WO2007140889A1 - Verfahren zur erzeugung perfekter macro- und microarrays durch kombinieren vorselektierter beschichteter festphasen-fragmente - Google Patents

Verfahren zur erzeugung perfekter macro- und microarrays durch kombinieren vorselektierter beschichteter festphasen-fragmente Download PDF

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support
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Ulf Steller
Winfried STÖCKER
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Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag
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Definitions

  • arrays are understood to mean a collection of different solid-phase bound capture molecules, each of which can more or less specifically bind one or more molecules of interest in a sample flow, the analytes.
  • the different capture molecules are often in the form of small spots. of about one to 1000 microns diameter immobilized on a flachformigen carrier and arranged lattice-like, but can also be present in other form, for example, as tiny spheres in suspension, in which case each ball ⁇ d R is coated with only one type Fanger molecule
  • Macro- and microarrays make it possible to determine a huge number (up to more than one hundred thousand) analytes simultaneously, ie by a single incubation of the sample fluid with the array.
  • Particularly widespread applications are the analysis of gene expression, the determination of DNA sequences (eg B the organisms identification, genotyping, determination of polymorphisms) as well as the determination of quantity and identity of proteins and antibodies in a biological sample, eg of human, animal or vegetable origin
  • Fanger molecules typically nucleic acids, eg Oligonukleotide , Polynucleotides or cDNA molecules, plasmids or BAC clones, proteins, antigens and antibodies or peptides as capture molecules are used
  • the most common methods currently used to produce flat-form arrays are the printing of molecules onto a support and / n-srfu synthesis directly on a support.
  • Printing is a universally applicable process for most types of molecules.
  • microdroplets typically 0.1 - 100 nl, each containing a variety of the capture molecules on the support by means of a printing process, for example by means of a dot matrix printer or an inkjet printer-like, non-contact microdispenser (eg piezo technology
  • the catcher molecules in the microdrops bind to the carrier and thus shape the spots, and the droplets are usually arranged in defined positions, for example in the form of a grid, later to be able to conclude the position of the spots on the identity of the captured at this point capture molecule.
  • the different capture molecules are synthesized in parallel directly on a support. This method is limited to those molecules which can be synthesized on solid phases and is e.g. used for the preparation of oligonucleotide and peptide arrays.
  • suspension arrays are used for multiparameter analysis, in which the capture molecules are bound to very small particles.
  • examples include the "UltraPlex” technology from the company SmartBead Technologies Ltd. (Cambridge, UK, www.SmartBead.com) and the xMAP TM technology from Luminex Corporation (USA, www.luminexcorp.com).
  • a code is attached to each particle, over which the identity of the capture molecule immobilized on the particle can be determined, since this assignment can not take place as in an ordered area array on the position.
  • xM4P TM technology this is done, for example, by the ratio of two fluorescent dyes used to color the plastic beads; UltraPlex technology uses highly miniaturized barcodes on the rod-shaped particles.
  • suspension arrays An advantage of suspension arrays is that the coating of the solid phase with the scavenger molecule similar to the invention presented here spatially and temporally separated from the expression of the array - in suspension arrays the mixing of differently coated particles - takes place.
  • this method also involves numerous disadvantages:
  • the coating quality can be controlled for each individual particle only with great technical effort, since each particle must be analyzed individually. To make matters worse in the analysis of three-dimensional particles added that in this survey is not necessarily the side of the particle is detected, which is also read later in the analysis. Thus, the ability to control each particle is only possible if it is ensured that the coating is very uniform over the entire surface of the particles. Ultimately, however, the evidence that the coating has met certain set criteria at the point read later in the analysis is almost impossible due to the random arrangement of the particles during the measurement process.
  • the binding conditions for the immobilization on the solid phase can be adapted only to a very limited extent to the different capture molecules.
  • different buffers can be used to apply the molecules be at least as far as they are compatible with the printing technique.
  • the incubation conditions during the attachment process for example, the dry bubbles, incubation at elevated temperatures or in a humid chamber, as well as UV irradiation etc., but can not be set individually for each capture molecule, since the spots are already on a common surface.
  • the use of printing techniques for the expression of the array prevents the application of other coating options, such as the attachment of the capture molecules from dilute solutions, which has proven for example in the coating of ELISA plates, or coating by spreading or spraying with a solution of the catcher molecule.
  • a spot may be missing e.g. due to pipette failure (clogged) or needle failure (needle stop, jamming), failed sample collection (empty template) or faulty sample delivery (no needle to carrier contact).
  • a spot does not contain the intended amount of capture molecules and thus binds a different amount of analyte than a spot that meets the standard under identical assay conditions.
  • a precise inference to the amount of analyte in a sample e.g. Based on a previously created calibration curve, this is no longer possible.
  • the e.g. Spot signal generated by means of a fluorescent dye marker on the array during analysis does not have the intended morphology, e.g. not exactly round or has a nonuniform signal intensity distribution, e.g. in the form of a gradient running from the inside to the edges ("donut" or "fried egg” effect).
  • This unevenness may e.g. caused by an uneven distribution of capture molecules in the spot, e.g. caused by the drying process, by application errors, surface inhomogeneities or by dust particles in the context of the array production.
  • inaccurate analysis results are often produced because i.d.R. It is not clear which area of the spot corresponds to the (homogeneous) reference spot and therefore correlates best with the amount of the analyte.
  • spots contain the wrong catcher molecules.
  • the reason for this is e.g. swapping the samples in the original or incorrect sample taking during printing.
  • the spots may contain contaminants with other capture molecules, e.g. the pipettes or needles have not been sufficiently cleaned between receiving different scavenger molecules.
  • the present invention consists in an improved process for producing areal macro- and microarrays, often called biochips, which are used for the analysis of the components in liquids, in particular of proteins and nucleic acids. It is a process consisting of up to four process steps according to FIG. 1: In a first step, several solid-phase surfaces are each filled with one or more different capture molecules, e.g. various proteins or nucleic acids coated; in a second step these solid phases are fragmented; In an optional third step, defective solid-phase fragments are sorted out and, in a fourth step, error-free solid-phase fragments on a support are combined to form one or more microarrays or macroarrays.
  • the error-prone step of the defined and uniform coating of a solid phase with capture molecules is completely or partially decoupled from the combination of different capture molecules on a suitable test carrier for the expression of a micro- or macroarray.
  • the method allows the solid phase and binding conditions to be individually adapted for the immobilization of each molecule and thus improved array qualities, especially in the combination of capture molecules with very different physicochemical properties, e.g. Proteins to reach.
  • the process thus significantly facilitates the production of particularly high-quality macro- and microarrays and leads to a strong reduction in the amount of materials and labor needed to produce them.
  • the method of combining a plurality of immobilized biological materials on a plate with the aim of carrying out several studies on tissue sections and cells side by side in a test field or reaction batch is described in the patent EP0117262 "Methods and devices for investigations on immobilized biological material" first described.
  • the present invention represents significant extensions and improvements of this method with the aim of making the principle of the combination of coated solid phases usable for the production of particularly high-quality micro and macroarrays.
  • the biological material is typically not composed of cells or tissue sections, but i.d.R. from one variety or mixtures of different capture molecules, e.g. from proteins, antibodies, DNA or oligonucleotides.
  • the coating of the solid phase fragments is carried out in a variant with the aid of modern methods of array production, e.g. by printing, spotting, or in-situ synthesis, which allows to write out arrays of different capture molecules on each fragment.
  • arrays with a very large number of different parameters can already be produced by combining relatively fewer solid-phase fragments.
  • the combination of fragments which in turn already contain a combination of solid phases coated with different capture molecules, enhances the ability to create very complex arrays as well as arranging multiple arrays in multiple test fields on a contiguous support.
  • the method is highly miniaturized and it can be so very small fragments of eg 0.25mm 2 and smaller combined with each other, whereby the number of parameters in a test field can be significantly increased.
  • the solid phases on which the capture molecules are immobilized are e.g. flat solid bodies of smooth materials such. Glass, quartz, plastic, silicon, metal and metal compounds, carbon or carbon compounds or even porous and / or flexible materials such as e.g. Membranes or hydrogels.
  • these support materials are modified to provide the capture molecules, e.g. via covalent bonding, non-covalent bonding by virtue of hydrophobic and Van der Waals interactions to bind to the surface, electrostatic bonding or hydrogen bonds.
  • the modification of the carrier consists e.g. in a chemical activation (e.g., introduction of amino, epoxy, aldehyde, isothiocyanate, amino, carbodiimide, NHS ester or metal complex groups).
  • a primary loading of the surface e.g. with antibodies, antigens, polylysine, protein A, G, L, biotin, avidin, streptavidin, nucleic acids, to bind to it the capture molecules.
  • the capture molecules may also be modified with appropriate attachment functions, e.g. by an amine, thiol, carbonyl or carboxy group or biotin, streptavidin, digoxigenin or fluorescein etc.
  • the solid phases can be pre-patterned before coating in order to support the uniform attachment of functional capture molecules in a precisely defined arrangement.
  • the solid phase may be subdivided into hydrophilic and hydrophobic regions such that upon immersion in a solution, the capture molecules will wet only the hydrophilic regions and thus be selectively bound at these sites.
  • These hydrophilic regions can be arranged, for example, in the form of circles or lines.
  • the hydrophilic regions may be further activated, for example, by the functional groups described above, to assist efficient attachment of the capture molecules.
  • membrane-based prestructured surfaces in which the membrane regions (spots) to be coated with one substance each are separated from one another by barriers, for example hydrophobic regions.
  • the coating is carried out, for example, by incubation of the solid phase with a dilute solution of the capture molecule or by spreading a solution of the capture molecule on the solid phase.
  • the solution of the scavenger molecule is applied, for example, by printing or spotting with a needle or micropipette.
  • special microarray printing robots it is also possible to combine several different scavenger molecules in the form of an array on a solid phase, as in traditional production. This is particularly advantageous if the final array is to consist of a very large number of different capture molecules and the capture molecules combined on a fragment have similar physicochemical properties so that they can be immobilized under identical attachment conditions, as in the case of DNA Oligonucleotides is the case.
  • the expression of these "primary arrays" also includes the above-described / ns / fu synthesis.
  • the dicing of the coated solid phases can be done mechanically e.g. by means of a knife or diamond (for example for plastics or glass), by means of the targeted action of high-energy radiation, e.g. by means of a laser beam (e.g., for plastics, membranes) or e.g. by targeted action of chemicals (etching) done.
  • a knife or diamond for example for plastics or glass
  • the targeted action of high-energy radiation e.g. by means of a laser beam (e.g., for plastics, membranes) or e.g. by targeted action of chemicals (etching) done.
  • the coated solid phases are applied to a flat support prior to fragmentation and e.g. Gravity force, reversible bonding, negative pressure, magnetic forces or mechanical barriers held in a predetermined position. It is also advantageous to select the fragmentation method and the carrier in such a way that the carrier remains coherent and thus the resulting solid fragments can still be held together via the carrier even after fragmentation and can thus be better handled in the following steps.
  • the flat solid phase can also be fragmented before coating. This offers e.g. the advantage that fragile capture molecules are not damaged by the fragmentation process, e.g. by heat when using laser radiation. In order to then be able to coat the solid phase fragments well, it is i d. R. also advantageous here, if the fragments are held together after the fragmentation initially still on a support.
  • the manufacturing process described here offers the decisive advantage, for the combination on the analytical support only those solid-phase fragments to select that are error-free according to freely determinable quality criteria.
  • These criteria are set according to later application and include, for example, the tolerances on the amount of immobilized capture molecules per coated fragment per spot, the uniformity of the distribution of capture molecules within a fragment or spots, the size and geometry of the fragments and spots or the position of the spots within a fragment relative to each other.
  • suitable fragments for the combination for example, the measurements of an in-process control are evaluated, which has monitored, for example when using the printing process, the output of each catcher molecule drop.
  • the spots on each piece of support are examined by detecting the immobilized capture molecules, for example, by their physical properties, such as light scattering or light absorption.
  • the immobilized capture molecules for example, by their physical properties, such as light scattering or light absorption.
  • it may be advantageous to mark the capture molecules before application to the support for example by coupling a fluorescence molecule.
  • the analysis is carried out indirectly, for example by binding a labeled binding partner to the immobilized capture molecules.
  • a labeled marker molecule can also be co-coated with each capture molecule. The binding of the marker molecule can then be measured very simply, for example via its fluorescence, and allows a conclusion on the coating result also for the simultaneously applied capture molecule. It is advantageous if marker and capture molecules are similar in their physicochemical properties or even identical except for the label.
  • the measurements of the coating quality are preferably carried out if the carrier pieces are not yet fragmented or at least not yet isolated and thus can be advantageously handled as a coherent solid.
  • samples of the coated fragments of each lot may be incubated with labeled binding partners for each capture molecule present on the fragment.
  • the absence of scavenger molecules in the incubation or printing solution and inactive scavenger molecules can thus be recognized and contamination of fragments and spots with other than the desired scavenger molecules, such as by carry-over or contamination in the array expression on a Fragment can occur by means of printing techniques are revealed. Fragments that have already been printed with arrays can be incubated check with different binding partners the position of each capture molecule spot in the array.
  • the supports on which the coated solid fragments are combined are e.g. planar solids of smooth materials, e.g. Glass, quartz, plastic, silicon, metal and metal compounds, carbon or carbon compounds or even porous materials.
  • the assembly of coated solid-phase fragments on a carrier takes place, for example, via established placement methods ("Method for producing solid-phase-bound bioreagents", WO2005 / 073693.)
  • the fragments are for this purpose, for example, taken up by a robot and at a predetermined location on the carrier, for example a slide Fixing is done eg by gluing, magnetic forces or clamping
  • double-sided adhesive tape is suitable for bonding
  • a liquid adhesive is recommended, which can be cured by irradiation with UV light
  • the fragments can be postponed after placing on the support and placed in the optimum position.
