WO2007059839A9 - Verfahren, vorrichtung und kit zur untersuchung von makromolekülen in einer probe - Google Patents

Verfahren, vorrichtung und kit zur untersuchung von makromolekülen in einer probe

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WO2007059839A9
WO2007059839A9 PCT/EP2006/010283 EP2006010283W WO2007059839A9 WO 2007059839 A9 WO2007059839 A9 WO 2007059839A9 EP 2006010283 W EP2006010283 W EP 2006010283W WO 2007059839 A9 WO2007059839 A9 WO 2007059839A9
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Christoph Gauer
Wolfgang Mann
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Advalytix Ag
Christoph Gauer
Wolfgang Mann
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the invention relates to a method, a device and a kit for the investigation of macromolecules in a sample and a method for producing a device according to the invention.
  • Typical numbers are usually between 2 and 10 such parameters.
  • macromolecules contained in a sample fluid such as certain nucleic acid sequences, antibodies, antigens, proteins, etc.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a sample liquid containing fluorescence-labeled nucleic acid sequences is brought onto the solid-state surface under hybridization conditions, the unknown and labeled nucleic acid sequences in the sample can hybridize with the oligonucleotides of the spots. If the sample liquid is subsequently washed away from the solid surface under stringent conditions, only those nucleic acid sequences of the sample which are specifically bound to corresponding probe oligonucleotides remain on the solid. By spatially resolved fluorescence measurements it is now possible to determine at which spots nucleic acid sequences of the sample were bound. Since the spotted oligonucleotides are known as probes, it is thus possible to draw conclusions about the nucleic acid sequences contained in the sample. Such arrays are used, for example, in diagnostics or research for gene expression profiling or CGH (Comparative Genomic Hybridization).
  • the quality of the product is defined by the degree of uniqueness of the sequence in a spot. The aim is to achieve only one population (100% without errors) of one sequence per spot if possible. In particular, in in-situ methods for producing such microarrays, the error rate of crucial importance.
  • the object of the present invention is to provide a method, a device and a kit for the investigation of macromolecules in a sample, which enable a multiplexing of assays in a simple and cost-effective manner.
  • a method for producing a device according to the invention is the subject matter of claim 31.
  • a carrier is provided with at least one reaction center to which at least two types of known macromolecules (hereinafter also referred to as "probe molecules” or “probe macromolecules”) are bound.
  • probe molecules for example, the macromolecules to be used as probe molecules are mixed before application to the reaction center.
  • the arrangement of the different probe macromolecules is negligible and therefore preferably randomly distributed.
  • at least one reaction center is used, on which different macromolecules to be detected (hereinafter also “sample molecules” or “sample macromolecules”) can bind specifically.
  • sample molecules In the sample to be examined macromolecules to be detected (sample molecules) are marked.
  • the at least one reaction center is completely contacted with the sample solution such that a reaction between at least one type of probe molecules with sample molecules can take place if a specific reaction between sample molecules with one type of probe molecule is possible.
  • unbound sample material is removed by, for example, a wash step.
  • the presence of specific sample molecules bound to the at least one reaction center is tested.
  • a spatially resolved evaluation of the results is not necessary for a reaction center, so that simply the overall result for the particular reaction center, which can be obtained, for example, by an integral evaluation of the fluorescence, can be used.
  • the marking of the macromolecules of the sample to be detected can be carried out before or after contacting the sample with the at least one reaction center. The marking can also be made after removal of the unbound sample material. If the labeling is made to be specific for at least one sort of sample molecules to be detected, it can be determined in each case whether corresponding sample molecules to be detected have been specifically bound to the reaction center.
  • two or more macromolecule species for example different organisms, can thus be detected when using the method according to the invention, depending on which macromolecules to be detected are labeled in the sample and reacted.
  • reaction centers With conventional microarrays you get only the information of a sequence per spot.
  • the spots must therefore be numerous and as dense as possible and as a result very small in order to obtain sufficient information even with a small sample liquid quantity. Since several information can be obtained in the process according to the invention with one reaction center, only one or a few reaction centers are required, at least less than in the case of a conventional microarray of spots.
  • the reaction centers therefore need not be as small as conventional microarrays and can Therefore, from a few microns to several millimeters, for example, 2 millimeters, diameter.
  • probe molecules are not present in spatially separated spots as in known microarrays, there is also the advantage that only minimal distances have to be covered for the contact of the sample molecules with the probe molecules. For diffusion-limited reactions this brings a considerable time advantage. This is particularly advantageous, for example, in the discrimination of alleles or in general to discriminate between "perfect match” and "mismatch” of the macromolecules which react specifically with one another, because the first bond generally proceeds quickly, but a balance is established only after a relatively long period of time because only by a diffusion process, the distance between the individual spots must be overcome.
  • the sample molecules of the sample liquid "see" different types of probe molecules at different spots.
  • the environment of the reaction is different in any case. However, it is not excluded that the environment itself, for example, significantly influences hybridization between probe molecules and sample molecules.
  • reaction centers are used on which the probe molecules have been mixed, a uniform distribution of the molecules at a reaction center can be assumed. Accordingly, different sample molecules also see the same environment in the method according to the invention, so that an influence of the environment on the reaction is eliminated. Even gradients that can occur because the sample solution wets the surface from left to right, for example, and takes some time to do so, can not be come.
  • the probe molecules are randomly distributed and the chance for a sample molecule to find the correct sequence is accordingly higher on average.
  • the different types of macromolecules which are to form the probe molecules are mixed before application, for example.
  • the mixing ratio of the at least two types of different macromolecules of a reaction center can be determined, for example, in comparative preliminary experiments in such a way that the signal-to-noise ratio is optimal for the composition expected in the sample. As a rule, this corresponds to an even distribution of the at least two different types of macromolecules at the reaction center. Depending on individual reaction behavior of the individual components but also other mixing ratios can be optimal.
  • the at least two sorts of bound macromolecules in the at least one reaction center comprise at least two different parts of that biological sequence. Accordingly, a reaction center then contains at least two different partial sequences which can react specifically with corresponding partial sequences of the one biological sequence to be detected. In this way, a very reliable determination of the presence of the sequence to be detected in the sample is possible.
  • sequence refers to a sequence of amino acids or nucleic acid components (for example RNA, DNA or PNA).
  • the at least two types of macromolecules bound to a reaction center comprise reaction partners for at least two different types of sample molecules, for example biological sequences belonging to different organisms. Depending on which sample molecules are labeled in the sample to be examined, these different organisms can be detected in the sample.
  • organism is understood for the purposes of the present text in a broad sense and is intended to include, for example, viruses, bacteria, spores, etc.
  • non-homologous or homologous sequences are considered to be different, as long as they are not identical, even if they have the same effect or function.
  • the method is also applicable to SNP sequences (single nucleotide polymorphism), which are simple polymorphisms in which homologous sequences differ only by one base.
  • different macromolecules or different types of macromolecules are those macromolecules whose similarity is less than 90%, more preferably less than 70%, more preferably less than 40% and most preferably less than 10%.
  • a label is only for such macromolecules to be detected.
  • These may be, for example, partial sequences of a sequence of this organism.
  • a marking is made for at least two types of macromolecules to be detected in the sample, the markings being different.
  • the label of the macromolecules to be detected may be, for example, radioactive or electrochemical.
  • the use of a fluorescent label is particularly simple and advantageous, the fluorescence being examined at the end of the method according to the invention for testing the presence of macromolecules bound to the at least one reaction center.
  • the fluorescence signal can be evaluated wavelength-selective. From the signal at different wavelengths, it can be concluded that appropriately marked macromolecules are present in the sample.
  • the fluorescence at different excitation wavelengths is evaluated to allow discrimination of differently labeled macromolecules in the sample.
  • the probe molecules are selected such that a maximum of 10, preferably a maximum of 7, and particularly preferably a maximum of 5 different constituents of the sample liquid can specifically react with probe molecules of the reaction center. In this way, the requirement for the accuracy of the evaluation method is reduced, since only a small number of differently labeled sample molecules must be discriminated.
  • the label is selected specifically so that only macromolecules to be detected are labeled and can be done after the application of the sample liquid on the support.
  • the marking material may then be present, for example, at the reaction center itself, for example in dried form. Likewise, a corresponding marking can also be made only after the removal of unbound sample material from the carrier.
  • a marking of the macromolecules to be detected in the sample is also possible before they are brought into contact with the at least one reaction center on the support.
  • a plurality of reaction centers with at least two types of macromolecules are used as probes on a support, which are preferably arranged in the form of an array.
  • the labeling of the sample molecules takes place by an amplification reaction, in particular by PCR (polymerase chain reaction) with, for example, fluorescently labeled primers. Only the sequences which can be amplified with the primers used are labeled so specifically.
  • the labeled primers for generating PCR products may be in dried form at the reaction centers themselves. If a PCR buffer is used in such embodiments of the method, with which the subsequent reaction for specific binding to the probe molecules of at least one reaction center can be carried out, no further pipetting steps are necessary.
  • the carrier used for the method according to the invention may be, for example, a microtitre plate whose individual cavities are used as corresponding reaction centers, a single cavity having a corresponding probe mixture, ie having at least two types of known macromolecules as probe molecules , coated.
  • a substantially planar support is used, wherein the at least one reaction center is encompassed by a region on the support which has other wetting properties than its surroundings.
  • the reaction center can be chosen to be hydrophilic in comparison to its surroundings.
  • the reaction center may correspond to the hydrophilic region or be contained in it.
  • the sample liquid it is possible for the sample liquid to remain in the form of a droplet held together by its surface tension on the hydrophilic area without penetrating into the hydrophobic environment of the reaction center. drain.
  • a simple localization of the sample liquid at the reaction center is possible and it can be a planar support, for example, a low-cost quartz or glass plate, are used.
  • a hydrophobic environment can be obtained, for example, by silanization.
  • groups of reaction centers may be included in an area having different wetting properties than its surroundings. Such areas may in turn be arranged in an array. It is particularly advantageous if individual reaction centers are surrounded by separate areas with different wetting properties, which makes particularly good localization and the use of very small amounts of material possible.
  • the at least one reaction center is surrounded by two concentric, preferably round regions, the inner region having different wetting properties than the region of the reaction center and the outer region.
  • the inner concentric region may be hydrophobic compared to the reaction center, thus providing the described localization effect for an aqueous liquid in the form of a droplet.
  • the outer concentric region may serve and have suitable wetting properties to position an oil film on the sample liquid drop so as to cover the sample liquid during the reaction and prevent evaporation. This is particularly advantageous when small sample volumes are used, in which even small amounts of evaporation lead to a falsification of the reaction result.
  • Oil film can be examined volumes of, for example, 0.1 .mu.l to 10 .mu.l sample liquid, wherein the corresponding volume of the oil drop, for example, by a factor of 2 to 5 is chosen to be larger.
  • the prevention of evaporation during the reaction is particularly favorable when a PCR reaction is carried out, which requires the passage of a corresponding temperature profile.
  • each reaction center may also be surrounded by an individual concentric region of other wetting properties to hold the sample liquid at each reaction center, and the array as a whole be surrounded by a region of appropriately adjusted wetting properties which will be a common oil drop on the array, which covers the individual sample solution drops together.
  • additional sound waves in particular surface acoustic waves, can be sent in the direction of the sample liquid volume located on the reaction center.
  • Surface acoustic waves can be generated, for example with the aid of an interdigital transducer on a piezoelectric chip, as described in DE 101 03 954 B4.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the examination of nucleic acid sequences.
