DE60307645T2 - Hoch-durchsatz assay zur messung von zellulären antworten mit hilfe von mikroarrays - Google Patents

Hoch-durchsatz assay zur messung von zellulären antworten mit hilfe von mikroarrays Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Assays, die auf Zellen beruhen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für funktionelle Durchmusterungsassays von zellulären Reaktionen auf einem Chip. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Durchmusterung und die pharmakologische Profilbestimmung von Verbindungen, die eine zelluläre physiologische Reaktion modulieren.
  • In der pharmazeutischen Industrie gibt es wegen der Verwendung kombinatorischer Chemie eine bedeutende Anzahl von Verbindungen, die bei Hinterlegungsstellen für Verbindungen erhältlich sind. Treffer aus diesen Verbindungsbibliotheken werden durch die Verwendung von Hochdurchsatzdurchmusterung (high throughput screening; HTS) identifiziert. Die primäre Funktion von HTS liegt darin, verschiedene chemische Verbindungen einer Hinterlegungsstelle auf Verbindungen gegen eine Vielzahl von Krankheitstargets in vielen verschiedenen biologischen Assays zu testen. Herkömmliche HTS verwenden üblicherweise 96-Loch Mikrotiterplatten. Es besteht ein großer Anreiz in der pharmazeutischen Industrie, diese Mikroplattenassays zu miniaturisieren, um Kosten zu reduzieren, Abfall zu reduzieren und um den benötigten Zeitaufwand zu minimieren. Man hat zwar vom 96-Loch-Format zu höheren Lochdichten wie 384- und 1536-Loch-Formaten gewechselt, aber diese können in Bezug auf die Handhabung von Flüssigkeiten, in Bezug auf das Instrumentarium zum Signalnachweis und in Bezug auf die Assaytechnologie Probleme aufwerfen. Darüber hinaus beinhalten typische Schwierigkeiten, denen man begegnet, wenn man Durchmusterungsassays verwendet, die auf Mikrotiterplatten basieren, z.B. (i) unterschiedliches Wachstum und/oder unterschiedliche Genexpression von identischen Klonen in separaten Löchern der Mikrotiterplatte und (ii) unterschiedliche Stressexposition (z.B. Hitzebehandlung, Feuchtigkeit) über die Platte hinweg.
  • Es wurden Anstrengungen unternommen, um die oben genannten Schwierigkeiten zu lösen. Beispielsweise stellt WO 99/35496 ein Verfahren und einen Apparat für eine Durchmusterung von bioaktiven Molekülen in einem Format hoher Dichte mit einer stark vereinfachten Technik für die Zufuhr der Testverbindung an eine Zellschicht bereit, d.h. ohne die Notwendigkeit einer komplizierten Handhabung von Flüssigkeiten. Mit diesem Verfahren können bis zu 6.144 Testverbindungen gleichzeitig auf Bioaktivität durchmustert werden.
  • Nichtsdestotrotz besteht ein Bedarf nach auf Zellen beruhenden funktionalen biologischen Assays noch höherer Dichte, die auf Grund der Beschränkungen, Mikrolitermengen von Zellen konsistent zuzuführen, ohne die Zellen zu scheren oder Stressreaktionen der Zellen selbst zu aktivieren, was den biologischen Assay stört, immer noch zu den am schwierigsten zu miniaturisierenden Assaytypen gehören.
  • Mit dem Aufkommen von Ansätzen der kombinatorischen Chemie, um pharmakologisch nützliche Verbindungen zu identifizieren, wird immer offensichtlicher, dass ein Bedarf an Verfahren und Apparaten auf Mikroarrayebene besteht, die in der Lage sind, eine Hochdurchsatzcharakterisierung von pharmakologischen Profilen und der entsprechenden Wirksamkeiten der Verbindungen in synthetisierten kombinatorischen Bibliotheken auszuführen.
  • Mikroarrays von lebenden Zellen könnten eine Abkürzung für die Entwicklung von sichereren und besser individualisierten persönlichen Medikamenten und zu einem besseren Verständnis der molekularen Reaktionswege bereitstellen, denen man bei der Funktionsweise von zellulären Organismen begegnet. Beispielsweise hat das Whitehead Institut for Biomedical Research in Cambridge Mikroarrays von lebenden Zellen für die Hochdurchsatzanalyse von Genfunktionen in Säugetierzellen entwickelt (Nature, Bd. 411, 3. Mai 2001). Während diese Technologie hocheffektiv ist, gibt es allerdings eine Anzahl von Beschränkungen in ihrer Verwendung, einschließlich der relativ hohen Mengen an benötigten Reagenzien, von denen eine wesentliche Menge mit dem Array niemals in Kontakt ist und daher verschwendet wird, und einschließlich des Erfordernisses einer beschwerlichen und zeitraubenden Handhabung.
  • US-Patent Nr. 6,103,479 offenbart ein weiteres Beispiel für einen Mikroarray von lebenden Zellen. Die offenbarten miniaturisierten Zellarrays, die durch eine reduzierte Loch- und Arraygröße gekennzeichnet sind, erlauben eine Durchmusterung in einem großen Umfang. Der nicht-poröse Charakter allerdings erlaubt den Zellen nicht, in/auf den Löchern oder den Zellbindungsstellen auf dem Array zu wachsen, um die Streuung unter Standardwachstumsbedingungen zu verhindern, die offensichtlich die einwandfreie Zellprobenunterscheidung stört.
  • Wie in der Fachwelt anerkannt werden wird, besteht ein beständiger Bedarf nach verbesserten Verfahren, welche die zuvor genannten Nachteile überwinden.
  • Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein hocheffizientes und kostengünstiges Verfahren für integrierte Assays, die auf Zellen beruhen, unter Verwendung von Mikroarrays bereitzustellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für Hochdurchsatzassays, die auf Zellen beruhen, bereitzustellen, die minimalen Mengen an Probe und Reagenzien benötigen.
  • Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mikroarrays oder Kits bereitzustellen, um solche Verfahren auszuführen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchmusterung zellulärer Reaktionen von zellulären Bestandteilen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Bereitstellen zellulärer Bestandteile, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Vesikel, Organellen, Vektoren, Viren und ganze intakte lebensfähige Zellen, Säugetierzellen, Insektenzellen, Hefezellen, pilzliche Zellen, Pflanzenzellen und mikrobielle Zellen einschließlich prokaryotischer Zellen, bakterieller Zellen, Mykoplasmen, Gewebeschnitte, fixierter Zellen, und mikroskopische multizelluläre Organismen einschließlich Nematoden und Zebrafisch umfasst, auf der Oberfläche eines festen porösen Metalloxidsubstrats, wobei
    • (i) das feste poröse Substrat gerichtete durchgehende Kanäle besitzt;
    • (ii) das feste poröse Substrat die zellulären Bestandteile auf seiner Oberfläche zurückhält, und wobei
    • (iii) das feste poröse Substrat innerhalb der darin vorhandenen Poren immobilisiert einen Array von Detektormolekülen aufweist;
    • (b) Zufuhr von Testverbindungen an Positionen auf dem Substrat, die den in einem Array vorliegenden Detektormolekülen auf der Oberfläche des festen porösen Substrats entsprechen;
    • (c) Inkubieren der Testverbindungen mit den zellulären Bestandteilen auf der Oberfläche des festen porösen Substrats unter Bedingungen, welche die Induktion zellulärer Reaktionen erlauben;
    • (d) Untersuchen der zellulären Reaktionen; und Identifizierung und Charakterisierung der zellulären Reaktionen, die durch die Testverbindungen induziert werden.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart weiter Verwendungen des oben genannten Verfahrens gemäß der Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Miniaturisierung von Assays, die auf Zellen beruhen, auf Mikroarray-Format bereit, wodurch der Durchsatz erhöht wird, während die Volumina an Reagenzien und Testverbindungen verringert werden.
  • Auf Grund der Durchflusscharakteristika der Vorrichtung, welche in dem Verfahren verwendet wird, stellt das vorliegende Verfahren weiter eine Hochgeschwindigkeits- und effiziente Analyse bereit.
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt eine nicht invasive Kultivierung von Zellen oder zellulären Bestandteilen auf einem Chip, wobei die Schicht unter gleichmäßigen Bedingungen über die Oberfläche des festen Substrats hinweg wächst und wobei die Zellen oder zellulären Bestandteile nur für die Zeit mit dem Kulturmedium in Kontakt sind, die benötigt wird, um eine erwünschte Dichte zu erhalten.
  • Zusätzliche Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden detaillierten Beschreibung dargestellt und teilweise aus der Beschreibung ersichtlich werden, oder sie können durch Ausübung der Erfindung in Erfahrung gebracht werden. Die Ziele und andere Vorteile der Erfindung werden erkannt und durch das Verfahren erreicht werden, das insbesondere in der Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen dargelegt ist.
  • Bevor das vorliegende Verfahren und die in den Verfahren verwendeten Lösungen beschrieben werden, soll man verstehen, dass diese Erfindung nicht auf die beschriebenen besonderen Verfahren, Bestandteile oder Lösungen beschränkt ist, da solche Verfahren, Bestandteile und Lösungen natürlich variieren können. Man sollte auch verstehen, dass die hierin verwendete Terminologie keine Beschränkung darstellen soll, da der Umfang der vorliegenden Erfindung nur von den anhängenden Ansprüchen beschränkt wird.
  • Wenn nicht anders definiert, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähneln oder ihnen gleich stehen, in der Ausübung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien im Folgenden beschrieben.
  • In dieser Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen beinhalten die Singularformen "einer" "eine" "eines" und "der" "die" und "das" auch die Pluralformen wenn es der Kontext nicht deutlich anderweitig vorschreibt.
  • Die Durchführung einer Durchmusterung von vielen Tausenden von Verbindungen erfordert eine parallele Handhabung und Prozessierung von vielen Verbindungen und Reagenzien, die Bestandteile des Assays sind. Standardmäßige Hochdurchsatzdurchmusterungen verwenden Gemische von Verbindungen und biologischen Reagenzien zusammen mit einer Indikatorverbindung, mit denen Lochreihen in standardmäßigen Mikrotiterplatten beladen werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Miniaturisierung im großen Maßstab, umfassend die Verwendung eines festen Substrats, auf das eine Vielzahl von Molekülen in vorbestimmten Bereichen angebracht wird, um einen Mikroarray auszubilden.
  • Es gibt hauptsächlich drei unterschiedliche Bestandteile, die bei den zellulären Arrays gemäß der vorliegenden Erfindung beteiligt sind: zelluläre Bestandteile, Testverbindungen und Detektormoleküle. Darüber hinaus können Zellfängermoleküle als vierter Bestandteil beteiligt sein; diese können z.B. Antikörper sein, um jeweils ein spezifisches Bakterium einzufangen. In Abhängigkeit von der Natur der Fängermoleküle können spezifische Zellen (Bakterien, Pilze, Viren, Mykoplasmen) eingefangen werden. Eine Vielzahl verschiedener Fängermoleküle auf einem Array kann einen zellulären Array bereitstellen, der eine Vielzahl von unterschiedlichen zellulären Bestandteilen umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt einen vielseitigen integrierten Assay bereit, der auf Zellen beruht, wobei eine Anzahl von Testformaten vorgesehen ist.
  • In einem Array von zellulären Bestandteilen werden Inseln verschiedener Zellen in einem Arrayformat auf dem Substrat kultiviert oder darauf aufgebracht. Nachfolgend wird der gesamte Array einer (oder einer begrenzten Anzahl von) Testverbindung(en) ausgesetzt und schließlich einem (oder einer begrenzten Anzahl von) Rezeptormolekül(en) (das/die ggf. in dem Substrat vorliegt/vorliegen) ausgesetzt, falls nötig nach einer Lyse. Solchermaßen erlaubt dieses Testformat die Durchmusterung eines Arrays von verschiedenen zellulären Bestandteilen auf Reaktionen, die von einer bestimmten Testverbindung induziert werden, mit einem bestimmten Detektormolekül. Dieses Detektormolekül kann nach der Inkubation der Testverbindung mit den zellulären Verbindungen bereitgestellt werden, oder es kann mit dem Substrat vor dem Kontakt des Substrats mit den zellulären Bestandteilen eingeführt worden sein. Darüber hinaus kann ein Detektormolekül in die zellulären Bestandteile vor der Exposition gegenüber den Testverbindungen eingeführt worden sein; z.B. kann GFP als eine zelluläre Reaktion exprimiert werden.
  • Zelluläre Bestandteile können auf dem festen Substrat durch Fängermoleküle eingefangen werden, die zuvor auf das feste Substrat aufgebracht wurden.
  • Die Begriffe "Detektormolekül", "Rezeptormolekül" und "Diskriminatormoleküle" können gegeneinander austauschbar verwendet werden und bezeichnen im Kontext der vorliegenden Erfindung Moleküle, die den Nachweis einer zellulären Reaktion erlauben. Ein Detektormolekül kann auch durch Konversion einer Testverbindung erzeugt werden.
  • In einem Testsubstanz-Array wird eine homogene Schicht eines zellulären Bestandteils lokal, in vorbestimmten Bereichen, durch in Kontakt bringen mit verschiedenen Testsubstanzen behandelt. Die Testsubstanz oder Testverbindung kann auch in dem Substrat vorliegen, bevor die zellulären Bestandteile aufgebracht werden, oder die Testsubstanz oder Testverbindung kann in den Zellen vorliegen. Nach der Behandlung können die zellulären Reaktionen mit einem bestimmten Detektormolekül nachgewiesen werden. Das Detektormolekül kann nach der Inkubation der Testverbindung mit den zellulären Verbindungen bereitgestellt werden, oder es kann im Substrat vor dem Kontakt des Substrats mit den zellulären Bestandteilen eingeführt worden sein. Das Detektormolekül kann auch in die Zellen eingeführt worden sein, beispielsweise um GFP-exprimierende Zellen zu erhalten.