  • an array is formed on a larger support containing several different capture molecules. If several different scavenger molecule spots are already arranged on a solid-phase fragment in the form of an array (see Fig. 1 bottom row), very large arrays can also be combined.
  • the arrays may be formed at several separated areas of a continuous carrier. In these separated regions, it is advantageous to incubate several different samples in parallel on a carrier, each with a composite array, which considerably reduces the work involved in the analysis of several samples.
  • the identity, correct position and exact position of the coated solid-phase fragments can be determined by means of random samples or as a final product inspection suitable measurement methods are checked in order to rule out errors during the assembly process. This can be done, for example, by visualizing the fragments on the basis of their physical properties, such as light refraction or light absorption. The identity and correct position of the fragments can be verified, for example, by reading out a label applied to the carrier pieces or by detecting the capture molecule identity.
  • carrier pieces, on which coated solid-phase fragments have been combined can again be used as solid-phase fragments and combined on a larger carrier to produce even larger arrays.
  • This combination of already combined arrays can advantageously continue to continue and makes it possible to stamp out particularly many spots on a support.
  • very large arrays with very many different capture molecules are pronounced or even multiple arrays are generated at different positions on a contiguous support, which can then be incubated with different samples
  • the array quality is improved, as a much wider range of coating methods is available
  • the coating process is decoupled from the array expression, ie the spatial arrangement of the catcher molecules on a solid phase, a considerably broader spectrum of methods can be used for the coating than in the case of the often problematic array method described above. Characterized by printing or spotting or in-situ synthesis according to the traditional method.
  • solutions of the catcher molecules can also be applied to a solid phase, for example by brushing or spraying.
  • the solid phase can be incubated, for example, with a strongly diluted solution of the scavenger molecule for any length of time without evaporation problems, as with microtubes.
  • the coating of dilute solutions is a technique that has been routinely used for many years to coat microtiter plates with proteins to make ELISA assays.
  • Such coating protocols can now also be used for the production of macro- and microarrays with the method described here. So on the one hand the characteristics of the immobilized capture molecules can be dramatically improved, and on the other hand, the coating process can be made significantly simpler and faster.
  • the array quality is improved because the coating process can be optimally adapted to the properties of each capture molecule
  • solid phase and coating conditions can be individually adapted to each capture molecule, since in extreme cases, the array is completely characterized by the assembly of "single spots", ie of flat solids coated with only one type of capture molecule ,
  • the optimal surface material e.g., glass or plastic or membrane, optionally pretreated
  • optimal coating times, temperatures, and buffers may be employed. This is particularly important if the scavenging molecules differ greatly in their physical and chemical properties from each other, e.g. for many proteins the case is.
  • attachment and activity for each scavenger molecule can be optimized separately, thereby achieving the very best binding specificities and sensitivities for each scavenger molecule on the array.
  • Ready-coated solid-phase fragments can be combined to different arrays solely by using the assembly process without having to perform the expensive coating process again.
  • arrays on different carriers and carrier formats can be developed very quickly and with little effort and the array composition can be adapted very flexibly and individually to new requirements by selecting different fragments - in the sense of a "customized"
  • Even small batches of a given array configuration can be produced with little effort, and by providing the appropriate placement machines, the array can even be assembled on-site by the user, which is often desirable when performing routine laboratory analysis.
  • Better quality control options increase the efficiency of the manufacturing process and the array quality
  • the quality of each spot can be controlled only at the level of the assembled array, while the method described here, the quality of the coating or each spot already at the level of fragments - before the expression of the entire array - can be checked.
  • this leads to a considerable saving of resources, since in the case of a fault, not the complete arrays, including all good spots, must be discarded, only the affected fragments.
  • the production of error-free arrays is greatly facilitated by the possibility of this preselection. The particularly great advantages which result in particular for the production of large arrays are described below.
  • the method described here not only makes it easier to ensure the presence and correctness of each spot, but also makes it easier to verify the correct identity and activity of the capture molecules for each spot, e.g. those of immobilized antigens or antibodies, or the correct sequence and hybridization activity, if nucleic acid scavenger molecules, e.g. Oligonucleotides were immobilized.
  • the spotted fragments can be tested with specific binding partners for all scavenger molecules present on the fragments. If several spots have already been marked on the fragments, the correct position of each capture molecule spot within the array lattice can be verified by successive incubation. Furthermore, the absence of scavenger molecules or inactive scavenger molecules in a spot can be detected as well as contamination of spots with other scavenger molecules, such as those found in e.g. can be revealed by carryover or contamination during the array manifestation.
  • capture molecules e.g. spotted by means of printing or spotting techniques on a flat solid, which is then fragmented, so that the desired number of spots remains on each fragment.
  • the proportion of error-free fragments, i. those in which all spots meet the quality criteria set is
  • ZS reliability of the spot creation process (values between 0 and 1), where a reliability of 1 corresponds to a completely error-free process, one of 0.999 an error frequency of 1 spot per 1000 spots, one of 0.99 an error frequency of 1 spot per 100 Spots etc.
  • ASPF number of spots per fragment
  • the method presented here combines the error-free fragments into the final arrays.
  • the proportion of error-free fragments assembled from error-free fragments is: AF
  • Eg reliability of the fragmentation and assembly process (values between 0 and 1), where a reliability of 1 corresponds to a completely error-free process, one of 0.999 of an error rate of 1 per 1000 fragmentation and equipping operations, 0.99 of an error rate of 1 per 100 operations, etc.
  • ZB is greater than or at least equal to ZS
  • Certain methods of spot generation are preferred for the expression of relatively small arrays, e.g. the DDI method (DNA directed immobilization, Wacker R and Niemeyer CM, Chembiochem., 2004 Apr 2; 5 (4): 453-9).
  • DDI method DNA directed immobilization, Wacker R and Niemeyer CM, Chembiochem., 2004 Apr 2; 5 (4): 453-9.
  • an array of DNA oligonucleotides is first expressed. This array is then used for site-specific immobilization of protein capture molecules by conjugating the proteins to different DNA sequences, each complementary to an oligonucleotide on the array.
  • each protein is then bound to a defined position on the array and, in turn, can serve as a scavenger molecule in the analysis of a sample fluid.
  • the method described here makes it possible to produce complex arrays by combining a plurality of such pronounced arrays into an overall array using the DDI method.
  • Spotting technologies can be done in less time than the conventional method, since only a small fraction of the fragments that are present on the entire array are stored per fragment
  • Capture molecules must be applied.
  • the arrays are themselves arranged in 25 rows and 10 columns; the distance between the centers is 2 mm in the horizontal and vertical directions.
  • the attachment of the oligonucleotides to the glass surface is carried out by incubation of the glasses overnight in a humid chamber. The drops are allowed to dry on the glasses and a picture of the substance residues on the glass is taken, which makes it possible to check the presence and position of each spot and each array on the glass slide (see WO2005073693 "Method for producing solid phase-bound bioreagents"
  • the glasses are then fragmented using the process described in WO2005 / 073693 and then loaded on a coherent support Firstly, the spotted glasses with the underside are coated on a carrier film (Ultron Systems Inc., Califomien, The image is precisely overlapped with the original image showing the location of the spots by the edges of the glass or other reference marks, and the semi-transparent representation of the upper image will help 2 mm xy grid over Lay the two images so that each array comes to rest in
  • genomic DNA is isolated from the sample in the case of analysis of polymorphisms or RNA for expression analysis.
  • genomic DNA the portions of interest are amplified and labeled with fluorescent molecules by using fluorescently labeled primers in a PCR reaction or by incorporation of fluorescently labeled nucleoside triphosphates.
  • the mRNA of a sample is transcribed into cDNA using the LabelStar kit (Qiagen, Hilden) and thereby labeled by the use of fluorescence-coupled nucleoside triphosphates.
  • nucleic acids are denatured by heating to 95 ° C and in a hybridization buffer using the EUROIMMUN Titerplane® technology (EUROIMMUN AG, Lübeck) at 45 ° C in each test field of EUROIMMUN slides with the oligonucleotide arrays overnight incubated. Nucleic acids non-specifically bound to the array are then removed by washing with unstring buffer (1X SSC, 0.1% SDS) and stringent wash buffer (0.1X SSC, 0.1% SDS). The slides are dried by air or nitrogen flow or by centrifugation. To determine the binding of the sample molecules to the spots, the slide is read with a BioAnalyzer 4F (LaVision BioTec GmbH, Bielefeld).
  • the presence of a fluorescence signal at the position of a spot shows that an oligonucleotide which is immobilized to the immobilized at this point exactly or substantially complementary marked Nukeinklaresequenz is present in the sample.
  • the intensity of fluorescence is a measure of the amount of nucleic acid sequence in the sample fluid.
  • Example 1 The preparation and use is carried out as indicated in Example 1. However, for improved quality control of the spots, all capture molecules are labeled with a fluorescent molecule at their 3 'end, or a small amount of another fluorescently labeled oligonucleotide is added to each oligonucleotide solution to be spotted. Instead of scanning the salt residue, the glasses are now not until after washing off bound oligonucleotides read using the BioAnalyzers and thereby determines the fluorescence signals of the tightly bound capture oligos or of the admixed oligonucleotide. On the basis of this fluorescence, it is checked before fragmenting the glasses whether each spot is present according to the requirements, homogeneous and correctly positioned.
  • this acquisition Prior to assembly, this acquisition is used as described above to determine the position of the arrays on the glass and mark fragments with defective arrays and exclude them from further use.
  • the use for the examination of sample liquids is carried out as indicated above, whereby a different fluorescence wavelength is used for the labeling of the sample molecules than for the labeling of the capture oligonucleotides or of the oligonucleotide added to the capture oligonucleotides.
  • the fluorescence signals of the capture oligonucleotide or of the fluorescence-labeled oligonucleotide admixed with the capture molecules are recorded again after the hybridization in parallel with the readout of the sample signals and serve as reference signals.
  • Example el3 Characterization of the arrays on the fragments using TopSpot technology
  • Example 1 or 2 The procedure and analysis is the same as in Example 1 or 2, however, 24 oligonucleotide solutions are simultaneously applied by TopSpot technology using a 24x printhead in the form of a 6x4 primary array.
  • the spot-to-spot distance here is 500 ⁇ m.
  • Example 4 prominence and use of An ⁇ 'gen-microarrays for Autoimmundiagostik
  • Example 2 If, analogously to Example 2, a fluorescent antigen is used or added to the solutions to be mocked, the scanning is carried out alternatively with the BioAnalyzerer only after washing off the unbound antigen molecules. The fragmentation and assembly is carried out for glass as described in Example 1 or 2. In contrast to this, plastic films are fragmented with the aid of a CO2 laser inscription (ALLTEC GmbH, Selmsdorf), whereby, as in the diamond cutting process, only the plastic film, but not an underlying carrier film, is severed. For testing, the test fields are incubated with diluted patient sera using Titerplane® technology.
  • ALLTEC GmbH, Selmsdorf CO2 laser inscription
  • the arrays are incubated with a fluorescein or otherwise fluorescently labeled (eg, Cy2, Cy3, Cy5) anti-human IgG or anti-human IgM antibody which binds to the autoantibodies from the sample serum, which in turn, during the first incubation bound to the antigenic spots.
  • a fluorescein or otherwise fluorescently labeled eg, Cy2, Cy3, Cy5
  • anti-human IgG or anti-human IgM antibody which binds to the autoantibodies from the sample serum, which in turn, during the first incubation bound to the antigenic spots.
  • those spots or antigens for which antibodies were present in the sample are identified by evaluation in a microscope or by means of the BioAnalyzer.
  • the intensity of the fluorescence signals is a measure of the amount of autoantibodies in the sample.
  • Example 5 Marking of antigen microarrays by combination of spotted glasses
  • Example 1 The assembly is carried out as described in Example 1 or 2, wherein an array of many different antigens is formed in each test field by combining up to 48 fragments per test field, which were each dropped with a different antigen.
  • the test procedure with these arrays is carried out as described in Example 4.
  • the selection of perfect membrane fragments is made by visualizing the spots on the basis of fluorescence signals of the antigens or oligonucleotides as described in Examples 2 and 4 above.
  • the assembly of the membrane fragments in the fields of a EUROIMMUN slide is then carried out with a pick and place machine as described in Example 1 or by hand, for example by means of tweezers.
  • a color reaction or luminescence reaction is performed as an alternative to fluorescence detection.
  • an alkaline phosphatase or peroxidase is coupled to the anti-human IgG or anti-human IgM antibody instead of the fluorescent molecule
  • the sample nucleic acid is labeled with biotin or fluorescein and the Array after DNA hybridization with streptavidin or anti-fluorescein-conjugated alkaline phosphatase incubated.
  • the color or luminescence signal is developed by overlaying the array with suitable substrates (NBT / BCIP, CDP-Star Roche Diagnostics GmbH, or Luminol) and with a conventional camera or a flatbed scanner or in the case of the luminescence signal is read out with the aid of the bioanalyzer.
  • suitable substrates NBT / BCIP, CDP-Star Roche Diagnostics GmbH, or Luminol
  • Example 4-7 The preparation and test procedure is carried out as in Example 4-7. Instead of the autoantigen solutions, however, extracts of animal and vegetable origin as well as food and microorganisms are used. In the test procedure, the presence of antibodies in the serum directed against a component of the immobilized extracts can thus be detected.
  • anti-human IgE antibodies are used as conjugates in addition to the described anti-human IgG and anti-human IgM antibodies.
  • the procedure is the same as in Examples 1-8, but the fragments are not combined on EUROIMMUN slides, but each placed in the wells of a 96-well multi-well plate (MTP).
