder Aktivitäten von Zellen untersucht und nachgewiesen werden können.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, die sich durch diverse Vorteile auszeichnet.
Das Auslesen der Ergebnisse stellt technisch keine hohen Anforderungen. Daher benötigt man bei der Durchführung des Verfahrens keine teuren Gerätschaften, insbesondere keine teure Scantechnik. Das Verfahren kommt ohne Spektrophotometer oder Mikroskope aus.
Das Verfahren kann im Rahmen der personalisierten Medizin verwendet werden, beispielsweise zum Screenen von Wirkstoffen gegen Krebs und zum Screenen von Antibiotika. Es eignet sich insbesondere zum Screenen vor Wirkstoffbibliotheken.
Die Erfindung zeichnet sich unter anderem durch seine Geschwindigkeit aus; nach nur wenigen Minuten liefert das Verfahren ein Ergebnis.
Durch die Simplizität und Schnelligkeit der Durchführung kann die Erfindung beispielsweise in der medizinischen Diagnostik als „bed-side“ oder „bench-to-bed“ Verfahren, also quasi direkt am Patientenbett durchgeführt werden. Das Verfahren kann auch als „point-of-care“-Verfahren durchgeführt werden
Darüber hinaus zeichnet sich das Verfahren durch eine hohe Sensitivität aus, insbesondere gegenüber Testverfahren in Mikrotiterplatten.
Weiterhin ist das Verfahren für viele Applikationen nützlich. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass der Array nach der Durchführung des Verfahrens nach dem Trocknen Form archiviert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein optisches Verfahren, das den Nachweis einer (bio)chemischen Reaktionen in einem Flüssigkeitsvolumen von wenigen Nanolitern erlaubt, ohne dass molekulare Markierungen („label“), die insbesondere bei der Untersuchung biologischer Systeme häufig benutzt werden, verwendet werden müssen. Es müssen auch keine weiteren Detektionsschritte verwendet werden. Das Verfahren kann ohne Fluoreszenz- und Lumineszenz-Detektion durchgeführt werden.
Das Verfahren basiert auf dem Nachweis der Fluoreszenz, einer Änderung der Lichtdurchlässigkeit (Turbidität) oder der Farbe eines Tropfens, der im Rahmen der Erfindung als wässriger Reaktionsraum dient. Der Reaktionsraum kann in einer Ausführungsform Zellen enthalten, die die Reaktion durchführen; Mindestens eine Eigenschaft der Zellen kann untersucht werden.
Die Turbidität A kann wie folgt bestimmt werden: $A = - log ({I/I}_{0})$
mit I: Intensität des Lichts nach dem Austritt aus einem Tropfen des DMA, I₀: Intensität des Lichts vor dem Eintritt in den Tropfen des DMA.
Der Ablauf einer (bio)chemischen Reaktion ändert die Turbidität oder Farbe bzw. Farbtiefe des Tropfens und dies optische Änderung wird qualitativ oder quantitativ beobachtet, die auf die abgelaufenen (bio)chemische Reaktion zurückgeht. Aus der Änderung der Turbidität oder Farbe des Tropfens kann ein Schluss z. B. über das Vorhandensein eines Stoffes, die Aktivität eines Enzyms oder über mindestens eine Eigenschaft einer Zelle gezogen werden.
Das Scannen kann mittels eines einfachen Scanners, insbesondere einer Digitalkamera oder einem handelsüblichen Papierscanner durchgeführt werden. Der Begriff des Scanner umfasst hier das Fotografieren. Sofern die Änderung der Turbidität oder Farbe des Tropfens quantifiziert werden soll, kann hierzu eine handelsübliche Softwäre verwendet werden, wie z. B. ImageJ.
Unter einem Microarray, Tropfenmikroarray (droplet microarray, DMA) oder Array im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man ein festes Substrat mit einer gemusterten Oberflächenschicht, die hydrophile Bereiche, so genannte Spots, umfasst, die jeweils von hydrophoben Bereichen (hydrophobe Grenzen) umschlossen sind. Die Oberflächenschicht kann hierbei beispielsweise in Form einer Folie, eines Films oder einer Beschichtung vorliegen. Das Substrat ist lichtdurchlässig und am bei Raumtemperatur fest. Das feste Substrat kann beispielsweise ausgewählt sein aus Glas, oder Kunststoff. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das feste transparente Substrat Glas. Das feste Substrat hat zweckmäßiger Weise eine flache Oberfläche, ohne Vorsprünge, so dass das Scannen einfacher erfolgen kann, insbesondere mittels eines Papierscanners. Zudem sollte das Substrat dünn sein, insbesondere maximal 1 mm hoch, so dass es mit einem Papierscanners problemlos gescannt werden kann.
Die Herstellung derartiger Arrays ist beispielsweise beschrieben in EP 2 684 601 A , EP 2952 267 A2 und EP 3 205 394 A1 . Derartige Arrays sind von der Aquarray GmbH, Eggenstein-Leopoldshafen, Deutschland erhältlich.
Ein Nachteil derartiger Arrays besteht darin, dass die superhydrophoben Bereiche das Licht stark streuen.
Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein optisches Nachweisverfahren.
Das optische Nachweisverfahren, insbesondere zum Nachweis eines Stoffes oder einer Aktivität (z. B. eines Enzyms oder einer Zelle) weist die folgenden Schritte auf:

- Bereitstellen eines lichtdurchlässigen, also transparenten Tropfenmikroarrays (DMA) aufweisend eine Mehrzahl von Tropfen, die als Reaktionsraum für das Nachweisverfahren dienen,
- Durchführen einer Reaktion in der Mehrzahl von Tropfen, die eine Änderung einer optischen Eigenschaft des Tropfens zur Folge hat bzw. haben kann (für negative Kontrollen wird beispielsweise keine Änderung der optischen Eingenschaft erwartet),
- Scannen einer optischen Eigenschaft der Mehrzahl von Tropfen des Tropfenmikroarrays insbesondere der Farbe oder Turbidität, und
- Schließen auf die in den Tropfen abgelaufene Reaktion. Hierbei wird z. B. auf die Anwesenheit eines Stoffes bzw. dessen Konzentration oder auf die Aktivität, etwa eines Enzyms geschlossen.

Die optische Bestimmung des Verfahrens kann auf unterschiedliche Weis erfolgen. Sie kann kolorimetrisch erfolgen oder die Ermittlung der Turbidität (Trübheit) der Tropfen zum Gegenstand haben.
Der im Verfahren verwendete DMA weist eine Mehrzahl von hydrophilen Spots auf einem superhydrophoben Grund auf. Für das Verfahren sollte der DMA lichtdurchlässig sein. Weiterhin ist es von Vorteil, wenn der DMA, flach ausgeformt ist, also eine Höhe von z. B. 1 mm hat und keine hervortretenden Strukturen aufweist, so dass der gesamte Array plan und somit leicht scannbar ist
Bei dem Verfahren beträgt das Volumen der Tropfen des DMA 5 nl bis 200 nl, insbesondere 20 nl bis 150 nl, bevorzugt ungefähr 90 nl. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens ist das Volumen der Tropfen geringer als 100 nl, insbesondere 90 nl ,80 nl, 70 nl, 60 nl, 50 nl, 40 nl, 30 nl, 20 nl, 10 nl oder 5 nl.