  • In einem Detektorarray wird eine Reihe von verschiedenen Rezeptor- oder Detektormolekülen mit einer homogenen Schicht von zellulären Bestandteilen in Kontakt gebracht, die mit einer bestimmten Testverbindung (oder mit einigen wenigen kurz nacheinander) behandelt werden.
  • Zelluläre Reaktionen werden überwacht, indem Ausscheidungsprodukte durch die Rezeptormoleküle nachgewiesen werden oder indem intrazelluläre Produkte durch die Bindung an die Rezeptormoleküle nach Lyse der zellulären Bestandteile nachgewiesen werden. Es können auch Zelltod und morphologische Veränderungen nachgewiesen werden.
  • Die Natur und Geometrie des festen Substrats wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich, unter anderem, dem Typ von Array und der Art der Anbringung. Im Allgemeinen kann das Substrat aus jedem beliebigen Material bestehen, das eine Zellkultivierung und Immobilisierung der erwünschten Moleküle erlaubt und das unter den Bedingungen, die für die Durchführung des auf Zellen beruhenden Assays verwendet werden, nicht schmelzen oder anderweitig wesentlich degradieren wird. Darüber hinaus sollte, wo eine kovalente Immobilisierung in Betracht gezogen wird, das Substrat mit reaktiven Gruppen aktivierbar sein, die in der Lage sind, eine Bindung, die kovalent sein kann, mit dem zu immobilisierenden Molekül auszubilden.
  • Im Stand der Technik wurde eine Anzahl von Materialien beschrieben, die für die Verwendung in Substraten, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, geeignet sind. Beispielhafte geeignete Substrate in der vorliegenden Erfindung umfassen Materialien, die acrylische, Acrylamid-, Methylen-bis-Acrylamid-, Dimethylaminopropylmethacrylamid-, Styrolmethylmethacrylat-Copolymere, Ethylen/Acrylsäure, Acrylnitril-Butadienstyrol (ABS), ABS/Polycarbonat, ABS/Polysulfon, ABS/Polyvinylchlorid, Ethylenpropylen, Ethylenvinylacetat (EVA), Nitrocellulose, Polyacrylnitril (PAN), Polyacrylat, Polycarbonat, Polybutylenterephthalat (PBT), Polyethylenterephthalat (PET), Polyethylen (einschließlich Molekulargewichtsgrade niedriger Dichte, linearer niedriger Dichte, hoher Dichte, quervernetzte und ultra-hohe Molekulargewichtsgrade), Polypropylenhomopolymer, Polypropylencopolymere, Polystyrol (einschließlich der Grade für Allgemeinzwecke und hochqualitative Grade), Polytetrafluorethylen (PTFE), fluoriertes Ethylenpropylen (FEP), Ethylen-Tetrafluorethylen (ETFE), Perfluoralkoxyethylen (PFA), Polyvinylfluorid (PVF), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polychlortrifluorethylen (PCTFE), Polyethylen-Chlortrifluorethylen (ECTFE), Polyvinylalkohol (PVA), Siliconstyrolacrylnitril (SAN), Styrolmaleinanhydrid (SMA) und Glas beinhalten. Weitere beispielhafte geeignete Substrate umfassen Gemische von zwei oder mehr der oben genannten Materialien.
  • Weitere beispielhafte geeignete Materialien für die Herstellung von Substraten in der vorliegenden Erfindung beinhalten Metalloxide. Metalloxide stellen einen Träger bereit, der sowohl eine hohe Kanaldichte als auch eine hohe Porosität aufweist, was Hochdichtearrays erlaubt, die unterschiedliche erste Bindungssubstanzen pro Einheit der Oberfläche für die Probenauftragung umfassen. Darüber hinaus sind Metalloxide für sichtbares Licht hoch durchlässig. Metalloxide sind relativ billige Substrate, die keine Verwendung irgendeiner üblichen Mikrofabrikationstechnologie benötigen und die eine verbesserte Kontrolle über die Flüssigkeitsverteilung über der Oberfläche des Substrats ermöglichen, beispielsweise eine elektrochemisch hergestellte Metalloxidmembran. Metalloxidmembranen mit durchgehenden gerichteten Kanälen können mittels elektrochemischer Ätzung einer Metallplatte hergestellt werden. Metalloxide, die in Erwägung gezogen werden, sind unter anderem Oxide von Tantal, Titan und Aluminium sowie Legierungen von zwei oder mehr Metalloxiden und dotierte Metalloxide und Legierungen, die Metalloxide enthalten. Die Metalloxidmembranen sind transparent, insbesondere wenn sie nass sind, was Assays unter Verwendung verschiedener optischer Techniken erlaubt. Solche Membranen besitzen gerichtete durchgehende Kanäle mit gut kontrolliertem Durchmesser und nützlichen chemischen Oberflächeneigenschaften. WO 99/02266, welche die Verwendung von AnoporeTM beschreibt, ist diesbezüglich als Beispiel zu nennen und ist insbesondere in der vorliegenden Erfindung in Bezug genommen.
  • Demgemäß ist in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das feste Substrat ein poröser fester Träger.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das feste Substrat, wie es in den Schritten des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ist, ein fester Durchflussträger.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das feste Substrat, wie es in den Schritten des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ist, ein Metalloxidsubstrat.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das feste Substrat, wie es in den Schritten des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ist, ein Aluminiumoxidsubstrat.
  • Der Begriff "zelluläre Bestandteile", wie er durchwegs in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet ganze intakte lebensfähige Zellen, einschließlich z.B. prokaryotische Zellen; sowie Zellbestandteile wie Vesikel, Organellen und Vektoren; sowie geschnittenes Material wie Gewebeschnitte; sowie fixierte Zellen; sowie mikroskopische multizelluläre Organismen wie z.B. Nematoden, Zebrafische. Zelluläre Bestandteile können auch Viren, Bakterien und Mykoplasmen sein.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Oberfläche des festen Substrats durch direkte Aufbringung darauf mit einem Inokulum von zellulären Bestandteilen in Kontakt gebracht werden. Das Inokulum kann eine flüssige Formulierung sein, welche die Bestandteile und ein geeignetes Wachstumsmedium umfasst.
  • Das letzte Inokulum kann allerdings auch aus einem beliebigen Wachstumsmedium bestehen und stattdessen Konservierungsstoffe umfassen, wie Glycerin (z.B. bakterielle Kulturen). Dementsprechend können zelluläre Bestandteile auf dem Substrat für eine spätere Analyse konserviert werden; d.h. zelluläre Bestandteile können auf dem Substrat unter konservierenden Bedingungen wie in Glycerin oder einem anderen geeigneten Medium oder in lyophilisierter Form vorliegen. Der Begriff "konservierende Bedingung" bezeichnet eine Bedingung, um die zellulären Bestandteile am Leben und/oder intakt zu halten und sie vor dem Verfall zu bewahren.
  • Alternativ kann eine Kultur zellulärer Bestandteile für Wachstum inkubiert werden, bis die exponentielle Phase hinsichtlich ihrer Wachstumskurve erreicht ist, gefolgt von einer Aufbringung eines Aliquots dieser Kultur direkt auf das Substrat.
  • Dementsprechend wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, wobei die Bereitstellung zellulärer Bestandteile auf der Oberfläche eines Substrats durch direkte Aufbringung eines Inokulums oder einer Kultur auf dieses Substrat erfolgt.
  • Wie von einem Fachmann auf dem Gebiet anerkannt werden wird, sind etablierte Protokolle für die Kultivierung verschiedener Zelltypen erhältlich. Solche Protokolle können die Verwendung von speziellen Beschichtungen und selektiven Medien erfordern, um das Zellwachstum und die Expression von spezialisierten zellulären Funktionen zu ermöglichen. Keines dieser Protokolle ist von der Verwendung in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen.
  • In der vorliegenden Erfindung können auf der Oberfläche des festen Substrats Nährstoffe von unterhalb oder von oberhalb der Poren und durch die Poren des festen Substrats bereitgestellt werden.
  • Diese Nährstoffe und/oder Effektoren können durch Diffusion zur Oberfläche des festen Substrats von unterhalb oder von oberhalb der Poren und durch die Poren des festen Substrats bereitgestellt werden.
  • Diese Nährstoffe können mit einem Wachstumsmedium, um die Zellen zu kultivieren, bereitgestellt werden. Dieses Wachstumsmedium kann jedes beliebige konventionelle Medium sein, das geeignet ist, um die Wirtszellen wachsen zu lassen, beispielsweise Minimal- oder Komplexmedium mit geeigneten Ergänzungsstoffen. Geeignete Medien sind von kommerziellen Anbietern erhältlich, oder sie können gemäß veröffentlichter Rezepte zubereitet werden (z.B. in Katalogen der American Type Culture Collection). Die Medien werden unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zubereitet.
  • Die Bereitstellung von Nährstoffen an das Substrat für das Wachstum der zellulären Bestandteile erfolgt unter aseptischen Bedingungen, die in dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Diese aseptischen Bedingungen können erreicht werden, indem in einer Sterilbank gearbeitet wird oder indem das Substrat bedeckt wird; d.h. auf der Seite der Aufbringung oder des Wachstums der zellulären Bestandteile.
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch mit geschnittenem Material ausgeführt werden, das direkt in Kontakt mit dem Substrat positioniert wird.
  • Falls für nachfolgende Assays benötigt, z.B. ein Immunfluoreszenznachweis, können die Zellen auf der Oberfläche des festen Substrats, z.B. durch chemische Fixierung, fixiert werden. Typischerweise wird das bevorzugte Fixierungsmittel davon abhängen, ob die zelluläre Reaktion oder das Molekül von Interesse auf der Oberfläche der Zelle oder innerhalb der Zelle stattfindet bzw. sich dort befindet. Beispielsweise werden einige Fixierungsverfahren (wie Methanol- oder Acetonfixierung) nicht bei Zellen verwendet, die permeabilisiert werden müssen (z.B. Untersuchung intrazellulärer Antigene).
  • Verschiedene Fixierungsprotokolle für verschiedene Zelltypen für verschiedene Assays sind in dem Fachgebiet wohlbekannt; z.B. können Säugetierzellen mit einem Fixierungsmittel wie Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 3,7% Paraformaldehyd und 4,0% Saccharose in Kontakt gebracht werden.
  • Der Begriff "zellulärer Bestandteil", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst alle Zelltypen, die mit standardisierter Gewebekulturware kultiviert werden können. Sowohl adhärente als auch nicht adhärente Zelltypen können verwendet werden. Ein "zellulärer Bestandteil", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet jede Zelle, die den Nachweis einer Reaktion nach Exposition oder Behandlung gegenüber/mit einer Testverbindung erlaubt. Ein zellulärer Bestandteil gemäß der vorliegenden Beschreibung kann eine wildtypische, eine mutante oder eine transformierte oder transfizierte Zelle (Bakterienzelle, virale Zelle, etc.) sein und kann daher das Vorhandensein oder die Aufbringung einer Nicht-Wirtssubstanz erfordern; diese Nicht-Wirtssubstanz kann lebensfähig sein, wie beispielsweise ein Parasit, oder nicht lebensfähig sein, wie beispielsweise ein Vektor, und sie kann stabil oder transient in dieser Wirtszelle vorhanden sein. Eine Zelle wurde mit exogenem oder heterologem genetischem Material transfiziert, wenn solches Material in das Innere der Zelle eingeführt wurde. Eine Zelle wurde mit exogenem oder heterologem genetischem Material transformiert, wenn das transfizierte Material eine zelluläre Änderung, z.B. eine phänotypische Veränderung, bewirkt. Üblicherweise sollte das transformierende genetische Material in die chromosomale DNA der Zelle integriert werden, die ihr Genom ausmacht. Die Integration von transformierendem genetischem Material, einschließlich Vektor-DNA, in das Wirtschromosom kann mittels homologer oder nicht-homologer Rekombination erfolgen. Weiter umfasst ein "zellulärer Bestandteil", wie er in der folgenden Beschreibung verwendet wird, jegliche Nachkommenschaft einer parentalen Zelle, die mit der parentalen Zelle auf Grund von Mutationen, die während der Replikation auftreten, nicht identisch ist.
  • Nützliche Zellen beinhalten Prokaryoten und Eukaryoten wie Säugetierzellen einschließlich Hybridomzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen und Protistenzellen umfassend Protozoen, Algen und Pilzzellen. Säugetierzellen können von jeder Quelle abstammen, die hinsichtlich der Art (z.B. human, Nagetier, Affe), der Gewebequelle (Gehirn, Leber, Lunge, Herz, Niere, Haut, Muskel) und des Zelltyps (z.B. epithelial, endothelial) bekannt ist. Darüber hinaus können Zellen, die mit rekombinanten Genen transfiziert wurden, ebenfalls unter Verwendung der vorliegenden Erfindung kultiviert werden.
  • Geeignete Zelllinien können z.B. von der American Type Culture Collection und der German Collection of Microorganisms and Cell Cultures umfasst sein.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die zellulären Bestandteile aus der Gruppe ausgewählt, die Säugetierzellen, Insektenzellen, Hefezellen, Pflanzenzellen und mikrobielle Zellen einschließlich bakterieller und Pilzzellen, zelluläre Vesikel, zelluläre Organellen, Gewebeschnitte und ganze mikroskopische Organismen einschließlich Nematoden umfasst.