  • other specific reactions for example antigen-antibody binding, may be assayed with either the antigens or the antibodies as known bound-phase macromolecules at the reaction center.
  • protein reactions can also be investigated.
  • the invented The process according to the invention is particularly suitable for hybridization reactions.
  • the method is also suitable for carrying out bead-based assays.
  • Beads refer to microspheres of a diameter of a few hundred nanometers to several micrometers, on which at least one reaction starting material is coated.
  • Conventional bead-based methods are known, for example, by Luminex® or by Quantum Dot Corporation.
  • beads can, for example, be coated with different oligonucleotides, antigens, antibodies or, for example, proteins and applied to the reaction center. To differentiate the beads different sizes, masses, color coding and other can be used.
  • the method according to the invention is also suitable for comparative hybridization reactions between samples to be examined and reference samples, as are customary for CGH (Comparative Genomic Hybridization) or gene expression analysis.
  • a device has a carrier on which at least one reaction center is arranged, to which at least two types of known macromolecules are bound as probe molecules.
  • the macromolecules of the at least two types do not have a predetermined arrangement within a reaction center.
  • the device according to the invention can have on the carrier a single reaction center or a plurality of reaction centers, preferably in the form of an array, each having at least two types of macro molecules as probes.
  • the support may be a microtiter plate or a substantially planar support, in which latter case the at least one reaction center may be comprised of an area on the support having wetting properties other than its environment.
  • the planar support may be, for example, a glass or quartz plate or a solid state chip.
  • a preferred embodiment of the device according to the invention with a substantially planar support has two concentric, preferably round regions around the at least one reaction center, the inner concentric region having different wetting properties than the reaction center and the outer region.
  • reaction centers In the case of an array-shaped arrangement of the reaction centers can also be provided that the wetting properties are selected such that sample solution droplets are kept individually at the individual reaction centers and a covering oil film is held above the entire array.
  • the reaction centers are surrounded by individual hydrophobic regions and the entire array is surrounded by an area that serves to locate an oil drop on the entire array.
  • a refinement of the device according to the invention has a device for generating sound waves, in particular surface acoustic waves, with the aid of which optimum distribution and / or thorough mixing of the sample liquid at a reaction center can be achieved.
  • a device comprises, for example, an interdigital transducer on a piezoelectric surface, as described in DE 101 03 954 B4.
  • the emission direction of the Interdigi Taltransducers is chosen such that it lies in the direction of a reaction center, so that sample liquid, which is located on this reaction center by means of the surface acoustic waves, which are generated with this interdigital transducer, can be set in motion.
  • Embodiments of the device which correspond in an analogous manner to the embodiments described for the method according to the invention are likewise included, without necessarily being separately explained again for the device.
  • the marking of the macromolecules to be detected in the sample liquid can also be done after the application of the sample liquid to the reaction center.
  • a particularly practical embodiment of the device according to the invention has at the reaction center not only the at least two types of known macromolecules as bound probe molecules, but additionally material for marking at least one type of sample molecules to be detected.
  • the labeling material (which may include, for example, labeled primers for generating PCR products) is nonspecifically bound, for example dried, to the at least one reaction center.
  • the unspecifically bound material dissolves and is available for marking.
  • the sample solution is applied to such a reaction center and dissolves the nonspecifically bound fluorophores, which can then react with the partial sequences in the sample solution in order to mark them.
  • Devices prepared in this way for carrying out the method according to the invention are easy to handle and can be used as finished Examination agent for selected macromolecules are provided in a sample solution.
  • At least one reaction center is used, on which at least two types of known macromolecules are bound as probe molecules.
  • the potential probe molecules are mixed, for example, before application to the solid surface of the support and then spotted as a reaction center. This results in a reaction center where different sample molecules can specifically bind a sample liquid.
  • the invention further relates to a kit for carrying out an investigation method according to the invention, comprising a device according to the invention and a marking material, preferably in the form of a A marking solution capable of labeling at least one predetermined type of sample macromolecules to be detected that are capable of specifically reacting with a variety of probe molecules at the at least one reaction center of the device.
  • a marking material preferably in the form of a A marking solution capable of labeling at least one predetermined type of sample macromolecules to be detected that are capable of specifically reacting with a variety of probe molecules at the at least one reaction center of the device.
  • the material for labeling may in particular comprise labeled primers for one or more PCR (polymerase chain reaction (s)) and, if appropriate, the buffers and nucleotides necessary for the PCR.
  • the material for labeling may already include the polymerase necessary for the PCR.
  • Embodiments of the kit which analogously correspond to the embodiments described for the method according to the invention or the embodiments described for the device according to the invention, are likewise included, without necessarily being separately explained again for the kit.
  • 1 shows an example of a reaction center
  • 2 shows an array of several reaction centers
  • Fig. 5 is a plan view of a detail of an inventive
  • FIG. 6 shows a section through the device according to the invention along the line VI-VI in Fig. 5,
  • FIG. 7 shows a test setup for comparative experiments
  • Fig. 1 describes a reaction center 10 to which probe molecules Al, A2, A3, Bl, B2 and B3 have been applied. Typical diameters of such reaction centers 10 are between 50 ⁇ m and a few millimeters.
  • Al, A2, A3, Bl, B2 and B3 are examples of macromolecules which can react with corresponding molecules in a sample solution. In the schematic representation of FIG. 1, only two of each bound macromolecule are shown. In carrying out the method according to the invention, the number is of course much larger, as a rule.
  • the macromolecules A1, A2, A3, B1, B2, B3 are randomly arranged at the reaction center 10. To prepare such an arrangement, the potential probe molecules are mixed prior to application to the solid surface of the support and then spotted as a reaction center. This results in a reaction center where different sample molecules can specifically bind a sample liquid.
  • the typical length of the macromolecules used is between 15 and 100 base pairs. It is also possible to use longer PCR products or, for example, clones, antigens or antibodies as probe molecules.
  • reaction centers which may contain either identical or different probe molecules can also be applied in the form of a matrix on a solid surface and thus form an array of reaction centers.
  • Such an arrangement is the subject of schematic Fig. 2, in the example of two of the illustrated reaction centers are designated by the reference numerals 10, 12.
  • macromolecules in a sample solution can be examined as follows. An example is first presented in which the presence of a specific nucleic acid sequence of an organism in a sample liquid is to be investigated.
  • Fig. 3 shows a schematic representation of a reaction method for assays in which the presence of a certain with high certainty Organism should be determined.
  • an organism a with the partial sequences al, a2 and a3 is present.
  • a typical example is the HIV virus, whose detection is carried out on several virus-specific sequences.
  • the partial sequences are labeled with a fluorophore fl.
  • a PCR polymerase chain reaction
  • primers in which only the partial sequences al, a2, a3 are amplified.
  • the reaction center 10 contains partial sequences A1, A2, A3 or B1, B2, which could react specifically with partial sequences of the organisms a and b, respectively.
  • the sequences A1 and al or A2 and a2 or A3 and a3 can hybridize in pairs.
  • the fluorescence of the fluorophores bound to partial sequences a1, a2 and a3 that are specifically bound to the sequences of the reaction center 10 can be detected by evaluating the fluorescence becomes. In such a case, a fluorescent dye is sufficient to perform the assay.
  • the sample solution contains an organism b
  • its partial sequences b1 and b2 are fluorescently labeled, for example by PCR, whereby only the partial sequences b1 and b2 are amplified, and the sample solution is brought into contact with the reaction center 10.
  • the sequences B 1 and b 1 or B2 and b 2 can then hybridize in pairs.
  • the evaluation is then as described above for the detection of the organism a.
  • a reaction center is therefore sufficient to detect both organism a and organism b, depending on which sequences are labeled in the sample.
  • the method can also be carried out for more than two different organisms a, b, c,..., With partial sequences corresponding to Al, A2, A3,..., Bl, B2, B3,..., Cl , C2, C3, ... are provided.
  • partial sequences a1, a2 of a first sequence a are labeled with a first fluorophore fl and partial sequences b1, b2 of a second sequence are labeled with a second fluorophore f2.
  • first fluorophore fl partial sequences a1, a2 of a first sequence a
  • second fluorophore f2 partial sequences b1, b2 of a second sequence
  • the partial sequences a1 and A1, the partial sequences a2 and A2, the partial sequences b1 and B1 or the partial sequences b2 and B2 react.
  • fluorophores f 1 and f 2 remain of those partial sequences which have been specifically bound to probe molecules of the reaction center 10.
  • the two-color fluorescence measurement is carried out either by a wavelength-selective evaluation of the fluorescence signal or by a fluorescence measurement with different excitation wavelengths.
  • FIGS. 3 and 4 may also be combined to further enhance the certainty of detection.
  • An additional increase in the number of parallel reactions to be carried out can be achieved if a plurality of differently equipped reaction centers are arranged and evaluated in the form of a matrix, as shown in FIG.
  • a polymerase chain reaction is carried out with appropriately labeled primers, for example using a buffer with which the reaction for specific binding to the probe molecules of the at least one Reaction center 10 can be performed.
  • the marking material may either be added to or included in the sample solution.
  • the marker may be in front of the
  • Reaction can be carried out by applying a specific labeling method in which only the sample molecules of interest are labeled. On the other hand, it is also possible to carry out the marking only after the reaction or after removal of unbound sample material.
  • the material for marking is present at the reaction center 10, for example in dried form.
  • the material for marking is present at the reaction center 10, for example in dried form.
  • Reaction center both the partial sequences Al, A2, A3, ..., Bl, B2, B3, ... for the specific reaction with the subsequences of the sample solution to be examined, as well as the required fluorescent markers. It may be, for example, labeled primers for PCR.
  • the sample solution is placed on such a reaction center. introduces and dissolves the nonspecifically bound fluorophores, which can then react with the partial sequences in the sample solution to label them.
  • Such prepared devices for carrying out the method according to the invention are easy to handle and can be provided as a finished assay for selected macromolecules in a sample solution.
  • the reaction center 10 is here surrounded by a concentric region 16, which is hydrophobic compared to the reaction center 10. This can be achieved, for example, by silanizing region 16.
  • the hydrophobic region 16 is surrounded by a further concentric region 18 which has such wetting properties that it can serve to localize an oil drop held together by its surface tension, ie is correspondingly lipophilic, for example.
  • the solid surface for example a glass plate, is designated 20.
  • Fig. 6 shows a section through such a reaction center along the line VI-VI, as indicated in Fig. 5.
  • a drop 22 of sample solution is shown, which is covered by an oil film 24.
  • the sample solution 22 is held together by its surface tension and does not leave the region of the reaction center 10 which is hydrophilic in comparison to the hydrophobic region 16 without external force, whereby it is located at the reaction center 10.
  • an oil drop 24 is applied above the sample solution drop 22, which does not leave the region 18 due to its surface tension.
  • the use of such an oil drop 24 is advantageous to prevent evaporation.
  • the geometry may also be chosen so that the oil drop covers several reaction centers and the sample solution drops thereon.
  • An additional mixing of the sample solution on the surface of the support can be achieved when surface acoustic waves are sent towards the reaction center, which are generated for example by means of an interdigital transducer on the support surface, whose emission direction is directed to the reaction center.
  • the carrier material may be piezoelectrically selected or coated for this purpose.
  • the following is an experiment to demonstrate the advantages of the method according to the invention in comparison with non-inventive methods.
  • the experiment is designed to detect sample molecules in a medium that can react with selected probe molecules.