Das Durchführen einer Reaktion umfasst in einigen Ausführungsformend das Hinzufügen eines Farbstoffes in die Mehrzahl von Tropfen. Ein Farbstoff ist insbesondere ein Stoff, der seine Farbe durch eine chemische Reaktion verändert. Der Nachweis beruht dann auf der Farbveränderung.
In anderen Ausführungsformen des Verfahrens ändert sich die Turbidität der Tropfen als Basis für den Nachweis.
Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass der Scanvorgang keine großen Anforderungen erfüllen muss. Der Scan kann mit einem handelsüblichen Dokumentenscanner oder einer Kamera, insbesondere mit einer Digitalkamera erfolgen. Der Scanner ermöglicht bevorzugter Weise die Einstellung der Lichtintensität und der Einstellung der Auslösung, insbesondere bis zu 6400 dpi. Ein Dokumentenscanner wirft Licht auf das zu untersuchende Objekt und lenkt das reflektierte Licht (für gewöhnlich mittels Spiegeln und/oder Linsen) auf ein photosensitives Element, wodurch eine digitale Kopie des gesamten Objektes erstellt wird. Damit ist es konstruktiv viel einfacher als beispielsweise ein Spektrophotometer.
In dem Verfahren kann jede Reaktion verwendet werden, deren Ablauf in einem wässrigen Medium zu einer Veränderung der Farbe, einschließlich der Farbintensität und/oder der Turbidität führt. In einigen Ausführungsformen dient das Nachweisverfahren dem Nachweis von Glucose, von Wasserstoffperoxid oder der beta-Galaktosidase-Aktivität.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens basiert auf Chlorophenol-Rot-Galaktosid (chlorophenol red galactoside, CPRG). Das gelbe CPRG wird durch beta-Galaktosidase in Galaktose und Chlorophenol Rot gespalten. Dadurch kann die Aktivität der beta-Galaktosidase nachgewiesen bzw. bestimmt werden.
Zum Nachweis von Glukose kann im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wie folgt vorgegangen werden. Eine Lösung von Kaliumiodid (KI), Glucoseoxidase und Peroxidase (horseradish peroxidase) wird auf die Spots eines DMA gegeben und getrocknet. Danach wird eine Glucoselösung auf die Spots des DMA gegeben. Nach einigen Minuten der Inkubation kommt es zu einer Farbänderung (gelb/orange).
Das Verfahren kann in einer Ausführungsform zum Nachweis von Wasserstoffperoxid verwendet werden. Eine Lösung von Kaliumiodid (KI) wird auf die Spots eines DMA gegeben und getrocknet. Danach wird eine Wasserstoffperoxidlösung auf die superhydrophilen Spots des DMA gegeben. Nach einigen Minuten der Inkubation kommt es zu einer Farbänderung (gelb/orange), die gescannt und optional quantifiziert werden kann.
In einigen Ausführungsformen des Verfahrens wird die Reaktion mittels einer Zelle durchgeführt. Die Reaktion kann dann in Abhängigkeit mindestens einer Eigenschaft der Zelle eine Änderung einer optischen Eigenschaft der Tropfen zur Folge haben.
Die Erfindung betrifft in einer Ausgestaltung ein in vitro Verfahren zur optischen Bestimmung mindestens einer Eigenschaft einer Zelle. Das Verfahren kann mindestens die folgenden Schritte aufweisen:

Zunächst wird ein Tropfen-Microarray (Droplet Microarray, DMA) bereitgestellt, der eine Mehrzahl von Tropfen mit mindestens einer Zelle aufweist.

In der Mehrzahl der Tropfen des DMA wird einer Reaktion durchgeführt, die in Abhängigkeit der mindestens einen Eigenschaft der Zelle eine Änderung einer optischen Eigenschaft der Tropfen zur Folge haben kann.
Nachfolgend wird ein Scan der optischen Eigenschaften der Mehrzahl der Tropfen durchgeführt, wobei der Scan Eigenschaften wie Farbe, einschließlich Farbsättigung und/ oder Trübheit der Tropfen betreffen kann.
Auf der Grundlage der durch den Scan gewonnen Informationen über die Mehrzahl der Tropfen bzw. die in den Tropen enthaltenen Zellen wird auf (von den gescannten optischen Eigenschaften) auf die Eigenschaft der Zelle geschlossen.
Mittels des Verfahrens können verschiedene Eigenschaften der in den Tropfen enthaltenen Zellen untersucht werden. Mögliche Eigenschaft sind die Viabilität der Zelle oder die Anzahl von Zellen, auch von lebenden bzw. metabolisierenden Zellen in einer Suspension oder Zellkulturflüssigkeit. Wie an anderer Stelle erläutert, kann die Eigenschaft auch nach einer Behandlung der Zellen mit einem Wirkstoff, insbesondere im Rahmen eines Wirkstoffscreenings, ermittelt werden.
In einer Ausführungsform betrifft das Verfahren ein Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Viabilität einer Zelle, das die folgenden Schritte aufweist:

- Bereitstellen eines Tropfen Microarrays (DMA), aufweisend eine Mehrzahl von Tropfen mit mindestens einer Zelle,
- Hinzufügen eines Farbstoffes in dem Tropfen des DMA, wobei der Farbstoff von einer lebenden Zelle in farbändernder Weise metabolisiert wird,
- Inkubieren des Farbstoffes mit der mindestens einen Zelle und
- Scannen der Farbe und/oder Farbsättigung der Mehrzahl von Tropfen und
- Schließen auf die Viabilität der Zelle auf der Grundlage der mittels des Scans erhaltenen Werte.

Bei dem Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Viabilität einer Zelle umfasst das Durchführen einer Reaktion in einer Ausführungsform das Hinzufügen eines Farbstoffes in die Mehrzahl von Tropfen, wobei der Farbstoff von einer lebenden Zelle in farbändernder Weise metabolisiert wird. Beispiele für einen derartigen Farbstoff ist Resazurin (CAS Nr. 550-82-3 ; 62758-13-8 (Natriumsalz)) oder WST-8 (CAS Nr. 193149-74-5).
Das Viabilitäts-Verfahren mit Resazurin und WST-8 ist besonders schnell und sensitiv verglichen mit bekannten Mikrotiterassays. Mit ihm kann eine geringe Anzahl von Zellen nach kurzer Zeit nachgewiesen werden.
In einigen Ausführungsformen des Verfahrens werden Resazurin oder WST-8 zu Tropfen des DMA gegeben, die 40 bis 300 Zellen aufweisen und die Farbstoffe metabolisieren, so dass Farbänderungen erfolgen. Diese können mittels eines Papierscanners gescannt werden.
Die in dem Verfahren in den Tropfen vorhandenen Zellen können eukaryontische Zellen oder prokaryontische Zelle sein. Das Verfahren ist mit 2- und 3-dimensionellen Zellkulturen durchführbar.
Im Falle von prokaryontischen Zellen sind diese in bestimmten Ausführungsformen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp, welche alle für Menschen fakultativ-pathogene Bakterien darstellen. Es können aber auch tierpathogene oder nichtpathogene Bakterien in dem Verfahren untersucht werden.
In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens wird die Anzahl der Zellen in einem Tropfen des DMA als Eigenschaft gemessen. Die Turbidität eines Tropfens steigt mit der Anzahl von Bakterienzelle in einem Tropfen (von lichtdurchlässig bis trüb). Diese Turbidität kann optisch erfasst werden, in einigen Ausführungsformen des Verfahrens sogar mit dem bloßen Auge.