  • Nicht beschränkende Beispiele von nützlichen Säugetierzelllinien beinhalten tierische und humane Zelllinien wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary; CHO), Lungenzellen des chinesischen Hamsters (Chinese hamster lung; CHL), Nierenzellen von Babyhamstern (baby hamster kidney; BHK), COS-Zellen, HeLa-Zellen, THP-Zelllinien, TAg-Jurkatzellen, Hybridomzellen, Karzinomzelllinien, Hepatozyten und dergleichen.
  • Geeignete Insektenzelllinien beinhalten Lepidoptera-Zelllinien wie Spodoptera frugiperola-Zellen (z.B. Sf9, Sf21) und Trichoplusia ni-Zellen (z.B. High FiveTM, BTI-Tn-5B1-4), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Nicht beschränkende Beispiele für Pilzzellen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten die Stämme Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota und Zygomycota als auch Oomycota und alle mitosporen Pilze. Repräsentative Gruppen der Ascomycota beinhalten z.B. Neurospora, Eupenicillium (oder Penicillium), Emericella (oder Aspergillus), Eurotium (oder Aspergillus) und echte Hefen wie sie oben aufgelistet sind. Beispiele von Basidiomycota beinhalten Pilze, Rostpilze und Schleimpilze. Repräsentative Gruppen der Chytridiomycota beinhalten z.B. Allomyces, Blastociadiella, Coelomomyces und in Wasser lebende Pilze. Repräsentative Gruppen der Oomycota beinhalten z.B. saprolegniomycete aquatische Pilze (Wasserschimmelpilze) wie Achlya. Beispiele für mitospore Pilze beinhalten Aspergillus, Penicillium, Candida und Alternaria. Repräsentative Gruppen der Zygomycota beinhalten z.B. Rhizopus und Mucor.
  • Pilzzellen können Hefezellen sein. Nicht beschränkende Beispiele für nützliche Hefezellen beinhalten ascosporogene Hefen (Endomycetales), basidiosporogene Hefen und Hefen, die zu den Fungi imperfecti oder Deuteromycota (Blastomycetes) gehören. Die ascosporogenen Hefen werden in die Familien der Spermophthoraceae und Saccharomycetaceae eingeteilt. Die letztere besteht aus vier Unterfamilien, Schizosaccharomycoideae (z.B. die Gattung Schizosaccharomyces einschließlich S. pombe), Nadsonioideae, Lipomycoideae und Saccharomycoideae (z.B. die Gattungen Pichia einschließlich P. pastoris, P. guillermondii und P. methanolio), Kluyveromyces einschließlich K. lactis, K. fragilis und Saccharomyces einschließlich S. carlsbergensis, S. cerevisiae, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis oder S. oviformis). Die basidiosporogenen Hefen beinhalten die Gattungen Leucosporidim, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium und Filobasidiella. Hefen, die zu den Fungi imperfecti gehören, werden in zwei Familien eingeteilt, Sporobolomycetaceae (z.B. die Gattungen Sporobolomyces und Bullera) und Cryptococcaceae (z.B. die Gattung Candida einschließlich C. maltose). Andere nützliche Hefewirtszellen sind Hansehula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Ustilago maydis.
  • Pilzzellen können filamentöse Pilzzellen einschließlich aller filamentösen Formen der Unterabteilungen Eumycota und Oomycota sein. Filamentöse Pilze sind durch ein vegetatives Mycelium gekennzeichnet, das aus Chitin, Cellulose, Glukan, Chitosan, Mannan und anderen komplexen Polysacchariden besteht. Das vegetative Wachstum erfolgt durch eine Elongation der Hyphen, und der Kohlenstoffkatabolismus ist obligatorisch aerob. Im Gegensatz dazu erfolgt das vegetative Wachstum von Hefen wie Saccharomyces cerevisiae mittels Knospung eines einzelligen Thallus, und der Kohlenstoffkatabolismus kann fermentativ sein. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die filamentöse pilzliche Wirtszelle eine Zelle einer Art von Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium und Trichoderma, oder ein Teleomorph oder Synonym davon, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Nützliche mikroorganismische Zellen können einzellig, z.B. Prokaryoten, oder nicht-einzellig, z.B. Eukaryoten, sein. Nützliche einzellige Zellen sind Archeabakterien. Weitere nützliche einzellige Zellen sind aerobe Bakterienzellen wie grampositive Bakterien, einschließlich der Gattungen Bacillus, Sporolactobacillus, Sporocarcina, Filibacter, Caryophanum, Arthrobacter, Staphylococcus, Planococcus, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, sind jedoch nicht darauf beschränkt; oder es können gramnegative Bakterien einschließlich der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter, Frateuria, Akaligenes, Achromobacter, Deleya, Amoebobacter, Chromatium, Lamprobacter, Lamprocystis, Thiocapsa, Thiocystis, Thiodictyon, Thiopedia, Thiospirillum, Escherichia, Salmonella, Shigella, Erwinia, Enterobacter, Serratia, Legionella, Neisseria, Kingella, Eikenella, Simonsiella, Alysiella, Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus, Nitrospira, Pseudomonas, Xanthomonas, Zoogloea, Fraturia, Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium, Rickettsia, Rochalimaea, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia, Treponema, Borrelia, Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Photobacterium, Brucella, Bordetella, Flavobacterium, Francisella, Chromobacterium, Janthinobacterium und Iodobacter sein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Geeignete Pflanzenzellen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten dicotyle Pflanzenzellen; Beispiele von diesen sind Arabidopsis thaliana-, Tabak-, Kartoffel-, Tomaten- und Leguminosen- (z.B. Bohne, Erbse, Soja, Alfalfa) -Zellen. Es wird allerdings in Erwägung gezogen, dass monocotyle Pflanzenzellen, z.B. monocotyle Pflanzenzellen von Getreidearten wie beispielsweise Reis, Roggen, Gerste und Weizen, genauso geeignet sein können.
  • Die Zufuhr von Testverbindungen, zellulären Bestandteilen oder Detektormolekülen an vorbestimmte Bereiche auf dem Substrat kann erreicht werden, indem eine Vorrichtung zur Handhabung von Flüssigkeiten verwendet wird, aber sie kann genauso gut durch manuelle Abwicklung (Handhabung) erreicht werden.
  • Demgemäß kann eine Vorrichtung für die Handhabung von Flüssigkeiten auf dem Substrat positioniert werden, wobei die Vorrichtung zur Handhabung von Flüssigkeiten eine Hochpräzisions-x-y-z-Pipettierhilfe oder ein Tintenstrahldrucker mit einem oder mehreren Kanal/Kanälen sein kann, durch welche die Flüssigkeit sequenziell oder parallel auf Positionen dispensiert werden kann, welche den angeordneten Molekülen auf der Oberfläche des festen Substrats entsprechen. Alternativ kann eine überlagernde Maske, die transversale Löcher umfasst, auf das Substrat aufgelagert werden, wobei die Überlagerung solchermaßen ist, dass jedes transversale Loch in der Maske einem aufgelagerten Molekül auf der Oberfläche auf dem festen Substrat entspricht.
  • Überlagernde Masken können für die Erzeugung von zellulären Arrays nützlich sein; d.h. nachdem eine konfluente Schicht von Zellen angewachsen ist, können diese Zellen nachfolgend durch eine Reihe von Vektoren oder Genkonstrukten transformiert werden, um einen Array von unterschiedlich transformierten Zellen zu erhalten. Die Verwendung einer Maske während des Transformationsschritts erlaubt die Transformation von Zellen, die mit einem bekannten Vektor oder Genkonstrukt transformiert werden sollen, die auf einem vorbestimmten Bereich auf dem Array wachsen. Solchermaßen wird durch die Verwendung einer Maske ein XV-Muster von transformierten Zellen erzeugt, von denen die XY-Position auf dem Array die transformierten Zellen identifiziert.
  • Die Zufuhr von Testverbindungen, zellulären Bestandteilen oder Detektormolekülen kann mittels einer Kontaktauftropfung oder einer kontaktlosen Auftropfung ausgeführt werden. Der Begriff „Kontaktauftropfung" oder „Anpresskraft" („Kontaktkraft"), wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, bedeutet einen direkten Oberflächenkontakt zwischen einem Aufdrucksubstrat und einem Zufuhrmechanismus, der eine oder eine Vielzahl oder eine Reihe von Pinzette(n), Nadel(n) oder Kapillare(n) enthalten kann, die dazu dient/dienen, jeden beliebigen Bestandteil innerhalb des Zufuhrmechanismus an die Oberfläche zu transferieren oder an sie zuzuführen, indem die Pinzette(n), Nadel(n) oder Kapillare(n) physikalisch auf die Oberfläche aufgetippt wird/werden. Weiter kann eine überlagernde Maske auf dem (Zellen enthaltenden) festen Träger positioniert werden, wobei der Inhalt der Löcher, wie sie durch die gefüllten Löcher in der Maske ausgebildet werden, passiv den Zellen mittels Kapillarkräfte zugeführt wird, wenn die Maske auf den Chip gedrückt wird. Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, wirkt eine Maske als eine Barriere für den Durchgang von Reaktionsmitteln. Üblicherweise erlaubt ein Lochmuster in der Maske einen selektiven Durchgang von Reaktionsmitteln und resultiert in einem entsprechenden Muster der Aufbringung von Reaktionsmitteln auf einer Oberfläche, die hinter/unter der Maske platziert ist.
  • Alternativ können die Testverbindungen auch durch eine Tintenstrahldrucktechnik zugeführt oder aufgetropft werden, eine kontaktfreie Technologie, mit der die Reaktionsmittel unter Verwendung einer Technologie, die ausgehend von Computer-Tintenstrahldruckern adaptiert wurde, auf die Oberfläche aufgesprüht werden. Das Tintenstrahlverfahren wird manchmal indirekt genannt, weil die Reaktionsmittel auf die Oberfläche eher aufgesprüht werden als dass sie direkt dort platziert werden. Tintenstrahlverfahren können in der Lage sein, kleinere Punkte zu erzeugen, und weil sie einen physischen Kontakt mit der Oberfläche vermeiden, können sie sich als zuverlässiger erweisen.
  • Nützliche Tintenstrahldruckverfahren können kontinuierliche und diskontinuierliche (drop-on-demand) Tintenstrahlverfahren beinhalten. Am besten geeignete Tintenstrahldruckverfahren sind diskontinuierliche (drop-on-demand) Tintenstrahlverfahren, von denen Beispiele piezo-elektrische und elektrostatische Tintenstrahlsysteme darstellen.
  • Weiter sind in der vorliegenden Erfindung Auftropfroboter oder Vorrichtungen zur Handhabung von Flüssigkeiten nützlich. Die meisten Auftropfroboter oder Vorrichtungen zur Handhabung von Flüssigkeiten verwenden einen X-Y-Z-Roboterarm (einer, der in alle drei Dimensionen beweglich ist), der auf einem Antivibrationstisch angebracht ist. Im Fall der kontaktfreien Auftropfung kann dieser Arm Düsen aufweisen. Bei der Kontaktauftropfung kann dieser Arm Nadeln aufweisen. Die Düsen oder Nadeln werden in eine erste Mikrotiterplatte eingetaucht, um die Flüssigkeit aufzunehmen (z.B. eine Lösung der Testverbindung), die zugeführt werden soll. Im Fall von Nadeln werden die Spitzen anschließend auf die Oberfläche des festen Trägers bewegt, und ihnen wird erlaubt, die Oberfläche nur minimal zu berühren; die Lösung der Testverbindung wird dann transferiert. Die Nadeln werden anschließend gewaschen und zur nächsten Anordnung von Löchern und Testverbindungen bewegt. Dieser Vorgang wird wiederholt bis Hunderte oder Tausende von Testverbindungen aufgebracht sind. Feste Nadeln, Federkiele und Nadel- und Ring-Konfigurationen von Nadeln können nützlich sein.
  • Demgemäß erfolgt in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Zufuhr von Testverbindungen durch Mittel, die ausgewählt werden aus der Gruppe, die eine Zufuhrmaske, eine Hochpräzisions-x-y-z-Pipettierhilfe, einen Tintenstrahldrucker und manuelle Abwicklung (Handhabung) umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Zufuhr von Testverbindungen mittels einer Hochpräzisions-x-y-z-Pipettierhilfe oder einem Tintenstrahldrucker.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Zufuhr von Testverbindungen an den Zellen enthaltenden Träger mittels einer Anpresskraft (Kontaktkraft).