  • the example shown is the supernatant of chondrocytes from a cell culture. It should be checked whether there are analytes in this medium which are able to react specifically with the antibodies MMP10 and MMP13.
  • a dilution solution PBS can be applied in pure form to check the correctness of the measuring apparatus.
  • the antibodies MMP10 and MMP13 were mixed according to the invention and the mixture thus prepared was used.
  • the antibodies which were present at a concentration of 1 mg / ml, were diluted 1: 1, 1: 2 and 1: 4, respectively.
  • a spotting buffer (SP) comprising PBS pH 7.4 was used for this purpose.
  • SP spotting buffer
  • the thus diluted antibody solutions are applied in an array on the slide, wherein said dilutions of the antibody solutions change as indicated in Fig. 7 in the vertical direction.
  • the antibody solutions are pipetted onto the slide or spotted.
  • the slide was incubated at room temperature overnight in a humid chamber so that the antibody solutions are not dried. Subsequently, the slide was dried outside the wet chamber for 30 minutes.
  • the medium to be examined was applied.
  • the slide was rehydrated in a washing station with a washing buffer (WP).
  • the wash buffer comprised 0.1% Tween 20 in PBS pH 7.4.
  • the slide was centrifuged dry.
  • the dilution buffer (VP) used was 1.5% BSA, 2.5% low fat milk powder, 0.1% Tween 20 in PBS pH 7.4. 1 .mu.l was applied in an arrangement on the slide, which in the horizontal direction in Fig. 7 is indicated.
  • neg is meant a point in which the dilution buffer was applied in a pure form. Incubation was for 45 minutes in a humid chamber at room temperature. Subsequently, the slide was washed in a washing station with the washing buffer WP and then dry-centrifuged.
  • the fluorescent label In the next step, the fluorescent label must be made.
  • fluorescent labels can be used which specifically bind either to the analyte which reacts with the antibody MMP10 or bind to the analyte which reacts with the antibody MMP13.
  • the fluorescent substance corresponding to the analyte bound to the antibody MMP10 In the region a of the slide shown in FIG. 7, only the fluorescent substance corresponding to the analyte bound to the antibody MMP10 would be detectable; in the region b of FIG. 7, only the fluorescent dye would be detected the analyte binds with the antibody
  • MMP 13 reacts while in region c the two fluorescent dyes could be detected.
  • the analyte that reacts with the antibody MMP13 is labeled with a fluorescent dye Cy3 ("green”) while the analyte that reacts with the antibody MMP10 is labeled with a fluorescent dye Cy5 (“red").
  • the following procedure can be used for marking.
  • detection antibodies biotin-anti-MMPIO (1 ⁇ g / ml, dilution in dilution buffer VP)
  • a detection antibody can bind only to those binding sites to which an analyte is bound that has reacted with an antibody MMP10.
  • Those binding sites in which an analyte reacted with an antibody MMP 13 remain free of this detection antibody.
  • a dye streptavidin-Cy5 can be applied for labeling. The incubation for these labeling reactions is carried out in each case 1 ⁇ l for 30 minutes in a moist chamber at room temperature.
  • the detection of the presence or absence of the dye Cy5 can be carried out by fluorescence analysis at the reaction center.
  • biotin anti-MMP13 (1 ⁇ g / ml, dilution in dilution buffer VP) is applied.
  • This detection antibody binds only to those binding sites where an analyte bound to an MMP13 antibody is present.
  • a dye streptavidin-Cy3 can be attached, the incubation is again carried out in 1 ul for 30 minutes in a humid chamber at room temperature. Accordingly, at the binding sites corresponding to the antibodies MMP 13, the dye Cy3 is present, which can be detected in a manner to be described with the aid of fluorescence analysis of the reaction center.
  • the detection is carried out with a commercial laser scanner at an excitation wavelength, whereby the generated spectrum is evaluated wavelength-selective.
  • a color distribution results in such a way that the area designated by a in FIG. 7 has red dots, the area designated by b has green dots and the area designated by c has yellow or brown dots.
  • area a where only the antibody
  • MMP10 was used as a probe, only the dye Cy5 is detectable, while in area b only the dye Cy3 is detectable. Both dyes are to be detected in region c, so that a mixture is shown in the photograph of FIG. 7.
  • Fig. 8 shows the corresponding fluorescence signals. The intensity of the fluorescence signal in arbitrary units is plotted against the location on the slide.
  • the sub-figures 8a, 8b, 8c correspond to the areas a, b and c, respectively, of the slide shown in FIG.
  • the trace A was made with an edge filter selected to substantially detect the dye Cy5, while the curve B was captured with an edge filter that essentially allows the detection of the dye Cy3. In areas a and b only one dye was detected. In region c, it can be seen that both dyes can be detected at the mixed reaction centers.
  • the described comparative experiment shows that the method according to the invention shows that analytes are present in the medium used both for the antibody MMP10 and for the antibody MMP13.
  • reaction center such as, for example, the reaction center denoted by 11 in FIG. 7c
  • the larger number of reaction centers visible on the slide in Figure 7 are only illustrative of the method compared to other methods.
  • dilution series from the decreasing luminous intensity, which can be seen in FIG. 7 with increasing dilution, it is possible to conclude a fault-free test procedure, so that the safety of the test result is increased.
  • the embodiments described herein relate to the fact that with the aid of several types of probe molecules present at the at least one reaction center, the presence of specific sample molecules in a sample solution or their reaction behavior should be investigated.
  • Other procedures provide that the macromolecules to be examined are applied in substituted form to the reaction center and are brought into contact with a solution containing known macromolecules to obtain information about the macromolecules bound to the reaction center.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe, bei dem ein Träger mit wenigstens einem Reaktionszentrum bereitgestellt wird, an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen als Sondenmoleküle gebunden sind, nachzuweisende Makromoleküle der Probe markiert werden, die Probe mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum derart in Kontakt gebracht wird, dass eine Reaktion zwischen wenigstens einer Sorte der gebundenen Makromoleküle mit den nachweisenden Makromolekülen stattfinden kann, wenn eine spezifische Reaktion zwischen nachzuweisenden Makromolekülen mit einer Sorte der gebundenen Makromoleküle möglich ist, ungebundenes Probenmaterial entfernt wird und das Vorhandensein von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum spezifisch gebundenen Proben-Makromolekülen geprüft wird. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung und ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Description

Verfahren, Vorrichtung und Kit zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe und ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
In der Diagnostik möchte man häufig einige wenige Parameter einer flüs- sigen Probe bestimmen. Typische Zahlen liegen meist zwischen 2 und 10 solcher Parameter. Untersucht werden zum Beispiel die Anwesenheit oder Beschaffenheit von in einer Probenflüssigkeit enthaltenen Makromolekülen wie zum Beispiel bestimmter Nukleinsäuresequenzen, Antikörpern, Antigenen, Proteinen, etc.. Beispielsweise werden alle Proben in Blutban- ken auf die Anwesenheit des HIV- und HCV- Virus geprüft. Vielfach werden PCR(Polymerasekettenreaktion) -gestützte Verfahren verwendet, die in der Regel in getrennten Reaktionen für die unterschiedlichen Teilsequenzen des HIV- Virus durchgeführt werden.
Es ist wünschenswert, wenn die Zahl der notwendigen Pipettierschritte und damit die Kosten, sowie der Verbrauch von Reagenzien und Probenmaterial verringert werden. Letzteres ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn nur wenig Probenmaterial, zum Beispiel bei Blutproben von Säuglingen, vorliegt. Daher wurde vorgeschlagen, derartige Untersuchungsas- says zu parallelisieren, das heißt zu "multiplexen", um mehrere Untersuchungen parallel durchführen zu können.
Aus EP 373 203 Bl oder DE 101 03 954 B4 sind Verfahren und Vorrichtungen bekannt, wie man zum Beispiel Nukleinsäureassays multiplexen kann. Dabei werden unterschiedliche Oligonukleotide auf Festkörperober- flächen in Form einer Matrix aufgebracht (zum Beispiel "gespottet") und dort so gebunden, dass sie sich unter den Hybridisierungsbedingungen nicht ablösen können. Die so gebundenen Oligonukleotide bilden "Sonden", die in nicht überlappenden Zellen, sogenannten Spots, angeordnet sind, die typischerweise Durchmesser von 50 bis 250 μm aufweisen. Eine Vielzahl von Spots in einer Matrix wird als Mikroarray bezeichnet.
Bringt man eine Probenflüssigkeit, die fluoreszenzmarkierte Nukleinsäu- resequenzen enthält, unter Hybridisierungsbedingungen auf die Festkör- peroberfläche, so können die unbekannten und markierten Nukleinsäure- sequenzen in der Probe mit den Oligonukleotiden der Spots hybridisieren. Wird im Anschluss die Probenflüssigkeit unter stringenten Bedingungen von der Festkörperoberfläche abgewaschen, bleiben nur diejenigen Nuk- leinsäuresequenzen der Probe auf dem Festkörper zurück, die spezifisch an entsprechende Sondenoligonukleotide gebunden sind. Durch ortsaufgelöstes Messen der Fluoreszenz lässt sich nun feststellen, an welchen Spots Nukleinsäuresequenzen der Probe gebunden wurden. Da die als Sonden gespotteten Oligonukleotide bekannt sind, lassen sich so Rückschlüsse auf die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuresequenzen ziehen. Derartige Arrays werden zum Beispiel in der Diagnostik oder der Forschung zur Genexpressionsanalyse (Gene Expression Profiling) oder CGH (Comparative Genomic Hybridization) eingesetzt.
Bei derartigen Verfahren ist es notwendig, die Fehlerraten beim Herstellen der Arrays, insbesondere beim Aufbringen der Sondenmoleküle, sehr gering zu halten. In konventionellen Mikroarrays definiert sich die Qualität des Produkts geradezu nach dem Grad der Einzigartigkeit der Sequenz in einem Spot. Es ist das Ziel, möglichst nur eine Population (100% ohne Fehler) einer Sequenz pro Spot zu erreichen. Insbesondere bei in-situ Verfahren zur Herstellung solcher Mikroarrays ist die Fehlerrate von ausschlaggebender Bedeutung. Auch Anbieter von Kontakt- oder Nicht- Kontaktprintern, die als Alternative zum in-situ Verfahren zum Einsatz kommen, werben für ihre Produkte damit, dass es bei der Herstellung der Mikroarrays nicht zur "Verschleppung von Material" von einem Spot zum anderen kommt, wodurch ebenfalls dokumentiert wird, dass bei konventionellen Mikroarrays gerade der Nicht- Vermischung große Bedeutung beigemessen werden muss. Es ist dementsprechend ein aufwändiger und kostenintensiver Spottingprozess mit hoher Genauigkeit notwendig, der insbesondere auch an die Qualitätskontrolle hohe Anforderungen stellt. Zudem sind die Spotmorphologien von Spots unterschiedlicher Makromoleküle abhängig von der Molekülsorte selbst, so dass die Durchmesser der Spots solcher gespotteten Mikroarrays immer ein wenig schwanken können, wodurch zum Beispiel die Auswertung mit Hilfe automatischer Bilderkennung problematisch werden kann.
Schließlich ist für das Auslesen derartiger Mikroarrays mit Spots, die sich durch die aufgebrachten Makromoleküle unterscheiden, ein Scanner notwendig, der die entsprechende Ortsauflösung bietet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe anzugeben, die ein Multiplexen von Assays auf einfache und kostengünstige Weise ermöglichen.