  • the test procedure with the sample material then takes place in the wells of the MTP using the fluorescence, luminescence or colorimetric detection methods described above.

Abstract

Die vorliegende Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung flächiger Macro- und Microarrays, häufig auch Biochips genannt. Die Erfindung besteht aus einem vierstufigen Verfahren gemäß Abb. 1, wobei in einem ersten Schritt mehrere flächige Festphasen mit unterschiedlichen Fänger-Molekülen, z.B. Proteinen oder Nukleinsäuren, beschichtet werden, in einem 2. Schritt diese Festphasen fragmentiert werden, in einem optionalen 3. Schritt fehlerhaft beschichtete Festphasenfragmente aussortiert werden und in einem 4. Schritt mehrere Festphasenfragmente auf einem Träger kombiniert werden. Durch das Verfahren wird der schwierige Schritt der gleichmäßigen Beschichtung einer Festphase mit Fänger-Molekülen von der Kombination mehrerer Festphasenmoleküle auf einem Träger zur Ausprägung eines Arrays entkoppelt. Das Verfahren bietet dadurch zwei wesentliche Vorteile: Erstens erleichtert es wesentlich die Herstellung fehlerfreier oder nahezu fehlerfreier Macro- und Microarrays. Zweitens ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren, eine Vielzahl unterschiedlicher Fänger-Moleküle auf einem Testträger miteinander zu kombinieren und dabei für jeden einzelnen Parameter individuell optimale Festphasen und Bindungsbedingungen zur Immobilisierung wählen zu können, so dass auch im Arrayverbund noch für jeden Parameter optimale Testergebnisse erzielt werden können. Im Gegensatz dazu müssen bei herkömmlichen Herstellungsverfahren für Microarrays einheitliche Bindungsbedingungen und Festphasen gewählt werden. Da sich diese häufig nicht für alle Fänger-Moleküle gleich gut eignen, liefern bisher verwendete Microarrays häufig nicht für jeden Parameter optimale Testergebnisse.

Description

Verfahren zur Erzeugung perfekter Macro- und Microarrays durch Kombinieren vorselektierter beschichteter Festphasen-Fragmente
Beschreibung Stand der Technik
Der Einsatz von Macro- und Microarrays zur Untersuchung der Menge und Identität von Nukleinsäuren, Proteinen und anderen Molekülen in einer Probenflussigkeit ist mittlerweile weit verbreitet. Unter Arrays versteht man in diesem Zusammenhang eine Zusammenstellung unterschiedlicher festphasengebundener Fanger-Molekule, von denen jedes mehr oder weniger spezifisch ein oder mehrere interessierende Moleküle in einer Probenflussigkeit, die Analyten, binden kann Die unterschiedlichen Fanger-Moleküle sind häufig in Form kleiner Flecken (Spots) von etwa ein bis 1000 μm Durchmesser auf einem flachenformigen Trager immobilisiert und gitterformig angeordnet, können aber auch in anderer Ausprägung, z B als winzige Kugelchen in Suspension vorliegen, wobei in diesem Fall jede Kugel ι d R nur mit einer Sorte Fanger-Molekül beschichtet ist
Nach Inkubation des - häufig markierten - Probenmateπals mit einem Array werden durch Nachweis des festphasengebundenen Analyten diejenigen Spots bzw Fanger-Molekule identifiziert, an die sich eine Substanz aus der Probe gebunden hat Durch Kenntnis der Bindungsspezifität der Fanger-Molekule an jeder Position des Arrays können so Rückschlüsse auf die genaue Identität und/oder die Menge bestimmter Substanzen oder Substanzgruppen in der Probe gezogen werden
Macro- und Microarrays gestatten es, eine riesige Anzahl (bis über hunderttausend) Analyten simultan, d h durch eine einzige Inkubation der Probenflussigkeit mit dem Array, zu bestimmen Bereits besonders weit verbreitete Anwendungen sind die Analyse der Genexpression, die Bestimmung von DNA-Sequenzen (z B die Organismen-Identifizierung, Genotypisierung, Bestimmung von Polymorphismen) sowie die Bestimmung von Menge und Identität von Proteinen und Antikörpern in einer biologischen Probe, z B humanen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs Für diese Anwendungen kommen als Fanger- Moleküle typischerweise Nukleinsäuren, z B Oligonukleotide, Polynukleotide oder cDNA- Molekule, Plasmide oder BAC-Klone, Proteine, Antigene und Antikörper oder auch Peptide als Fänger-Moleküle zum Einsatz
Die derzeit verbreitetsten Verfahren zur Herstellung flachenformiger Arrays sind das Drucken von Molekülen auf einen Träger und die /n-srfu-Synthese direkt auf einem Trager Das Drucken ist ein universell für die meisten Molekülsorten anwendbares Verfahren. Hierbei werden eine Vielzahl von Microtröpfchen, typischerweise 0,1 - 100 nl, welche jeweils eine Sorte der Fänger-Moleküle enthalten, auf den Träger mit Hilfe eines Druckverfahrens, beispielsweise mittels eines Nadeldruckers oder eines Tintenstrahldrucker-ähnlichen, kontaktfrei arbeitenden Microdispensers (z.B. Piezo-Technologie) aufgebracht (häufig auch als „Spotten" bezeichnet). Die in den Microtropfen befindlichen Fänger-Moleküle binden sich an den Träger und prägen so die Spots aus. In der Regel werden die Tröpfchen in definierten Positionen z.B. in Form eines Gitters angeordnet, um später über die Position der Spots auf die Identität des an dieser Stelle immobilisierten Fänger-Moleküls schließen zu können.
Bei /n-s/fry-Verfahren werden die unterschiedlichen Fänger-Moleküle parallel direkt auf einem Träger synthetisiert. Dieses Verfahren ist begrenzt auf solche Moleküle, die sich an Festphasen synthetisieren lassen und kommt z.B. für die Herstellung von Oligonukleotid- und Peptidarrays zum Einsatz.
Als Alternative zu den flächenförm igen Arrays kommen zur Multiparameter-Analyse auch so genannte Suspensionsarrays zum Einsatz, bei denen die Fänger-Moleküle an kleinste Partikel gebunden sind. Beispiele hierfür sind die "UltraPlex"-Technologie der Fa. SmartBead Technologies Ltd. (Cambridge, UK, www.SmartBead.com) sowie die xMAP™ Technologie der Firma Luminex Corporation (USA, www.luminexcorp.com). Bei diesen Systemen ist an jedem Partikel ein Code befestigt, über den die Identität des auf dem Partikel immobilisierten Fänger-Moleküls ermittelt werden kann, da diese Zuordnung ja nicht wie bei einem geordneten flächigen Array über die Position erfolgen kann. Bei der xM4P™-Technologie erfolgt dies beispielsweise über das Verhältnis zweier Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Kunststoffkügelchen eingefärbt werden; bei der UltraPlex-Technologie über stark miniaturisierte Barcodes an den stäbchenförmig ausgeprägten Partikeln.
Vorteilhaft an Suspensionsarrays ist, dass die Beschichtung der Festphase mit dem Fänger- Molekül ähnlich der hier vorgelegten Erfindung räumlich und zeitlich getrennt von der Ausprägung des Arrays - bei Suspensionsarrays dem Zusammengeben unterschiedlich beschichteter Partikel - erfolgt. Jedoch sind mit diesem Verfahren auch zahlreiche Nachteile verbunden:
Die Auswahl der Festphasenmaterialien ist durch die Codierung stark einschränkt und kann nicht allein an den Eigenschaften des Fänger-Moleküls ausgerichtet werden. So ist die xMAP™-Technologie beispielsweise allein auf die Verwendung von Polystyrolkugeln ausgelegt.
Die Codierung verkompliziert und verteuert die Produktion der Arrays. So müssen i.d.R. in einem zusätzlichen Produktionsschritt die Festphasen zunächst mit den unterschiedlichen Codes versehen werden.
Die Beschichtungsqualität kann für jeden einzelnen Partikel nur unter großem technischen Aufwand kontrolliert werden, da dazu jeder Partikel einzeln analysiert werden muss. Erschwerend kommt bei der Analyse dreidimensionaler Partikel hinzu, dass bei dieser Vermessung nicht notwendigerweise die Seite des Partikels erfasst wird, die auch später in der Analyse ausgelesen wird. So ist die Möglichkeit zur Kontrolle jedes Partikels überhaupt nur dann möglich, wenn sicher gestellt ist, dass die Beschichtung über die ganze Oberfläche der Partikel sehr gleichmäßig erfolgt. Letztendlich ist aber der Beweis, dass die Beschichtung an der später in der Analyse ausgelesenen Stelle bestimmte gesetzte Kriterien erfüllt hat, aufgrund der zufälligen Anordnung der Partikel während des Messvorganges nahezu unmöglich.
Urn diese und andere Ungenauigkeiten bei der Analyse mit Suspensionsarrays zu kompensieren, werden in der Regel sehr viele Partikel für ein und dasselbe Fänger-Molekül ausgelesen, um die nötige Genauigkeit zu gewährleisten. Dadurch besteht ein erhöhter Bedarf an Partikeln, Reagenzien und Messzeit. Weiterhin müssen komplizierte Auswerteverfahren entwickelt werden, die schwer zu validieren sind und der Anwendung statistischer Methoden bedürfen, um ein akzeptables Maß an Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu erhalten.
Zusätzlich erfordert das Auslesen von Suspensionsarrays aufwendige und teure Auslesegeräte, da neben dem analytischen Signal auch der Code jedes Partikels ausgelesen werden muß.
Die Verwendung ein- oder zweidimensionaler Arrays auf flächenförmigen Trägern bietet daher wegen der flexibleren Auswahl des Array-Trägermaterials und der Beschichtungsbedingungen sowie der sehr einfachen Codierung, die allein über die räumliche Anordnung der Spots erfolgt, große Vorteile. Jedoch treten bei der Herstellung solcher flächenförmiger Arrays mit den bisherigen Verfahren zahlreiche Probleme auf, welche die Herstellung fehlerfreier Arrays mit reproduzierbaren Eigenschaften je nach Array- Grόße erschweren oder sogar unmöglich machen.
Das grundlegende Prinzip der Kombination mehrerer mit unterschiedlichen biologischen Materialien beschichteter Festphasen gemäß Patent EP0117262 "Verfahren und Vorrichtungen für Untersuchungen an unbeweglich gemachtem biologischen Material", das Bestandteil der hier vorgelegten Erfindung ist, beschreibt die Kombination mehrerer unterschiedlicher Gewebeschnitte und Zellen, um Untersuchungen an mehreren Substraten nebeneinander in einem Testfeld bzw. Reaktionsansatz zu ermöglichen. Die Anwendung dieses Verfahrens bietet für sich genommen jedoch noch keine Lösung für die speziellen Probleme, die bei der Herstellung hochwertiger molekularer Macro- und Microarrays auftreten.
Probleme bei der Microarray-Herstellung
- Das fehlerfreie und reproduzierbare Ausprägen gleichmäßiger Fänger-Molekül-Spots auf einem Träger ist bisher jedoch nicht zufrieden stellend gelöst, worunter insbesondere die Reproduzierbarkeit, Genauigkeit, Zuverlässigkeit und der dynamische Messbereich der Array-Analysen leiden. So treten bei dem oben erwähnten breit einsetzbaren Druckverfahren, bei dem unterschiedliche Fänger-Moleküle in Form eines Arrays auf ein gemeinsames Substrat aufgedruckt werden, folgende Probleme auf: Die Festphase kann nicht für jedes Fänger-Molekül individuell gewählt und optimiert werden, da alle Moleküle auf der gleichen Festphase immobilisiert werden. Dies ist insbesondere dann problematisch, wenn sich die physikochemischen Eigenschaften der Moleküle stark voneinander unterscheiden, wie dies z.B. bei Proteinen häufig der Fall ist. Bei der Ausprägung von Arrays mit herkömmlichen Verfahren muss daher in Kauf genommen werden, dass einzelne Fänger-Moleküle nicht in der optimalen Menge und Konformation immobilisiert sind und dadurch den Analyten schlechter oder unspezifischer binden, als dies bei der Verwendung von individuell auf das Fänger-Molekül optimierten Festphasen der Fall wäre. Eine solche vorteilhafte Auswahl bzw. Anpassung der Festphase an die individuellen Anforderungen des Fänger-Moleküls wird bei diagnostischer Testsystemen, bei denen lediglich ein Parameter pro Testfeld bzw. Reaktionsgefäß gemessen wird, bereits erfolgreich eingesetzt..
- Die Anbindungsbedingungen für die Immobilisierung auf der Festphase können nur in sehr begrenztem Umfang auf die unterschiedlichen Fänger-Moleküle angepasst werden. So können zwar unterschiedliche Puffer zum Aufbringen der Moleküle verwendet werden, zumindest soweit diese mit der Drucktechnik kompatibel sind. Die Inkubationsbedingungen während des Anbindungsprozesses, z.B. das Trockenblasen, die Inkubation bei erhöhten Temperaturen oder in einer Feuchtkammer, sowie UV- Bestrahlung etc. können aber nicht für jedes Fänger-Molekül individuell eingestellt werden, da die Spots sich ja bereits auf einer gemeinsamen Oberfläche befinden. Weiterhin verhindert die Anwendung von Drucktechniken zur Ausprägung des Arrays die Anwendung anderer Beschichtungsmöglichkeiten, wie z.B. das Anbinden der Fänger- Moleküle aus verdünnten Lösungen, das sich z.B. bei der Beschichtung von ELISA- Platten bewährt hat, oder das Beschichten durch Ausstreichen oder Besprühen mit einer Lösung des Fänger-Moleküls.