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Zufuhr von Testverbindungen eine den Zellen enthaltenden Träger mittels einer Anpresskraft, die eine Kapillarkraft oder eine piezo-elektrische Kraft sein kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Durchmusterung und die pharmakologische Profilbestimmung von Testverbindungen bereit, die eine zelluläre Reaktion modulieren, z.B. eine physiologische Reaktion und/oder die Aktivitäten von Zellen. Eine Vielzahl von Wirkungen, die von den Verbindungen, die durchmustert werden sollen, verursacht werden, können gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen und quantitativ charakterisiert werden. Diese Wirkungen beinhalten Veränderungen in der intrazellulären Konzentration von ionisiertem Kalzium, cAMP-Unterschiede (z.B. auf Grund metabolischer Aktivierung oder Inaktivierung), pH, Temperatur, NO und das Transmembranpotenzial, intrazelluläre Ca-, K- oder Na-Flüsse in die Zelle oder aus der Zelle hinaus und andere physiologische und biochemische Charakteristika von lebenden Zellen, die von einer Vielzahl von konventionellen Mitteln gemessen werden können, beispielsweise unter Verwendung spezifischer fluoreszierender, lumineszenter oder farbentwickelnder Farbstoffe, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Verfahren für die Durchmusterung agonistischer oder antagonistischer Aktivität von Wirkstoffen, Verfahren der Charakterisierung ihrer Wirksamkeitsprofile, Verfahren zur Identifizierung des Expressionsmusters von Rezeptoren auf der Zellmembran ("Rezeptorfingerabdruckbestimmung", "receptor fingerprinting"), Verfahren zur Bestimmung von Toxizitätsprofilen für die Verbindungen (z.B. toxikologische Reaktionen, CYP 450, HERC), bakterieller Lyse, Apoptose, zellulärer Nekrose, Zellmutationsvorgängen wie z.B. Karzinogenese, wirkstoffinduzierter Protein-Protein-Wechselwirkungen, die unter Verwendung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) oder des Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfers (BRET) nachweisbar sind, ADME (Adsorption, Verteilung, Metabolismus und Eliminierung) oder beliebiger anderer zellulärer Reaktionen. Die Vielzahl von zellulären Reaktionen beinhaltet eine zelluläre Reaktion, die ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Signaltransduktion, allgemeinen Protein-Protein-Wechselwirkungen, Veränderungen in der Enzymaktivität, Vesikelverkehr, Proteinbewegung, Vesikelbewegung, Aktivierung oder Inhibierung einer Rezeptor-vermittelten Reaktion, Aktivierung oder Inhibierung eines Ionenkanals, Aktivierung oder Inhibierung einer nicht-selektiven Pore, Aktivierung oder Inhibierung eines durch einen sekundären Botenstoff vermittelten Reaktionswegs stromabwärts eines Rezeptors oder Kanals, Aktivierung oder Inhibierung von Apoptose und Aktivierung oder Inhibierung zellulärer Nekrose, zellulärer Toxizität, Zelldifferenzierung und Zellproliferation besteht. Einige zelluläre Reaktionen wie bakterielle Lyse, Apoptose, Nekrose, Proliferation benötigen nicht notwendigerweise Detektormoleküle, um sie nachzuweisen; stattdessen können sie mittels visueller Inspektion nachgewiesen werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um biochemische Analysen wie Western-Analysen, Northern-Analysen, Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), Nachweis von enzymatischen Aktivitäten oder Assays mit molekularen Anordnungen durchzuführen.
  • Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Fähigkeit und Wirksamkeit von Substanzen, als Agonisten oder Antagonisten für Rezeptoren, Ionenkanäle, Ionenpumpen und Ionentransporter, die auf einer Zelloberflächenmembran lokalisiert sind, zu wirken, nachgewiesen, evaluiert und charakterisiert werden. Diese molekularen Anordnungen arbeiten zusammen, um die intrazelluläre Ionenhomöostase aufrecht zu erhalten. Jegliche Veränderung in der Aktivität dieser Systeme würde eine Verschiebung der intrazellulären Konzentrationen von Ionen verursachen und infolgedessen auch die metabolische Reaktion der Zelle.
  • Ionenpumpen wirken, um die transmembranen Ionengradienten aufrecht zu erhalten, wobei sie ATP als Energiequelle verwenden. Beispiele für Ionenpumpen sind: Na+/K+-ATPase, welche den Transmembrangradienten von Natrium- und Kaliumionen aufrecht erhält, Ca2+-ATPase, welche den Transmembrangradienten von Kalziumionen aufrecht erhält, und H+-ATPase, welche den Transmembrangradienten von Protonen aufrecht erhält.
  • Ionentransporter verwenden die elektrochemische Energie von Transmembrangradienten einer Ionenart, um die Gradienten eines anderen Gegenions aufrecht zu erhalten. Beispielsweise verwendet der Na+/Ca2+-Austauscher das chemische Potenzial des Natriumgradienten, der nach innen gerichtet ist, um Kalziumionen gegen ihr chemisches Potenzial nach außen zu pumpen.
  • Ionenkanäle erlauben, nach ihrer Aktivierung, Ionen, sich gemäß ihrem elektrochemischen Potenzial durch die Zellmembran zu bewegen.
  • Demgemäß wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie hierin beschrieben, ein Verfahren bereitgestellt, wobei zelluläre Reaktionen ausgewählt werden aus der Gruppe, die chemisch induzierte oder physiologische Ereignisse in der Zelle umfasst, einschließlich Lyse, Apoptose, Wachstumsinhibierung und Wachstumsförderung; Herstellung, Sekretion und Oberflächenexposition eines Proteins oder eines anderen Moleküls von Interesse durch die Zelle; Aktivierung eines Moleküls auf der Membranoberfläche einschließlich Rezeptoraktivierung; transmembrane Ionentransporte; und transkriptionelle Regulationen.
  • Moleküle von Interesse, die überwacht werden können, können alle Moleküle biologischen Ursprungs sein; nicht beschränkende Beispiele von diesen sind Peptide, Polypeptide, Proteine, Enzyme, post-translational modifizierte Polypeptide wie Lipopeptide oder glykosylierte Peptide, antimikrobielle Peptide oder Moleküle, primäre oder sekundäre Metaboliten wie Alginate, kleine organische Moleküle, Moleküle mit pharmazeutischen Eigenschaften, etc.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei das Molekül von Interesse ausgewählt wird aus der Gruppe, die Peptide umfasst, einschließlich Lipopeptide, glykosylierte Peptide und antimikrobielle Peptide, Polypeptide, Proteine, Enzyme, antimikrobielle Moleküle, primäre und sekundäre Metaboliten und kleine organische Moleküle einschließlich pharmazeutischer Moleküle.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei die Testverbindung ein Wirkstoff oder eine beliebige Verbindung ist, die ein Wirkstoff werden könnte. Diese Testverbindung kann bei dem Selektions-/Validierungsverfahren eines Wirkstoffkandidaten nützlich sein.
  • Demgemäß wird in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren bereitgestellt, wobei die Testverbindung ein Wirkstoff oder eine beliebige Verbindung ist, die bei dem Auswahlverfahren eines Wirkstoffkandidaten nützlich ist.
  • Die Anzahl von möglichen Testverbindungen beläuft sich auf Millionen. Kommerziell erhältliche Verbindungsbibliotheken, die Peptide, Proteine, Zucker, etc. beinhalten, können z.B. von ArQule, Pharmacopeia, Graffinity, Panvera und Oxford erhalten werden.
  • In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Testverbindung ein Wirkstoff, der aus einer chemischen oder natürlichen Wirkstoffkandidatenbibliothek ausgewählt wird.
  • Die Untersuchung zellulärer Reaktionen kann auf eine Vielzahl von Arten ausgeführt werden. Der Nachweis kann lediglich mittels visueller Inspektion ausgeführt werden; z.B. Zellwachstum oder keines, Zellmorphologie, etc., oder er kann durch die Verwendung von Detektormolekülen ausgeführt werden. Detektormoleküle können bereits in dem Arraysystem vorliegen; z.B. wenn nach der Expression eines Gens mit einem GFP-Reporter geschaut wird. Die Detektormoleküle können auch aus dem Agar unterhalb des Substrats, wie in Beispiel 2 beispielhaft dargestellt ist, diffundieren.
  • Wo Detektormoleküle noch nicht in dem zellulären Array vorliegen, können zelluläre Reaktionen durch die Zugabe der Detektormoleküle zu dem zellulären Array nach Inkubation von Testverbindungen mit zellulären Bestandteilen untersucht werden.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren, wie beschrieben, bereitgestellt, wobei die Untersuchung zellulärer Reaktionen durch folgende Schritte erfolgt:
    • (a) Versehen der zellulären Bestandteile mit einem Nachweisagens;
    • (b) Wegwaschen des Überschusses an nicht eingebautem Nachweisagens; und
    • (c) Nachweis des Vorliegens oder Fehlens einer Änderung eines nachweisbaren Signals, wobei das Vorliegen einer Änderung des nachweisbaren Signals eine zelluläre Reaktion anzeigt.
  • Alternativ kann ein markierungsfreier Nachweis zellulärer Reaktionen beispielsweise durch kalorimetrische Messungen ins Auge gefasst werden. Dies erlaubt die Messung von z.B. metabolischen Aktivitäten in einer Zelle durch Nachweis mit beispielsweise einer sensitiven IR-Kamera.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zelluläre Reaktionen im Vollmedium oder Zellkulturmedium untersucht, in isolierten Zellen wie pelletierten Zellen, im Überstand der zellulären Bestandteile oder im Lysat der zellulären Bestandteile.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Detektormoleküle ausgewählt aus der Gruppe, die Nukleinsäuren, einschließlich modifizierte Analoga davon, Peptide, Proteine und Antikörper, einschließlich Antikörperfragmente, Enzymsubstrate und spezifische Farbstoffe umfasst.
  • Nicht beschränkende geeignete Beispiele von spezifischen Farbstoffen sind in dem Fachgebiet wohlbekannt und beinhalten Fluo-3, Fluo-4 und Ca-Farbstoffe wie beispielsweise Kalzium Grün-1 (siehe z.B. Katalog von Molecular Probes).
  • Die vorliegende Erfindung erwägt die Überwachung von mehr als einer zellulären Reaktion, indem z.B. die Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen ermittelt wird, indem z.B. CY3- und CY5-Farbstoffe verwendet werden, oder indem verschiedene Nachweisverfahren simultan verwendet werden.
  • Zellen oder zelluläre Bestandteile können mit lumineszenten Indikatoren für chemische oder molekulare zelluläre Eigenschaften modifiziert und in einem lebenden Zustand analysiert werden. Diese Indikatoren können in die Zellen, bevor oder nachdem diese mit den Testverbindungen konfrontiert wurden, und mittels eines physikalischen Verfahrens oder einer Kombination einer Vielzahl physikalischer Verfahren, wie beispielsweise – aber nicht darauf beschränkt – Diffusion durch die Zellmembran, mechanische Störung der Zellmembran, oder gentechnisch, so dass sie in Zellen unter vorbestimmten Bedingungen exprimiert werden, eingeführt werden. Lebendstudien erlauben die Analyse des physiologischen Status der Zelle, wie er durch den Indikator angezeigt wird, während ihres Lebenszyklus oder wenn sie mit einer Testverbindung wie einem Wirkstoff oder einer anderen reaktiven Substanz in Kontakt gebracht wird.
  • Demgemäß erfolgt in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Zufuhr eines Nachweisagens zu den zellulären Bestandteilen vor der Zufuhr einer Testverbindung, wodurch vormarkierte zelluläre Bestandteile bereitgestellt werden.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Identifizierung der zellulären Reaktionen mittels Lumineszenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Lumineszenz Fluoreszenz.
  • Besonders nützliche fluoreszente Moleküle beinhalten beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Malachit-Grün, Oregon-Grün, Texas-Rot, Kongo-Rot, SybrGreen, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4',7',4,7-hexachlorfluorescein (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM), N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), Cyaninfarbstoffe (z.B. Cy5, Cy3), BODIPY-Farbstoffe (z.B. BODIPY 630/650, Alexa542, etc.), das grün fluoreszierende Protein (GFP), das blau fluoreszierende Protein (BFP), das gelb fluoreszierende Protein (YFP), das rot fluoreszierende Protein (RFP) und dergleichen (siehe z.B. Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Mittel zum Nachweis von Signalen im Allgemeinen sind dem Fachmann wohlbekannt. Daher können zum Beispiel radioaktive Markierungen unter Verwendung eines Fotografiefilms oder von Szintillationszählern nachgewiesen werden, fluoreszierende Markierungen können unter Verwendung eines Fotodetektors nachgewiesen werden, um das emittierte Licht nachzuweisen. Enzymatische Markierungen werden üblicherweise nachgewiesen, indem dem Enzym ein Enzymsubstrat zugeführt wird und das Reaktionsprodukt, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat hergestellt wurde, nachgewiesen wird, und kolorimetrische Markierungen werden nachgewiesen, indem die farbige Markierung einfach visualisiert wird. Weitere Nachweismittel sind beispielsweise die (mikro-) kalorimetrische und (Licht)-Mikroskopie.
  • Der Nachweis von zellulären Reaktionen kann auch durch mehrstufige Nachweisverfahren ausgeführt werden. Diese Verfahren können beispielsweise Sandwich-Assays, wie sie auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, und enzymatische Konversionen in ein nachweisbares Produkt sein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Untersuchung in Echtzeit ausgeführt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Untersuchung eine Endpunktuntersuchung.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können insbesondere für die Überwachung induzierter zellulärer Reaktionen von Wirtszellen verwendet werden. Induzierte zelluläre Reaktionen beinhalten Rekombination, Transformation und virale Induktion, beispielsweise durch Temperaturverschiebung, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Demgemäß kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere für auf dem Chip ausgeführte Rekombination, Transformation oder virale Induktion zellulärer Bestandteile verwendet werden.
  • Darüber hinaus können die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere für die funktionale Durchmusterung zellulärer Reaktionen nach Untersuchung der Wirtszellen mit Testverbindungen verwendet werden.
  • Man wird das Verfahren und die Mikroarrays gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere für Durchmusterungen von Arrays von z.B. Antibiotika mit Mykoplasmen für geeignet halten.
  • Wie auf dem Fachgebiet anerkannt werden wird, sind die Verfahren und Mikroarrays gemäß der vorliegenden Erfindung auch besonders für kombinatorische Durchmusterungen geeignet.
  • Arrays mit Testverbindungen können Testverbindungen aufweisen, die auf der Oberfläche eines festen Substrats immobilisiert sind.