Diese Aufgabe wird mit einem Untersuchungsverfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 , einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 21 bzw. einem Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 32 gelöst. Unteransprüche sind auf bevorzugte Ausführungsformen gerichtet. Ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist Ge- genstand des Anspruches 31. Bei dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren wird ein Träger mit wenigstens einem Reaktionszentrum bereitgestellt, an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen (im folgenden auch "Son- denmoleküle" oder "Sonden-Makromoleküle") gebunden sind. Dazu werden zum Beispiel die als Sondenmoleküle einzusetzenden Makromoleküle vor dem Aufbringen auf das Reaktionszentrum abgemischt. An einem Reaktionszentrum ist die Anordnung der unterschiedlichen Sonden- Makromoleküle unerheblich und daher vorzugsweise statistisch verteilt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also zumindest ein Reaktionszentrum eingesetzt, an dem unterschiedliche nachzuweisende Makromoleküle (im folgenden auch "Probenmoleküle" oder "Proben- Makromoleküle") spezifisch binden können.
In der zu untersuchenden Probe werden nachzuweisende Makromoleküle (Probenmoleküle) markiert. Das wenigstens eine Reaktionszentrum wird vollständig mit der Probenlösung derart in Kontakt gebracht, dass eine Reaktion zwischen wenigstens einer Sorte Sondenmoleküle mit Probenmolekülen stattfinden kann, wenn eine spezifische Reaktion zwischen Pro- benmolekülen mit einer Sorte der Sondenmoleküle möglich ist.
Nach Abwarten einer typischen Reaktionszeit wird ungebundenes Probenmaterial zum Beispiel durch einen Waschschritt entfernt. Schließlich wird das Vorhandensein von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum spezifisch gebundenen Probenmoleküle geprüft. Eine ortsaufgelöste Auswertung der Ergebnisse ist für ein Reaktionszentrum nicht nötig, so dass einfach das Gesamtergebnis für das jeweilige Reaktionszentrum, das zum Beispiel durch eine integrale Auswertung der Fluoreszenz erhalten werden kann, verwendet werden kann. Die Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle der Probe kann vor oder nach dem Inkontaktbringen der Probe mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum erfolgen. Die Markierung kann aber auch nach dem Entfernen des ungebundenen Probenmaterials vorgenommen werden. Wenn die Markierung derart vorgenommen wird, dass sie für wenigstens eine Sorte nachzuweisender Probenmoleküle spezifisch ist, kann in jedem Fall nachgewiesen werden, ob entsprechende nachzuweisende Probenmoleküle spezifisch an dem Reaktionszentrum gebunden wurden.
Mit einem Reaktionszentrum auf einer Festkörperoberfläche können somit bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahren zwei oder mehrere Makromolekülsorten zum Beispiel unterschiedlicher Organismen nachgewiesen werden, abhängig davon, welche nachzuweisenden Makromoleküle in der Probe markiert und zur Reaktion gebracht werden.
Im Vergleich zu bekannten Verfahren, bei denen Mikroarrays eingesetzt werden, bei denen je Spot nur eine Sorte von Makromolekülen vorhanden ist, ist der Aufwand beim Spotten zur Herstellung des Trägers zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erheblich reduziert und die Anzahl der notwendigen Pipettierschritte sehr viel kleiner.
Bei konventionellen Mikroarrays erhält man je Spot nur die Information einer Sequenz. Die Spots müssen daher zahlreich und möglichst dicht angeordnet und in Folge dessen sehr klein sein, um auch mit einer klei- nen Probenflüssigkeitsmenge ausreichend Informationen zu bekommen. Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Reaktionszentrum mehrere Informationen erhalten werden können, benötigt man nur ein oder einige wenige Reaktionszentren, jedenfalls weniger als bei einem konventionellen Mikroarray aus Spots. Die Reaktionszentren müssen daher nicht so klein sein wie bei herkömmlichen Mikroarrays und können daher von wenigen Mikrometern bis zu mehreren Millimetern, zum Beispiel 2 Millimetern, Durchmesser aufweisen.
Da die Sondenmoleküle nicht wie bei bekannten Mikroarrays in räumlich getrennten Spots vorliegen, ergibt sich außerdem der Vorteil, dass zum Kontakt der Probenmoleküle mit den Sondenmolekülen nur minimale Wegstrecken zurückgelegt werden müssen. Für diffusionslimitierte Reaktionen bringt das einen erheblichen Zeitvorteil. Besonders vorteilhaft ist dies zum Beispiel bei der Diskriminierung von Allelen oder allgemein zur Diskriminierung von "Perfect Match" und "Mismatch" der spezifisch miteinander reagierenden Makromoleküle, weil die erste Bindung in der Regel zwar schnell geht, ein Gleichgewicht sich aber erst nach längerer Zeitdauer einstellt, da erst durch einen Diffusionsprozess die Entfernung zwischen den einzelnen Spots überwunden werden muss.
Bei einem konventionellen Mikroarray, bei dem an den Spots jeweils nur eine Sorte von Makromolekülen vorhanden ist, "sehen" die Probenmoleküle der Probenflüssigkeit an unterschiedlichen Spots eine andere Sorte von Sondenmolekülen. Die Umgebung der Reaktion ist also auf jeden Fall unterschiedlich. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass die Umgebung selbst zum Beispiel eine Hybridisierung zwischen Sondenmolekülen und Probenmolekülen maßgeblich beeinflusst. Beim erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem Reaktionszentren eingesetzt werden, an denen die Sondenmoleküle abgemischt wurden, kann man dagegen von einer gleichmä- ßigen Verteilung der Moleküle an einem Reaktionszentrum ausgehen. Unterschiedliche Probenmoleküle sehen dementsprechend beim erfindungsgemäßen Verfahren auch dieselbe Umgebung, so dass ein Einfluss der Umgebung auf die Reaktion wegfällt. Auch Gradienten, die auftreten können, weil die Probenlösung die Oberfläche zum Beispiel von links nach rechts benetzt und eine gewisse Zeit dazu braucht, können nicht vor- kommen. Die Sondenmoleküle sind statistisch verteilt und die Chance für ein Probenmolekül, die richtige Sequenz zu finden, ist dementsprechend im Durchschnitt höher.
Bei der Herstellung eines Trägers zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die unterschiedlichen Sorten von Makromolekülen, die die Sondenmoleküle bilden sollen, vor dem Aufbringen zum Beispiel abgemischt. Das Mischungsverhältnis der wenigstens zwei Sorten unterschiedlicher Makromoleküle eines Reaktionszentrums kann zum Beispiel in vergleichenden Vorversuchen derart festgelegt werden, dass das Signal-Rausch- Verhältnis für die in der Probe erwartete Zusammensetzung optimal ist. In der Regel entspricht dies einer Gleichverteilung der wenigstens zwei verschiedenen Sorten Makromoleküle an dem Reaktionszentrum. Abhängig von individuellen Reaktionsverhalten der einzelnen Komponenten können aber auch andere Mischungsverhältnisse optimal sein.
Insbesondere bei Assays, bei denen mit hoher Sicherheit die Anwesenheit einer bestimmten biologischen Sequenz (zum Beispiel eine Sequenz eines bestimmten Organismus) nachgewiesen werden soll, umfassen die wenigstens zwei Sorten von gebundenen Makromolekülen in dem wenigstens einen Reaktionszentrum wenigstens zwei unterschiedliche Teile dieser biologischen Sequenz. Ein Reaktionszentrum enthält dann dementsprechend zumindest zwei unterschiedliche Teilsequenzen, die spezifisch mit korrespondierenden Teilsequenzen der einen nachzuweisenden biologischen Sequenz reagieren können. Auf diese Weise ist eine sehr sichere Feststellung des Vorhandenseins der nachzuweisenden Sequenz in der Probe möglich. "Sequenz" bezeichnet dabei zum Beispiel eine Abfolge von Aminosäuren oder Nukleinsäurebausteinen (zum Beispiel RNA, DNA oder PNA). Bei einer anderen Ausgestaltung des erfϊndungsgemäßen Untersuchungsverfahrens umfassen die wenigstens zwei Sorten von an einem Reaktionszentrum gebundenen Makromoleküle Reaktionspartner für wenigstens zwei unterschiedliche Sorten von Probenmolekülen, zum Beispiel biologischer Sequenzen, die zu unterschiedlichen Organismen gehören. Je nachdem, welche Probenmoleküle in der zu untersuchenden Probe markiert werden, können diese unterschiedlichen Organismen in der Probe nachgewiesen werden.
Der Begriff Organismus wird für die Zwecke des vorliegenden Textes in weiten Sinne verstanden und soll zum Beispiel auch Viren, Bakterien, Sporen etc. umfassen.
Als unterschiedlich bzw. verschieden werden für die Zwecke des vorliegenden Textes nicht-homologe oder homologe Sequenzen angesehen, solange sie nicht identisch sind, auch wenn sie die gleiche Wirkung bzw. Funktion haben. Insbesondere ist das Verfahren auch bei SNP-Sequenzen (Single-Nucleotide-Polymorphism) anwendbar, bei denen es sich um einfa- che Polymorphismen handelt, bei denen sich homologe Sequenzen nur durch eine Base unterscheiden.
Bevorzugt kommen als unterschiedliche Makromoleküle bzw. unterschiedliche Sorten von Makromolekülen jedoch solche Makromoleküle zum Einsatz, deren Ähnlichkeit geringer als 90%, bevorzugter geringer als 70%, besonders bevorzugt geringer als 40% und ganz besonders bevorzugt geringer als 10% ist.
Wenn nur ein Organismus in der Probe nachgewiesen werden soll, so wird eine Markierung nur für solche nachzuweisenden Makromoleküle der Probe vorgenommen, die zu diesem Organismus gehören. Dabei kann es sich zum Beispiel um Teilsequenzen einer Sequenz dieses Organismus handeln.
Soll andererseits die Anwesenheit mehrerer unterschiedlicher Makromoleküle zum Beispiel unterschiedlicher Organismen getrennt aber gleichzeitig nachgewiesen werden, so wird eine Markierung für wenigstens zwei Sorten von nachzuweisenden Makromolekülen in der Probe vorgenommen, wobei sich die Markierungen unterscheiden.
Die Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle kann zum Beispiel radioaktiv oder elektrochemisch sein. Besonders einfach und vorteilhaft ist die Verwendung einer Fluoreszenzmarkierung, wobei zur Prüfung des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum gebun- denen Makromoleküle am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens die Fluoreszenz untersucht wird.
Sollen unterschiedliche Makromoleküle in einer Probe nachgewiesen werden, kann das Fluoreszenzsignal wellenlängenselektiv ausgewertet werden. Aus dem Signal bei unterschiedlichen Wellenlängen kann auf das Vorhandensein entsprechend markierter Makromoleküle in der Probe geschlossen werden.
Bei einer anderen Verfahrensführung wird die Fluoreszenz bei unter- schiedlichen Anregungswellenlängen ausgewertet, um eine Diskriminierung unterschiedlich markierter Makromoleküle in der Probe zu ermöglichen.
Insbesondere bei der Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen ist es vorteilhaft, wenn weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5 unterschied- lieh markierte Bestandteile vorliegen, um eine sichere Diskriminierung der Signale der unterschiedlichen Markierungen zu gewährleisten.
Andererseits ist es vorteilhaft, wenn bei Einsatz von unterschiedlichen Sorten von Sondenmolekülen an einem Reaktionszentrum die Sondenmoleküle derart ausgewählt sind, dass maximal 10, vorzugsweise maximal 7, und besonders vorzugsweise maximal 5 unterschiedliche Bestandteile der Probenflüssigkeit mit Sondenmolekülen des Reaktionszentrums spezifisch reagieren können. Auf diese Weise verringert sich die Anforderung an die Genauigkeit der Auswertemethode, da nur eine geringe Anzahl unterschiedlich markierter Probenmoleküle diskriminiert werden muss.