Das Verfahren erlaubt somit die Bestimmung der Zellzahl in einem Tropfen, ohne dass die Bakterien markiert werden müssten oder dass weitere Nachweisschritte erforderlich wären. Daher eignet sich dieser Verfahren beispielsweise zum Screenen von Wirkstoffkandidaten, z. B. für Antibiotika.
Das Verfahren eignet sich insbesondere als Plattformtechnologie für Screeningverfahren, also bei der Suche nach geeigneten Wirkstoffkandidaten aus einer Vielzahl von möglichen Stoffen und Verbindungen. Das Verfahren weist dann zusätzlich den Schritt der Hinzugabe eines zu testenden Stoffes in einen Tropfen des DMA auf, wobei der zu testende Stoff ein Wirkstoff, beispielsweise ein Medikament ist, insbesondere wobei der zu testende Stoff Teil einer Bibliothek von zu testenden Stoffen ist. Somit kann das Verfahren im Rahmen eines Hochdurchsatz-Screenings verwendet werden.
Der in dem Verfahren zu testende Stoff kann unterschiedlicher Natur sein. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens ist der zu testende Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wirkstoff, kleines Molekül (small molecule), Nukleinsäure (insbesondere DNA, RNA, mRNA oder siRNA), Oberflächenmaterialien etc.
Der Wirkstoff kann ein Medikament gegen eine Krankheit beim Menschen oder beim Tier sein, beispielsweise gegen Krebs. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens ist das Medikament ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pazopanib, Vorinostat, Nilotinib und Dasatinib, Cytarabine, Gemcitabine, Etoposide, Tamoxifen, Tretinoin, Dasatinib, Pazopanib, Nilotinib, Gefitinib, Bicalutamide, Vorinostat, Vinblastine, Carboplatin, Oxalitacin, und Alendronate, die alle als Krebsmedikamente bekannt sind.
In bestimmten Ausführungsformen werden eurkaryonte Zellen, beispielsweise eine menschliche Zelllinie, in den Tropfen eines DMA untersucht, wobei Resazurin oder WST-8 eingesetzt werden, welche durch lebende Zellen derart metabolisiert werden, dass es zu einer Farbänderung kommt. Das Scannen der Farbänderung kann mit dem Auge des Betrachters durchgeführt werden. Insbesondere zur Quantifizierung der Farbänderung kann der DMA gescannt werden, z. B. mittels eines handelsüblichen Papierscanners, gefolgt von der Bestimmung der Farbtiefe. Hierzu kann ein frei erhältliches Programm wie ImageJ verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen werden eurkaryonte Zellen zusammen mit einem Antibiotikum als Wirkstoff untersucht, beispielsweise mit Ciprofloxacin, Vancomycin, oder anderen. In einigen Ausführungsformen können hierzu pro Tropfen 1 bis 100 Zellen eingebracht werden. In Abhängigkeit von der Wirksamkeit des Antibiotikums ändert sich die Turbidität der Tropfen. Nach dem Trocknen des DMA kann die Turbidität z. B. mittels einer Digitalkamera bestimmt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Verwendung eines DMA in einem optischen Nachweisverfahren, insbesondere in einem optischen biologischen oder medizinischen Verfahren, insbesondere in einem Verfahren zur optischen Bestimmung mindestens einer Eigenschaft einer Zelle der hier beschriebenen Art.
In einer Ausführungsform betrifft die Verwendung einen DMA, der eine optische Auswertung erlaubt, insbesondere auf Basis der Turbidität oder der Farbe bzw. Farbtiefe der auf dem DMA untersuchten Tropfen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit zur Durchführung eines zur optischen Bestimmung mindestens einer Eigenschaft einer Zelle der hier beschriebenen Art. Ein derartiger Kit weist in einer Ausführungsform einen Träger für einen Tropfen-Microarray (oder einen Tropfen-Midcroarray) der hier beschriebenen Art und mindestens einen Stoff auf, der von einer lebenden Zelle in farbändernder Weise metabolisierbar ist.
Figuren

1. Schematische Darstellung des Mechanismus des Resazurin beziehungsweise WST-8 Viabilitätsassays und des Workflows des kolorimetrischen Verfahrens auf der Tropfenmikroarray (DMA) Plattform. (a) Beispiele von Arrays repräsentiert durch einen 3x3 Array von 250 nL Tröpfchen innerhalb hydrophiler Rechtecke mit einer Seitenlänge von 1 mm umgeben von einem superhydrophopen Hintergrund. Maßstableiste: 0,5 mm. (b) Der Workflow des kolorimetrischen Verfahrens auf der DMA Plattform.
2. Kolorimetrische Analyse auf dem Chip mit einem Zellgradienten unter Verwendung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays im Vergleich zu Calzein AM Färbung, gefolgt von Mikroskopie- und Zellquantifikation. (a) Mikroskopisches Bild des Tropfenmikroarrays mit einem Gradienten von Zellen gefärbt mit Calzein AM (oben); Scans von Tropfenmikroarrays enthaltend einen Gradienten von Zellen gefärbt mit Resazurin (Mitte) und WST-8 (unten). (b) Graph beschreibend die Verteilung der Zellzahl, die mit Calzein AM (links) gefärbt wurde und Graphen, die die gemessene Farbtiefe nach der Färbung der Zellen mit Resazurin (Mitte) und WST-8 (rechts) zeigen.
3. Vergleich der Resazurin und WST-8 kolorimetrischen Viabilitätsassays durchgeführt auf einem Tropfenmikroarray und in einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen. (a) und (b) Die Graphen zeigen einen Vergleich der Signaländerung von WST-8 (a) und Resazurin (b) Viabilitätsassays, die entwickelt wurden unter Verwendung von 300 Zellen pro Vertiefung/ Spot über eine Zeitdauer von 5 Stunden. 300 Zellen wurden in 30 Mikroliter pro Vertiefung ausgesät und in 150 nL pro Vertiefung über Nacht inkubiert. Es wurde das entsprechende Volumen der Viabilitätsassay Reagenz in jede Vertiefung/Spot hinzugegeben und die Absorption bei 450 nm für WST-8 und bei 570/600 nm für Resazurin in einer Platte mit 384 Vertiefungen und die Farbtiefe auf einem Tropfenmikroarray zu den folgenden Zeitpunkten gemessen: 15, 30, 45 Minuten, 1, 2, 3, 4 und 5 Stunden. Fehlerbalken im Graphen stehen für Standardabweichungen. 48 beziehungsweise 32 Wiederholungen wurden für jede Messung des Tropfenmikroarrays und der Platte mit 384 Vertiefungen durchgeführt. (c) und (d) Die Graphen zeigen den Vergleich der Signaländerung von WST-8 (c) und Resazurin (d) Viabilitätsassays, die für die folgenden Zellgradienten entwickelt wurden: 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500. Verschiedene Anzahl von Zellen wurden in 30 µL pro Vertiefung ausgesät und in 150 nL pro Spot über Nacht inkubiert. Das entsprechende Volumen des Viabilitätsassay Reagenz wurde in jede Vertiefung/Spot hinzugegeben und die Absorption bei 450 nm für WST-8 und bei 570/600 nm für Resazurin in den Platten mit 384 Vertiefungen und die Farbtiefe auf dem Tropfenmikroarray nach 5 Stunden und 1 Stunde sowohl in den Platten als auch auf dem Array gemessen. Die Fehlerbalken im Graph repräsentieren die Standardabweichung. 24 beziehungsweise 16 Wiederholungen wurden für jede Messung des Tropfenmikroarrays beziehungsweise der Platte mit 384 Vertiefungen durchgeführt.