Einzelne Spots können fehlen z.B. aufgrund eines Pipettenausfalls (verstopft) oder Nadelausfalls (Nadelabbruch, klemmt), einer nicht erfolgten Probenaufnahme (Vorlage leer) oder einer fehlerhaften Probenabgabe (kein Kontakt der Nadel zum Träger). Ein Spot enthält nicht die beabsichtigte Menge an Fänger-Molekülen und bindet daher unter identischen Testbedingungen eine andere Menge des Analyten als ein Spot, der dem Standard entspricht. Ein präziser Rückschluss auf die Menge des Analyten in einer Probe, z.B. anhand einer zuvor erstellten Eichkurve, ist so nicht mehr möglich. Grund für diese fehlerhaften Spots können nicht exakt reproduzierte Volumina bei der Applikation der Fänger-Moleküle (typischerweise 0,1 - 1 nl) sein oder auch die unterschiedlich effiziente Anbinduπg der Fänger-Moleküle an die Träger aufgrund einer inhomogenen Oberflächenbeschaffenheit des Trägers - z B. eine unterschiedliche Dichte der zur Anbindung der Fänger-Moleküle notwendigen funktionellen Gruppen, z.B. Amin-, Epoxyd- oder Carbonylgruppen.
Das z.B. mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoff-Markers auf dem Array im Rahmen der Analyse erzeugte Spot-Signal hat nicht die beabsichtigte Morphologie, ist also z.B. nicht exakt rund oder weist eine ungleichmäßige Signalintensitätsverteilung auf, z.B. in Form eines vom Innern zu den Rändern laufenden Gradienten („Donut"- oder „Spiegelei"- Effekt). Diese Ungleichmäßigkeit kann z.B. durch eine ungleichmäßige Verteilung der Fänger-Moleküle im Spot verursacht werden, die z.B. durch den Eintrocknungsprozess, durch Applikationsfehler, Oberflächeninhomogenitäten oder auch durch Staubpartikel im Rahmen der Arrayherstellung verursacht werden. Als Resultat entstehen häufig ungenaue Analysenergebnisse, da i.d.R. nicht klar ist, welcher Bereich des Spots dem (homogenen) Referenzspot entspricht und daher mit der Menge des Analyten am besten korreliert.
Die Positionierung der Spots ist zu ungenau, so dass sie z.B. nicht exakt in der beabsichtigten Anordnung, z.B. in Form eines Gitters, angeordnet sind. Dies erschwert eine automatische Auswertung der Bindungsereignisse erheblich oder macht sie sogar unmöglich.
- Ein oder mehrere Spots enthalten die falschen Fänger-Moleküle. Ursache hierfür ist z.B. das Vertauschen der Proben in der Vorlage oder eine fehlerhafte Probenaufnahme beim Drucken. Alternativ können auch die Spots Verunreingungen mit anderen Fänger- Molekülen enthalten, wenn z.B. die Pipetten oder Nadeln zwischen der Aufnahme unterschiedlicher Fänger-Moleküle nicht ausreichend gereinigt wurden.
In Anbetracht der sehr großen Zahl an Spots, die zur Ausprägung eines Arrays generiert werden müssen, ist es trotz der bereits weit über 10 Jahre andauernden Weiterentwicklung der Druck- bzw. Spotting-Verfahren sowie der /n-s/ftv-Synthese nach wie vor äußerst schwierig oder sogar unmöglich, größere Macro- und Microarrays fehlerfrei herzustellen, d.h. sie so herzustellen, dass alle Spot-Qualitätsparameter eines Arrays nur in einem engen und exakt definierten Toleranzbereich um einen festgelegten Referenzwert liegen. Beispielsweise ergibt sich unter der Annahme, dass mit dem eingesetzten Verfahren zur Ausprägung der Spots in zufälliger Verteilung bei jedem 1.000sten Spot Fehler auftreten, dass nur 0.9991000 = 36,8 % Arrays völlig fehlerfrei sind, wenn ein Array aus 1.000 Spots besteht. Die Ausschussrate für die Herstellung fehlerfreier Arrays beträgt damit 63,2 %. Bei 4.000 Spots beträgt unter der gleichen Annahme der Ausschuss schon 98,2 %, bei 10.000 Spots - lediglich eine etwa mittlere Dichte für Microarrays - bereits 99,9954 %. Liegt die Zuverlässigkeit der Spot-Generierung nur bei 99 %, was einen typischen Wert für viele derzeit verfügbaren Druckverfahren darstellt, so entsteht schon bei der Herstellung eines 500 Spots umfassenden fehlerfreien Arrays eine Ausschussrate von 99,34 %. Eine wirtschaftliche Herstellung fehlerfreier oder auch nur weitgehend fehlerfreier Macro- und Microarrays ist so mit den bisherigen Verfahren nicht möglich.
Durch Mehrfachbestimmungen und Replikate wird versucht, die Verlässlichkeit der Array- Analysen trotz schlechter Reproduzierbarkeit der Einzelspot-Ergebnisse zu verbessern. Insbesondere für die zunehmende Bedeutung von Macro- und Microarray-Analysen in der In- wfro-Diagnöstik, die einen besonders hohen Anspruch einerseits an die Zuverlässigkeit der Analysen stellt, bei der aber andererseits auch ein möglichst einfaches und transparentes Auswerteverfahren anzustreben ist, um Fehlerquellen in der Analyse zu minimieren sowie Kosten und Zeitaufwand zu reduzieren, sind Verbesserungen in der Microarray-Qualität von großem Vorteil. So können die Einzelspot-Ergebnisse reproduzierbarer und die Array- Analyse dadurch verlässlicher und nachvollziehbarer gemacht und dadurch Arbeits- und materialintensive Mehrfachbestimmugen überflüssig werden. Erfindung
Die vorliegende Erfindung besteht in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung flächiger Macro- und Microarrays, häufig auch Biochips genannt, die für die Analyse der Bestandteile in Flüssigkeiten, insbesondere von Proteinen und Nukleinsäuren, zum Einsatz kommen. Es handelt sich um einen Prozess, der gemäß Abb. 1 aus bis zu vier Verfahrensschritten besteht: In einem 1. Schritt werden mehrere flächige Festphasen mit jeweils einem oder mehreren unterschiedlichen Fänger-Molekülen, z.B. verschiedenen Proteinen oder Nukleinsäuren, beschichtet; in einem 2. Schritt werden diese Festphasen fragmentiert; in einem optionalen 3. Schritt werden fehlerhafte Festphasenfragmente aussortiert und in einem 4. Schritt fehlerfreie Festphasenfragmente auf einem Träger zu einem oder mehreren Micro- oder Macroarrays kombiniert.
Mit der Erfindung wird der fehleranfällige Schritt der definierten und gleichmäßigen Beschichtung einer Festphase mit Fänger-Molekülen ganz oder teilweise entkoppelt von der Kombination verschiedener Fänger-Moleküle auf einem geeigneten Testträger zur Ausprägung eines Micro- oder Macroarrays. Dies bietet zwei wesentliche Vorteile:
Erstens wird trotz der derzeit nicht oder nur mit größtem Aufwand zu vermeidenden Beschichtungsfehler die Herstellung fehlerfreier oder nahezu fehlerfreier Macro- und Microarrays wesentlich erleichtert oder sogar erst möglich, da die Qualität jedes beschichteten Festphasenfragments vor der Ausprägung des Arrays auf dem Testträger überprüft werden kann und solche Fragmente, die zuvor definierten Qualitätskriterien nicht entsprechen, aussortiert werden können. So kommen nur fehlerfreie Fragmente zur Ausprägung eines „perfekten" Arrays zum Einsatz. Bei einer großen Anzahl an Spots ist es aufgrund des fehlerbehafteten Beschichtungsprozesses ohne diese Vorselektion praktisch unmöglich, fehlerfrei Arrays herzustellen.
Zweitens ermöglicht das Verfahren, die Festphase und die Anbindungsbedingungen für die Immobilisierung jedes Moleküls individuell anzupassen und so verbesserte Arrayqualitäten gerade bei der Kombination von Fänger-Molekülen mit sehr unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften, wie z.B. Proteinen, zu erreichen.
Das Verfahren erleichtert so wesentlich die Produktion besonders hochwertiger Macro- und Microarrays und führt zu einer starken Reduktion der Menge an Materialien und Arbeitszeit, die zu deren Herstellung benötigt wird. Das Verfahren der Kombination mehrerer unbeweglich gemachter biologischer Materialien auf einer Platte mit dem Ziel, mehrere Untersuchungen an Gewebeschnitten und Zellen nebeneinander in einem Testfeld bzw. Reaktionsansatz ablaufen zu lassen, ist in dem Patent EP0117262 "Verfahren und Vorrichtungen für Untersuchungen an unbeweglich gemachtem biologischen Material" erstmalig beschrieben. Die hier vorliegende Erfindung stellt bedeutende Erweiterungen und Verbesserungen dieses Verfahrens dar mit dem Ziel, das Prinzip der Kombination beschichteter Festphasen zur Ausprägung besonders hochwertiger Micro- und Macroarrays nutzbar zu machen. Wesentliche Weiterentwicklungen bestehen z.B. in folgenden Punkten:
- Das biologische Material besteht typischerweise nicht aus Zellen oder Gewebeschnitten, sondern i.d.R. aus einer Sorte oder Gemischen unterschiedlicher Fänger-Moleküle, z.B. aus Proteinen, Antikörpern, DNA oder Oligonukleotiden.
- Durch Kontrollieren und ggf. Aussortieren fehlerhaft beschichteter Fragmente im 3. Schritt gemäß Abb. 1, das vor der Kombination auf einem Träger erfolgt, wird die Ausprägung perfekter oder nahezu perfekter Arrays ermöglicht.
- Die Möglichkeit zur Verwendung unterschiedlicher Festphasen zur Immobilisierung unterschiedlicher Fänger-Moleküle gestattet es, auch bei Kombination aller Parameter in einem Testfeld in Form eines Arrays für jeden Parameter optimale Testergebnisse zu erzielen.
- Die Beschichtung der Festphasenfragmente erfolgt in einer Ausführungsvariante mit Hilfe moderner Methoden der Array-Herstellung, z.B. durch Drucken, Spotten oder in-situ- Synthese, die es ermöglichen, bereits auf jedem Fragment Arrays aus unterschiedlichen Fänger-Molekülen auszuprägen. Mit dieser Ausführungsvariante können bereits durch Kombination relativ weniger Festphasenfragmente Arrays mit einer sehr großen Anzahl unterschiedlicher Parameter erzeugt werden.
- Die Kombination von Fragmenten, die ihrerseits bereits eine Kombination von mit unterschiedlichen Fänger-Molekülen beschichteten Festphasen enthalten, verbessert die Möglichkeit zur Erzeugung sehr komplexer Arrays sowie die Anordnung mehrerer Arrays in mehreren Testfeldern auf einem zusammenhängenden Träger.
- Neben biochemischen und histochemischen Methoden kommen auch molekularbiologische Methoden im Rahmen der Testdurchführung zum Einsatz.
- Die Methode wird stark miniaturisiert und es können so auch sehr kleine Fragmente von z.B. 0,25mm2 und kleiner miteinander kombiniert werden, wodurch die Anzahl der Parameter in einem Testfeld deutlich erhöht werden kann. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Herstellung beschichteter, flächiger Festphasenfragmente
Die Festphasen, auf denen die Fänger-Moleküle immobilisiert werden, sind z.B. flächige Festkörper aus glatten Materialien wie z.B. Glas, Quarz, Kunststoff, Silizium, Metall und Metallverbindungen, Kohlenstoff oder Kohlenstoffverbindungen oder auch porösen und/oder flexiblen Materialen wie z.B. Membranen oder Hydrogelen. Häufig sind oder werden diese Trägermaterialien modifiziert, um die Fänger-Moleküle z.B. über kovalente Bindung, nicht kovalente Bindung augrund hydrophober und Van der Waals Wechselwirkungen, elektrostatische Bindung oder Wasserstoff-Brücken an die Oberfläche binden zu können. Die Modifizierung des Trägers besteht z.B. in einer chemischen Aktivierung (z.B. Einführung von Amino-, Epoxy-, Aldehyd-, Isothiocyanat, Amino-, Carbodiimid-, NHS-Ester oder Metallkomplex-Gruppen). Neben dem nasschemischen Aufbringen derartiger Kopplungsgruppen können dafür beispielsweise auch Plasmaverfahren eingesetzt werden. Alternativ oder zusätzlich kann auch eine Primärbeladung der Oberfläche, z.B. mit Antikörpern, Antigenen, Polylysin, Protein A, G, L, Biotin, Avidin, Streptavidin, Nukleinsäuren, erfolgen, um darüber daran die Fänger-Moleküle zu binden. Entsprechend der beabsichtigten Anbindung werden ggf. auch die Fänger-Moleküle mit geeigneten Anbindungsfunktionen modifiziert, z.B. durch eine Amin-, Thiol-, Carbonyl- oder Carboxygruppe oder Biotin, Streptavidin, Digoxigenin oder Fluoreszein etc.