  • Es kann wünschenswert sein, die Testverbindungen in Lösung an vorbestimmte Bereiche innerhalb eines Substrats aufzubringen, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu durchmustern. Mikroarrays, wie sie in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind besonders für die Konservierung von Testverbindungen geeignet. Wenn sie in Lösung bereitgestellt werden, sind die Testverbindungen während der Durchmusterungsverfahren frei beweglich. Dies könnte im Vergleich zu fixierten Verbindungen, die einen Effekt der sterischen Hinderung hervorrufen könnten, von Vorteil sein.
  • Demgemäß ist es ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Mikroarray zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, wobei ein Array von Testverbindungen innerhalb vorbestimmter Bereiche bereitgestellt wird, wobei die Testverbindungen in flüssiger Lösung vorliegen und nicht auf dem Substrat immobilisiert sind.
  • Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Mikroarray zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, wobei ein Array von zellulären Bestandteilen auf vorbestimmten Bereichen auf einem Substrat bereitgestellt wird, wobei die zellulären Bestandteile für eine Konservierung auf dem Substrat aufbereitet sind.
  • Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Mikroarray für die Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, wobei ein zellulärer Bestandteil auf einem Substrat bereitgestellt wird, wobei der zelluläre Bestandteil für eine Konservierung auf dem Substrat aufbereitet ist.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroarray gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei die Aufbereitung ausgewählt wird aus der Gruppe, die Lyophilisierung und Auflösung in Glyzerin umfasst.
  • Arrays mit konservierten Zellen, wie sie oben beschrieben sind, sind gut für eine Langzeitaufbewahrung geeignet. Es wird anerkannt werden, dass solchermaßen aufbereitete zelluläre Arrays als Matrizen verwendet werden können; d.h. als Master-Arrays, um nachfolgend sekundäre identische Arrays zu erzeugen, zum Beispiel indem zelluläre Bestandteile von dem Master-Array auf einen sekundären Array Rücken an Rücken aufgedruckt werden. Diese Handhabung kann einige Male mit demselben Master wiederholt werden, um eine Serie von sekundären Arrays zu erzeugen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Mikroarray, wie er hierin beschrieben ist, bereitgestellt, wobei eine Reihe von Detektormolekülen in dem Substrat immobilisiert ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroarray gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei die Reihe von Detektormolekülen eine Vielzahl von gleichen Detektormolekülen oder eine Vielzahl von verschiedenen Detektormolekülen umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines Mikroarrays oder eines festen porösen Substrats, wie es in der vorliegenden Beschreibung beschrieben ist, um eine geringe Streuung des Wachstums der zellulären Bestandteile auf der Oberfläche des Substrats zu erreichen. Es wurde überraschenderweise herausgefunden, dass die Inokulation zellulärer Bestandteile auf der Oberfläche des festen Substrats in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu einer beschränkten Streuung zwischen eng gepackten Kolonien auf dem Substrat führt.
  • Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, umfassend einen Mikroarray, wie er hierin beschrieben ist.
  • 1 stellt das Vorliegen von transformierten Kolonien auf einem festen Durchflusssubstrat dar, die sich auf den Rand des Substrats fokussieren. Die untere Teilabbildung (B) zeigt Kolonien von E. coli XL2 MRF', die auf dem Substrat gewachsen sind, mit Nährstoffen, die von unten aus dem Agar durch das Substrat diffundieren. Die obere Teilabbildung (A) zeigt Kolonien, die direkt auf Agar gewachsen sind.
  • 2 stellt den Nachweis der von E. coli exprimierten β-Galaktosidaseaktivität unter Verwendung des fluorogenen Substrats MUG dar. Die Bilder zeigen einen 4 mm × 3 mm großen Bereich und weisen eine identische Skalierung auf.
    • (A) Assayprinzip. Bakterien, die auf der Oberfläche des festen Durchflusssubstrats eingefangen sind, exprimieren ein Enzym, das ein fluoreszierendes Produkt ausbildet, entweder mittels des Substrats für das Enzym (in diesem Fall MUG), das nach oben zu den Bakterien diffundiert und/oder mittels des Enzyms (β-Galaktosidase), das von den Zellen freigesetzt wird und nach unten zum Agar diffundiert. A, Agar; b, Durchflusssubstrat; c, Kolonie (β-Galaktosidase)
    • (B) Bakterien, die direkt auf Nährstoffagar plattiert wurden, oder
    • (C) auf einem festen Durchflusssubstrat, das auf den Agar gelegt wurde.
  • 3 stellt ein festes Substrat mit einer Maske dar, um das mikrobielle Wachstum oder die enzymatischen Reaktionen zu kompartimentalisieren. Diffusion ist von einem darunter liegenden Wachstumsmedium aus möglich, während eine laterale Streuungsbewegung von Mikroorganismen oder anderen Materialien verhindert wird.
    • (A) Schematisches Diagramm (von oben gesehen);
    • (B) Abbildung eines mit Methanol gewaschenen maskierten Substrats in einem Fluoreszenzkanal, von oben gesehen. Die Kompartimente variieren in ihrer Breite von 0,5 mm bis 1 mm und in ihrer Fläche von 0,25 bis 1 mm2. Allerdings sind mit einer geeigneten Drucktechnologie weit kleinere Kompartimente möglich. c, Kompartiment, dm, trennende Maske auf der Oberfläche oder den Chip penetrierend.
  • 4 stellt ein maskiertes Substrat dar (ähnlich zu 3):
    • (A) mit E. coli, die GFP exprimieren, inokuliertes Substrat, in dem eine Bakterienkultur über die gesamte Oberfläche verteilt wurde. Die Bildaufnahme erfolgte durch ein BX41 Mikroskop bei einer Expositionszeit von 30 ms unter Verwendung eines Fluoresceinfilters. In diesem Fall beträgt die Breite der Kompartimente etwa 0,5 bis 1 mm. Die hellen Flächen sind mit Bakterien gefüllte Kompartimente;
    • (B) visuelle Lichtgebung eines Substrats, das mit GFP exprimierenden E. coli inokuliert wurde, indem ein 0,5 mm mal 0,5 mm-Kompartiment mit einer Pipettenspitze berührt wurde;
    • (C) Visualisierung von GFP unter UV-Beleuchtung eines Substrats, das mit GFP exprimierenden E. coli inokuliert wurde, indem ein 0,5 mm mal 0,5 mm-Kompartiment mit einer Pipettenspitze berührt wurde.
  • 5 stellt eine Filtrationsanhäufung von Bakterien auf einem Durchflusssubstrat dar:
    • (A) Das Substrat wurde in L-Medium bei Raumtemperatur inkubiert, wobei 103 GFP exprimierende Bakterien pro ml vorhanden waren und;
    • (B) Filtration von Medium durch das Substrat, wobei Bakterien auf seiner Oberfläche eingefangen wurden;
    • (C) Nachweis einer GFP exprimierenden Kolonie von E. coli (30 ms Expositionszeit), die 6 Stunden lang auf einem Durchflusssubstrat wachsen gelassen wurde;
    • (D) ein Punkt, der von der Hybridisierung eines RNA-Transkripts, das mit Flu markiert wurde, an eine Oligosonde, die ebenfalls auf dem PamChip-Array vorhanden ist, resultierte (98 ms Expositionszeit); dieses Bild weist eine identische Skalierung im Vergleich zu (C) auf; die Punkte von (C) und (D) weisen eine ähnliche Größe auf;
    • (E), (F) Vergleich von typischen Kolonien von auf L-Agar ausplattierten GFP exprimierenden E. coli (E) und von Kolonien, die für denselben Zeitraum auf derselben Platte auf einem Durchflusssubstrat wachsen gelassen wurden, das auf der Agarbasis platziert wurde (F). Die Vergrößerung war für beide Bilder identisch. Die Ränder, welche eine Koloniegrenze definieren, sind ausnahmslos schärfer im Fall für Bakterien, die auf dem Substrat wachsen gelassen wurden.
  • 6 stellt die GFP-Expression als ein Indikator von Kanamycin-Aktivität in kompartimentalisierten Durchflusschips dar. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von Dreifachmessungen.
  • 7 stellt eine Transformation von
    • (A) pUC18 (das eine Ampicillinresistenz, aber kein GFP exprimiert); und
    • (B) pGFPuv (welches das GFP-Protein sowie die Ampicilllinresistenz exprimiert) auf kompartimentalisierten festen Durchflusssubstraten auf L-Agarplatten dar; nt, keine Transformation;
    • (C) Transformation von pGFPuv in E. coli durch Mischung von Zellen und DNA auf einem Chip. Mikrokolonien in einem Pam-Substratkompartiment werden mittels GFP-Fluoreszenz visualisiert;
    • (D) Wie (A) und (B), aber nach 48 Stunden Inkubation mit dem Substrat unter Verwendung von sichtbarer Beleuchtung. Es ist erwähnenswert, dass die Kompartimentalisierung immer noch eine Koloniestreuung enthält, obwohl die inokulierten Kompartimente konfluent sind. Die vier Ecken weisen ein konfluentes Bakterienwachstum auf, das nicht bis zu den zentralen Kompartimenten oder sogar teilweise über das Maskierungsagens hinweg gestreut hat.
  • 8 stellt einen Antikörpernachweis von E. coli dar, die durch GFP-Expression visualisiert wurden:
    • (A) M13-Antikörper (Negativkontrolle);
    • (B) E. coli-Antikörper (gegen Gesamtzellextrakte gerichtet)
  • 9 stellt das Wachstum eines Penicillium-Isolats auf einem festen Durchflusssubstrat dar:
    • (A) parentaler Stamm, der auf Brot wachsen gelassen wurde;
    • (B) Mycel, das unmittelbar auf der Substratoberfläche wächst;
    • (C) Luft-Mycel, das 3 mm über der Substratoberfläche desselben Experiments wie in (B) wächst; das Bild fokussiert auf das Mycel, das von dem Substrat stammt, aber projiziert signifikant darüber.
  • 10 stellt die Prinzipien des Einfangens mit Antikörpern und des Nachweises auf dem Chip dar, die auf Detergenzsensitivität, Enzymaktivität und einer Transposoninsertion in einem Stamm beruhen, bei einer Stammtypisierung, einem Diagnoseaufbau für ein bakterielles Pathogen.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele der Erfindung sind beispielhaft und sollten keinesfalls als Beschränkung aufgefasst werden.
  • Die folgenden Experimente zeigen die Verwendung eines Durchflusssubstrats in Lebendarray-Analyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung – niedermolekulare Verbindungen, die entweder auf das Substrat aufgedruckt wurden oder durch das Substrat diffundieren, können durch eine zelluläre Reaktion nachgewiesen werden. In den folgenden Beispielen stammten die zellulären Reaktionen, die verwendet wurden, von Mikroorganismen, einschließlich Wachstum (oder Inhibierung von Wachstum), Enzymaktivität oder die Aufnahme von DNA, was zu einer Expression eines fluoreszierenden Proteins führt. Allerdings beschränkt dies die Anwendung nicht auf diese Gebiete allein; sie erläutern lediglich unterschiedliche Effektoren, die mit lebenden zellulären Arrays anwendbar sind. Die zellulären Reaktionen auf Effektoren wurden auf dem Substrat untersucht, das für das Aufdrucken von Verbindungen in einer hohen Dichte für multiple, parallele und miniaturisierte Analysen geeignet ist.
  • Beispiel 1: Zufuhr von transformierten E. coli-Zellen auf die Oberfläche eines porösen festen Substrats
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Oberfläche des festen Substrats durch direkte Aufbringung darauf mit einem Inokulum zellulärer Bestandteile in Kontakt gebracht werden.
  • Ein mit Ethanol sterilisiertes festes Durchflusssubstrat (Aluminiumoxid-Substrat; Anopore, Whatman) wurde auf L-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin (Sigma) aufgelegt. 10 pg pUC18-Plasmid (Sigma) wurde in kompetente XL2 MRF'-Zellen transformiert (Stratagene, es wurde das Protokoll des Herstellers verwendet, außer dass nur 20 μl und nicht 100 μl kompetente Zellen pro Transformation verwendet wurden) und anschließend auf das Substrat in unterschiedlichen Verdünnungen plattiert, anschließend 8 Stunden lang bei 37°C wachen gelassen, und das Auftreten von Ampicillin-resistenten Kolonien wurde bestimmt. Sowohl Nährstoffe als auch das Ampicillin erreichen die Bakterien von unterhalb des Substrats durch die Poren des Substrats.
  • Wie in 1B gezeigt ist, waren nach 8 Stunden die Kolonien auf dem Substrat im Vergleich zu L-Agar ein wenig kleiner und wiesen, im Vergleich zu Kolonien, die direkt auf L-Agar wachsen gelassen wurden, eine reduzierte Tendenz auf, zu streuen (1A). Nach 16 Stunden wiesen die Kolonien auf dem porösen Substrat etwa einen halben Durchmesser derjenigen auf den Agarplatten auf. Der Nachweis erfolgte durch Lichtmikroskopie und visuelle Inspektion. Die Transformationseffizienzen betrugen 2,7 × 108 cfu/μg Plasmid (Agar) und 1,8 × 108 cfu/μg (Substrat).
  • Diese Experimente zeigen, dass das Substrat leicht sterilisiert wird und das Wachstum und die Selektion von mit Plasmid transformierten Zellen schnell auf der Oberfläche eines porösen Substrats mit nur wenig geringerer Wachstumseffizienz ausgeführt werden können. Obwohl das Koloniewachstum im Vergleich zum direkten Wachstum auf Agar innerhalb der ersten 8 Stunden nur marginal beschränkt zu sein scheint, scheint das Wachstum danach schneller gedrosselt zu werden als auf Agar; dies ist ein Vorteil bei der Beschränkung der Streuung zwischen eng gepackten Kolonien auf dem Substrat, was dies für Arrayanwendungen tauglich macht, indem es die Möglichkeit der Kontamination zwischen den Proben reduziert.
