DE102007059476B3

DE102007059476B3 - Vorrichtung und Verfahren zur Vermehrung und zur anschließenden Charakterisierung von Zellen

Info

Publication number: DE102007059476B3
Application number: DE200710059476
Authority: DE
Inventors: Marianna Dr. Alunni-Fabbroni; Karin Dr. Görner; Michael Dr. Riepl
Original assignee: Advalytix AG
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2007-12-11
Filing date: 2007-12-11
Publication date: 2009-07-30
Anticipated expiration: 2027-12-12
Also published as: WO2009074245A3; WO2009074245A2

Abstract

Eine Vorrichtung zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen, umfasst: - ein planares Substrat, auf dem wenigstens eine Reaktionsstelle vorgesehen ist, wobei jede der wenigstens einen Reaktionsstelle einen zentralen hydrophilen Bereich umfasst, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist, sowie - einen Aufsatz, welcher mit dem Substrat lösbar verbindbar ist und welcher wenigstens einen eine obere Öffnung sowie eine untere Öffnung aufweisenden Durchgangskanal aufweist, wobei, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, wenigstens eine der dem Substrat zugewandten unteren Öffnung(en) des wenigstens einen Durchgangskanals des Aufsatzes über einem zentralen hydrophilen Bereich einer Reaktionsstelle derart angeordnet ist, dass in dem wenigstens einen Durchgangskanal befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil des zentralen hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht den diesen umgebenden mittleren hydrophilen Bereich der Reaktionsstelle benetzen kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen.
Entsprechende Vorrichtungen werden in der biologischen und medizinischen Forschung eingesetzt, um Zellen zunächst zu vermehren, bevor diese anschließend beispielsweise durch eine Enzymreaktion oder durch einen Immunoassay charakterisiert werden. Diese Vorrichtungen umfassen üblicherweise ein Substrat, beispielsweise einen Objektträger aus Glas, sowie einen Aufsatz, in dem einzelne voneinander getrennte Kammern vorgesehen sind. Nachdem der Aufsatz auf den Objektträger aufgebracht worden ist, wird in die einzelnen Kammern Zellsuspension eingefüllt und die Vorrichtung solange bei einer geeigneten Temperatur inkubiert, bis sich die Zellen ausreichend vermehrt und an den Objektträger angehaftet haben. Anschließend werden das flüssige Medium sowie der Aufsatz entfernt, bevor die einzelnen Zellproben auf dem Objektträger weiter untersucht werden können.
Ein Nachteil dieser bekannten Vorrichtungen liegt jedoch darin, dass die einzelnen Zellproben, nur in begrenztem Umfang auf dem Objektträger untersucht werden können. Dies liegt daran, dass die meisten Charakterisierungsverfahren, wie beispielsweise enzymatische Reaktionen oder Immunoassays, die Zugabe von Flüssigkeit auf die einzelnen, auf dem Objektträger vorliegenden Zellproben erfordern. Werden allerdings einzelne Flüssigkeitstropfen auf einen Objektträger aus Glas aufgebracht, besteht die Gefahr, dass die einzelnen Flüssigkeitstropfen miteinander verlaufen.