Neben homogenen Festphasen können die Festphasen bereits vor der Beschichtung vorstrukturiert werden, um die gleichmäßige Anbindung funktioneller Fänger-Moleküle in exakt definierter Anordnung zu unterstützen. Die Festphase kann z.B. in hydrophile und hydrophobe Bereiche unterteilt sein, so dass beim Eintauchen in eine Lösung die Fänger- Moleküle nur die hydrophilen Bereiche benetzen und so selektiv an diesen Stellen gebunden werden. Diese hydrophilen Bereiche können z.B. in Form von Kreisen oder Linien angeordnet sein. Die hydrophilen Bereiche können weiterhin z.B. durch die oben beschriebenen funktionellen Gruppen aktiviert sein, um eine effiziente Anbindung der Fänger-Moleküle zu unterstützen. Alternativ können z.B. membranbasierte vorstrukturierte Oberflächen zum Einsatz kommen, in denen die mit jeweils einer Substanz zu beschichtenden Membranbereiche (Spots) durch Barrieren, z.B. hydrophobe Bereiche, voneinander getrennt sind. Die Beschichtung erfolgt z.B. durch Inkubation der Festphase mit einer verdünnten Lösung des Fänger-Moleküls oder durch Ausstreichen einer Lösung des Fänger-Moleküls auf der Festphase. Alternativ erfolgt das Aufbringen der Lösung des Fänger-Moleküls z.B. durch Drucken oder Spotten mit einer Nadel oder Micropipette. Unter Verwendung spezieller Microarray-Druckroboter können so wie bei der traditionellen Herstellung auch bereits mehrere unterschiedliche Fänger-Moleküle in Form eines Arrays auf einer Festphase kombiniert werden. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das endgültige Array aus einer sehr großen Anzahl verschiedener Fänger-Moleküle bestehen soll und die auf einem Fragment kombinierten Fänger-Moleküle ähnliche physikochemische Eigenschaften aufweisen, so dass sie unter identischen Anbindungsbedingungen immobilisiert werden können, wie es z.B. bei DNA-Oligonukleotiden der Fall ist. Alternativ kommt zur Ausprägung dieser "Primär-Arrays" auch die oben beschriebene /n-s/fu-Synthese in Betracht.
Das Zerteilen der beschichteten Festphasen kann mechanisch z.B. mittels eines Messers oder Diamanten (z.B. für Kunststoffe oder Glas), mittels gezielter Einwirkung energiereicher Strahlung z.B. mit Hilfe eines Laserstrahls (z.B. für Kunststoffe, Membranen) oder z.B. mittels gezielter Einwirkung von Chemikalien (Ätzen) erfolgen.
Vorteilhaft werden die beschichteten Festphasen vor der Fragmentierung auf einen flächigen Träger aufgebracht und z.B. über Gravitationskraft, reversible Klebung, Unterdruck, magnetische Kräfte oder mechanische Barrieren an einer vorgegebenen Position gehalten. Vorteilhaft ist es auch, das Fragmentierverfahren und den Träger so auszuwählen, dass der Träger zusammenhängend bleibt und so die entstehenden Festkörperfragmente auch nach dem Fragmentieren noch über den Träger zusammengehalten werden und dadurch in den folgenden Schritten besser gehandhabt werden können.
Die flächige Festphase kann auch bereits vor dem Beschichten fragmentiert werden. Dies bietet z.B. den Vorteil, dass empfindliche Fänger-Moleküle nicht durch den Fragmentierungsprozess beschädigt werden, z.B. durch Hitze bei Anwendung von Laserstrahlung. Um die Festphasenfragmente anschließend noch gut beschichten zu können, ist es i d. R. auch hier vorteilhaft, wenn die Fragmente auch nach der Fragmentierung zunächst noch auf einem Träger zusammen gehalten werden.
Selektion fehlerfrei beschichteter Fragmente vor der Kombination zu Arrays
Das hier beschriebene Herstellungsverfahren bietet den entscheidenden Vorteil, für die Kombination auf dem Analysenträger ausschließlich diejenigen Festphasenfragmente auszuwählen, die gemäß frei bestimmbarer Qualitätskriterien fehlerfrei sind. Diese Kriterien werden entsprechend der späteren Anwendung festgelegt und beinhalten z.B. die Toleranzen bezüglich der Menge immobilisierter Fänger-Moleküle pro beschichtetem Fragment bzw. pro Spot, der Gleichmäßigkeit der Verteilung der Fänger-Moleküle innerhalb eines Fragmentes bzw. der Spots, der Größe und Geometrie der Fragmente und Spots oder der Position der Spots innerhalb eines Fragmentes relativ zueinander. Zur Auswahl geeigneter Fragmente für die Kombination werden z.B. die Messungen einer In-Prozess- Kontrolle ausgewertet, die z.B. bei Anwendung des Druckverfahrens die Abgabe jedes Fänger-Molekül-Tropfens überwacht hat. Zusätzlich oder alternativ werden die Spots auf jedem Trägerstückchen untersucht, indem die immobilisierten Fänger-Moleküle z.B. anhand ihrer physikalischen Eigenschaften wie Lichtstreuung oder Lichtabsorption nachgewiesen werden. Zur besseren Detektierbarkeit kann es dafür vorteilhaft sein, die Fänger-Moleküle vor dem Aufbringen auf den Träger zu markieren, z.B. durch Ankopplung eines Fluoreszenzmoleküls. Alternativ erfolgt die Analyse indirekt, z.B. indem ein markierter Bindungspartner an die immobilisierten Fänger-Moleküle gebunden wird. Alternativ kann auch ein markiertes Markermolekül gemeinsam mit jedem Fänger-Molekül beschichtet werden. Die Anbindung des Markermoleküls kann dann sehr einfach z.B. über seine Fluoreszenz gemessen werden und erlaubt einen Rückschluss auf das Beschichtungsergebnis auch für das simultan aufgebrachte Fänger-Molekül. Dabei ist es günstig, wenn Marker- und Fänger-Molekül sich in ihren physikochemischen Eigenschaften ähneln oder sogar bis auf die Markierung identisch sind.
Bevorzugt werden die Messungen der Beschichtungsqualität durchgeführt, wenn die Trägerstücke noch nicht fragmentiert oder zumindest noch nicht vereinzelt sind und so vorteilhaft als zusammenhängender Festkörper gehandhabt werden können.
Weiterhin ist es i.d.R. zur Überprüfung der Array-Qualität wünschenswert, die Identität und Bindungsaktivität der Fänger-Moleküle, z.B. die von immobilisierten Antigenen, Antikörpern oder Nukleinsäuresequenzen zu überprüfen. Dazu können z.B. Stichproben der beschichteten Fragmente jeder Charge mit markierten Bindungspartnern für jedes auf dem Fragment vorhandene Fänger-Molekül inkubiert werden. Das Fehlen von Fänger-Molekülen in der Inkubations- oder Drucklösung und inaktive Fänger-Moleküle können so erkannt werden und Verunreinigungen von Fragmenten und Spots mit anderen als den gewünschten Fänger-Molekülen, wie sie z.B. durch Verschleppungen oder Kontaminationen bei der Array- Ausprägung auf einem Fragment mittels Drucktechniken auftreten können, werden aufgedeckt. Für Fragmente, die bereits mit Arrays bedruckt wurden, kann durch Inkubation mit unterschiedlichen Bindungspartnern die Position jedes Fänger-Molekül-Spots im Array überprüft werden. In Verbindung mit den oben genannten Methoden, mit deren Hilfe jedes Fragment zerstörungsfrei überprüft werden kann, ergibt sich so eine umfassende Kontrolle der Eigenschaften jedes beschichteten Fragments.
Kombination beschichteter Fragmente zur Ausprägung von Arrays
Die Träger, auf denen die beschichteten Festkörperfragmente kombiniert werden, bestehen z.B. aus flächigen Festkörpern aus glatten Materialien wie z.B. Glas, Quarz, Kunststoff, Silizium, Metall und Metallverbindungen, Kohlenstoff oder Kohlenstoffverbindungen oder auch porösen Materialien.
Das Zusammenfügen von beschichteten Festphasenfragmenten auf einem Träger erfolgt beispielsweise über etablierte Bestückungsverfahren („Verfahren zur Herstellung Festphasen-gebundener Bioreagenzien", WO2005/073693). Die Fragmente werden dazu z.B. von einem Roboter aufgenommen und an einer vorbestimmten Stelle auf den Träger, z.B. einen Objektträger, gesetzt und dort fixiert. Die Fixierung erfolgt z.B. durch Klebung, magnetische Kräfte oder Klemmung. Für die Klebung kommt z.B. doppelseitiges Klebeband in Frage. Bei transparenten Fragmenten bietet sich besonders die Verwendung eines Flüssigklebers an, der durch Bestrahlung mit UV-Licht zum Aushärten gebracht wird. So können die Fragmente nach dem Aufsetzen auf den Träger noch verschoben und in die optimale Position gebracht werden.
Durch Kombination mehrerer unterschiedlich beschichteter Festphasenfragmente wird auf einem größeren Träger ein Array ausgeprägt, das mehrere unterschiedliche Fänger- Moleküle enthält. Sind bereits auf einem Festphasenfragment mehrere verschiedene Fänger-Molekül-Spots in Form eines Arrays angeordnet (s. Abb. 1 unterste Reihe) können so auch sehr große Arrays kombiniert werden.
In einer Ausführungsvariante können die Arrays an mehreren separierten Bereichen eines zusammenhängenden Trägers ausgeprägt werden. In diesen separierten Bereichen können vorteilhaft mehrere unterschiedliche Proben parallel auf einem Träger jeweils mit einem zusammengesetzten Array inkubiert werden, wodurch der Arbeitsaufwand bei der Analyse mehrerer Proben erheblich reduziert wird.
Überprüfung der korrekten Kombination der beschichteten Festphasen fragmente
Abschließend kann anhand von Stichproben oder als Produkt-Endkontrolle die Identität, korrekte Position und genaue Lage der beschichteten Festphasenfragmente mittels geeigneter Messmethoden überprüft werden, um Fehler im Rahmen des Bestückungsprozesses auszuschließen. Dies kann z.B. durch Sichtbarmachen der Fragmente anhand ihrer physikalischen Eigenschaften wir Lichtbrechung oder Lichtabsorption erfolgen. Die Identität und korrekte Position der Fragmente kann z.B. durch Auslesen einer auf den Trägerstückchen aufgebrachten Markierung oder durch Nachweis der Fänger-Molekül-Identität verifiziert werden.
Kambinieren von bestückten Trägern zu größeren Arrays
In einem weiteren Schritt können auch Trägerstücke, auf denen beschichtete Festphasenfragmente kombiniert wurden, wiederum als Festphasenfragmente eingesetzt werden und auf einem größeren Träger zur Ausprägung noch größerer Arrays kombiniert werden. Dieses Kombinieren bereits kombinierter Arrays lässt sich vorteilhaft immer weiter fortführen und ermöglicht es, besonders viele Spots auf einem Träger auszuprägen. So können z.B. sehr große Arrays mit sehr vielen unterschiedlichen Fänger-Molekülen ausgeprägt werden oder auch mehrere Arrays an unterschiedlichen Positionen auf einem zusammenhängenden Träger erzeugt werden, die dann mit unterschiedlichen Proben inkubiert werden können
Vorteile des beschriebenen Verfahrens
Die Array-Qualität wird verbessert, da eine erheblich größere Bandbreite an Beschichtungsmethoden zur Verfügung steht
Da beim hier beschriebenen Verfahren der Beschichtungsprozess von der Array- Ausprägung, d.h. der räumlichen Anordnung der Fänger-Moleküle auf einer Festphase, entkoppelt ist, kann ein erheblich breiteres Methodenspektrum für die Beschichtung zum Einsatz kommen, als bei der oben beschriebenen, häufig problematischen Array-Ausprägung durch Drucken bzw. Spotten oder in-situ-Synthese gemäß dem traditionellen Verfahren. So können mit dem hier beschriebenen Verfahren Lösungen der Fänger-Moleküle z.B. auch durch Ausstreichen oder Aufsprühen auf eine Festphase aufgebracht werden. Alternativ kann die Festphase z.B. mit einer stark verdünnten Lösung des Fänger-Moleküls für beliebig lange Zeiträume inkubiert werden, ohne dass, wie bei Microtropfen, Probleme mit dem Verdunsten auftreten. Die Beschichtung aus verdünnten Lösungen ist z.B. eine Technik, die bereits seit vielen Jahren routinemäßig für die Beschichtung von Microtiterplatten mit Proteinen zur Herstellung von ELISA-Assays eingesetzt wird. Derartige Beschichtungsprotokolle lassen sich mit dem hier beschriebenen Verfahren jetzt auch für die Herstellung von Macro- und Microarrays nutzen. So können einerseits die Eigenschaften der immobilisierten Fänger-Moleküle dramatisch verbessert werden, und andererseits kann der Beschichtungsprozess erheblich einfacher und schneller gestaltet werden.
Die Array-Qualität wird verbessert, da das Beschichtungsverfahren optimal an die Eigenschaften jedes Fänger-Moleküls angepasst werden kann
Mit dem hier beschriebenen Verfahren können Festphase und Beschichtungsbedingungen an jedes Fänger-Molekül individuell angepasst werden, da im Extremfall das Array komplett durch das Zusammensetzen von "Einzelspots", also von flächigen Festkörpern, die nur mit einer Sorte Fänger-Molekül beschichtet sind, ausgeprägt wird. Zum Beispiel können dadurch für jedes Fänger-Molekül das optimale Oberflächenmaterial (z.B. Glas oder Kunststoff oder Membran, ggf. vorbehandelt) und die optimalen Beschichtungszeiten, -temperaturen und - puffer eingesetzt werden. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn sich die Fänger- Moleküle in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften stark voneinander unterscheiden, wie dies z.B. für viele Proteine der Fall ist. So können Anbindung und Aktivität für jedes Fänger-Molekül getrennt optimiert und dadurch allerbeste Bindungsspezifitäten und Sensitivitäten für jedes Fänger-Molekül auf dem Array erreicht werden.