  • Beispiel 2: Nachweis von β-Galaktosidase-Aktivität von E. coli-Zellen, die auf dem porösen Substrat wachsen, unter Verwendung von MUG, einem fluorogenen Substrat für dieses Enzym
  • Ein steriles Durchflusssubstrat wurde auf 2TY-Platten mit 10 μg/ml Ampicillin (Sigma) und 50 μg/ml MUG (4-Methylumbelliferyl β-D-Galaktosid, Sigma, Kat.-Nr.: M-1633) platziert. 50 μl-Aliquots von L-Medium mit 103 cfu/ml E. coli XL2 Blue MRF' mit dem Plasmid pUC18 (welches β-Galaktosidase exprimiert) wurden auf das Substrat und ein ähnliches Volumen direkt auf Agarose plattiert. Kontrollen wurden durchgeführt, indem der Wirtsstamm ohne pUC18 auf dieselben Platten (ohne Ampicillin) plattiert wurde. Die Konversion von MUG zu seinem fluoreszierenden Produkt (4-Methylumbelliferon) wurde nach 8 Stunden Wachstum ermittelt, indem die Agarplatten auf einen UV-Transilluminator platziert und Aufnahmen von den fluoreszierenden Kolonien unter Verwendung einer UVP Epi Chemi II CCD-Kamera gemacht wurden. 2A stellt den Experimentalaufbau dar, und die 2B und 2C zeigen die auf dem Substrat (2C) oder direkt auf dem Agar (2B) erhaltenen Ergebnisse.
  • Kolonien, die keine β-D-Galaktosidase exprimieren, waren nicht fluoreszierend. Fluoreszenz konnte bei E. coli-Kolonien mit pUC18 (und die daher das Enzym exprimierten) sowohl auf Agar als auch auf dem Substrat, das auf der Oberfläche der gleichen Agarplatten lag, nachgewiesen werden. Die Fluoreszenz war auf dem porösen Substrat besser nachweisbar und weniger diffus (2B).
  • Zusammenfassend gesagt, erlauben die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Diffusion von Nährstoffagar oder anderen Matrizes von unterhalb des Substrats; z.B. können Enzymsubstrate nach oben diffundieren. Darüber hinaus konnte ein geeignet gestütztes Substrat mit Mikroorganismen auf seiner Oberfläche zwischen verschiedenen Medien hin und her bewegt werden, was sequenzielle Assays erlaubt. In diesem Experiment wurde, indem Bakterien, die ein Enzym exprimierten, auf poröses Material und das Niedermolekulargewichtssubstrat für das Enzym auf den darunter liegenden Agar plattiert wurden, der Nachweis von Bakterien gezeigt, der auf der Expression eines spezifischen Enzyms beruht, in anderen Worten ein Phänotyp, der auf einer Enzymaktivität beruht. Dies weist eine Vielzahl von Anwendungen auf, z.B. in Diagnostikverfahren, in denen die Typisierung von Bakterien, die auf verschiedenen colorimetrischen und fluorometrischen Assays beruht, üblich ist. Darüber hinaus stellt das Substrat einen geringen Hintergrund für den Nachweis von Fluoreszenzagenzien dar, und der Nachweis wurde auf dem porösen Durchflussmaterial leicht verbessert, was teilweise die geringere Streuung der Bakterien und/oder eine geringere laterale Diffusion des Enzyms widerspiegelt – eine nützliche Eigenschaft für eine mikrobielle Matrix, die für das Wachstum einer großen Anzahl von Mikrokolonien in enger Nachbarschaft angewendet werden kann.
  • Beispiel 3: Bakterielles Zellwachstum auf der Oberfläche eines festen Durchflusssubstrats – Sensitivität gegenüber Antibiotika, die von unterhalb des Substrats bereitgestellt werden
  • 200 nl-Tropfen von geschmolzenem 0,5%-igem Agar mit entweder 0 μg/ml, 500 μg/ml oder 5 mg/ml Kanamycin (0, 100 und 1000 ng Kanamycin) wurden auf ein mit Ethanol sterilisiertes Durchflusssubstrat getropft, so dass Agartropfen mit einem Durchmesser von 1 mm durch das Substrat ausgebildet wurden. Die poröse Natur des Substrats zieht den geschmolzenen Agar mittels Kapillarkraft in die Poren. Diese behandelten Substrate wurden dann mit 106 cfu/ml E. coli XL2 MRF'-Zellen überschichtet, welche das Plasmid pUC18 enthielten und die im 2TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin kultiviert wurden, und auf 2TY-Platten mit derselben Konzentration an Ampicillin aufgebracht. Die Platten wurden anschließend 12 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Zusammenfassend gesagt, zeigt dieses Experiment, dass eine Antibiotikasensitivität im Mikromaßstab getestet werden kann, indem Agartropfen, die ein Antibiotikum enthalten, auf das poröse Substrat aufgedruckt werden. Der Lebendarray gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt die Lokalisierung von Effektoren in kontrollierten Tropfen, die entweder direkt aufgedruckt oder in eine Matrix, wie Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, innerhalb der Poren des porösen Substrats eingebettet wurden. Das Aufdrucken des Antibiotikums direkt oder in Agar oder anderen Matrizes erlaubt es, dass dieser Assay als Multiplex-Assay verwendet werden kann, so dass Tausende von Assays pro Quadratzentimeter Arrayoberfläche mit einer Präzision und einem Fehlen an Kreuzkontamination ausgeführt werden können, die/das auf Glas- oder anderen planaren Assays nicht möglich ist.
  • Beispiel 4: Einfangen von Bakterien auf der Oberfläche eines festen Durchflusssubstrats mittels Filtration – Kolonienachweis und Morphologie
  • E. coli XL2 blue MRF'-Zellen, die das Plasmid pGFPuv (Clontech/BD) enthielten und aktiv GFP exprimierten, wurden auf 103 Bakterien/ml verdünnt. Ein steriles Durchflusssubstrat wurde in einen Nalgene-Filter mit 0,22 μM Poren und 10 cm Durchmesser platziert, und Medium wurde über und durch das Substrat gegossen. Als eine Kontrolle wurde das Substrat unter Schütteln in einem ähnlichen Volumen an Medium mit derselben Dichte an Bakterien inkubiert. Das Substrat wurde anschließend auf L-Agarplatten über Nacht inkubiert, und GFP wurde verwendet, um Kolonien zu visualisieren.
  • Wie in 5A und 5B gezeigt ist, wurde die Anhäufung von Bakterien gezeigt. Darüber hinaus konnten Mikrokolonien nachgewiesen werden, die einen Durchmesser von weniger als 100 μm auf dem Substrat aufwiesen (5C und 5D); bakterielle Kolonien (5C) konnten in derselben Größe wie ein aufgedruckter Oligonukleotidpunkt nachgewiesen werden (5D).
  • Zusammenfassend gesagt, wurde die Konzentrierung von Bakterien gezeigt, indem sie durch Filtration unter Verwendung eines geeignet gestützten Durchflusssubstrats eingefangen wurden. Im Allgemeinen wird nicht zugelassen, dass Mikroorganismen den Agar oder eine andere Matrix unterhalb des Substrats penetrieren. Dies findet seine Anwendung in Anwendungen wie der Testung der Wasserqualität, beispielsweise eine Kombination von Filteranreicherung und einem Arraysubstrat, auf das selektive Wachstumsmedien oder ein weiteres Einfang- (Nachweis-) oder Typisierungsagens (z.B. Antikörper) aufgetropft wurden. Darüber hinaus streuen bakterielle Kolonien, wie in anderen Experimenten gesehen wurde, im Vergleich zum Agar auf dem Durchflusssubstrat weniger, und sie können in derselben Größe wie ein aufgedruckter Oligonukleotidpunkt nachgewiesen werden. Die letzteren beiden Eigenschaften unterstützen die Verwendung des Durchflusssubstrats in hochdichten Lebendarray-Anwendungen.
  • Beispiel 5: Verwendung einer überlagernden Maske auf dem festen Durchflusssubstrat – Kompartimentalisierung und Test auf Autofluoreszenz
  • Wie in den oben genannten Experimenten gezeigt wurde, zeigt das feste Durchflusssubstrat, wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine relativ geringe Streuung von Mikroorganismen auf seiner Oberfläche, allerdings kann es wünschenswert sein, es für enzymatische Reaktionen oder Mikrobiologie oder andere Lebendzellarray-Anwendungen noch weiter zu kompartimentalisieren.
  • Ein mit Ethanol sterilisiertes festes Durchflusssubstrat wurde mit einer Vielzahl von Verbindungen versehen, um nach einem geeigneten Maskierungsagens zu suchen, um Bereiche auf dem Substrat zu kompartimentalisieren. Kriterien für ein geeignetes Markierungsagens waren: (1) leichte Anwendbarkeit, (2) geringe Fluoreszenz in Cy3-, Cy5- und Fluorescein-Kanälen, (3) Resistenz gegenüber Lösungsmittelsterilisierung, (4) fehlende Wasserlöslichkeit und (5) Fähigkeit, sowohl die Poren in dem Substrat zu blockieren als auch eine mikrobielle Streuung innerhalb einzelner Bereiche zu verhindern (siehe 3A). Der führende Kandidat, ein Maskierungsfilm aus Latex, wurde extensiv auf seine Eignung hinsichtlich Sterilität, Lösungsmittelresistenz, Autofluoreszenz und Einfachheit der Anwendung getestet.
  • Als eine geeignete Substanz wurde ein flüssiger Maskierungsfilm aus Latex mit geringer Fluoreszenz gefunden, wie er von den üblichen Anbietern in dem Fachgebiet verkauft wird. Talens Liquid Masking Film (052, Royal Talens, Apeldoorn, Holland) war geeignet, aber andere Maskierungsagenzien können genauso anwendbar sein. Das Markierungsagens wurde unter Verwendung einer mit Ethanol sterilisierten Zobelhaarbürste Nummer 1 aufgetragen. Nachdem sie 2 Stunden lang trocknen gelassen wurden, wurden die Proben in 95% Ethanol, 100% Methanol, 100% Isopropanol, steriles 1 % SDS, steriles Wasser oder 100% DMSO 10 Minuten lang eingetaucht, wonach sie in sterilem Wasser abgespült und getrocknet wurden. Das behandelte Substrat wurde anschließend auf Resistenz der Maskierungsflüssigkeit gegenüber Lösungsmitteln, Fluoreszenz und Sterilität untersucht (siehe Tabelle 2). Ein Beispiel der Maskierung ist in 3B gezeigt.
  • Zusammenfassend gesagt, kann die Oberfläche des Durchflusssubstrats für Mikroorganismen unter Verwendung eines aufgedruckten Maskierungsagens kompartimentalisiert werden, welches das Substrat auch in ein robusteres Kompositmaterial verwandelt. Selbst unter Bedingungen, die zu einem Überwachsen auf Agar führen würden, ist die Kompartimentalisierung auf dem Durchflusssubstrat effektiv.
  • Der Waschschritt wies eine gemäßigte Wirkung auf die Fluoreszenz des Maskierungsagens auf, beeinträchtigte jedoch nicht die Sterilität. Methanol und DMSO erwiesen sich als die besten Waschagenzien, da sie das Substrat und das Maskierungsagens unbeschädigt und mit einer geringen Autofluoreszenz hinterließen. Sobald es trocken war, war das Maskierungsagens gegenüber den getesteten Lösungsmitteln außerordentlich resistent. Diese Maske soll den Lebendarray kompartimentalisieren, wobei jedes Kompartiment einen anderen Analyten oder Zelltyp enthält, und ist außergewöhnlich gut anwendbar für das Wachstum auf einem festen Substrat, das für bakterielle und pilzliche Anwendungen geeignet ist, kann jedoch auch verwendet werden, um eine laterale Streuung von Säugetier- oder anderen auf der Oberfläche kultivierten Gewebekulturzellen zu reduzieren.
  • Beispiel 6: Maskierungsbereiche auf dem Durchflusssubstrat – Kompartimentalisierung für bakterielles Wachstum
  • Das Durchflusssubstrat wurde sterilisiert, wie oben angegeben maskiert und vor Verwendung in 100% Methanol gewaschen. Das Substrat wurde anschließend auf L-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG platziert und mit E. coli XL2 blue MRF', die das Plasmid pGFPuv (Clontech/BD Biosciences) enthielten und eine Variante von GFP exprimieren, die für Bakterien geeignet ist, entweder überschichtet oder bedruckt. Das Wachstum und die Fluoreszenz wurden nach Inkubation über Nacht bei 37°C ermittelt.
  • Wie in 4A gezeigt ist, wurde im Fall des spezifischen Auftropfens in Kompartimente ein gutes Wachstum beobachtet, es wurde eine gute Eingrenzung von Bakterien ohne Streuung in benachbarte Kompartimente gezeigt (4B und 4C).
  • Zusammenfassend gesagt, kann bakterielles Wachstum effektiv ohne Streuung zwischen Kompartimenten unter Verwendung eines Maskierungsagens effektiv kompartimentalisiert werden. Ein automatisiertes Bedrucken und eine automatisierte Maskierung können eine weitere Miniaturisierung dieses Vorgangs gewährleisten.