4. Vergleich von auf Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays bzw Mikroskopie basierendem Verfahren (read-out) für die Abschätzung einer Antwort auf eine bestimmte Medikamentendosis. (a) Scans von Tropfenmikroarrays enthaltend HeLa Zellen behandelt mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin gefärbt mit Resazurin und WST-8. (b) Der Graph zeigt den Vergleich der Dosisantwort von HeLa Zellen auf Doxorubicin erhalten unter Verwendung von drei verschiedenen Read-out Verfahren, nämlich Mikroskopie, Resazurin und WST-8 (links). Eine Tabelle, die die IC50 Werte von Doxorubicin zusammenfasst, welche unter Verwendung der drei Read-Out Verfahren erhalten wurde, ist rechts gezeigt.
5. Vergleich der Leistung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays mit Mikroskopie basierten Read-outs bei randomisierter Behandlung mit einem Medikament auf einem Tropfenmikroarray. (a) Scans von Tropfenmikroarrays enthaltend HeLa Zellen behandelt mit drei verschiedenen Konzentrationen von Pazopanib in zufällig ausgewählten Stellen gefärbt mit Resazurin und WST-8 (links). Eine Tabelle, die die Konzentrationen von Pazopanib in µM in zufälligen Stellen zeigt entsprechend den Scans auf der linken Seite (rechts). (b-e) Die Graphen zeigen eine dosisabhängige Antwort von HeLa Zellen auf Pazopanib (b), Vorinostat (c), Nilotinib (d) und Dasatinib (e) und eine Tabelle, die die IC50 Werte für die genannten Medikamente zusammenfasst, welche unter Verwendung der drei Read-out Verfahren erhalten wurde.
6. Mittels Chip durchgeführte kolorimetrischer Analyse von Sphäroiden unter Verwendung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays. (a) Scans und mikroskopische Bilder von Tröpfchen enthaltend Sphäroide, die von unterschiedlichen Zellzahlen kultiviert wurden. Verschiedene Anzahlen von HepG2 Zellen wurden in 200 nL pro Spot ausgesät und in einer invertierten „hanging droplet“ Position für 72 Stunden kultiviert. Das entsprechende Volumen von Resazurin (oben) und WST-8 (unten) Viabilitätsassay Reagenz wurden jedem Spot zugegeben und die Farbtiefe wurde nach 40 Minuten Inkubation gemessen. (b) Die Graphen zeigen die Größenverteilung der gewachsenen Sphäroide (Mitte) und die Analyse der Farbtiefe für Resazurin (links) und WST-8 (rechts) Viabilitätsassays. Die Fehlerbalken des Graphen repräsentieren die Standardabweichungen. Im Ganzen wurden 24 Wiederholungen für jede Messung durchgeführt.
7. Optimierung des Bildgebungsprozesses des gesamten DMA unter Verwendung von Lebensmittelfarbe. (a) Eine digitale Fotografie eines 14x14 Arrays von Tröpfchen von 100 nL enthaltend eine serielle Verdünnung von Lebensmittelfarbe. Die Länge der Maßstabsleiste beträgt 2 mm. (b) Der Scan von Tröpfchen mit 100 nL Volumen auf dem DMA enthaltend verschiedene Verdünnungen einer Lebensmittelfarbe. Die Länge der Maßstabsleiste beträgt 0,5 mm. (c) Graphen zeigend die mittleren Grauwerte (links) und normalisierte mittlere Grauwerte (rechts) nach der Bildanalyse von Scans der DMA enthaltend eine serielle Verdünnung der Lebensmittelfarbe. Die Bildanalyse wurde mittels ImagJ Software durchgeführt, welche die Bilder in 8 Bit Bilder umwandelt, bevor die mittleren Grauwerte ermittelt werden. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.
8. Auf einem Array durchgeführte kolorimetrische Analyse von Zellgradienten unter Verwendung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays verglichen mit Calzein AM Färbung mit nachfolgender Zellquantifiation mittels Mikroskopie, (a) Eine Tabelle, die die Verteilung der Zellzahlen über den gesamten Tropfenmikroarray zeigt, (b) Analyse der Farbtiefe über den gesamten Tropfenmikroarray mit einem Zellgrandienten unter Färbung mit Resazurin. (c) Analyse der Farbtiefe des gesamten Tropfenmikroarrays enthaltend einen Zellgradienten mittels Färbung mit Kit-8.
Figure 9. Analyse der Farbtiefe des gesamten Tropfenmikroarrays enthaltend HeLa Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin behandelt wurden und mit WST-8 beziehungsweise Resazurin gefärbt wurden.
Figure 10. Scans von Tropfenmikroarrays enthaltend HeLa Zellen, welche mit verschiedenen Konzentrationen von Dasatinib (a), Pazopanib (b), Nilotinib (c) und Vorinostat (d) behandelt wurden, welche auf dem Mikroarray zufällig verteilt sind und mit Resazurin beziehungsweise WST-8 (links) gefärbt wurden. Tabellen zeigen die Konzentrationen der jeweiligen Medikamente in µM/L in zufälligen Positionen, welche denen des auf der linken Seite befindlichen Scans entsprechen (rechts).
11. Wachstum von P. aeruginosa PAO1 auf einem DMA Träger (a) Schema des Aussäens von Bakterien auf einem DMA. (b) Fotografie von Wassertropfen auf dem hydrophoben Rand (links) und einem hydrophilen Rechteck (rechts) der DMA Oberfläche mit dem entsprechenden statistischen Kontaktwinkel des Wassers. (c) Digitales Bild des DMA, nachdem sich Tropfen des BM2 Mediums gebildet haben. (d) Verteilung des Tropfenvolumens auf dem DMA Träger. (e) Fluoreszenzbilder des P. aeruginosa PAO1 GFP, für 24 Stunden auf dem DMA Träger und auf einer Platte mit 96 Vertiefungen inkubiert. 500 µm, 1 mm und 3 mm sind die Seitenlängen des hydrophilen Rechtecks. (f) Wachstum von P. aeruginosa PAO1 GFP in Platten mit 96 Vertiefungen und auf einer DMA Oberfläche detektiert durch Messung der mittleren Fluoreszenzintensität per Pixel der kultivierten Bakterien. Alle Fluoreszenzintensitätswerte wurden gegen P. aeruginosa PAO1 GFP normalisiert, welches für 24 Stunden in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert wurde. Die Daten werden als Median ± Standardabweichung von drei Experimenten mit jeweils drei Wiederholungen gezeigt. P-values <0.05 wurden als statistisch signifikant angesehen, (g) Bakteriendichte in Platten mit 96 Vertiefungen und auf der DMA Oberfläche nach einer Inkubation für 24 Stunden. Die Daten sind als Median ± Standardabweichung dreier Experimente mit jeweils drei Wiederholungen gezeigt.