Schnelle und flexible ("customized"- oder "on-demand"-) Fertigung von Arrays aus gelagerten Festphasen fragmenten ist problemlos möglich
Fertig beschichtete Festphasenfragmente können allein durch Anwendung des Bestückungsprozesses zu unterschiedlichen Arrays kombiniert werden, ohne dafür erneut den aufwendigen Beschichtungsprozeß durchführen zu müssen. Bei Anlegen eines Vorrates beschichteter Festphasen können so vorteilhaft sehr schnell und mit wenig Aufwand Arrays auf unterschiedlichen Trägern und Trägerformaten ausgeprägt werden und durch die Auswahl verschiedener Fragmente die Array-Zusammensetzung jeweils sehr flexibel und individuell an neue Anforderungen angepasst werden - im Sinne eines „Customized" Arrays. Auch kleine Chargen einer bestimmten Arraykonfiguration können auf diese Weise mit geringem Aufwand hergestellt werden. Durch Verfügbarmachen entsprechender Bestückungsmaschinen kann das Array sogar vor Ort vom Anwender selbst zusammengestellt werden, was z.B. bei der Durchführung von Routine-Laboranalysen häufig wünschenswert ist. Bessere Möglichkeiten zur Qualitätskontrolle erhöhen die Effizienz des Herstellungsprozesses und die Array-Qualität
Beim herkömmlichen Verfahren kann die Qualität jedes Spots erst auf Ebene des fertig zusammengesetzten Arrays kontrolliert werden, während mit dem hier beschriebenen Verfahren die Qualität der Beschichtung bzw. jedes Spots bereits auf Ebene der Fragmente - vor der Ausprägung des gesamten Arrays - überprüft werden kann. Für die Herstellung weitgehend oder komplett fehlerfreier Arrays führt dies zu einer erheblichen Einsparung von Ressourcen, da im Falle eines Fehlers nicht die kompletten Arrays einschließlich aller guten Spots verworfen werden müssen, sondern nur die betroffenen Fragmente. Die Herstellung fehlerfreier Arrays wird durch die Möglichkeit dieser Vorselektion wesentlich erleichtert. Die besonders großen Vorteile, die sich dabei gerade für die Herstellung großer Arrays ergeben, sind weiter unten beschrieben.
Das hier beschriebene Verfahren erleichtert es aber nicht nur, die Anwesenheit und korrekte Ausprägung jedes Spots sicher zu stellen, sondern vereinfacht es weiterhin, die korrekte Identität und Aktivität der Fänger-Moleküle für jeden Spot zu verifizieren, z.B. die von immobilisierten Antigenen oder Antikörpern oder die korrekte Sequenz und Hybridisierungsaktivität, wenn Nukleinsäure-Fänger-Moleküle, z.B. Oligonukleotide, immobilisiert wurden.
Dazu können vorteilhaft wiederum vor der abschließenden Arrayausprägung die bespotteten Fragmente mit spezifischen Bindungspartnern für alle auf den Fragmenten vorhandenen Fänger-Moleküle getestet werden. Sofern auf den Fragmenten bereits mehrere Spots ausgeprägt wurden, kann durch sukzessive Inkubation die korrekte Position jedes Fänger- Molekül-Spots innerhalb des Array-Gitters verifiziert werden. Weiterhin können das Fehlen von Fänger-Molekülen oder inaktive Fänger-Moleküle in einem Spot erkannt sowie Verunreinigungen von Spots mit anderen Fänger-Molekülen, wie sie z.B. durch Verschleppungen oder Kontaminationen während der Array-Ausprägung auftreten können, aufgedeckt werden.
Ausreichend ist hier häufig eine Kontrolle von Stichproben jeder Charge. Dies gilt zumindest dann, wenn Veränderungen bezüglich der genannten Parameter während des Vorganges der Spot-Erzeugung nahezu ausgeschlossen werden können. Dies ist z.B. dann der Fall, wenn Mehrkanal-Druckköpfe, wie sie z.B. bei der TopSpot-Technologie (DEVICE AND METHOD FOR THE NON-CONTACT APPLICATION OF MICRO-DROPLETS ON A SUBSTRATE, WO0216021) zum Einsatz kommen, verwendet werden. Wenn dann z.B. für das erste und letzte bespottete Fragment die Spot-Identitätsüberprüfung durchgeführt wird, kann daraus sicher geschlossen werden, dass die Spot-Identität auch bei den zeitlich dazwischen produzierten Arrays fehlerfrei ist, da deren Herstellung mit der selben Probenbeladung erfolgt ist. In Verbindung mit den oben genannten zerstörungsfreien Kontrollen, welche die Ausprägung jedes Fänger-Molekül-Spots auf jedem Fragment nachweist, ergibt sich so eine lückenlose Qualitätssicherung.
Zur Herstellung fehlerfreier Arrays werden erheblich weniger Ressourcen benötigt
Mit dem hier beschriebenen Verfahren gelingt es auch bei Anwendung der derzeit verfügbaren, fehlerbehafteten Druck- bzw. Spottechniken, mit akzeptablem Aufwand Arrays in höchster Qualität - also beliebig wählbar ganz oder auch nur fast ohne fehlerhafte Spots - herzustellen. Unter fehlerhaft wird dabei verstanden, dass ein Spot bestimmten ausgewählten Kriterien nicht entspricht (s.o.).
Der wesentliche Vorteil liegt darin, dass zur Erzeugung fehlerfreier Arrays erheblich weniger Spots ausgeprägt werden müssen, als mit dem konventionellen Verfahren und dadurch in erheblichem Umfang Material und Arbeitszeit eingespart werden kann. Dieser Vorteil wird anhand folgender Beispielrechnung verdeutlicht:
Für das hier beschriebene Verfahren gilt:
Im ersten Schritt werden Fänger-Moleküle z.B. mittels Druck- oder Spotting-Techniken auf einen flächigen Festkörper aufgespottet, der anschließend fragmentiert wird, so dass auf jedem Fragment die gewünschte Anzahl an Spots verbleibt. Der Anteil fehlerfreier Fragmente, d.h. solche, bei denen alle Spots den gesetzten Qualitätskriterien genügen, beträgt
ZSASPF
mit
ZS = Zuverlässigkeit des Spot-Erzeugungsprozesses (Werte zwischen 0 und 1), wobei eine Zuverlässigkeit von 1 einem komplett fehlerfreien Prozess entspricht, eine von 0,999 einer Fehlerhäufigkeit von 1 Spot pro 1000 Spots, eine von 0,99 einer Fehlerhäufigkeit von 1 Spot pro 100 Spots usw. ASPF = Anzahl der Spots pro Fragment
In einem zweiten Schritt werden bei dem hier vorgestellten Verfahren die fehlerfreien Fragmente zu den endgültigen Arrays kombiniert. Der Anteil der aus fehlerfreien Fragmenten fehlerfrei zusammengesetzten Arrays beträgt: AF
ZB
mit
ZB = Zuverlässigkeit des Fragmentier- und Bestückungsprozesses (Werte zwischen 0 und 1), wobei eine Zuverlässigkeit von 1 einem komplett fehlerfreien Prozess entspricht, eine von 0,999 einer Fehlerhäufigkeit von 1 pro 1000 Fragmentier- und Bestückungsvorgängen, eine von 0,99 einer Fehlerhäufigkeit von 1 pro 100 Vorgängen usw.
AF = Anzahl der zum Array kombinierten Fragmente
Unter Berücksichtigung beider Verfahrensschritte beträgt damit der Anteil der im ersten Schritt erzeugten Spots, die letztendlich in fehlerfreie Arrays eingehen:
ZBAF X ZSASPF
Beim herkömmlichen Prozess beträgt die Ausbeute fehlerfreier Arrays demgegenüber:
AS
ZS
mit
ZS = s.o.
AS = Anzahl der Spots pro Array
Das hier vorgestellte Verfahren ist damit effizienter, wenn ZBAF x ZSASPF > ZSAS ist.
Da der Fragmentier- und Bestückungsprozess im Gegensatz zum Spotausprägungsprozess ein rein mechanischer Prozess ist, ist er i.d.R. mindestens so zuverlässig wie der Spoterzeugungsprozess. Unter der Annahme, dass ZB lediglich genau so groß wie ZS ist, ergibt sich für das hier beschriebene Verfahren:
ZBAF x ZSASPF = ZSAP + ASPF
Selbst unter dieser - für das hier beschriebene Verfahren ungünstigen - Annahme ergibt sich ein deutlicher Vorteil für das hier beschriebene Verfahren, wenn
zsAF + ASPF > zsAS = zsAF x ASPF
Da 0 < ZS < 1 , ist diese Gleichung erfüllt, wenn
AF + ASPF < AF x ASPF ist.
Da AF und ASPF jeweils ≥ 2 sind (mind. 2 Spots pro Fragment und 2 Fragmente pro Array), ist diese Bedingung immer erfüllt, wenn:
AF oder/und ASPF ≥ 3 sind
Damit ergibt sich bereits ab 3 Spots pro Fragment (ASPF = 3) oder ab 3 Fragmenten pro Array (AF = 3) mit dem hier beschriebenen Verfahren in jedem Fall eine bessere Ausbeute fehlerfreier Arrays als bei der direkten Arrayherstellung gemäß dem konventionellen Verfahren.
Je größer das Array ist (also je größer AF und ASPF bzw. AS) und je kleiner die Zuverlässigkeit des Spoterzeugungs-Prozesses ist, desto größer ist der Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens. Die Vorteile sind, wie in folgendem Beispiel zu sehen, bereits für die Herstellung eines relativ kleinen Microarrays beachtlich:
Beispiel:
Ziel: Herstellung eines Arrays mit 600 Spots
Annahme: AS = 600; AF = 20; ASPF = 30; ZS = ZB = 0,99
Bezogen auf die Anzahl der initial erzeugten Spots beträgt die Ausbeute fehlerfreier Arrays über den gesamten Prozess:
AS 600
- mit dem herkömmlichen Verfahren = ZS = 0,99 = 0,24 %
AF ASPF 50
- mit dem hier vorgestellten Verfahren = ZB x ZS = 0,99 = 61 % w L. r , ^70AF + ASPF -AF x ASPF
- Verbesserungsfaktor = ZS = 251 ,6
Mit dem herkömmlichen Verfahren müssen also zur Herstellung eines perfekten Arrays mit 600 Spots 250-mal mehr Spots erzeugt werden als mit dem hier beschriebenen Verfahren. Der Material- und Zeitaufwand für die Arrayproduktion wird demzufolge mit dem hier beschriebenen Verfahren erheblich reduziert.
Wie anhand dieser Beispielrechnung leicht abzuleiten ist, ergeben sich auch für andere Randbedingungen und selbst für die Herstellung kleinerer Arrays klare Vorteile für das hier beschriebene Verfahren.
Die Herstellung fehlerfreier großer Arrays gelingt auch mit nicht perfekten Verfahren zur Spot-Ausprägung
Für große Arrays (großes AS) sinkt die Anzahl fehlerfreier Arrays beim konventionellen
AS Herstellungsverfahren gemäß ZS gegen null (da 0 < ZS < 1), d.h. eine Herstellung ist nicht mehr oder nur noch unter Einsatz immens großer Ressourcen möglich.
Bei dem hier vorgestellten Verfahren besteht demgegenüber die Möglichkeit, bereits auf Ebene der bespotteten Fragmente die Spotqualität zu untersuchen und nur solche Fragmente zum Gesamt-Array zu kombinieren, die den gewünschten Anforderungen entsprechen. Diese Vorselektion ermöglicht es, trotz fehlerhafter Verfahren der Spot- Ausprägung fehlerfreie große Arrays herzustellen. Dies wird anhand folgender Beispielrechnung deutlich.
Bei Durchführung einer Vorselektion fehlerfreier Fragmente beträgt der Anteil fehlerfreier
AF Arrays nach Kombination ZB
Da
1. AS bei größeren Arrays erheblich größer als AF ist
und unter der realistischen Annahme, dass der rein mechanische Bestückungsprozess zuverlässiger als das zur Spoterzeugung verwendete Verfahren ist, also
2. ZB größer oder mindestens gleich ZS ist,
. . • --—Ar _ΛAb ist auch ZB » ZS
Mit dem hier beschriebenen Verfahren steigt daher die Ausbeute fehlerfreier Arrays bei Verwendung fehlerbehafteter Methoden der Spot-Ausprägung erheblich an, wie anhand des folgenden Beispiels noch einmal verdeutlicht wird:
Beispiel: Herstellung von Arrays mit 1000 Spots.
Annahme: AS = 1000; AF = 25; ASPF = 40; ZS = ZB = 0,99
AS Der Anteil fehlerfreier Arrays beträgt gemäß ZS = 0,991000 = 0,0043 % für das herkömmliche Verfahren - eine Herstellung ist praktisch unmöglich.
AF Mit dem hier beschriebenen Verfahren erhöht sich der Anteil fehlerfreier Arrays auf ZB =
25 0,99 = 77,8 %, unter der Voraussetzung, dass fehlerhafte Fragmente vor der Kombination zum Array heraussortiert werden. Unter den gegebenen Randbedingungen wird so die Herstellung fehlerfreier 10OOer-Arrays ermöglicht. Spezielle Verfahren, die bisher nur für kleine Arrays geeignet waren, können jetzt auch zur Herstellung hochkomplexer Arrays genutzt werden
Bestimmte Verfahren der Spot-Erzeugung eignen sich bevorzugt für die Ausprägung relativ kleiner Arrays, z.B. das DDI-Verfahren (DNA directed immobilization, Wacker R und Niemeyer CM. Chembiochem. 2004 Apr 2;5(4):453-9). Hier wird zunächst ein Array aus DNA-Oligonukleotiden ausgeprägt. Dieses Array wird dann zur positionsspezifischen Immobilisierung von Protein-Fänger-Molekülen genutzt, indem die Proteine mit unterschiedlichen DNA-Sequenzen konjugiert werden, die jeweils zu einem Oligonukleotid auf dem Array komplementär sind. Durch Hybridisierung der DNA-Proteinkonjugate mit dem Oligoarray wird jedes Protein dann an einer definierten Stelle des Arrays gebunden und kann wiederum als Fänger-Molekül bei der Analyse einer Probenflüssigkeit dienen. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht es, mit dem DDI-Verfahren durch Kombination mehrerer so ausgeprägter Arrays zu einem Gesamtarray auch komplexe Arrays herzustellen.