Die Markierung wird derart spezifisch gewählt, dass nur nachzuweisende Makromoleküle markiert werden und kann nach dem Aufbringen der Probenflüssigkeit auf dem Träger geschehen. Das Material zur Markierung kann dann zum Beispiel an dem Reaktionszentrum selbst vorliegen, zum Beispiel in getrockneter Form. Ebenso kann eine entsprechende Markierung auch erst nach dem Entfernen ungebundenen Probenmateriales von dem Träger geschehen.
Schließlich ist eine Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle in der Probe auch vor deren Inkontaktbringen mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum auf dem Träger möglich.
Eine noch weiter gehende Parallelisierung zur weiteren Erhöhung der Anzahl von Sorten unterschiedlicher nachzuweisender Makromoleküle kann erreicht werden, wenn mehrere Reaktionszentren mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Makromolekülen als Sonden auf einem Träger eingesetzt werden, die vorzugsweise in Form eines Arrays angeordnet sind. Bei einer besonderen Ausführungsform findet die Markierung der Probenmoleküle durch eine Amplifikationsreaktion, insbesondere durch PCR (Polymerasekettenreaktion) mit zum Beispiel fluoreszenzmarkierten Primern statt. Nur die mit den verwendeten Primern amplifizierbaren Se- quenzen werden so spezifisch markiert. Die markierten Primer zur Erzeugung von PCR-Produkten können zum Beispiel in getrockneter Form an den Reaktionszentren selbst vorliegen. Wird bei solchen Ausgestaltungen des Verfahrens ein PCR-Puffer eingesetzt, mit dem auch die anschließende Reaktion zur spezifischen Bindung an den Sondenmolekülen des wenigs- tens einen Reaktionszentrums durchgeführt werden kann, sind keine weiteren Pipettierschritte mehr notwendig.
Bei dem für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Träger kann es sich zum Beispiel um eine Mikro titerplatte handeln, deren einzelne Kavitä- ten als entsprechende Reaktionszentren eingesetzt werden, wobei eine einzelne Kavität mit einem entsprechenden Sondengemisch, das heißt mit wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen als Sondenmolekülen, beschichtet ist.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens wird ein im Wesentlichen planarer Träger eingesetzt, wobei das wenigstens eine Reaktionszentrum von einem Bereich auf dem Träger umfasst ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung hat. Wird als Probenlösung zum Beispiel eine wässrige Lösung verwendet, so kann das Reaktionszentrum im Vergleich zu seiner Umgebung hydrophil gewählt werden. Das Reaktionszentrum kann dabei dem hydrophilen Bereich entsprechen oder in ihm enthalten sein. So lässt es sich erreichen, dass die Probenflüssigkeit sich in Form eines durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltenen Tropfens auf dem hydrophi- len Bereich hält ohne in die hydrophobe Umgebung des Reaktionszent- rums abzufließen. Auf diese Weise ist eine einfache Lokalisierung der Probenflüssigkeit am Reaktionszentrum möglich und es kann ein planarer Träger, zum Beispiel ein kostengünstiges Quarz- oder Glasplättchen, eingesetzt werden. Eine hydrophobe Umgebung lässt sich zum Beispiel durch Silanisierung erhalten.
Im Falle einer arrayförmigen Anordnung können Gruppen von Reaktionszentren von einem Bereich umfasst sein, der andere Benetzungseigen- schaften als seine Umgebung hat. Derartige Bereiche können ihrerseits wieder in einem Array angeordnet sein. Besonders vorteilhaft ist es, wenn einzelne Reaktionszentren von eigenen Bereichen mit unterschiedlichen Benetzungseigenschaften umgeben sind, wodurch eine besonders gute Lokalisierung und die Verwendung sehr geringer Materialmengen möglich ist.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn das wenigstens eine Reaktionszentrum von zwei konzentrischen, vorzugsweise runden Bereichen umgeben ist, wobei der innere Bereich andere Benetzungseigenschaften als der Bereich des Reaktionszentrums und als der äußere Bereich hat. So kann zum Beispiel der innere konzentrische Bereich im Vergleich zum Reaktionszentrum hydrophob sein und so den beschriebenen Lokalisierungseffekt für eine wässrige Flüssigkeit in Form eines Tropfens zur Verfügung stellen. Analog kann der äußere konzentrische Bereich dazu dienen und geeignete Benetzungseigenschaften aufweisen, einen Ölfilm auf dem Pro- benflüssigkeitstropfen so zu positionieren, dass er die Probenflüssigkeit während der Reaktion abdeckt und eine Verdampfung verhindert. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn kleine Probenvolumina verwendet werden, bei der auch geringe Verdampfungsmengen zu einer Verfälschung des Reaktionsergebnisses führen. Bei der beschriebenen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung eines abdeckenden Ölfilms können Volumina von zum Beispiel 0,1 μl bis 10 μl Probenflüssigkeit untersucht werden, wobei das entsprechende Volumen des Öltropfens zum Beispiel um einen Faktor 2 bis 5 größer gewählt wird.
Die Verhinderung der Verdampfung während der Reaktion ist insbesondere dann günstig, wenn eine PCR-Reaktion durchgeführt wird, die das Durchfahren eines entsprechenden Temperaturprofils erfordert.
Im Falle einer arrayförmigen Anordnung kann auch jedes Reaktionszent- rum von einem individuellen konzentrischen Bereich anderer Benetzungs- eigenschaften umgeben sein, um die Probenflüssigkeit an jedem Reaktionszentrum zu halten, und das Array im Ganzen von einem Bereich entsprechend angepasster Benetzungseigenschaften umgeben sein, der einen gemeinsamen Öltropfen auf dem Array hält, der die einzelnen Probenlö- sungstropfen gemeinsam abdeckt.
Um eine optimale Verteilung der Probenflüssigkeit auf dem Reaktionszentrum zu gewährleisten, können zusätzlich Schallwellen, insbesondere Oberflächenschallwellen, in Richtung des auf dem Reaktionszentrum befindlichen Probenflüssigkeitsvolumens geschickt werden. Oberflächenschallwellen können zum Beispiel mit Hilfe eines Interdigitaltransducers auf einen piezoelektrischen Chip erzeugt werden, wie es in DE 101 03 954 B4 beschrieben ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Untersuchung von Nukleinsäuresequenzen. Ebenso können andere spezifische Reaktionen, beispielsweise Antigen- Antikörperbindungen untersucht werden, wobei sich entweder die Antigene oder die Antikörper als bekannte Makromoleküle in gebundener Phase an dem Reaktionszentrum befinden. Analog können auch Proteinreaktionen untersucht werden. Das erfin- dungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für Hybridisierungs- reaktionen.
Das Verfahren eignet sich auch zur Durchführung von beadbasierten Assays. Beads bezeichnen Mikrokügelchen eines Durchmessers von einigen 100 Nanometern bis zu einigen Mikrometern, auf die wenigstens ein Reaktionsausgangsstoff aufbeschichtet ist. Konventionelle beadbasierte Verfahren sind zum Beispiel durch Luminex® oder von Quantum Dot Corporation bekannt. Beads können zur Durchführung des erfindungs- gemäßen Verfahrens zum Beispiel mit unterschiedlichen Oligonukleoti- den, Antigenen, Antikörpern oder zum Beispiel Proteinen beschichtet und auf das Reaktionszentrum aufgebracht werden. Zur Unterscheidung der Beads können unterschiedliche Größen, Massen, Farbkodierungen und anderes eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch für vergleichende Hybridisierungsreaktionen zwischen zu untersuchenden Proben und Referenzproben, wie sie für die CGH (Comparative Genomic Hybridization) oder die Genexpressionsanalyse üblich sind.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist einen Träger auf, auf dem wenigstens ein Reaktionszentrum angeordnet ist, an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen als Sondenmoleküle gebunden sind. Die Makromoleküle der wenigstens zwei Sorten haben dabei inner- halb eines Reaktionszentrums keine vorbestimmte Anordnung.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auf dem Träger ein einzelnes Reaktionszentrum oder mehrere, vorzugsweise in Form eines Arrays angeordnete Reaktionszentren mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Makro- molekülen als Sonden aufweisen. Bei dem Träger kann es sich zum Beispiel um eine Mikrotiterplatte oder um einen im Wesentlichen planaren Träger handeln, wobei im letztgenannten Fall das wenigstens eine Reaktionszentrum von einem Bereich auf dem Träger umfasst sein kann, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung hat. Der planare Träger kann zum Beispiel ein Glasoder Quarzplättchen oder ein Festkörperchip sein.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem im wesentlichen planaren Träger weist um das wenigstens eine Reaktionszentrum zwei konzentrische, vorzugsweise runde Bereiche auf, wobei der innere konzentrische Bereich andere Benetzungseigenschaften als das Reaktionszentrum und als der äußere Bereich hat.
Im Falle einer arrayförmigen Anordnung der Reaktionszentren kann auch vorgesehen sein, dass die Benetzungseigenschaften derart gewählt sind, dass Probenlösungstropfen individuell an den einzelnen Reaktionszentren gehalten werden und ein abdeckender Ölfilm oberhalb des gesamten Arrays gehalten wird. Dazu sind zur Verwendung von zum Beispiel wäss- rigen Probenlösungen die Reaktionszentren von individuellen hydrophoben Bereichen umgeben und das gesamte Array von einem Bereich, der zur Lokalisierung eines Öltropfens auf dem gesamten Array dient.
Eine Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist eine Ein- richtung zur Erzeugung von Schallwellen, insbesondere von Oberflächenschallwellen auf, mit deren Hilfe eine optimale Verteilung und/ oder Durchmischung der Probenflüssigkeit an einem Reaktionszentrum erreicht werden kann. Eine solche Einrichtung umfasst zum Beispiel einen Interdigitaltransducer auf einer piezoelektrischen Oberfläche, wie er in DE 101 03 954 B4 beschrieben ist. Die Abstrahlrichtung des Interdigi- taltransducers ist dabei derart gewählt, dass sie in Richtung eines Reaktionszentrums liegt, so dass Probenflüssigkeit, die sich auf diesem Reaktionszentrum befindet mit Hilfe der Oberflächenschallwellen, die mit diesem Interdigitaltransducer erzeugt werden, in Bewegung versetzt werden kann.
Ausführungsformen der Vorrichtung, die den für das erfindungsgemäße Verfahren geschilderten Ausgestaltungen analog entsprechen, sind ebenfalls umfasst, ohne dass sie notwendigerweise für die Vorrichtung noch einmal gesondert erläutert werden.
Die Wirkungen und Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der beschriebenen und anderer besonderer Ausführungsformen ergeben sich in analoger Weise aus den oben bereits für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Ausgestaltungen und die dort für das erfindungsgemä- ße Verfahren und seine Ausgestaltungen erläuterten Effekte und Vorteile.