12. Tropfenmikroarray als Screeningplattform. (a) Schema des Sandwiching Verfahrens zum Screenen von Antibiotika. (b) Muster gedruckter Antibiotika auf fluorierten Glasträgern. (c) Bild der Grünfluoreszenz der Bakterien auf DMA mit 25 (5 x5) Spots behandelt nacheinander mit Vancomycin (13.5 µmol/l) Ciprofloxacin (40 µmol/l). (d) Scan der Fluoreszenzintensität über die in c) gezeigte gelbe Linie. (e) Bild roter Fluoreszenz der aktiven Bakterien auf einem DMA mit 25 (5 x 5) Spots nacheinander behandelt mit Vancomycin (13,5 µM) oder Ciprofloxacin (40 µM) und gefärbt mit CTC (Ditolyltetrazoliumchlorid) unter Verwendung der Sandwiching Methode. (f) Scan der Fluoreszenzintensität über die in (e) gezeigte gelbe Linie. (g) Digitales Bild der DMA Oberfläche der Bakterien auf dem DMA mit 25 (5 x 5) Spots nacheinander behandelt mit Vancomycin (13,5 µM) oder Ciprofloxacin (40 µM). Die DMA Träger wurden auf schwarzes Papier gelegt. (h) Graustufenscan der in (g) gezeigten gelben Linie. (i.) Rasterelektronenmikroskop (SEM) Bild des transparenten hydrophilen Spots auf der in (g) gezeigten DMA Oberfläche, (j) SEM Bild des in (g) gezeigten Licht undurchlässigen hydrophilen Spots der DMA Oberfläche.
13. (a-e): Minimale Inhibitionskonzentration (MIC) von Ciprofloxacin, Ceftazidime, Tobramycin, Ampicillin und Tetracycline für P. aeruginosa PAO1 GFP getestet in Platten mit 96 Vertiefungen und auf DMA Oberflächen (DMA Träger: ausgelesen durch Fluoreszenzintensität und die Intensitäten wurden in Werte optischer Dichte (OD) konvertiert; Platten mit 96 Vertiefungen: Auslesen durch OD Messungen). Alle Ergebnisse wurden bezogen auf eine Leere Kontrolle (0 µM in Platten mit 96 Vertiefungen (96-well plates)). Die Daten werden als Median ± Standardabweichung dreier Experimente mit jeweils 10 Wiederholungen dargestellt. (f) Zeitverlaufexperiment der antibakteriellen Aktivität von Polymyxin B auf P. aeruginosa PAO1 auf DMA Trägern. Die Daten werden als Median ± Standardabweichung dreier Experimente mit jeweils 5 Wiederholungen dargestellt.
14. Screeningergebnisse der antibiotischen Wirksamkeit P. aeruginosa 49 auf einer DMA Oberfläche und einer Platte mit 96 Vertiefungen. Es wurden zwei Konzentrationen der Antibiotika getestet. Der MIC Wert der Antibiotika wurde der EUCAST Datenbank entnommen. In der Platte mit 96 Vertiefungen wurden die Antibiotika in die bakterielle Suspension transferiert (100 µM pro Vertiefung). Auf der DMA Oberfläche wurden die Antibiotika mittels der Sandwiching Methode in die Tröpfchen der bakteriellen Suspension übertragen. Ursprüngliche bakterielle Dichte: OD₆₀₀ = 0,001. Die Bakterien wurden für 24 Stunden bei 37 °C mit Antibiotika inkubiert. Die antibiotische Aktivität wurde mittels visueller Prüfung der Transparenz der Vertiefungen oder Tropfen evaluiert, wobei Lichtundurchlässigkeit lebende Bakterien anzeigt. Es wurden drei Experimente mit 10 Wiederholungen (10 Vertiefungen und 10 Spots) für jede Konzentration eines Antibiotikums durchgeführt. Das Antibiotikum wurde als wirksam angesehen, wenn ≥ 8 Vertiefungen oder Spots transparent waren. S: sensitiv; NS: nicht sensitiv.

Beispiele
Kolorimetrische Assays auf dem DMA
Die Erfinder haben ein einfaches Verfahren für die Bestimmung eines kolorimetrischen Viabilitätsassays auf einem Tropfenmikroarray (Droplet Microarray, DMA) entwickelt, wobei beispielsweise ein handelsüblicher Dokumentenscanner oder ein mittels einer Smartphone App zur Verfügung gestellten, auf einer Smartphone Kamera beruhenden Bilderfassung zur Auswertung verwendet werden kann. Die DMA Plattform besteht aus einem Array von hydrophilen Spots auf einem superhydrophoben Hintergrund und ermöglicht die Bildung von Arrays von hunderten von separierten, stabilen Tröpfchen mit einem Volumen im Nanoliterbereich, insbesondere von 5 nL bis 200 nL, bevorzugt von 10 nL bis 150 nL. Diese Tröpfchen können zur Kultivierung von lebenden Zellen verwendet werden. Es ist auch möglich, einen derartigen Tropfenmikroarrays zur Durchführung eines sogenannten Hochdurchsatz (High Throughput)-Screenings zu verwenden.
Im Stand der Technik ist beschrieben, dass eine DMA mittels Mikroskopie ausgewertet wird. Dabei erlaubt die Mikroskopie es, detaillierte Informationen über den Status der kultivierten Zellen und verschiedener Zellprozesse zu erfahren. Nachteilig ist jedoch, dass die Anwendung der Mikroskopie in High Throughput Screenings zu langwierigen Laborprotokollen mit großen Datenmengen und komplexer Bildanalyse führt, die ein teures automatisiertes Screeningmikroskop nötig macht, welches nicht in jedem Labor zur Verfügung steht.
Sofern eine detaillierte mikroskopische Analyse der einzelnen Zellen nicht nötig ist hat es sich als ausreichend erwiesen, bei einigen Screeningapplikationen lediglich eine Schätzung der Zellviabilität vorzunehmen.
Resazurin und WST-8 sind Farbstoffe, mittels derer die Vaibilität von Zellen bestimmt werden kann, was für gewöhnlich in Mikrotiterplatten durchgeführt wird (1a). Resazurin ist ein Phenoxazinfarbstoff mit einer dunkelblauen Farbe und einer Absorption bei 600 nm. Er wird durch aerobe Respiration von lebenden Zellen zu Resorophin reduziert, das eine hellrosane Farbe und Absorption bei 470 nm zeigt (1a, oben). WST-8 ist ein farbloses Tetrazolsalz, welches durch lebende Zellen zu dem hellgelben WST-8 Formazan reduziert wird, welches bei 450 nm absorbiert (1a).
In einem ersten Schritt wurde mittels Lebensmittelfarbe, die auf ein DMA gedruckt wurde, ein einfaches bildgebendes Verfahren entwickelt, mittels dessen hochauflösende homogene Farbbilder eines gesamten DMA Arrays erhalten werden können (7). Im Rahmen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann ein handelsüblicher Dokumentenscanner beispielsweise mit einer Auflösung von 6400 dpi und 80% Belichtung verwendet werden (7a, 1a, Bilder der Arrays). Für die Bildanalyse und Schätzung der Farbänderungen in den Tröpfchen wurde ein automatisierter Algorithmus entwickelt. Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 1b gezeigt.