Die Produktionseffizienz steigt, da die Handhabung der Fänger-Molekülbanken vereinfacht wird und Fehler durch Vertauschungen und Kontaminationen unwahrscheinlicher werden
Mit dem hier beschriebenen Verfahren wird bei der schwierigen initialen Festphasenbeschichtung pro Arbeitsgang jeweils nur ein kleiner Teil der Fänger-Moleküle, die das spätere Gesamt-Array ausmachen, an eine Festphase gekoppelt. Es müssen also nicht alle Fänger-Moleküle gleichzeitig vorgelegt, ggf. aliquotiert, verdünnt usw. werden, wodurch das Risiko, dass Fehler bei der Handhabung der Fänger-Moleküllösungen auftreten, abnimmt und dadurch die Produktionseffizienz steigt.
Bessere Array quäl itäten werden durch verkürzten Bespottungsprozess ermöglicht
Die Ausprägung der Arrays auf den Festphasenfragmenten mit Hilfe von Druck- bzw.
Spottechnologien kann in kürzerer Zeit als bei dem herkömmlichen Verfahren erfolgen, da pro Fragment jeweils nur ein kleiner Teil der später auf dem Gesamt-Array vorhandenen
Fänger-Moleküle aufgebracht werden muss.
Dadurch ergeben sich folgende Vorteile:
- Die Verdunstung der Fänger-Moleküllösungen in der Vorlage wird reduziert, die Konzentration bleibt dadurch über den gesamten Bespottungsprozess besser konstant und damit reproduzierbar; Verdunstungs-Vermeidungstechniken wie eine feuchte Kammer oder Kühlung werden u.U. überflüssig. - Die spontane Deaktivierung der Träger-Oberflächen, z.B. durch Reaktion mit Luftsauerstoff oder Luftfeuchtigkeit, ist in der kürzeren Zeit weniger stark ausgeprägt. Für alle Fänger-Moleküle werden damit besser äquivalente Anbindungsbedingungen und dadurch besser reproduzierbare Anbindungsergebnisse ermöglicht.
Beispiele
Beispiel 1: Ausprägung und Verwendung kombinierter DNA-Microarrays auf Objektträgern der Firma EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG (Lübeck)
Vier Glasträger in den Abmessungen 26 mm x 76 mm und von 140 μm Dicke werden mit 1 % 3-Glycidyl-propoxy-trimethoxysilan (GPTS) in Hexan silanisiert. Auf die so mit Epoxy- Gruppen aktivierte Oberfläche werden mit einem kontaktfreien Piezo-Spotter (NanoPlotter NP1.2, GeSiM mbH, Großerkmannsdorf) verschiedene Lösungen 10 - 50 μM konzentrierter 5'-Amino-modifizierter DNA-Oligonukleotide in Form mehrerer 4 x 4-Spots großer Arrays aufgetropft. Die Tropfengröße beträgt ca. 300 pl. Der Spot zu Spot-Abstand innerhalb der Arrays beträgt 400 μm. Die Arrays sind ihrerseits in 25 Zeilen und 10 Spalten angeordnet; der Abstand der Mittelpunkte beträgt in horizontaler und vertikaler Richtung jeweils 2 mm. Die Anbindung der Oligonukleotide an die Glasoberfläche erfolgt durch Inkubation der Gläser über Nacht in einer Feuchtkammer. Die Tropfen lässt man auf den Gläsern eintrocknen und es wird ein Bild der Substanzreste auf dem Glas aufgenommen, welches es ermöglicht, die Anwesenheit und Position jedes Spots und jedes Arrays auf dem Glasträger zu überprüfen (siehe WO2005073693 „Verfahren zur Herstellung Festphasen-gebundener Bioreagenzien"). Anschließend werden die nicht gebundenen Oligonukleotide abgewaschen. Die Gläser werden mit dem in WO2005/073693 beschriebenen Prozess fragmentiert und anschließend auf einem zusammenhängenden Träger bestückt. Zunächst werden dazu die bespotteten Gläser mit der Unterseite auf einer Trägerfolie (Ultron Systems Inc., Califomien, USA) angeheftet und erneut gescannt. Das Bild wird mit dem ursprünglichen Bild, welches die Lage der Spots zeigt, anhand der Ränder des Glases oder anderer Referenzmarkierungen präzise zur Überlappung gebracht; dabei hilft die halbtransparente Darstellung des oberen Bildes. Mit der Software wird dann ein 2 mm großes x-y-Raster über die beiden Bilder gelegt, so dass jedes Array in der Mitte eines 2 mm x 2 mm großen Kästchens zum Liegen kommt. Diejenigen Kästchen, für die anhand der ersten Aufnahme zu erkennen ist, dass sie fehlerhafte Arrays bzw. Spots enthalten, werden mit Hilfe der Software gekennzeichnet und später nicht zur Bestückung verwendet. Entlang der Rasterlinien wird dann präzise mit einem Diamant-Schneidwerkzeug geschnitten, wodurch 250 2 x 2 mm große Glasfragmente entstehen. Die Fragmente, die fehlerfreie Arrays enthalten, werden mit Hilfe eines vakuum unterstützten Saugπapfes von ca. 1 mm Durchmesser angehoben und mittels einer Transfereinheit präzise auf den 5 Testfeldern eines 5er-EUR0IMMUN-0bjekträgers positioniert. In jedem der ca. 7 x 9 mm großen Testfelder werden 4 unterschiedliche Arrays kombiniert, so dass sich in einem Testfeld insgesamt 4 x 16 = 64 Spots befinden und insgesamt 20 Glasfragmente auf einem Objektträger fixiert werden.
Die Arrays werden anschließend zur Untersuchung der genauen Sequenzen oder/und Mengen von Nukleinsäuren in einer Probe eingesetzt. Dafür wird genomische DNA im Falle der Analyse von Polymorphismen oder RNA für Expressionsanalysen aus der Probe isoliert. Anschließend werden bei genomischer DNA die interessierenden Abschnitte vervielfältigt und mit Fluoreszenzmolekülen markiert, indem in einer PCR-Reaktion fluoreszenzmarkierte Primer eingesetzt werden oder fluoreszenzmarkierte Nukleosidtriphosphate eingebaut werden. Alternativ wird die mRNA einer Probe unter Verwendung des LabelStar-Kits (Qiagen, Hilden) in cDNA umgeschrieben und diese dabei durch den Einsatz fluoreszenzgekoppelter Nukleosidtriphosphate markiert. Die so markierten Nukleinsäuren werden durch Erhitzen auf 95°C denaturiert und in einem Hybridisierungspuffer unter Anwendung der EUROIMMUN-Titerplane®-Technologie (EUROIMMUN AG, Lübeck) bei 45°C in jeweils einem Testfeld der EUROIMMUN-Objektträger mit den Oligonukleotid-Arrays über Nacht inkubiert. Nicht spezifisch an das Array gebundene Nukleinsäuren werden anschließend durch Waschen mit unstringentem Puffer (1X SSC, 0,1 % SDS) und stringentem Waschpuffer (0,1 X SSC, 0,1 % SDS) entfernt. Die Objektträger werden durch einen Luft- oder Stickstrom oder durch Zentrifugation getrocknet. Zur Bestimmung der Bindung der Probenmoleküle an die Spots wird der Objektträger mit einem BioAnalyzer 4F (LaVision BioTec GmbH, Bielefeld) ausgelesen. Die Anwesenheit eines Fluoreszenzsignals an der Position eines Spots weist dabei nach, dass eine zu dem an dieser Stelle immobilisierten Oligonukleotid exakt oder weitgehend komplementäre markierte Nukeinsäuresequenz in der Probe vorhanden ist. Die Intensität der Fluoreszenz ist ein Maß für die Menge der Nukleinsäuresequenz in der Probenflüssigkeit.
Beispiel 2: Ausprägung und Verwendung kombinierter, qualitätskontrollierter DNA- Microarrays auf Objektträgern der Fa. EUROIMMUN Labordiagnostika AG
Die Herstellung und Verwendung erfolgt wie im Beispiel 1 angegeben. Jedoch sind zur verbesserten Qualitätskontrolle der Spots alle Fänger-Moleküle an ihrem 3'-Ende mit einem Fluoreszenzmolekül markiert oder jeder zu spottenden Oligonukleotidlösung wird eine geringe Menge eines anderen fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids zugesetzt. Anstelle des Scannens der Salzreste werden die Gläser jetzt erst nach dem Abwaschen der nicht gebundenen Oligonukleotide mit Hilfe des BioAnalyzers ausgelesen und dabei die Fluoreszenzsignale der fest gebundenen Fänger-Oligos bzw. des hinzugemischten Oligonukleotids ermittelt. Anhand dieser Fluoreszenz wird vor dem Fragmentieren der Gläser geprüft, ob jeder Spot entsprechend den Anforderungen vorhanden, homogen ausgeprägt und korrekt positioniert ist. Vor der Bestückung wird diese Aufnahme wie oben beschrieben herangezogen, um die Position der Arrays auf dem Glas zu ermitteln sowie Fragmente mit fehlerhaften Arrays zu markieren und von der weiteren Verwendung auszunehmen. Die Verwendung zur Untersuchung von Probenflüssigkeiten erfolgt wie oben angegeben, wobei zur Markierung der Probenmoleküle eine andere Fluoreszenz-Wellenlänge zum Einsatz kommt als zur Markierung der Fänger-Oligonukleotide bzw. des den Fänger- Oligonukleotiden hinzugemischten Oligonukleotids. Die Fluoreszenzsignale des Fänger- Oligonukleotids bzw. des den Fänger-Molekülen hinzugemischten fluoreszenzmarkierten Oligonukleotids werden nach der Hybridisierung parallel zum Auslesen der Probensignale erneut aufgenommen und dienen als Referenzsignale.
Beisp!el3: Ausprägung der Arrays auf den Fragmenten mittels TopSpot-Technologie
Das Verfahren und die Analyse entspricht dem in Beispiel 1 oder 2, jedoch werden 24 Oligonukleotid-Lösungen gleichzeitig mittels der TopSpot-Technologie unter Verwendung eines 24er Druckkopfes in Form eines 6 x 4-Primär-Arrays aufgebracht. Der Spot-zu-Spot- Abstand beträgt hier 500 μm. Es wird ansonsten exakt wie in Beispiel 1 oder 2 verfahren, jedoch haben die Glasfragment eine Größe von 3,5 mm x 2,5 mm, um jeweils ein komplettes Array aufnehmen zu können. Wegen der größeren Abmessungen werden auf dem oben erwähnte Trägerglas lediglich 7 x 25 = 175 anstatt 250 Primär-Arrays ausgeprägt.
Beispiel 4: Ausprägung und Verwendung von Anϋ'gen-Microarrays für die Autoimmundiagostik
Auf ein mit Aldehydgruppen funktionalisiertes Glas in den Abmessung 26 mm x 76 mm und von 140 μm Dicke oder dünne Kunststofffolien, z.B. aus PMMA, werden mit einem kontaktfreien Piezo-Spotter (NanoPlotter NP1.2, GeSiM mbH, D - Großerkmannsdorf) 16 verschiedene Autoantigenlösungen (0,2 - 0,5mg/ml) in Form mehrerer Arrays mit aus je 4x4- Spots aufgetropft. Die Array-Ausprägung entspricht dem Beispiel 1 , die Inkubation in einer Feuchtkammer entfällt aber. Nach der Überprüfung der Anwesenheit aller Spots durch Scannen, wie in Bsp. 1 beschrieben, werden die nicht gebundene Antigenmoleküle abgewaschen. Wenn analog zum Bsp. 2 ein fluoreszierendes Antigen verwendet bzw. den zu spottenden Lösungen zugesetzt wird, erfolgt das Scannen alternativ dazu mit dem BioAnalyzerer erst nach dem Abwaschen der nicht gebundenen Antigenmoleküle. Die Fragmentierung und Bestückung erfolgt für Glas wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben. Kunststofffolien werden davon abweichend mit Hilfe eines CO2-Laserbeschrifters (ALLTEC GmbH, Selmsdorf) fragmentiert, wobei wie beim Diamant-Schneidverfahren nur die Kunststofffolie, nicht aber eine darunter liegende Trägerfolie, durchtrennt wird. Zur Testdurchführung werden die Testfelder unter Anwendung der Titerplane®-Technologie mit verdünnten Patientenseren inkubiert. Nach Waschschritten werden die Arrays mit einem Fluoreszein oder anders fluoreszenzmarkierten (z.B. Cy2, Cy3, Cy5) Anti-Human-IgG- oder Anti-Human-IgM-Antikörper inkubiert, der an die Autoantikörper aus dem Probenserum bindet , die ihrerseits während der ersten Inkubation an die Antigen-Spots gebunden haben. Nach erneutem Waschen werden durch Auswertung im Mikroskop oder mittels des BioAnalyzers diejenigen Spots bzw. Antigene identifiziert, für die in der Probe Antikörper vorhanden waren. Die Intensität der Fluoreszenzsignale ist dabei ein Maß für die Menge der Autoantikörper in der Probe.