  • Beispiel 7: Verwendung der GFP-Expression, um die Antibiotika-Sensitivität auf einem kompartimentalisierten Durchflusssubstrat zu überwachen
  • Kompartimente eines Durchflusssubstrats wurden in 1 % Metaphor-Agarose mit verschiedenen Konzentrationen an Kanamycin bedruckt. Es wurde darauf geachtet, dass das Bedrucken bei einer Temperatur von unter 60°C stattfand, und alle Proben wurden in dreifacher Ausführung aufgedruckt. Diese Substrate wurden auf L-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin platziert und mit E. coli XL2 Blue beschichtet, die GFP exprimierten. Ein mit einer Kappa-Kamera ausgerüstetes Mikroskop wurde verwendet, um Aufnahmen zu machen, welche digitalisiert und quantifiziert wurden, um die Wirkung von Kanamycin auf das bakterielle Wachstum und die Lebensfähigkeit zu bestimmen.
  • Die Wirkung von Kanamycin auf die Lebensfähigkeit konnte unter Verwendung eines GFP-Reporters, wie er in 6 gezeigt ist, deutlich nachgewiesen werden.
  • Zusammenfassend gesagt, zeigt dieses Experiment die Verwendung eines Fluoreszenzreporters oder Auslesesystems, die bei Lebendarrays auf einem Durchflusssubstrat verwendet werden.
  • Beispiel 8: Transformation von Plasmiden in E. coli auf einem kompartimentalisierten Durchflusssubstrat
  • Es wurden zwei Verfahren verwendet, wobei bei dem ersten Verfahren (a) Plasmid und E. coli unmittelbar vor der Aufbringung auf den Array gemischt wurden, und wobei bei dem zweiten Verfahren (b) die zwei Bestandteile auf dem Array selbst gemischt wurden.
    • (A) 10 ng pGFPuv oder pUC18 wurden separat in 10 μl-Aliquots in kompetente Zellen (Stratagene XL2 Blue MRF') transformiert, indem die zwei Bestandteile einfach gemischt wurden, und diese Gemische wurden in (etwa) 0,2 μl-Aliquots auf kompartimentalisierte Durchflusschips getropft, welche anschließend über Nacht auf L-Agar/Ampicillin-Platten kultiviert wurden.
    • (B) pGFPuv-DNA (etwa 0,2 μl) wurde auf das Substrat getropft; anschließend wurden 0,5 μl kompetente Zellen wenige Sekunden später dazugetropft. Das Substrat wurde anschließend auf L-Agar/Ampicillin-Platten platziert und über Nacht darauf inkubiert.
  • Wie in den 7A und 7B gezeigt ist, konnten pUC und pGFPuv auf dem kompartimentalisierten Substrat nach einer kurzen Mischung gemäß dem oben dargestellten Verfahren A effizient transformiert werden. Es wurde keine Streuung in benachbarte Kompartimente beobachtet.
  • Wie in 7C gezeigt ist, konnte pGFPuv ebenfalls in E. coli transformiert werden, indem die zwei Bestandteile auf dem Substrat gemäß dem oben beschriebenen Verfahren B gemischt wurden.
  • Zusammenfassend gesagt, ist die Kompartimentalisierung sogar nach 48 Stunden (7D) bei der Begrenzung des Wachstums inokulierter Bereiche und bei der Verhinderung von Kreuzkontamination wirksam. Diese Daten hinsichtlich der Transformation eröffnen den Weg zu Transformationsverfahren, welche die Auftropfung aufgereinigter DNA gefolgt von der Einführung von Zellen direkt auf das Substrat, entweder in rascher Auseinanderfolge oder gemeinsam, für Anwendungen bei einem Lebendarray beinhalten. Bakterien können unmittelbar vor dem Bedrucken oder sogar auf dem Chip mit hoher Effizienz transformiert werden.
  • Eine gekühlte Inkubation von Bakterien mit DNA und ein Hitzeschock, was bei vielen Transformationsprotokollen üblich ist, können ebenfalls auf einem Chip ausgeführt werden. Es ist gegebenenfalls möglich, beispielsweise 96 Zelltypen (z.B. E. coli mit 96 unterschiedlichen Transposoninsertionen) von einem Satz 96-Loch-Platten mit 96 komplementierenden Plasmiden (oder einem anderen Effektor, der vom Substrat aus aufgenommen wird) für Tausende von Kombinationen von Stamm und Effektor unter Verwendung dieser Methodik aufzudrucken.
  • Beispiel 9: Einfangen von Bakterien mit Antikörpern auf einem Durchflusssubstrat
  • Unbehandeltes Durchflusssubstrat wurde mit Ethanol sterilisiert und anschließend mit Aliquots einer Hase-Anti-E. coli-Ig-Fraktion, die durch Inokulation eines Hasen mit einem sonifizierten Extrakt des von E. coli K12 abgeleiteten Stamms C600 (von DAKO A/S, Dänemark, CATB0357, Charge 090-101) erhalten wurde, oder einen Kontrollantikörper (M13-Antikörper von Santa Cruz) behandelt. Diese Objektträger wurden 2 Stunden lang in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert und anschließend kurz getrocknet, um die Antikörper zu immobilisieren, gewaschen und unter leichtem Schütteln mit 10 ml L-Medium mit 106 E. coli, die GFP exprimieren, (oder einer Sterilitätskontrolle ohne E. coli) inkubiert. Nach Waschen in L-Medium wurden die Substrate auf L-Agarplatten plattiert, und fluoreszierende Kolonien wurden am nächsten Tag gezählt.
  • Als ein Ergebnis wurde die Anhäufung von Bakterien, die für den E. coli spezifischen Antikörper spezifisch waren, beobachtet, wie in 8 gezeigt ist. Mit dem E. coli-Antikörper wurden im Durchschnitt 214 Kolonien pro Substrat (n = 2) und 71 mit dem M13-Kontrollantikörper (n = 2) beobachtet.
  • Zusammenfassend gesagt, wurde ein spezifisches Einfangen von Zellen mit Antikörpern auf dem Durchflusssubstrat gezeigt.
  • Beispiel 10: Antikörper-Arrays
  • Antikörper gegen die Hitzeschockproteine HSP90alpha, HSP90beta, PolyUBQ und Beta-Aktin werden in einem Arrayformat auf ein Aluminiumoxidsubstrat (Anopore, Whatman) unter Verwendung von Standardprotokollen aufgetropft.
  • Jurkatzellen werden unter Standardbedingungen in einem CO2-Inkubator bis zu einer Dichte von 106 Zellen/ml wachsen gelassen. 25 μl Zellsuspension werden zum Array hinzugefügt. Das Kulturmedium wird durch Absaugen durch den Array unter Verwendung von Standardausrüstung entfernt, und 50 μl frisches Medium werden hinzugefügt. Die Zellen werden unter sterilen Bedingungen auf dem Substrat bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert, oder bis eine Dichte von 107 Zellen/ml erreicht ist. Die Temperatur wird 15 Minuten lang auf 43°C angehoben. Die Kontrolle wird bei 37°C gehalten. Das Kulturmedium wird mittels Absaugung durch den Array entfernt. Die Zellen werden mit 50 μl Waschflüssigkeit gewaschen. Nach Entfernung dieser Flüssigkeit mittels Absaugung durch den Array werden 25 μl Lysepuffer hinzugefügt. Nach einer Lyse von 15 min. Länge wird die Flüssigkeit 15 min. lang mit zwei Zyklen Ein- und Abfluss pro Minute durch den Array hin und her gepumpt. Die Flüssigkeit wird mittels Absaugung entfernt, der Array wird mit 25 μl Waschpuffer gewaschen, der mittels Absaugung entfernt wird. 20 μl eines Gemisches von Anti-Hitzeschock-Antikörpern (Anti-HSP90alpha, Anti-HSP90beta, Anti-PolyUBQ und Anti-Beta-Aktin, alle mit Fluorescein markiert) werden hinzugefügt und 15 Minuten lang mit zwei Zyklen pro Minute durch den Array gepumpt. Alle zwei Minuten werden Aufnahmen gemacht. Im Fall, dass der Hintergrund zu stark ist, wird die Antikörperlösung aus dem Array entfernt, und der Array wird mit Waschpuffer gewaschen. Aufnahmen werden gemacht. Die Daten werden unter Verwendung von Standardsoftware analysiert.
  • Die Antikörper können monoklonale, polyklonale, Einzelkettenantikörper, Aptamere sein, wobei diejenigen, die auf das Substrat getropft werden, ein anderes Epitop erkennen als diejenigen, die für den Nachweis der gebundenen Antikörper hinzugefügt werden.
  • Beispiel 11: Induktion von Cytochrom P450 Isoenzym 1A (CYP1A)
  • Ethoxyresorufin wird chemisch mit einem Kreuzvernetzungsmittel modifiziert und unter Verwendung einer Auftropftechnologie, wie sie auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist, auf ein Aluminiumoxid-Substrat aufgetropft.
  • Hepatozyten werden, wie von van 't Hoen et al. (2000) beschrieben, zubereitet. P.A.Chr 't Hoen et al., Selective induction of crytochrome P450 3A1 by dexamethason in cultured rat hepatocytes. Analyses with a novel reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Biochemical Pharmacology, Bd. 60, S. 1509–1518 (2000). Die Lebensfähigkeit wird mittels Tryptan-Blau-Ausschluss beurteilt. 50 μl Zellsuspension mit einer Zelldichte von 80.000 Zellen/ml werden zu dem Substrat hinzugefügt. Das Kulturmedium wird mittels Absaugung durch das Substrat unter Verwendung von Standardausrüstung entfernt. Um eine Anhaftung zu erlauben, werden die Zellen anfänglich 3,5 Stunden lang in DMEM mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum, 140 mU ml–1 Insulin, 2 mM L-Glutamin, 100 U ml–1 Penicillin und 100 Mikrogramm ml–1 Streptomycin in einer feuchten CO2-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Danach werden nicht anhaftende Zellen mittels Pipettierung des Mediums weggewaschen. Das Inkubationsmedium wird zu serumfreiem DMEM gewechselt, das 0,2% (w/v) BSA, 140 mU ml–1 Insulin, 2 mM L-Glutamin, 200 U ml–1 Penicillin und 200 μg ml–1 Streptomycin enthält. Die Hepatozyten werden innerhalb eines Tages eine konfluente Schicht ausbilden. Vierundzwanzig Stunden nach Auftrag der Zellen auf dem Array wird ein Großteil des Mediums mittels Absaugung entfernt, wobei darauf geachtet wird, dass die Zellen nicht austrocknen.
  • Benz[a]pyren, Dexamethason, Phenobarbital, Hexobarbital, Debrisquine, Anilin, Midazolam (Konzentration reicht von 1 bis 100 μM in DMSO) werden auf spezifische Bereiche (in Arrayform) auf die Zellschicht mittels einer Piezotintenstrahlauftropftechnologie aufgetragen. Dreißig Minuten nach Auftrag der Induktoren werden 25 Mikroliter Kulturmedium hinzugefügt.
  • Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wird das Medium mittels Absaugung entfernt, und 5 μl Lysepuffer werden hinzugefügt. Zwei μl einer Reaktionslösung werden hinzugefügt, und das Lysat wird in den Array gezogen. Die Entwicklung von Fluoreszenz durch Freisetzung von Resorufin in den Poren wird unter Verwendung der Standardausrüstung überwacht, und alle 10 sec werden Bilder gemacht.
  • Diese Verbindungen induzieren unterschiedliche Isoenzyme von Cytochrom c. Einige sind sehr aktiv in der Konversion von Ethoxyresorufin, einige sind es kaum oder überhaupt nicht. Durch Lyse sollte cyt P450 aus der Zelle diffundieren, aber dies kann schwierig sein, da es ein Membran-gebundenes Enzym ist, das Co-Enzyme und Co-Faktoren benötigen könnte.
  • Alternativ ist es möglicherweise nicht notwendig, Ethoxyresorufin an das Substrat zu koppeln; die Zugabe und Aufnahme durch die Zellen kann eine Überwachung der Aktivität in situ erlauben, bevor es weg diffundiert.
  • Während dieser enzymatischen Reaktion erfolgt kein Pumpen, um zu verhindern, dass das Produkt von der Reaktionsstelle weg diffundiert.
  • Beispiel 12: Wachstum eines filamentösen Pilzes auf einem Durchflusssubstrat
  • Eine Penicillium-Pilzart, die von altem Brot isoliert wurde, wurde auf ein Durchflusssubstrat (Aluminiumoxid, Anopore; Whatman) auf L-Agar plattiert und in einer feuchten Kammer 3 Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Es wurde ein gutes und schnelles Wachstum erhalten, wie in 9A, 9B und 9C gezeigt ist.
  • Dieses Experiment zeigt, dass auf dem Durchflusssubstrat pilzliches Wachstum möglich ist, eine ähnliche Bandbreite von Anwendungen wie für prokaryotische Mikroorganismen kann auf Lebendchips möglich sein.
  • Beispiel 13: Prinzipien des Einfangens mit Antikörpern und des Nachweises auf einem Chip, beruhend auf Detergenzsensitivität, Enzymaktivität und einer Transposoninsertion, bei einer Stammtypisierung, Diagnoseaufbau für ein bakterielles Pathogen
  • Erläutert werden die Prinzipien des Einfangens mit Antikörpern und des Nachweises auf einem Chip, beruhend auf Detergenzsensitivität, Enzymaktivität und einer Transposoninsertion, bei einer Stammtypisierung, einem Diagnoseaufbau für ein bakterielles Pathogen. In dieser Analyse wird eine Vielzahl von Informationen von einem Array mit nur 5 Auftropfstellen erhalten. Das Experiment geht von einem Gemisch von neun Bakterienstämmen, die von einem Patienten erhalten wurden (Tabelle 3), und einem Antikörper-Arrayformat mit 5 Auftropfstellen aus, die Antikörper gegen die Antigene A, B, C, D bzw. E darstellen (10); Auftropfstelle E ist eine Auftropfstelle für eine Negativkontrolle.