Wie bereits bei dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren beschrieben, kann die Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle in der Probenflüssigkeit auch nach dem Aufbringen der Probenflüssigkeit auf das Reaktionszentrum geschehen. Eine besonders praktische Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist dazu an dem Reaktionszentrum nicht nur die wenigstens zwei Sorten bekannter Makromoleküle als gebundene Sondenmoleküle auf, sondern zusätzlich Material zur Markierung wenigstens einer Sorte nachzuweisender Probenmoleküle. Beim Aufbringen der Probenflüssigkeit auf das Reaktionszentrum findet dann nicht nur die Reaktion zwischen den Probenmolekülen und den Sondenmolekülen statt, sondern gleichzeitig auch die Markierung der nachzuweisenden Proben-Makromoleküle in der Probe. Vorzugsweise ist das Material zur Markierung (das zum Beispiel markierte Primer zur Erzeugung von PCR-Produkten umfassen kann) an dem wenigstens einen Reaktionszentrum unspezifisch gebunden, zum Beispiel getrocknet. Beim Aufbringen der Probenflüssigkeit löst sich das unspezi- fisch gebundene Material und steht für eine Markierung zur Verfügung.
Die Probenlösung wird auf ein solches Reaktionszentrum aufgebracht und löst die unspezifisch gebundenen Fluorophore auf, die dann mit den Teilsequenzen in der Probenlösung reagieren können, um diese zu markie- ren. Derartig vorbereitete Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind einfach zu handhaben und können als fertiges Untersuchungsmittel für ausgewählte Makromoleküle in einer Probenlösung bereitgestellt werden.
Die Auswahl besonderer Materialien zur Markierung, deren Effekte und Vorteile wurden bereits oben mit Bezug zu Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens erläutert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kommt zumindest ein Reaktions- Zentrum zum Einsatz, auf dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen als Sondenmoleküle gebunden sind. Zur Herstellung einer solchen Anordnung werden die potenziellen Sondenmoleküle vor dem Aufbringen auf die Festkörperoberfläche des Trägers zum Beispiel abgemischt und dann als ein Reaktionszentrum aufgespottet. Somit ent- steht ein Reaktionszentrum, an dem unterschiedliche Probenmoleküle einer Probenflüssigkeit spezifisch binden können.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung und ein Markierungsmaterial, vorzugsweise in Form einer Markierungslösung, aufweist, das geeignet ist, wenigstens eine vorbestimmte Sorte von nachzuweisenden Proben-Makromolekülen zu markieren, die mit einer Sorte von Sondenmolekülen an dem wenigstens einen Reaktionszentrum der Vorrichtung spezifisch reagieren können.
Das Material zur Markierung kann insbesondere markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymerasekettenreaktion(en)) und ggf. die für die PCR notwendigen Puffer und Nukleotide umfassen. Schließlich kann das Material zur Markierung auch bereits die für die PCR notwendige Polymerase umfassen.
Die Vorteile und Effekte eines solchen erfindungsgemäßen Kits und seiner in den Unteransprüchen definierten speziellen Ausführungsformen ergeben sich aus den oben beschriebenen Vorteilen und Effekten des erfin- dungsgemäßen Untersuchungsverfahrens und seiner besonderen Ausgestaltungen bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen.
Ausführungsformen des Kits, die den für das erfindungsgemäße Verfahren geschilderten Ausgestaltungen bzw. den für die erfindungsgemäße Vorrichtung geschilderten Ausführungsformen analog entsprechen, sind ebenfalls umfasst, ohne dass sie notwendigerweise für das Kit noch einmal gesondert erläutert werden.
Die Erfindung wird anhand besonderer Ausgestaltungen unter Bezugnahme auf die anliegenden Figuren im Detail erläutert, die in schemati- scher Darstellung erfindungsgemäße Verfahrensführungen und Vorrichtungen darstellen. Dabei zeigt
Fig. 1 ein Beispiel eines Reaktionszentrums, Fig. 2 ein Array mehrerer Reaktionszentren,
Fig. 3 eine Schemadarstellung eines erfindungsgemäßen Reaktionsverfahrens,
Fig. 4 eine Schemadarstellung eines anderen erfindungsgemäßen Reaktionsverfahrens,
Fig. 5 eine Draufsicht auf ein Detail einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung,
Fig. 6 einen Schnitt durch die erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß der Linie VI-VI in Fig. 5,
Fig. 7 einen Versuch saufbau für vergleichende Experimente, und
Fig. 8 die dabei gemessenen Fluoreszenzsignale.
Fig. 1 beschreibt ein Reaktionszentrum 10, an dem Sondenmoleküle Al, A2, A3, Bl, B2 und B3 aufgebracht wurden. Typische Durchmesser solcher Reaktionszentren 10 liegen zwischen 50 μm und einigen Millimetern. Al, A2, A3, Bl, B2 und B3 stehen hier beispielhaft für Makromoleküle, die mit entsprechenden Molekülen in einer Probenlösung reagieren können. In der schematischen Darstellung der Fig. 1 sind von jeder gebundenen Makromolekülsorte nur zwei dargestellt. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Anzahl in der Regel selbstverständlich viel größer. Die Makromoleküle Al, A2, A3, Bl, B2, B3, sind an dem Reaktionszentrum 10 regellos angeordnet. Zur Herstellung einer solchen Anordnung werden die potenziellen Sondenmoleküle vor dem Aufbringen auf die Festkörperoberfläche des Trägers abgemischt und dann als ein Reaktionszentrum aufgespottet. Somit ent- steht ein Reaktionszentrum, an dem unterschiedliche Probenmoleküle einer Probenflüssigkeit spezifisch binden können.
Die typische Länge der verwendeten Makromoleküle liegt zwischen 15 und 100 Basenpaaren. Es können auch längere PCR-Produkte oder zum Bei- spiel Klone, Antigene oder Antikörper als Sondenmoleküle verwendet werden.
Mehrere solcher Reaktionszentren, die entweder gleichartige oder auch unterschiedliche Sondenmoleküle enthalten können, können auch in Form einer Matrix auf einer Festkörperoberfläche aufgebracht werden und so ein Array aus Reaktionszentren bilden. Eine solche Anordnung ist Gegenstand der schematischen Fig. 2, in der beispielhaft zwei der dargestellten Reaktionszentren mit den Bezugsziffern 10, 12 bezeichnet sind. Auf der Festkörperoberfläche 14 können sich mehr als die dargestellte Anzahl an Reaktionszentren in Form einer Matrix befinden, was durch die Punktlinien 13 angedeutet sein soll.
Mit den beschriebenen Anordnungen können wie folgt Makromoleküle in einer Probenlösung untersucht werden. Es wird zunächst ein Beispiel dargestellt, bei dem die Anwesenheit einer bestimmten Nuklein säure se- quenz eines Organismus in einer Probenflüssigkeit untersucht werden soll.
Fig. 3 zeigt in schematischer Darstellung ein Reaktionsverfahren für Assays, in denen mit hoher Sicherheit die Anwesenheit eines bestimmten Organismus festgestellt werden soll. In der Probe sei ein Organismus a mit den Teilsequenzen al, a2 und a3 vorhanden. Ein typisches Beispiel ist das HIV- Virus, dessen Nachweis über mehrere virusspezifische Sequenzen erfolgt. Die Teilsequenzen werden mit einem Fluorophor fl markiert. Dazu wird eine PCR (Polymerasekettenreaktion) mit markierten Primern durchgeführt, bei der nur die Teilsequenzen al, a2, a3 amplifiziert werden.
Das Reaktionszentrum 10 enthält in dem gezeigten Beispiel Teilsequenzen Al, A2, A3 bzw. Bl, B2, die spezifisch mit Teilsequenzen der Organismen a bzw. b reagieren könnten.
Wird eine Probenlösung mit den fluoreszenzmarkierten Teilsequenzen al, a2, a3 mit dem gesamten Reaktionszentrum 10 in Verbindung gebracht, können die Sequenzen Al und al bzw. A2 und a2 bzw. A3 und a3 paar- weise hybridisieren. Nach einem stringenten Waschschritt der Festkörperoberfläche, auf dem sich das Reaktionszentrum 10 befindet, kann die Fluoreszenz der Fluorophore, die an Teilsequenzen al, a2 und a3 gebunden sind, die spezifisch an den Sequenzen des Reaktionszentrums 10 gebunden sind, nachgewiesen werden, indem die Fluoreszenz ausgewertet wird. In einem solchen Fall ist eine Fluoreszenzfarbe ausreichend, um den Assay durchzuführen.
Soll überprüft werden, ob die Probenlösung einen Organismus b enthält, werden dessen Teilsequenzen bl und b2 zum Beispiel über PCR fluores- zenzmarkiert, wobei nur die Teilsequenzen bl und b2 amplifiziert werden, und die Probenlösung mit dem Reaktionszentrum 10 in Kontakt gebracht. Die Sequenzen B 1 und b 1 bzw. B2 und b2 können dann paarweise hybridisieren. Die Auswertung erfolgt dann wie oben für den Nachweis des Organismus a beschrieben. Ein Reaktionszentrum ist also ausreichend, um sowohl den Organismus a als auch den Organismus b nachweisen zu können, abhängig davon, welche Sequenzen in der Probe markiert werden.
Das Verfahren kann auch für mehr als zwei unterschiedlichen Organismen a, b, c, ... durchgeführt werden, wobei auf dem Reaktionszentrum 10 korrespondierende Teilsequenzen Al, A2, A3, ..., Bl, B2, B3, ..., Cl, C2, C3, ... vorgesehen sind.
Um die Anwesenheit mehrerer Sequenzen getrennt aber gleichzeitig nachweisen zu können, wird ein Verfahren verwendet, wie es mit Bezug zu Fig. 4 erläutert wird. Beispielsweise Teilsequenzen al, a2 einer ersten Sequenz a werden mit einem ersten Fluorophor fl und Teilsequenzen bl, b2 einer zweiten Sequenz werden mit einem zweiten Fluorophor f2 markiert. In dem Fall, der in Fig. 4 dargestellt ist, sind zwei verschiedene Organismen a und b mit den Teilsequenzen al, a2 und bl, b2 in der Probenflüssigkeit vorhanden. Wird eine solche Probenflüssigkeit mit dem Reaktionszentrum 10 in Kontakt gebracht, so reagieren die Teilsequenzen al und Al, die Teilsequenzen a2 und A2, die Teilsequenzen bl und Bl bzw. die Teilse- quenzen b2 und B2. Nach einem stringenten Waschschritt im Anschluss an die Reaktion verbleiben Fluorophore f 1 und f2 solcher Teilsequenzen, die an Sondenmolekülen des Reaktionszentrums 10 spezifisch gebunden wurden. Durch eine Zweifarbenfluoreszenzmessung werden die beiden Organismen getrennt nachgewiesen. Die Zweifarbenfluoreszenzmessung wird entweder durch eine wellenlängenselektive Auswertung des Fluoreszenzsignals oder durch eine Fluoreszenzmessung mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen vorgenommen .
Die mit Bezug zur Fig. 3 und Fig. 4 beschriebenen Verfahren können auch kombiniert werden, um die Sicherheit des Nachweises weiter zu erhöhen. Eine zusätzliche Erhöhung der Anzahl der parallel durchzuführenden Reaktionen kann erreicht werden, wenn mehrere unterschiedlich bestückte Reaktionszentren in Form einer Matrix angeordnet und ausgewertet werden, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist.
Um die spezifische Markierung einzelner Sequenzen bzw. Teilsequenzen in der Probenlösung zu erreichen, wird zum Beispiel eine Polymeraseketten- reaktion mit entsprechend markierten Primern durchgeführt, wobei zum Beispiel ein Puffer eingesetzt wird, mit dem auch die Reaktion zur spezifischen Bindung an den Sondenmolekülen des wenigstens einen Reaktionszentrums 10 durchgeführt werden kann.