Beispiel 5: Ausprägung von Antigen-Microarrays durch Kombination bespotteter Gläser
Die Herstellung erfolgt wie in Beispiel 4, jedoch werden die Spots mit Hilfe eines Hochdurchsatz-Spotters im Abstand von etwa 300 μm erzeugt. Dabei wird eine Mikropipette über ein mit Gläsern belegtes Tablett hin- und herbewegt und dabei werden ca. 600 bis zu mehreren tausend Spots pro Sekunde abgegeben. Nach dem Abwaschen überschüssiger Antigenmoleküle werden die Gläser oder Kunststofffolien wie in Bsp. 4 beschrieben fragmentiert, wobei aus einem Glas etwa 20 x 70 = 1400 quadratische Fragmente von je 1 mm2 Fläche geschnitten werden. Hierbei wird auf die genaue Anordnung der Spots keine Rücksicht genommen, da unter den genannten Randbedingungen immer mehrere komplette Spots in einem Fragment zum liegen kommen. Nach der Fragmentierung werden die Gläser wie in Bsp. 4 beschrieben ausgelesen und Fragmente, die nur oder zu viele fehlerhafte Spots enthalten, aussortiert. Die Bestückung erfolgt wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben, wobei durch Kombination von bis zu 48 Fragmenten pro Testfeld, die jeweils mit einem anderen Antigen betropft wurden, in jedem Testfeld ein Array aus vielen verschiedenen Antigenen ausgeprägt wird. Die Testdurchführung mit diesen Arrays erfolgt wie in Bsp. 4 beschrieben.
Beispiel 6: Herstellung von Protein- und DNA-Microarrays auf Basis von Membranen
Die Herstellung und Testdurchführung erfolgt wie in den Beispielen 1-5, nur kommen anstelle der aktivierten Glasoberflächen oder Folien dünne Nylonmembranen (PALL GmbH, Dreieich) oder Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schüll, Dassel) zum Einsatz. Diese sind ggf. zur Versteifung auf dünne Gläser oder Kunststofffolien aufgeklebt. Die Fragmentierung der Membranen auf Gläsern erfolgt wie in Bsp. 1 beschriebenen mit einem Diamantschneider. Membranen allein oder auf dünnen Kunststofffolien, z.B. PMMA, befestigte Membranen werden mit Hilfe eines Laserbeschrifters (ALLTEC GmbH, Selmsdorf) fragmentiert, dessen Leistung so eingestellt wird, dass der Laserstrahl die Membran ggf. einschließlich der daran fixierten Kunststofffolie, nicht aber eine darunter liegende Trägerfolie (s. Bsp. 1) durchtrennt. Die Auswahl perfekter Membranfragmente erfolgt durch Sichtbarmachen der Spots anhand von Fluoreszenzsignalen der Antigene bzw. Oligonukleotide wie in den obigen Beispielen 2 und 4 beschrieben. Die Bestückung der Membranfragmente in die Felder eines EUROIMMUN-Objektträgers erfolgt anschließend mit einer Bestückungsmaschine wie in Bsp. 1 beschrieben oder auch von Hand, z.B. mit Hilfe eine Pinzette. Bei der Testdurchführung wird bei der Verwendung von Membranen alternativ zur Fluoreszenzdetektion eine Farbreaktion oder Luminiszenzreaktion durchgeführt. Dafür wird im Fall von Antigenarrays eine alkalische Phosphatase oder Peroxidase anstelle des Fluoreszenzmoleküls an den Anti-Human-IgG- bzw. Anti-Human-IgM-Antikörper gekoppelt und im Fall von DNA-Arrays die Proben-Nukleinsäure mit Biotin oder Fluoreszein markiert und das Array nach der DNA-Hybridisierung mit Streptavidin- bzw. Anti-Fluoreszein- konjugierter alkalischer Phosphatese inkubiert. Nach Abwaschen der überschüssigen Phosphatase- bzw. Peroxidase-Konjugate wird das Färb- bzw. Lumineszenzsignal durch Überschichten des Arrays mit geeigneten Substraten (NBT/BCIP, CDP-Star Roche Diagnostics GmbH, oder Luminol) entwickelt und mit einer konventionellen Kamera oder einem Flachbettscanner bzw. im Falle des Lumineszenzsignals mit Hilfe des BioAnalyzers ausgelesen.
Beispiel 7: Flächige Beschichtuπg der Substrate
Glas-, Kunststoff-, oder Membransubstrate, wie in den Beispielen 4 - 6 beschrieben, werden in Objektträger-Versandbehälter mit jeweils einer Antigenlösungen (1 - 20 μg/ml Protein) über Nacht inkubiert. Die nicht gebundenen Antigenmoleküle werden anschließend abgewaschen und die auf der Oberfläche verbliebenen aktiven Gruppen durch Inkubation mit einer Proteinlösung, z.B. einer BSA-Lösung, blockiert. Die so beschichteten Substrate werden wie in den Beispielen 4 - 6 beschrieben fragmentiert. Nach Kontrolle der Beschichtungsqualität jedes Fragments anhand des Fluoreszenzsignals werden die perfekt beschichteten Fragmente auf einem Testträger zur Ausprägung eines Arrays kombiniert und wie in den Beispiel 4 - 6 beschrieben verwendet. Eine flächige Beschichtung kann auch mit Hilfe anderer Methoden erreicht werden, wie Siebdruck, Sprühtechniken, Spotten, Ausstreichen usw. Beispiel 8: Ausprägung und Verwendung von Allergie-Microarrays für die Allergiediagnostik
Die Herstellung und Testdurchführung erfolgt wie in Beispiel 4 - 7. Anstatt der Autoantigenlösungen kommen jedoch Extrakte tierischen und pflanzlichen Ursprungs sowie aus Lebensmitteln und Mikroorganismen zum Einsatz. Bei der Testdurchführung kann so die Anwesenheit von Antikörpern im Serum, die gegen einen Bestandteil der immobilisierten Extrakte gerichtet sind, nachgewiesen werden. Als Konjugate kommen neben den beschriebenen Anti-Human-IgG- und Anti-Human-IgM-Antikörpern insbesondere Anti- Human-lgE-Antikörper zum Einsatz.
Beispiel 9: Ausprägung von Microarrays in Mikrotiterplatten
Das Verfahren entspricht dem in den Beispielen 1 - 8, jedoch werden die Fragmente nicht auf EUROIMMUN-Objektträgern kombiniert, sondern jeweils in den Vertiefungen einer 96er Multititerplatte (MTP) abgesetzt. Die Testdurchführung mit dem Probenmaterial findet anschließend in den Vertiefungen der MTP unter Anwendung der oben beschriebenen Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder kolorimetrischen Nachweismethoden statt.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Macro- und Microarrays (Biochips), dadurch charakterisiert, dass jeweils ein oder mehrere Fänger-Moleküle auf jeweils einem Trägerstück immobilisiert werden und anschließend zwei oder mehr dieser Trägerstücke auf einem Träger kombiniert und fixiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Fänger-Moleküle auf Trägerstücken immobilisiert werden, die aus unterschiedlichen Materialien bestehen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 - 2, bei dem die Beschichtungsqualität der Trägerstücke vor der Kombination kontrolliert wird und nur diejenigen Trägerstücke zur Kombination ausgewählt werden, welche bestimmte, gewählte Qualitätsmerkmale erfüllen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Beschichtungsqualität unter anderem oder ausschließlich dadurch kontrolliert wird, dass nach dem Eintrocknen der Beschichtungslösung ein Bild von den präzipitierten Substanzresten, z.B. Salzen aus der Beschichtungslösung, aufgenommen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Beschichtungsqualität unter anderem oder ausschließlich dadurch kontrolliert wird, dass die Fänger-Moleküle oder ein anderer Bestandteil der Beschichtungslösung eine Fluoreszenzmarkierung trägt und nach erfolgter Beschichtung die Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffs auf dem Trägerstück z.B. mittels eines Fluoreszenzscanners ermittelt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 - 5, bei dem mehrere Trägerstücke in einem Testfeld kombiniert werden, so dass die immobilisierten Fänger-Moleküle ein gemeinsames Array ausprägen und gemeinsam mit einer einzigen Probenlösung inkubiert werden können.
7. Verfahren nach Anspruch 1 - 6, bei dem das durch die Kombination der Trägerstücke in einem Testfeld erzeugte Array mehr unterschiedliche Fänger-Molekül-Spezies enthält als die zur Kombination verwendeten Trägerstücke.
8. Verfahren nach Anspruch 1 - 7, bei dem mehrere Trägerstücke so auf einem zusammenhängenden Träger angeordnet werden, dass sie anschließend in unterschiedlichen Testfeldern mit unterschiedlichen Probenflüssigkeiten inkubiert werden können.
9. Verfahren nach Anspruch 1 - 8, bei dem die Fänger-Moleküllösungen durch Spotten, Drucken, Pipettieren oder in s/ϊu-Synthese auf die Trägerstücke aufgebracht werden und so ein oder mehrere Spots auf jedem Trägerstück ausgeprägt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Fänger-Moleküllösungen mit Hilfe der TopSpot- Technologie auf die Trägerstücke aufgebracht werden.
11 Verfahren nach Anspruch 1 - 8, bei dem die Trägerstücke durch Benetzen mit der Fänger-Moleküllösungen beschichtet werden.
12 Verfahren nach Anspruch 1 - 8, bei dem die Trägerstücke spezielle aktivierte Regionen enthalten, an denen sich durch Benetzen mit einer Lösung die Fänger-Moleküle anheften, während die nicht aktivierten Regionen unbeschichtet bleiben.
13. Verfahren nach Anspruch 1 - 12, bei dem die Beschichtung zunächst auf einem zusammenhängenden großen Trägerstück erfolgt, das anschließend in einzelne Trägerstücke fragmentiert wird, die dann gemäß Anspruch 1 - 12 zur Ausprägung von Arrays kombiniert werden.
14 Verfahren nach Anspruch 1 - 13, bei dem ein Trägerstück auf einem zweiten Träger lose angeheftet wird, das Trägerstück dann in kleine Trägerstücke fragmentiert wird, die über den zweiten Träger in ihrer Position gehalten werden, die angehefteten kleinen Trägerstücke dann mit Fänger-Molekülen beschichtet und anschließend vom zweiten Träger abgehoben und gemäß Anspruch 1 - 12 zur Ausprägung von Arrays kombiniert werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1 - 14, bei dem das Verfahren gemäß WO2005/073693 zur Fragmentierung und anschließenden Bestückung ganz oder teilweise genutzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1 - 15, bei dem die Fragmentierung mit Hilfe eines Lasers erfolgt.
17. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem jedes Trägerstück nur mit einer Sorte von Fänger-Molekülen beschichtet ist.
18. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem mindestens zwei unterschiedliche Sorten von Fänger-Molekülen auf jedes Trägerstück aufgebracht werden.
19. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem mindestens fünf unterschiedliche Sorten von Fänger-Molekülen auf jedes Trägerstück aufgebracht werden.
20. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem mindestens 20 unterschiedliche Sorten von Fänger-Molekülen auf jedes Trägerstück aufgebracht werden.
21. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem mindestens 100 unterschiedliche Sorten von Fänger-Molekülen auf jedes Trägerstück aufgebracht werden.
22. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem höchstens zwei unterschiedliche Sorten von Fänger-Molekülen auf jedes Trägerstück aufgebracht werden.
23. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem höchstens 10 unterschiedliche Sorten von Fänger-Molekülen auf jedes Trägerstück aufgebracht werden.
24. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem höchstens 100 unterschiedliche Sorten von Fänger-Molekülen auf jedes Trägerstück aufgebracht werden.
25. Verfahren nach Anspruch 1 - 16, bei dem höchstens 1000 unterschiedliche Sorten von Fänger-Molekülen auf jedes Trägerstück aufgebracht werden.
26. Verfahren nach Anspruch 1 - 25, bei dem anstelle von beschichteten Trägerstücken bereits aus mindestens zwei Trägerstücken kombinierte Arrays auf einem zusammenhängenden Träger kombiniert und fixiert werden.
27. Verfahren nach Anspruch 1-26, bei dem die Fänger-Moleküle aus Nukleinsäuren einschließlich Oligonukleotiden, Polynukleotiden, cDNA, DNA, RNA oder LNA bestehen
28. Verfahren nach Anspruch 1 - 26, bei dem die Fänger-Moleküle Proteine, Antigene oder Peptide sind
29. Verfahren nach Anspruch 1 - 26, bei dem die Fänger-Moleküle organische oder metallorganische Moleküle sind
30. Verfahren nach Anspruch 1 - 26, bei dem die Fänger-Moleküle Mischungen, Verbindungen, Konjugate oder Komplexe von zwei oder mehr der in den Ansprüchen 27 - 29 beschriebenen Molekülgruppen sind.
31. Macro und Microarrays, die mit einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 - 30 hergestellt wurden.
32. Einen Assay zur Untersuchung der Identität, Menge, und/oder Aktivität von Nukleinsäuren, Proteinen und/oder anderen Molekülen in einer Probenflüssigkeit, in dem die Probe in einem ersten Schritt mit einem Macro- oder Micorarray gemäß Anspruch 26 inkubiert wird und anschließend die an die Fänger-Moleküle gebundenen Analyten bzw. deren Aktivität unter Nutzung geeigneter Markierungs- und Detektionsverfahren oder auch direkt aufgrund ihrer physikalischen, biochemischen oder enzymatischen Eigenschaften nachgewiesen werden. Die Identität der Fänger-Moleküle, an die Moleküle aus der Probe gebunden haben, wird durch die Position im Array ermittelt und erlaubt Rückschlüsse auf die Identität, Menge und/oder Aktivität der in der Probe vorhandenen Moleküle.
33. Ein Reagenzien-Testsystem, das Macro- und Microarrays gemäß Anspruch 31 umfasst und gemäß Anspruch 32 zur Untersuchung der Menge und Identität von Nukleinsäuren, Proteinen und/oder anderen Molekülen eingesetzt wird.
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