In einem ersten Schritt wird ein Viabilitätsfarbstoff auf den DMA gegeben, welcher Zellen aufweist, die mit den Molekülen einer geeigneten Bibliothek behandelt worden sind (beispielsweise Medikamente, kleine Moleküle, siRNAs, etc.), wobei beispielsweise ein handelsüblicher „non-contact Low Volume Dispenser“ verwendet wird (1b Schritt 1). Das Verteilen von 100 nL Farbstoff über den ganzen Array dauert ungefähr eine Minute. In einem zweiten Schritt wird der DMA in einem Zellkulturinkubator für 20 Minuten inkubiert, sodass die Zellen den Viabilitätsfarbstoff metabolisieren können. In einem dritten Schritt wird der DMA gescannt, beispielsweise mittels eines handelsüblichen Dokumentenscanners, was mit der nötigen Auflösung ungefähr 6 Minuten dauert. In einem vierten Schritt erfolgt die Analyse des Arrayscans mittels eines automatisierten Algorithmus, welcher ungefähr zwei Minuten pro Scan in Anspruch nimmt. Somit ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren innerhalb von nur ungefähr 30 Minuten durchzuführen.
Um zu zeigen, dass das Verfahren unter Verwendung verschiedener Viabilitätsfarbstoffe funktioniert, wurden sowohl Resazurin als auch WST-8 zur Abschätzung der Zellviabilität verwendet, wobei ein Gradient von Zellen mit 0, 40, 80, 120, 160, 200, 250 und 300 Zellen pro Spot in 150 nL Tröpfchen auf dem DMA, wie in 2a gezeigt, aufgebracht wurden und über Nacht inkubiert wurden. Danach wurden 100 nL Resazurin oder WST-8 Farbstoff über den gesamten DMA verteilt, in einem Zellkulturinkubator für 20 Minuten inkubiert und unter Verwendung eines handelsüblichen Dokumentenscanners gescannt (2a). Ein Kontroll DMA wurde mittels Calzein AM gefärbt, mikroskopisch ausgewertet und die Anzahl lebender Zellen bestimmt (2a). Die Scans wurden mittels eines Algorithmus ausgewertet, welcher jeder Probe eine Zahl zugewiesen hat, die als Farbtiefe für jeden Spot bezeichnet wird. Wie in 2b gezeigt wurde ein Gradient der Farbtiefe sowohl für Resazurin als auch für WST-8 Viabilitätsfarbstoff erhalten (2b, Mitte und rechts), was dem Gradienten der berechneten Calzein positiven Zellen entspricht (2b, links). Der Low Volume Dispenser, welcher für das Aussäen der Zellen verwendet wurde, zählt die Zellen nicht, sodass eine Verteilung der Zellzahl pro Spot erhalten wurde (2b, links). Dies zeigt sich in der Verteilung der Daten für jede Zellzahl des Gradienten, welche sich sowohl für die kolorimetrischen Assays als auch für die Quantifizierung lebender Zellen zeigt (2b). Die Ergebnisse zeigen, dass Resazurin und WST-8 Viablilitätsfarbstoffe für eine leichte und schnelle Abschätzung von Zellzahlen pro Spot eines DMA verwendet werden können, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten werden wie unter Verwendung eines Mikroskops.
Vergleich mit Platten mit 384 Vertiefungen
Als nächstes wurde die Sensitivität und die Inkubationszeit für Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays auf einem DMA mit einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen verglichen. Zunächst wurde untersucht, wieviel Zeit nötig ist, um ein Signal von 300 Zellen auf DMA beziehungsweise Mikroplatten zu erhalten. Wie in den 3a und b gezeigt, war auf einem DMA ein Signal von beiden Farbstoffen bereits nach 5 Minuten Inkubation detektierbar und nach 50 Minuten gesättigt. Demgegenüber dauerte es ungefähr eine Stunde, bis auf einer Platte mit 384 Vertiefungen ein detektierbares Signal vorhanden war, welches selbst nach 5 Stunden der Inkubation nicht gesättigt war (3a und b). Zweitens wurde untersucht, wie groß die minimale Anzahl von Zellen ist, die auf einem DMA beziehungsweise einer Plattform mit 384 Vertiefungen unter Verwendung von Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays detektierbar ist. Dazu wurde ein Zellgradient von Zellen von 100 bis 300 pro Spot/Vertiefung aufgetragen und für 1 Stunde und 5 Stunden auf DMA beziehungsweise Platten inkubiert. Wie in den 3c und d gezeigt, kann das Signal von beiden Viabilitätsfarbstoffen auf dem DMA bereits bei 10 Zellen pro Spot detektiert werden, wobei auf der Platte mit 384 Vertiefungen die Detektion erst mit 25 beziehungsweise 100 Zellen für WST-8 beziehungsweise Resazurin möglich war (3c und d). Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Resazurin als auch WST-8 Viabilitätsassays schneller und sensitiver auf DMA sind als auf Mikroplatten und bereits 10 Zellen nach nur 20 Minuten der Inkubation nachweisbar sind.
Behandlung mit Wirkstoffen wie Medikamenten
Um zu zeigen, dass etablierte Resazurin beziehungsweise WST-8 kolorimetrische Viabilitätsassays verwendet werden können, um Zellviabilität nach der Behandlung mit einem Medikament abzuschätzen, wurden HeLa Zellen mit verschiedenen Konzentrationen des Antikrebsmedikamentes Doxorubicin behandelt (4). Dazu wurden, wie in 4a gezeigt, verschiedene Konzentrationen von Doxorubicin in hydrophile Spots eines DMAvorgedruckt. Dann wurden HeLa Zellen auf die vorbedruckte DMA gebracht und für 24 Stunden inkubiert. Sowohl Resazurin als auch WST-8 kolorimetrische Viabilitätsassays wurden gemäß dem etablierten Protokoll durchgeführt (4a und 9, vormals S3). Die mit kolorimetrischen Methoden erhaltenen Ergebnisse wurden mit denen verglichen, die unter Verwendung einer Färbung erhalten wurde, gefolgt von Mikroskopie, also der normalerweise in Laboratorien zur Abschätzung der Toxizität eines Medikamentes verwendeten Verfahren. Wie in 4b gezeigt, war die mittels aller drei Methoden gemessene Dosisantwort der HeLa Zellen mit IC50 Werten vergleichbar, nämlich 0.5±0.03, 0.7±0.04 und 0.4±0.2 für Mikroskopie, Resazurin beziehungsweise WST-8. Diese Ergebnisse zeigen, dass etablierte kolorimetrische Viabilitätsassays als Verfahren für Wirkstofftoxizität Screening Anwendungen auf einem DMA verwendbar sind.
Im nächsten Schritt wurde geprüft, ob etablierte kolorimetrische Assays als Verfahren in Wirkstoffscreenings verwendet werden können, bei denen verschiedene Konzentrationen der zu prüfenden Verbindungen in zufälligerweise auf dem Array vorgedruckt sind um mögliche Einflüsse der Positionen zu vermeiden, wobei nur 4 Wiederholungen pro Konzentration verwendet werden, wie dies allgemeinhin in dem im Stand der Technik verwendeten Screening Experimenten der Fall ist. Es wurden verschiedene Konzentrationen der Antikrebswirkstoffe Pazopanib, Vorinostat, Nilotinib und Dasatinib auf ein DMA vorgedruckt, wie in den 5a und 10 gezeigt. Nachfolgend wurden HeLa Zellen auf die vorgedruckten Arrays aufgebracht und für 24 Stunden inkubiert. Die Dosisantwort und IC50 Werte, die unter Verwendung kolorimetrischer Assays für jeden Wirkstoff erhalten wurden, wurden mit Mikroskopie-basierten Auswertungsverfahren verglichen. Wie in 5 gezeigt sind die erhaltenen Dosisantwortkurven und die IC50 Werte für alle vier getesteten Wirkstoffe vergleichbar. Dies beweist, dass kolorimetrische Viabilitätsassays in Hochdurchsatzscreening Verfahren verwendet werden können.