Das Material zur Markierung kann der Probenlösung entweder zugeführt werden oder bereits in ihr enthalten sein. Die Markierung kann vor der
Reaktion durchgeführt werden, indem ein spezifisches Markierungsverfahren angewendet wird, bei dem nur die interessierenden Probenmoleküle markiert werden. Andererseits ist es auch möglich, die Markierung erst nach der Reaktion bzw. nach dem Entfernen ungebundenen Probenmate- riales vorzunehmen.
Bei einer anderen Verfahrensführung ist das Material zur Markierung an dem Reaktionszentrum 10 vorhanden, zum Beispiel in getrockneter Form. So ist es zum Beispiel möglich entsprechend vorbereitete Untersuchungs- Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die auf dem wenigstens einen
Reaktionszentrum sowohl die Teilsequenzen Al, A2, A3, ..., Bl, B2, B3, ... zur spezifischen Reaktion mit den zu untersuchenden Teilsequenzen der Probenlösung enthalten, als auch die benötigten Fluoreszenzmarkierungsstoffe. Es kann sich dabei zum Beispiel um markierte Primer für PCR handeln. Die Probenlösung wird auf ein solches Reaktionszentrum aufge- bracht und löst die unspezifisch gebundenen Fluorophore auf, die dann mit den Teilsequenzen in der Probenlösung reagieren können, um diese zu markieren. Derartig vorbereitete Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind einfach zu handhaben und können als fertiges Untersuchungsmittel für ausgewählte Makromoleküle in einer Probenlösung bereitgestellt werden.
Fig. 5 zeigt die Draufsicht auf ein Reaktionszentrum einer abgewandelten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Reaktions- Zentrum 10 ist hier von einem konzentrischen Bereich 16 umgeben, der im Vergleich zum Reaktionszentrum 10 hydrophob ist. Dies lässt sich zum Beispiel durch eine Silanisierung des Bereiches 16 erreichen. Der hydrophobe Bereich 16 ist von einem weiteren konzentrischen Bereich 18 umgeben, der solche Benetzungseigenschaften aufweist, dass er zur Lokali- sierung eines durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltenen Öltropfens dienen kann, also zum Beispiel entsprechend lipophil ist. Die Festkörperoberfläche, zum Beispiel ein Glasplättchen, ist mit 20 bezeichnet.
Fig. 6 zeigt einen Schnitt durch ein solches Reaktionszentrum entlang der Linie VI-VI, wie sie in Fig. 5 angedeutet ist. Außerdem ist ein Tropfen 22 von Probenlösung dargestellt, der von einem Ölfilm 24 bedeckt wird.
Die Probenlösung 22 wird durch ihre Oberflächenspannung zusammen- gehalten und verlässt den im Vergleich zum hydrophoben Bereich 16 hydrophilen Bereich des Reaktionszentrums 10 ohne äußere Krafteinwirkung nicht, wodurch sie am Reaktionszentrum 10 lokalisiert ist. Zum Schutz gegen Verdampfung ist oberhalb des Probenlösungstropfens 22 ein Öltropfen 24 aufgebracht, der den Bereich 18 aufgrund seiner Oberflä- chenspannung nicht verlässt. Insbesondere bei Verwendung von kleinen Probenvolumina von 0, 1 μl bis 10 μl ist die Verwendung eines solchen Öltropfens 24 vorteilhaft um ein Verdampfen zu verhindern.
Die Geometrie kann auch so gewählt sein, dass der Öltropfen mehrere Reaktionszentren und die darauf befindlichen Probenlösungstropfen abdeckt.
Eine zusätzliche Durchmischung der Probenlösung auf der Oberfläche des Trägers kann erreicht werden, wenn Oberflächenschallwellen in Richtung des Reaktionszentrums geschickt werden, die zum Beispiel mit Hilfe eines Interdigitaltransducers auf der Trägeroberfläche erzeugt werden, dessen Abstrahlrichtung auf das Reaktionszentrum gerichtet ist. Gegebenenfalls kann dazu das Trägermaterial piezoelektrisch ausgewählt oder beschichtet werden.
Vergleichende Experimente
Im Folgenden wird ein Experiment beschrieben, um die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu nicht-erfindungsgemäßen Verfahren aufzuzeigen. Das Experiment dient dem Nachweis von Probenmolekülen in einem Medium, die mit ausgewählten Sondenmolekülen reagieren können. Bei dem zu untersuchenden Medium handelt es sich bei dem gezeigten Beispiel um den Überstand von Chondrozyten aus einer Zellkultur. Geprüft werden soll, ob sich in diesem Medium Analyten befin- den, die speziell mit den Antikörpern MMP10 und MMP13 reagieren können.
Um einen Vergleich durchführen zu können, wurden auf drei Bereiche (siehe Fig. 7a, b bzw. c) eines Trägers ("Slide") drei unterschiedliche Ver- suchreihen präpariert. In einem Bereich wurde nur der Antikörper MMP10 eingesetzt, in einem zweiten Bereich nur der Antikörper MMPl 3. Auf Vergleichspunkten kann zum Beispiel eine Verdünnungslösung PBS in reiner Form aufgebracht werden um die Korrektheit der Messapparatur zu prüfen.
Für den dritten Bereich wurden die Antikörper MMPlO und MMP 13 erfin- dungsgemäß abgemischt und die so hergestellte Abmischung verwendet.
Die Antikörper, die in einer Konzentration von 1 mg/ ml vorlagen, wurden 1: 1, 1:2 bzw. 1:4 verdünnt. Dazu wurde ein Spottingpuffer (SP) verwendet, der PBS pH 7,4 umfasst. Die so verdünnten Antikörperlösungen werden in einem Array auf das Slide aufgebracht, wobei sich die genannten Verdünnungen der Antikörperlösungen wie in Fig. 7 in vertikaler Richtung angegeben ändern. Die Antikörperlösungen werden zum Beispiel auf das Slide aufpipettiert oder aufgespottet.
Das Slide wurde bei Raumtemperatur über Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert, so dass die Antikörperlösungen nicht eingetrocknet sind. Anschließend wurde das Slide außerhalb der feuchten Kammer für 30 Minuten getrocknet.
In einem nächsten Schritt wurde das zu untersuchende Medium aufgebracht. Zunächst wurde dazu das Slide in einer Waschstation mit einem Waschpuffer (WP) rehydriert. Der Waschpuffer umfasste 0, 1% Tween 20 in PBS pH 7,4. Anschließend wurde das Slide trockenzentrifugiert. Von dem Medium, das untersucht werden sollte (Überstand von Chondrozyten aus einer Zellkultur) wurde eine Verdünnungsreihe 1:2, 1:5, 1: 10, 1:20 präpariert. Als Verdünnungspuffer (VP) wurde 1,5% BSA, 2,5% Low Fat Milchpulver, 0, 1% Tween 20 in PBS pH 7,4 verwendet. Je 1 μl wurde in einer Anordnung auf das Slide aufgebracht, die in horizontaler Richtung in Fig. 7 angegeben ist. Mit "neg" ist ein Punkt bezeichnet, in den der Verdünnungspuffer in reiner Form aufgebracht wurde. Die Inkubation erfolgte für 45 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das Slide in einer Waschstation mit dem Waschpuffer WP gewaschen und dann trockenzentrifugiert.
Im nächsten Schritt muss die Fluoreszenzmarkierung vorgenommen werden. Dazu können Fluoreszenzmarkierungsstoffe eingesetzt werden, die spezifisch entweder an dem Analyten binden, der mit dem Antikörper MMPlO reagiert, oder an den Analyten binden, der mit dem Antikörper MMP 13 reagiert. In dem Bereich a des in Fig. 7 gezeigten Slides würde dann nur der Fluoreszenzstoff nachgewiesen werden können, der dem Analyten entspricht, der an den Antikörper MMPlO gebunden hat, im Bereich b der Fig. 7 würde nur der Fluoreszenzfarbstoff nachgewiesen werden können, der an den Analyten bindet, der mit dem Antikörper
MMP 13 reagiert, während in dem Bereich c die beiden Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen werden könnten.
Der Analyt, der mit dem Antikörper MMPl 3 reagiert, wird zum Beispiel mit einem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 ("grün") markiert, während der Analyt, der mit dem Antikörper MMP10 reagiert, mit einem Fluoreszenzfarb Stoff Cy5 ("rot") markiert wird.
Alternativ kann zur Markierung wie folgt vorgegangen werden. Zunächst werden Detektionsantikörper (Biotin-Anti-MMPIO (1 μg/ml, Verdünnung in dem Verdünnungspuffer VP)) aufgebracht. Ein solcher Detektionsantikörper kann nur an solchen Bindungsstellen binden, an denen ein Analyt gebunden ist, der mit einem Antikörper MMP10 reagiert hat. Diejenigen Bindungsstellen, bei denen ein Analyt mit einem Antikörper MMP 13 rea- giert hat, bleiben von diesem Detektionsantikörper frei. An das Biotin kann jetzt ein Farbstoff Streptavidin-Cy5 zur Markierung aufgebracht werden. Die Inkubation für diese Markierungsreaktionen erfolgt in je 1 μl für 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Jetzt kann in noch zu beschreibender Weise der Nachweis des Vorhandenseins bzw. des Nicht- Vorhandenseins des Farbstoffes Cy5 mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse an dem Reaktionszentrum vorgenommen werden.
In einem zweiten Durchgang wird Biotin-Anti-MMP13 (1 μg/ml, Verdünnung in dem Verdünnungspuffer VP) aufgebracht. Dieser Detektionsanti- körper bindet nur mit solchen Bindungsstellen, an denen ein Analyt vorhanden ist, der an einem Antikörper MMP 13 gebunden ist. An diesem Biotin kann ein Farbstoff Streptavidin-Cy3 angelagert werden, wobei die Inkubation wiederum in 1 μl für 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorgenommen wird. An den Bindungsstellen, die den Antikörpern MMP 13 entsprechen, liegt dann dementsprechend der Farbstoff Cy3 vor, der in noch zu beschreibender Weise mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse des Reaktionszentrums nachgewiesen werden kann.
Der Nachweis erfolgt in den beschriebenen Fällen mit einem kommerziel- len Laserscanner bei einer Anregungswellenlänge, wobei das erzeugte Spektrum wellenlängenselektiv ausgewertet wird. In einer photographischen Aufnahme des Slides ergibt sich dabei eine Farbaufteilung derart, dass der in Fig. 7 mit a bezeichnete Bereich rote Punkte aufweist, der mit b bezeichnete Bereich grüne Punkte und der mit c bezeichnete Bereich gelbe bzw. braune Punkte. Im Bereich a, in dem nur der Antikörper
MMP10 als Sonde verwendet wurde, ist nur der Farbstoff Cy5 nachweisbar, während im Bereich b nur der Farbstoff Cy3 nachweisbar ist. In dem Bereich c sind beide Farbstoffe nachzuweisen, so dass sich in der photographischen Aufnahme der Fig. 7 eine Mischung zeigt. Fig. 8 zeigt die entsprechenden Fluoreszenzsignale. Aufgetragen ist dabei die Intensität des Fluoreszenzsignales in beliebigen Einheiten gegen den Ort auf dem Slide. Die Teilfiguren 8a, 8b, 8c entsprechen den Bereichen a, b bzw. c des Slides, das in Fig. 7 gezeigt ist. Die Messkurve A wurde mit einem Kantenfilter vorgenommen, das derart ausgewählt ist, dass im Wesentlichen der Farbstoff Cy5 nachgewiesen wird, während die Kurve B mit einem Kantenfilter aufgenommen wurde, das im Wesentlichen die Detektion des Farbstoffes Cy3 erlaubt. In den Bereichen a und b wurde nur jeweils ein Farbstoff nachgewiesen. Im Bereich c zeigt sich, dass bei den abgemischten Reaktionszentren jeweils beide Farbstoffe nachgewiesen werden können. Das geschilderte vergleichende Experiment zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren ergibt, dass in dem verwendeten Medium Analyten sowohl für den Antikörper MMPlO als auch für den Antikör- per MMP 13 vorliegen.