  • Eine komplexe Probe pathogener Bakterien von einem Patienten wird durch zwei identische Arrays passagiert, wie in 10 – Array 1A beschrieben ist. Die erwartete Rekrutierung jedes Stammtyps an den Array, die auf den Oberflächenantigenen A bis D beruht, die von spezifischen Antikörpern gebunden werden, ist in 10 – Array 1B gezeigt. Die Zahlen auf jeder Auftropfstelle zeigen die Stämme an, die zu jeder Position auf dem Array rekrutiert wurden.
  • Der erste Array wird anschließend auf ein nicht selektives Agarmedium platziert, auf dem alle Stämme wachsen sollten. Der zweite Array wird auf ein Selektivmedium platziert, das ein Detergenz enthält, welches das Wachstum von Detergenz-sensitiven Stämmen inhibiert. Die erwarteten Wachstumsmuster (d.h. Auftropfstellen, die durch Nährstoffe, die durch das poröse Pam-Substrat nach oben diffundieren, zu Kolonien werden) sind in 10 – Arrays 1C und 1D gezeigt.
  • Die Arrays 1C und 1D werden nun auf ein weiteres Medium plattiert, welches ein fluorogenes Substrat für das Enzym von Interesse enthält. Die Kolonien, von denen vorauszusehen ist, dass sie auf Grund von Enzymaktivität fluoreszent werden, sind in 10 – Arrays 1E und 1F gezeigt. Dies erfordert die Bindung des geeigneten Stamms, das Wachstum auf einem Selektivmedium und die Produktion des fraglichen Enzyms.
  • Die Arrays werden anschließend von dem Selektivagar entfernt, und die Zellen werden auf dem Array in situ lysiert, ihre DNA mit dem Substrat kreuzvernetzt. Anschließend wird mit einem markierten Oligonukleotid, welches das Transposon X mittels spezifischer Hybridisierung nachweist, eine Standardnukleinsäurehybridisierung ausgeführt, wobei die Funktionalität des Durchflussarrays als ein Schnellhybridisierungsarray genutzt wird. Die erwarteten Ergebnisse sind in 10 – Arrays 1G und 1H gezeigt. Nun sind nur Stämme, die von einem spezifischen Antikörper eingefangen werden, in der Lage, auf dem verwendeten Medium zu wachsen, und sie werden als Transposonsequenz enthaltend nachgewiesen.
  • Dieses Arraysystem ermöglicht eine große Flexibilität und die Möglichkeit, viele verschiedene Assays zu einer komplexen Analyse einer Vielzahl von Parametern simultan zu verbinden.
  • Tabelle 1: Sensitivität von E. coli XL2 Blue MRF' gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin, wenn sie auf dem Pam-Substrat kultiviert werden.
    Figure 00410001
  • Tabelle 2: Effekt der Waschbehandlung auf das Maskierungsagens, das auf das Pam-Substrat aufgetragen wurde.
    Figure 00410002
  • Fluoreszenz: Wurde unter Verwendung eines Olympus BX41 UV-Mikroskops bestimmt. ++ nicht akzeptierbare hohe Autofluoreszenz (Sättigung erfolgt bei einer Expositionszeit von weniger als 98 ms), + Sättigung erfolgt unter Verwendung einer 12-bit Kappa CCD-Kamera bei einer Expositionszeit zwischen 98 und 200 ms, +/– Sättigung erfolgt unter Verwendung einer CCD-Kamera zwischen 200 ms und 1 Sekunde. – Sättigung erfolgt unter Verwendung einer CCD-Kamera bei einer Expositionszeit von mehr als 1 Sekunde.
  • Lösungsmittelresistenz: Wurde unter Verwendung von Lichtmikroskopie mit einer BX41-Kamera bestimmt; sie wurde auf der Grundlage der Resistenz des Maskierungsmittels gegenüber der Waschbehandlung bestimmt.
  • Sterilität: Wurde bestimmt, indem das Substrat über Nacht auf L-Agarplatten bei 37°C plattiert wurde. Steril zeigt keine Kolonien auf der Substratoberfläche an.
  • Tabelle 3: Neun Bakterienstämme in einer Probe von einem Patienten, wie sie in Beispiel 13 verwendet wurde. Nur die Stämme 4 und 5 weisen das Transposon X in ihrem Genom inseriert auf.
    Figure 00420001

Claims (31)

  1. Verfahren zur Durchmusterung zellulärer Reaktionen auf zelluläre Bestandteile, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen zellulärer Bestandteile, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Vesikel, Organellen, Vektoren, Viren und ganze intakte lebensfähige Zellen, Säugetierzellen, Insektenzellen, Hefezellen, pilzliche Zellen, Pflanzenzellen und mikrobielle Zellen einschließlich prokaryotischer Zellen, bakterieller Zellen, Mykoplasmen, Gewebeschnitte, fixierter Zellen, und mikroskopische multizelluläre Organismen einschließlich Nematoden und Zebrafisch umfasst, auf der Oberfläche eines festen porösen Metalloxidsubstrats, wobei (i) das feste poröse Substrat gerichtete durchgehende Kanäle besitzt; (ii) das feste poröse Substrat die zellulären Bestandteile auf seiner Oberfläche zurückhält, und wobei (iii) das feste poröse Substrat innerhalb der darin vorhandenen Poren immobilisiert einen Array von Detektormolekülen aufweist; (b) Zufuhr von Testverbindungen an Positionen auf dem Substrat, die den in einem Array vorliegenden Detektormolekülen auf der Oberfläche des festen porösen Substrats entsprechen; (c) Inkubieren der Testverbindungen mit den zellulären Bestandteilen auf der Oberfläche des festen porösen Substrats unter Bedingungen, welche die Induktion zellulärer Reaktionen erlauben; (d) Untersuchen der zellulären Reaktionen; und Identifizierung und Charakterisierung der zellulären Reaktionen, die durch die Testverbindungen induziert werden.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das feste Substrat ein durchfluss-poröses festes Substrat ist.
  3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Bereitstellen zellulärer Bestandteile auf der Oberfläche eines Substrats durch eine direkte Aufbringung eines Inokulums oder einer Kultur auf das Substrat erfolgt.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zufuhr von Testverbindungen mittels Anpresskraft erfolgt.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Anpresskraft eine Kapillarkraft oder eine piezo-elektrische Kraft ist.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der/die Nährstoff(e) von unterhalb der Poren der festen Oberfläche bereitgestellt werden.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Untersuchung der zellulären Reaktionen erfolgt durch: (a) Versehen der zellulären Bestandteile mit einem Nachweisagens; (b) Wegwaschen eines Überschusses an nicht eingebautem Nachweisagens; (c) Nachweis des Vorliegens oder Fehlens einer Änderung eines nachweisbaren Signals, wobei das Vorliegen einer Änderung des nachweisbaren Signals eine zelluläre Reaktion anzeigt.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die zelluläre Reaktion in der Gesamtkultur oder im Zellkulturmedium, in isolierten Zellen wie pelletierten Zellen, im Überstand der zellulären Bestandteile oder im Lysat der zellulären Bestandteile untersucht wird.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zufuhr von Testverbindungen durch ein Mittel erfolgt, das ausgewählt wird aus der Gruppe, die eine Zufuhrmaske, eine Hochpräzisions-x-y-z-Pipettierhilfe, einen Tintenstrahldrucker und manuelle Abwicklung umfasst.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Zufuhr von Testverbindungen mittels einer Hochpräzisions-x-y-z-Pipettierhilfe oder einem Tintenstrahldrucker erfolgt.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Identifizierung der zellulären Reaktionen durch Lumineszenz erfolgt.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Lumineszenz Fluoreszenz ist.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Detektormoleküle ausgewählt werden aus der Gruppe, die Nukleinsäuren einschließlich modifizierter Analoga davon, Peptide, Proteine und Antikörper einschließlich Antikörperfragmente, Enzymsubstrate und spezifische Farbstoffe umfasst.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die zellulären Reaktionen ausgewählt werden aus der Gruppe, die chemisch induzierte oder physiologische Ereignisse in der Zelle einschließlich Lyse, Apoptose, Wachstumsinhibierung und Wachstumsförderung umfasst; Produktion, Sekretion und Exponieren eines Proteins oder anderer Moleküle von Interesse auf der Oberfläche durch die Zelle umfasst; die Aktivierung eines Membranoberflächenmoleküls einschließlich der Rezeptoraktivierung umfasst; Transmembranionentransporte umfasst; und transkriptionelle Regulationen umfasst.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Molekül von Interesse ausgewählt wird aus der Gruppe, die Peptide einschließlich Lipopeptide, glykosylierte Peptide und antimikrobielle Peptide, Polypeptide, Proteine, Enzyme, antimikrobielle Moleküle, primäre und sekundäre Metaboliten und kleine organische Moleküle einschließlich pharmazeutischer Moleküle umfasst.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Testverbindung ein Wirkstoff oder eine beliebige Verbindung ist, die im Auswahlverfahren eines Wirkstoffkandidaten nützlich ist.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Testverbindung ein Wirkstoff ist, der ausgewählt wird aus einer chemischen oder natürlichen Wirkstoffkandidatenbibliothek.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das feste Substrat ein Aluminiumoxidsubstrat ist.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Untersuchung in Echtzeit ausgeführt wird.
  20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Untersuchung eine Endpunktuntersuchung ist.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Zufuhr eines Nachweisagens an die zellulären Bestandteile vor der Zufuhr einer Testverbindung erfolgt, wobei bereits markierte zelluläre Bestandteile bereitgestellt werden.
  22. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Überwachung induzierter zellulärer Reaktionen von Wirtszellen.
  23. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 für auf dem Chip ausgeführte Rekombination, Transformation oder virale Einführung zellulärer Bestandteile.
  24. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 für die funktionale Durchmusterung zellulärer Reaktionen nach Untersuchung der Wirtszellen mit Testverbindungen.
  25. Mikroarray, umfassend ein festes poröses Metalloxidsubstrat mit gerichteten durchgängigen Kanälen und einen Array von Detektormolekülen innerhalb der Poren des Substrats, zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei ein Array von Testverbindungen innerhalb vorbestimmter Bereiche bereitgestellt wird, wobei die Testverbindungen in flüssiger Lösung vorliegen und nicht in dem Substrat immobilisiert sind.
  26. Mikroarray, umfassend ein festes poröses Metalloxidsubstrat mit gerichteten durchgängigen Kanälen und einen Array von Detektormolekülen innerhalb der Poren des Substrats, zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei ein Array zellulärer Bestandteile, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Vesikel, Organellen Vektoren, Viren und ganze intakte lebensfähige Zellen, Säugetierzellen, Insektenzellen, Hefezellen, pilzliche Zellen, Pflanzenzellen und mikrobielle Zellen einschließlich prokaryotischer Zellen, bakterieller Zellen, Mykoplasmen, Gewebeschnitte, fixierter Zellen, und mikroskopische multizelluläre Organismen einschließlich Nematoden und Zebrafisch umfasst, in vorbestimmten Bereichen auf einem Substrat bereitgestellt werden, wobei die zellulären Bestandteile so konditioniert sind, dass sie auf dem Substrat konserviert sind.
  27. Mikroarray, umfassend ein festes poröses Metalloxidsubstrat mit gerichteten durchgängigen Kanälen und einen Array von Detektormolekülen innerhalb der Poren des Substrats, zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei ein zellulärer Bestandteil, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die Vesikel, Organellen, Vektoren, Viren und ganze intakte lebensfähige Zellen, Säugetierzellen, Insektenzellen, Hefezellen, pilzliche Zellen, Pflanzenzellen und mikrobielle Zellen einschließlich prokaryotischer Zellen, bakterieller Zellen, Mykoplasmen, Gewebeschnitte, fixierter Zellen, und mikroskopische multizelluläre Organismen einschließlich Nematoden und Zebrafisch umfasst, auf einem Substrat bereitgestellt wird, wobei der zelluläre Bestandteil so konditioniert ist, dass er auf dem Substrat konserviert ist.
  28. Mikroarray gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei der Array von Detektormolekülen eine Vielzahl gleicher Detektormoleküle oder eine Vielzahl unterschiedlicher Detektormoleküle umfasst.
  29. Mikroarray gemäß Anspruch 26 oder 27, wobei die Konditionierung ausgewählt wird aus der Gruppe, die Lyophilisierung und Glycerinauflösung umfasst.
  30. Verwendung eines Mikroarrays gemäß einem der Ansprüche 25 bis 29, um zelluläre Bestandteile, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Vesikel, Organellen, Vektoren, Viren und ganze intakte lebensfähige Zellen, Säugetierzellen, Insektenzellen, Hefezellen, pilzliche Zellen, Pflanzenzellen und mikrobielle Zellen einschließlich prokaryotischer Zellen, bakterieller Zellen, Mykoplasmen, Gewebeschnitte, fixierter Zellen, und mikroskopische multizelluläre Organismen einschließlich Nematoden und Zebrafisch umfasst, auf der Oberfläche eines Substrats bereitzustellen, zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die zellulären Bestandteile mit Eigenschaften einer geringen Verteilung ausgestattet werden.
  31. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, umfassend einen Mikroarray gemäß einem der Ansprüche 25 bis 29.
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