3D-Zellkultur
Da das vorliegende Verfahren nicht nur für adhärente Zellen, sondern auch für suspensive Zellen verwendet werden soll, wurden bekannte Protokolle zur Abschätzung der Größe von Sphäroiden getestet, die auf dem DMA gebildet sind. HepG2 Sphäroide werden dazu als „hanging droplet“ Methode auf einem DMA inkubiert. Um einen Gradienten der Sphäroide mit unterschiedlichen Größen auf dem Array zu erreichen, wurden verschiedene Anzahlen von Zellen zwischen 40 bis 300 Zellen pro Spot in Blöcken von 6x14 Spots ausgesät (2a). Danach wurde der DMA mit den Zellen invertiert und auf einer Halterung innerhalb einer Petrischale in einem Zellkulturinkubator inkubiert. Nach drei Tagen der Kultivierung hatten sich HepG2 Sphäroide verschiedener Durchmesser auf der DMA gebildet (6a). Dann wurden Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays gemäß dem etablierten Protokoll mit ansteigender Inkubationszeit mit Reagenzien von 20 bis 60 Minuten durchgeführt (6). Wie in den 6a und b gezeigt, wurde die unterschiedliche Größe der Sphäroid Durchmesser durch die Farbänderung von Resazurin und WST-8 abgebildet. Dieses Ergebnis zeigt, dass Resazurin und WST-8 Viabilitätsassays für Screenings von 3D Zellkulturen verwendet werden können.
Zellkultur
Die humane zervikale Adenokarzinomzelllinie HeLa CCL2 und die humane Leberkrebszelllinie HepG2 wurde in Dulbecco modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden in 10 ml Zellkulturschalen kultiviert und alle 2 bis 3 Tage passagiert.
2D Zellkulturen auf DMA
DMA Platten wurden von der Aquarray GmbH erworben. Die DMA Slides enthielten 672 rechteckige hydrophile Spots im Arrayformat von 14 x 48 mit hydrophilen Spots mit einer Seitenlänge von 1 mm. Vor der Kultivierung von Zellen wurden die DMA Platten mit 70% Ethanol für 5 Minuten sterilisiert gefolgt von einer Trocknung unter sterilen Bedingungen für 15 Minuten. Die Zellen wurden vor dem Aussäen entsprechend dem Standardprotokoll trypsinisiert, gezählt und unter Verwendung von Zellkulturmedium auf die gewünschte Konzentration gebracht. Die Zellen wurden auf die DMA Platte unter Verwendung des low volume non-contact Dispensers I-DOT-One (Dispendix GmbH) in einem Volumen von 150 nL pro Spot ausgesät. Während des Aussäens der Zellen wurde die Feuchtigkeit auf 70 % eingestellt. Die Zellen wurden mittels 8 parallelen Kanälen auf einen DMA ausgesät unter Verwendung von Luftdruck von 150 La, wobei das Verteilen der Zellen auf 672 Spots 44 Sekunden dauerte. Sofort nach dem Auftragen der Zellen wurde der DMA in eine 10 cm Petrischale mit 2 mL Dulbecco's PBS gesetzt und fecht gehalten. Die Petrischale wurde in einen Standardzellkulturinkubator verbracht und die Zellen wurden für 24 Stunden auf dem DMA Slide mit oder ohne zugegebene Verbindungen inkubiert, bevor sie gefärbt wurden.
Resazurin und WST-8 Viabilitätsassay auf dem DMA
Die Färbung wurde durchgeführt durch Verteilung von 100 nL von entweder WST-8 (Kit-8, Dojindo EU GmbH, Deutschland) oder Resazurin (Sigma-Aldrich, Deutschland) direkt in jedes Zellen enthaltende Tröpfchen unter Verwendung eines kontaktlosen Dispensers mit kleinem Volumen, low volume non-contact Dispensers I-DOT-One I-DOT One (Dispendix GmbH). Nach der Zugabe des Reagenzes wurde das DMA in den Zellkulturinkubator gelegt und je nach Experiment zwischen 20 Minuten und 5 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die DMAs mit einem handelsüblichen Papierscanner gescannt, wobei die folgenden Einstellungen verwendet wurden: Farbe: 80%, Licht 6700 dpi. Das Scannen des gesamten Arrays benötigte 6 Minuten.
Mikroskopie
Zur Schätzung der Anzahl von Zellzahlen pro Spot wurden die Zellen mit Calzein AM durch Dispension von 50 nL einer Lösung mit 1,5 µg/mL Calzein AM (Thermo Scientific) in Dulbecco's PBS verteilt, wobei ein I-DOT One dispenser (Dispendix GmbH) verwendet wurde. Danach wurden die Zellen für 15 Minuten in einem Zellkulturinkubator inkubiert, bevor die Bildgebung durchgeführt wurde. Zunächst wurde das gesamte Slide mit zweifacher Vergrößerung mit einem Keyence BZ-9000 Mikroskop (KEYENCE, Osaka, Japan) mikroskopiert. Dann wurde jeder Spot mit zehnfacher Vergrößerung mit einem automatisierten Screeningmikroskop Olympus IX81 Mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) untersucht.
Zur Schätzung der Zellzahl pro Spot nach der Behandlung mit einem Medikament wurden die Zellen mit Hoechst 33342 (Thermo Scientific) gefärbt durch Verteilen von 50 nL der Lösung enthalten 4 µg/mL von Hoechst in Dulbecco's PBS mit einer I-DOT One (Dispendix GmbH). Danach wurden die Zellen für 15 Minuten in einem Zellkulturinkubator inkubiert. Das Bild jedes Spots wurde mittels zehnfacher Vergrößerung mit einem automatisierten Screeningmikroskop Olympus IX81 microscope (Olympus, Tokyo, Japan) erhalten.
Bildanalyse
Die Analyse gescannter Bilder von DMAs, die mit WST-8 oder Resazurin gefärbt wurden, wurde wie folgt durchgeführt. Für jedes Bild wurde die Anzahl der Zeilen und Spalten festgelegt sowie die linke obere Ecke und die untere rechte Ecke und die horizontale und vertikale Position aller Vertiefungen. Die mittlere Position aller Vertiefungen wurde geschätzt und ein Rechteck von 41 x 41 Pixeln, die sich um die zentrale Position befindet, wurde extrahiert. Die Intensität der Farbkanäle wurde kalkuliert und auf [0,1] normalisiert (für violette Vertiefungen wurde das Verhältnis von R-Kanal zu R+G-Kanal berechnet, für graugelbe Bilder wurde der blaue Kanal invertiert). Die Intensitäten wurden innerhalb des betrachteten Rechtecks gemittelt, um eine Intensitätsgröße zu erhalten.
Mikroskopische Bilder wurden unter Verwendung der ImageJ Software analysiert. Zunächst wurde das Bild in ein 8 Bit Bild konvertiert, dann wurde der Threshold per Hand angepasst. Ein „Watershed“ Algorithmus wurde verwendet, um Zellen voneinander zu trennen. Dann wurde die „Analyze particle“ Funktion verwendet, um die Anzahl der pro Spot gefärbten Zellen zu zählen. Die „Batch Macro“ Funktion von ImageJ wurde verwendet, um alle 672 Bilder automatisch zu analysieren.