Wesentlich ist zudem, dass ein einzelnes Reaktionszentrum, wie zum Beispiel das in Fig. 7c mit 11 bezeichnete Reaktionszentrum, zur Durchführung des erfϊndungsgemäßen Verfahrens ausreicht. Die größere Anzahl Reaktionszentren, die auf dem Slide in Fig. 7 sichtbar ist, dient nur der Darstellung des Verfahrens im Vergleich mit anderen Methoden. Außerdem ist aus den Verdünnungsreihen aus der abnehmenden Leuchtintensität, die in Fig. 7 mit steigender Verdünnung erkennbar ist, auf einen fehlerfreien Versuchsablauf zurückschließbar, so dass die Sicherheit des Versuchsergebnisses erhöht wird.
Um die Frage zu beantworten, ob in dem zu untersuchenden Medium Analyten, die mit dem Antikörper MMPlO reagieren, und Analyten, die mit dem Antikörper MMP 13 reagieren, vorhanden sind, sind bei dem nicht erfindungsgemäßen Verfahren zwei Experimente (die in den Bereichen a und b des Slides der Fig. 7 durchgeführt wurden) mit einer entsprechenden Anzahl Spots notwendig. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, in dem die Antikörper MMPlO und MMP 13 in abgemischter Form vorliegen, reicht ein Experiment bzw. Reaktionszentrum.
Die im vorliegenden Text beschriebenen Ausgestaltungen beziehen sich darauf, dass mit Hilfe von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum vorliegenden mehreren Sorten von Sondenmolekülen das Vorhandensein von bestimmten Probenmolekülen in einer Probenlösung bzw. deren Reak- tionsverhalten untersucht werden soll. Andere Verfahrensführungen sehen vor, dass die zu untersuchenden Makromoleküle in abgemischter Form auf das Reaktionszentrum aufgebracht werden und mit einer Lösung in Kontakt gebracht werden, die bekannte Makromoleküle enthält, um Information über die an dem Reaktionszentrum gebundenen Makro- moleküle zu erhalten.
Bezugszeichenliste
10, 11, 12 Reaktionszentren
13 Fortsetzungslinien 14 Reaktionsarray
16 hydrophober Bereich
18 hydrophiler Bereich
20 Festkörperoberfläche
22 Probenflüssigkeitstropfen 24 Ölbedeckung

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe mit folgenden Schritten:
Bereitstellen eines Trägers (20) mit wenigstens einem Reaktionszentrum (10, 12), an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen (Al, A2, A3, Bl, B2, B3) als Sondenmoleküle gebunden sind, - Markieren nachzuweisender, komplementärer Proben-
Makromoleküle (al, a2, bl, b2) der Probe (22), In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 12) derart, dass eine Reaktion zwischen wenigstens einer Sorte der gebundenen Sonden-Makromole- küle (Al, A2, A3, Bl, B2, B3) mit den nachzuweisenden Proben-Makromolekülen (al, a2, bl, b2) stattfinden kann, wenn eine spezifische Reaktion zwischen nachzuweisenden Proben- Makromolekülen mit einer Sorte der gebundenen Sonden- Makromoleküle möglich ist, - Entfernen von ungebundenem Probenmaterial, und
Prüfen des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum spezifisch gebundenen Proben- Makromolekülen.
2. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 1 , bei dem die wenigstens zwei Sorten von gebund- nen Sonden-Makromolekülen wenigstens zwei unterschiedliche Teile einer biologischen Sequenz eines Organismus (a) oder unterschiedliche Sequenzen eines Organismus umfassen.
3. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die wenigstens zwei Sorten von gebundenen Sonden-Makromolekülen wenigstens zwei Reaktionspartner für wenigstens zwei unterschiedliche Sorten von Proben-Makromolekülen umfassen.
4. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 3, bei dem die wenigstens zwei unterschiedlichen Sorten von Proben-Makromolekülen biologische Sequenzen umfas- sen, die zu unterschiedlichen Organismen (a, b) gehören.
5. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Markierung nur für solche nachzuweisende Makromoleküle der Probe vorgenommen wird, die zu demselben Organismus gehören.
6. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Markierung für wenigstens zwei Sorten von nachzuweisenden Makromolekülen in der Probe vorgenommen wird, die zu unterschiedlichen Organismen (a, b) gehören, wobei die Makromoleküle unterschiedlicher Organismen mit unterschiedlichen Markierungen (fl, f2) versehen werden.
7. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem als Markierung Fluoreszenzmarkierung verwendet wird und zur Prüfung des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum nach der Reaktion gebundenen Proben-Makromolekülen die Fluoreszenz untersucht wird.
8. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 7, bei dem zur Unterscheidung verschiedener Makromoleküle der Probe mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen das Fluoreszenzsignal wellenlängenselektiv ausgewertet wird.
9. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 7 oder 8, bei dem die Fluoreszenz bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen ausgewertet wird.
10. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem weniger als zehn, vorzugsweise weniger als fünf unterschiedlich markierte Bestandteile in der Probe vorgesehen werden.
11. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die Markierung der Makromoleküle der Probe auf dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 12) nach dem Entfernen ungebundenen Probenmaterials erfolgt.
12. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem mehrere, vorzugsweise in Form eines Arrays angeordnete, Reaktionszentren (10, 12) mit jeweils wenigstens zwei Sorten von gebundenen Makromolekülen als Sonden auf einem Träger (20) eingesetzt werden.
13. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem zur Markierung der Probenmoleküle eine oder mehrere PCR (Polymerasekettenreakti- on(en)) mit entsprechend markierten Primern eingesetzt wird.
14. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 13, bei dem für die PCR ein Puffer eingesetzt wird, mit dem auch die Reaktion zur spezifischen Bindung an den Son- denmolekülen des wenigstens einen Reaktionszentrums (10, 12) durchgeführt werden kann.
15. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem ein im wesentlichen planarer Träger (20) eingesetzt wird, wobei das wenigstens eine Reaktionszentrum (10) von einem Bereich auf dem Träger umfasst ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung (16) hat.
16. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 15, bei dem das wenigstens eine Reaktionszentrum
(10) von zwei konzentrischen Bereichen (16, 18) umgeben ist, wobei der innere konzentrische Bereich (16) andere Benetzungseigenschaften als das Reaktionszentrum und als der äußere konzentrische Bereich (18) hat.
17. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 16, insbesondere nach einem der Ansprüche 13 bis 16, bei dem die Probenflüssigkeit (22) während der Reaktion mit Öl (24) bedeckt wird.
18. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem Schallwellen, vorzugsweise Oberflächenschallwellen, in Richtung der Probenflüssigkeit geschickt werden, nachdem die Probenflüssigkeit mit dem wenigs- tens einen Reaktionszentrum in Kontakt gebracht worden ist.
19. Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem die zu untersuchenden Makromoleküle in der Probe und/oder die auf dem wenigstens einen Reaktionszentrum vorhandenen Sondenmoleküle Nuklein säure se- quenzen oder Antigene oder Antikörper oder Proteine umfassen.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bei dem an einem Reaktionszentrum (10, 12) unterschiedliche Sorten von Sondenmo- lekülen vorhanden sind, die derart ausgewählt sind, dass nachzuweisende Makromoleküle von maximal zehn, vorzugsweise maximal sieben, besonders vorzugsweise maximal fünf Bestandteilen der Probenflüssigkeit mit Sondenmolekülen des Reaktionszentrums spezifisch reagieren können.
21. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, mit einem Träger (20) und wenigstens einem auf dem Träger (20) angeordneten Reakti- onszentrum (10, 12) mit wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen (Al, A2, A3, Bl, B2, B3), die ohne vorbestimmte räumliche Anordnung an dem Reaktionszentrum als Sondenmoleküle gebunden sind.
22. Vorrichtung nach Anspruch 21 mit mehreren, vorzugsweise in Form eines Arrays angeordneten, Reaktionszentren (10, 12) mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Makromolekülen als Sonden.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 mit einem im wesentlichen planaren Träger (20), wobei das wenigstens eine Reak- tionszentrum (10) von einem Bereich auf dem Träger umfasst ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung (16) hat.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, bei der das wenigstens eine Reakti- onszentrum (10) von zwei konzentrischen Bereichen (16, 18) umgeben ist, wobei der innere konzentrische Bereich (16) andere Benetzungseigenschaften als das Reaktionszentrum (10) und als der äußere konzentrische Bereich (18) hat.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, bei der an einem Reaktionszentrum (10, 12) unterschiedliche Sorten von Sondenmolekülen vorhanden sind, die derart ausgewählt sind, dass nachzuweisende Makromoleküle von maximal zehn, vorzugsweise maximal sieben, besonders vorzugsweise maximal fünf unterschiedlichen Be- standteilen der Probenflüssigkeit mit Sondenmolekülen des Reaktionszentrums spezifisch reagieren können.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25 mit einer Einrichtung zur Erzeugung von Schallwellen mit einer Abstrahlrichtung in Richtung des wenigstens einen Reaktionszentrums, vorzugsweise wenigstens eines Interdigital transducers zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, bei der sich an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 12) zu jeder dort vorhandenen Sorte von Sondenmolekülen Material zur Markierung wenigstens einer Sorte nachzuweisender Probenmoleküle befindet, vorzugsweise unspezifisch gebunden ist, die mit der jeweiligen Sorte von Sondenmolekülen spezifisch reagieren können.
28. Vorrichtung nach Anspruch 27, bei der das Material zur Markierung fluoreszierend ist.
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, bei der das Material zur Markierung von nachzuweisenden Proben-Makromolekülen derart ausgewählt ist, dass die Probenmoleküle eines Organismus dasselbe Auswerte signal ergeben.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, bei der das Mate- rial zur Markierung markierte Primer für eine oder mehrere PCR
(Polymerasekettenreaktion(en)) umfasst.
31. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21 bis 30, bei dem - eine Mischung von wenigstens zwei Sorten unterschiedlicher
Makromoleküle hergestellt wird und auf einen Träger (20) aufgespottet wird.
32. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20, mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26 und einem Markierungsmaterial, vorzugsweise in einer Markierungslösung, das geeignet ist, wenigstens eine vorbestimmte Sorte von nachzuweisenden Makromolekülen (al, a2, bl, b2) zu markieren, die mit einer Sorte von Sondenmolekülen (Al,
A2, A3, Bl, B2, B3) an dem wenigstens einen Reaktionszentrum der Vorrichtung spezifisch reagieren können.
33. Kit nach Anspruch 32, bei dem das Markierungsmaterial fluoreszie- rend ist.
34. Kit nach einem der Ansprüche 32 oder 33, bei dem das Material zur Markierung von nachzuweisenden Makromolekülen derart ausgewählt ist, dass die Probenmoleküle eines Organismus dasselbe Auswertesignal ergeben.
35. Kit nach einem der Ansprüche 32 bis 34, bei dem das Material zur Markierung markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymera- sekettenreaktion(en)) umfasst.
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