Resazurin und WST-8 Viabilitätstest in Platten mit 384 Vertiefungen
WST-8 und Resazurin Viabilitätstests auf Platten mit 384 Vertiefungen wurden gemäß Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Zellen wurden per Hand in 30 µL Kulturmedium aussät und für 24 Stunden inkubiert. Viabilitätstests wurden durch Zugabe von 10 µL von entweder WST-8 (Kit-8, Dojindo EU GmbH, Deutschland) oder Resazurin (Sigma-Aldrich, Deutschland) durchgeführt. Nach der Zugabe des Reagenzes wurden die Platten in einem Zellkulturinkubator für 20 Minuten bis 5 Stunden inkubiert, abhängig von der Art des Experimentes. Die Absorption bei 450 nm wurde im Fall des WST-8 und bei 570 und 600 nm für Resazurin gemessen. Für die Analyse wurde die Absorption von Kontrollmedium für jede Vertiefung abgezogen. Für Resazurin wurde die Absorption bei 570 nm von der bei 600 nm abgezogen.
Wirkstoffbehandlung
Die folgenden Wirkstoffe wurden verwendet: Doxorubicin, Pazopanib, Vorinostat, Nilotinib und Dasatinib. Lösungen dieser Wirkstoffe mit einer Konzentratioin von 4 mmol/L wurden in DMSO hergestellt. Danach wurden Vorratslösungen in DMSO hergestellt mit Konzentration von 7,5 µM and 750 µM. Die Wirkstoffe wurden auf sterile und trockene DMAs verteilt und direkt in die hydrophilen Spots mit einem sciFLEXARRAYER S11 Flüssigkeitsdispenser (Scienion, Berlin, Deutschland) aufgetragen. Verteilt für Endkonzentrationen von 0.05 µM - 1 nL, für 0.1 µM - 2 nL, für 0.5 µM - 10 nL, für 1 µM - 20 nL der 7.5 µM Vorratslösung. Für Endkonzentrationen von 5 µM - 1 nL, 10 µM - 2 nL, 25 µM - 5 nL, 50 µM - 10 nL der 750 µM Vorratslösung. 10 nL Konzentration wurden als Kontrolle verwendet. Nach der Verteilung wurden DMA Slides mit vorgedruckten Wirkstoffen unter Vakuum für 2 Stunden getrocknet und am nächsten Tag für Zellexperimente verwendet.
3D Sphäroidkulturen auf DMA
HepG2 Zellen wurden wie beschrieben auf DMAs ausgesät. Direkt nach dem Aussäen wurden die DMAs mit den Zellen einerHalterung in umgekehrter Position auf eine 10 cm Petrischale gesetzt. Die Sphäroide bildeten innerhalb von 72 Stunden sogenannte „hanging droplets“ auf dem DMA bevor sie mit WST-8 und Resazurin gefärbt wurden.
Hefe Östrogen Assay (Yeast Estrogen Assay, YES)
100 nL Probenvolumens wurden auf jeden Spot eines DMA mit runden Spots (Durchmesser d = 900 µm) gegeben. Die Probelösungen bestanden entweder aus entionisiertem Wasser (für UV-freigegebene (UV-released) Verbindungen und negative Kontrollen) oder aus einem wässrigen 17β-Estradiol (17β-Östradiol) Standard mit Konzentrationen von 400 ng/L, 200 ng/ L, 100 ng/L, 40 ng/L, 20 ng/L, 10 ng/L und 5 ng/L. Nachfolgend wurden 50 nL der Hefesuspension zu jedem Spot gegeben und der DMA wurde in einer feuchten Atmosphäre für 24 h bei 30 °C inkubiert. Das LacZ-Substrat Reaktionsgemisch (aufweisend Chlorophenol-Rot-Galaktosid, Chlorophenol Red Galactoside (CPRG)) wurde hinzugegeben (10 nL pro Spot) und die Farbe der Tropfen wurde nach 30 Minuten Inkubations mittels eines Dokumentenscanners gemessen.

Claims

Optisches Nachweisverfahren, insbesondere zum Nachweis eines Stoffes oder einer Aktivität, aufweisend die folgenden Schritte: - Bereitstellen eines lichtdurchlässigen/transparenten Tropfenmikroarrays (DMA), aufweisend eine Mehrzahl von Tropfen, - Durchführen einer Reaktion in der Mehrzahl von Tropfen zur Änderung einer optischen Eigenschaft des Tropfens, - Scannen einer optischen Eigenschaft der Mehrzahl von Tropfen des Tropfenmikroarrays und - Schließen auf die in den Tropfen abgelaufenen Reaktion, wobei - der Tropfenmikroarrays (DMA) eine Mehrzahl von hydrophilen Spots auf einem superhydrophoben Grund aufweist, - das Volumen der Tropfen 5 nl bis 200 nl beträgt, - die optische Eigenschaft des Tropfens die Farbe oder die Turbidität ist, - das Scannen mit einem Scanner, einem Dokumentenscanner oder einer Kamera erfolgt und - das Verfahren ohne Spektrophotometer oder Mikroskop durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Volumen der 20 nl bis 150 nl, insbesondere ungefähr 100 nl beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Durchführen einer Reaktion das Hinzufügen eines Farbstoffes in die Mehrzahl von Tropfen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, wobei die Kamera eine Digitalkamera ist.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, wobei die Reaktion mittels einer Zelle durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Reaktion in Abhängigkeit mindestens einer Eigenschaft der Zelle eine Änderung einer optischen Eigenschaft der Tropfen zur Folge haben kann.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Farbstoff von einer lebenden Zelle in farbändernder Weise metabolisiert wird, insbesondere wobei der Farbstoff Resazurin oder WST-8 ist.
Verfahren nach Anspruch 5 bis 7, wobei die mindestens eine Zelle eine eukaryontische Zelle oder eine prokaryontische Zelle ist, insbesondere eine Säugertierzelle, eine Hefe oder ein Bakterium.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die prokaryontische Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter spp.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, weiterhin aufweisend den Schritt der Hinzugabe eines zu testenden Stoffes in einen Tropfen des Tropfenmikroarrays, wobei der zu testende Stoff ein Wirkstoff, beispielsweise ein Medikament ist, insbesondere wobei der zu testende Stoff Teil einer Bibliothek von zu testenden Stoffen ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der zu testende Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wirkstoff, Medikament, kleines Molekül (small molecule) und Nukleinsäure, insbesondere DNA, RNA, mRNA oder siRNA.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Medikament ein Medikament gegen Krebs ist, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pazopanib, Vorinostat, Nilotinib und Dasatinib, Cytarabine, Gemcitabine, Etoposide, Tamoxifen, Tretinoin, Dasatinib, Pazopanib, Nilotinib, Gefitinib, Bicalutamide, Vorinostat, Vinblastine, Carboplatin, Oxalitacin, und Alendronate.
Verwendung eines Tropfenmikroarrays (DMA) in einem biologischen oder medizinischen Verfahren, insbesondere in einem Verfahren zur optischen Bestimmung mindestens einer Eigenschaft einer Zelle, insbesondere in einem Verfahren nach Anspruch 1 bis 12.