Daher muss, selbst wenn zur Charakterisierung der Zellen nur sehr geringe Flüssigkeitsmengen auf den Objektträger aufgebracht werden, sehr vorsichtig gearbeitet werden. Für größere Flüssigkeitsmengen sind diese Vorrichtungen ohnehin ungeeignet, weswegen Charakterisierungen, welche solche größeren Flüssigkeitsmengen erfordern, in anderen Reaktionsgefäßen durchgeführt werden müssen. Zudem kann mit diesen bekannten Vorrichtungen keine PCR ("polymerase chain reaction", Polymerasekettenreaktion) durchgeführt werden, so dass auch in diesem Fall die Charakterisierung in anderen Reaktionsgefäßen durchgeführt werden muss. Dies erfordert eine Überführung der einzelnen Zellproben von dem Objektträger in Reaktionsgefäße, was zusätzliches Material erfordert und sowohl zeitals auch kostenintensiv ist. Zudem übt die Überführung auf die einzelnen Zellen Stress aus, der wiederum z. B. die Expression einzelner Gene in den Zellen beeinflussen und so das spätere Charakterisierungsergebnis verfälschen kann. Daher werden die bisher bekannten Vorrichtungen oftmals als unbefriedigend empfunden.
Aus der DE 696 22 090 T2 ist eine Kultur-Trägervorrichtung mit einem Basiselement, einer Aufnahmekammer und einem Mittel zum lösbaren Verbinden der Kammer mit dem Basiselement bekannt, welche zudem einen beweglichen Hebel aufweist, welcher zum Trennen der Kammer von dem Basiselement mit der Kammer verbunden ist.
In der DE 102 14 250 A1 wird eine, eine Mehrzahl an Kavitäten aufweisende Mikrotiterplatte beschrieben, welche aus einer Bodenplatte und einem mit dieser verbundenen Multiwellaufsatz, der die Mikrotiterplatte in Kavitäten aufteilt, besteht, wobei die Bodenplatte aus einem transparenten Material besteht, welches einseitig auf der dem Multiwellaufsatz zugewandten Seite mit einem optisch transparenten elektrisch leitfähigen Material beschichtet ist.
Aus der DE 10 2006 056 694 A1 ist ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion mit einer wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Probe bekannt, bei dem der Zellkern der Eukaryontenzelle an gefärbt wird und die Eukaryontenzelle in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 10 μl auf einer festen Reaktionsstelle eines festen Substrats abgelegt wird, bevor detektiert wird, ob wenigstens ein gefärbter Zellkern auf der Reaktionsstelle des Substrat vorliegt und mit der einen Eukaryontenzelle auf dem Substrat eine enzymatische Reaktion durchgeführt wird. Dabei kann die Reaktionsstelle einen inneren hydrophilen Bereich umfassen, der von einem hydrophoben Bereich umgeben ist, welcher wiederum von einem mittleren hydrophilen Bereich, der außenseitig von einem hydrophoben Bereich (16) umgeben ist, umgeben ist.
Yap und McGee beschreiben in Nucleic Acids Reasearch, Bd. 19, Seite 4294, "Silde PCR: DNA amplification from cell samples an microscopic glass slides" ein Verfahren zum Amplifizieren von DNA aus kultivierten Zellen direkt auf Glasstreifen.
In der US 5,480,783 A wird ein Verfahren zur Replikation und Detektion einer Ziel-DNA-Sequenz offenbart, bei dem die DNA-Probe vor dem Replikationsschritt mit wenigstens einem Didesoxynukleosidtriphosphat und einer DNA-Polymerase so lange kontaktiert wird, bis das Nukleosid an die DNA-Probe bindet, bevor die behandelte DNA-Probe von dem Didesoxynukleosidtriphosphat und der DNA-Polymerase abgetrennt wird. Dabei kann es sich bei der DNA-Probe um ein Gewebe oder eine Zellkultur handeln.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung einer Vorrichtung zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakteri sierung der Zellen, mit der vorzugsweise mehrere Zellproben auf einem Substrat gleichzeitig vermehrt werden können und die einzelnen Zellproben anschließend auf diesem Substrat, auch unter Einsatz einer PCR oder von anderen, vergleichsweise große Flüssigkeitsmengen erfordernden Verfahren, bei einfacher Handhabung charakterisiert werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Bereitstellung einer Vorrichtung zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen, welche umfasst:

– ein planares Substrat, auf dem wenigstens eine Reaktionsstelle vorgesehen ist, wobei jede der wenigstens einen Reaktionsstelle einen zentralen hydrophilen Bereich umfasst, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist, sowie
– einen Aufsatz, welcher mit dem Substrat lösbar verbindbar ist und welcher wenigstens einen eine obere Öffnung sowie eine untere Öffnung aufweisenden Durchgangskanal aufweist, wobei, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, wenigstens eine der dem Substrat zugewandten unteren Öffnungen) des wenigstens einen Durchgangskanals des Aufsatzes über einem zentralen hydrophilen Bereich einer Reaktionsstelle derart angeordnet ist, dass in dem wenigstens einen Durchgangskanal befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil des zentralen hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht den diesen umgebenden mittleren hydrophilen Bereich der Reaktionsstelle benetzen kann.

Indem die wenigstens eine Reaktionsstelle einen zentralen hydrophilen Bereich aufweist, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist, wird die Aufgabe vergleichsweise großer Flüssigkeitsmengen auf die wenigstens eine Reaktionsstelle unter Ausbildung von an dem Substrat fest haftenden Flüssigkeitstropfen ermöglicht, so dass auf den Reaktionsstellen des Substrats auch große Flüssigkeitsmengen erfordernde Zellcharakterisierungen durchgeführt werden können, ohne dass eine Überführung der einzelnen Zellproben in ein geschlossenes Reaktionsgefäß oder dergleichen erforderlich ist. Dadurch werden zum einen arbeits- und zeitaufwendige Transferschritte vermieden und ferner wird es dadurch ermöglicht, dass auf dem Substrat mehrere Proben parallel aufbereitet werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass sich die räumlich eng beieinander liegenden Flüssigkeitstropfen bei geringfügigen Erschütterungen oder aufgrund des Verlaufens von Flüssigkeitstropfen infolge zu hohen Tropfenvolumens miteinander vermischen. Desweiteren wird durch die vorgenannte Ausbildung der Reaktionsstellen erreicht, dass einzelne auf den Reaktionsstellen befindliche Flüssigkeitstropfen mit Öltropfen stabil überschichtet werden können, ohne dass die Flüssigkeit verläuft, so dass mit dem Substrat mit den auf den Reaktionsstellen abgelegten Zellproben auch eine PCR durchgeführt werden kann. Schließlich ermöglicht die erfindungsgemäße Positionierung des Aufsatzes auf dem Substrat, dass die mittleren hydrophilen Bereiche der einzelnen Reaktionsstellen nicht mit in den Durchgangskanälen des Aufsatzes befindlicher Flüssigkeit in Kontakt kommen, so dass eine Zerstörung oder anderweitige Funktionsbeeinträchtigung der mittleren hydrophilen Bereiche bei der Verwendung der Vorrichtung zuverlässig vermieden wird.
Unter einem Durchgangskanal wird im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Hohlraum verstanden, welcher sich, bei Verbindung des Aufsatzes mit dem Substrat von dem Substrat aus gesehen, von unten nach oben durch den Aufsatz erstreckt, wobei der Hohlraum oben und unten offen ist, aber ansonsten durch eine oder mehrere Seitenwände begrenzt ist. Dabei kann der Hohlraum jede beliebige Querschnittsform annehmen und kann mithin beispielsweise im Querschnitt kreisrund, elliptisch, rechteckig oder quadratisch sein. Zudem kann sich die Querschnittsfläche des Durchgangskanals von oben nach unten verändern; beispielsweise kann der Hohlraum in dem Aufsatz eine größere Querschnittsfläche aufweisen als die untere und die obere Öffnung des Durchgangskanals.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind auf dem Substrat wenigstens zwei Reaktionsstellen vorgesehen und der Aufsatz weist wenigstens zwei jeweils eine obere Öffnung sowie eine untere Öffnung aufweisende Durchgangskanäle auf, wobei, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, die dem Substrat zugewandten Öffnungen der Durchgangskanäle des Aufsatzes über den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen derart angeordnet sind, dass in den Durchgangskanälen befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht die mittleren hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen benetzen kann.
Vorzugsweise entspricht die Querschnittsform der unteren Öffnungen des wenigstens einen Durchgangskanals des Aufsatzes der Querschnittsform der zentralen hydrophilen Bereiche der wenigstens einen Reaktionsstelle. Zudem ist es bevorzugt, dass die Querschnittsfläche der unteren Öffnungen des wenigstens einen Durchgangskanals gleich oder zumindest im Wesentlichen gleich groß wie die Querschnittsfläche der zentralen hydrophilen Bereiche der wenigstens einen Reaktionsstelle ist. Dadurch wird erreicht, dass die unteren Öffnungen der Durchgangskanäle passgenau über den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen angeordnet werden können, so dass einerseits in den Durchgangskanälen befindliche Flüssigkeit Kontakt mit der gesamten Fläche der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen hat, andererseits jedoch zuverlässig verhindert werden kann, dass die Flüssigkeit außer mit den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen mit anderen Bereichen der Reaktionsstellen, wie den ersten hydrophoben Bereichen oder den mittle ren hydrophilen Bereichen, in Berührung kommt, so dass eine Funktionsbeeinträchtigung dieser anderen Bereiche der Reaktionsstellen zuverlässig vermieden wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der zentralen hydrophile Bereich der Reaktionsstelle bzw. sind die zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen kreisförmig ausgebildet und sind jeweils von einem kreisringförmigen ersten hydrophoben Bereich konzentrisch umgeben, welcher außenseitig von einem kreisringförmigen mittleren hydrophilen Bereich konzentrisch umgeben ist.
Eine besonders stabile Ausbildung von Flüssigkeitstropfen auf den Reaktionsstellen wird erreicht, wenn die Hydrophilie der zentralen hydrophilen Bereiche der wenigstens einen Reaktionsstelle und die Hydrophobie der diese umgebenden ersten hydrophoben Bereiche derart eingestellt sind, dass sich bei Auftrag von weniger gleich 10 μl Wasser auf die Reaktionsstellen ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel von 20 bis 70°, bevorzugt von 30 bis 60° und besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet. Dadurch wird gewährleistet, dass sich auf den Reaktionsstellen des Substrats stabile Flüssigkeitstropfen ausbilden, die fest an den Reaktionsstellen haften, so dass sich die Flüssigkeitstropfen nicht schon bei geringsten Vibrationen des Substrats, wie diese etwa beim Transport des Substrats beispielsweise innerhalb eines Labors vorkommen, von dem Substrat lösen oder auf dem Substrat verlaufen.
Vorzugsweise beträgt der Durchmesser des zentralen hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle bzw. der Durchmesser der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen, sofern diese, wie dies bevorzugt ist, kreisförmig ausgestaltet sind, zwischen 0,1 und 5 mm, be sonders bevorzugt zwischen 0,3 und 3 mm und ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 2 mm.
Um das parallele Aufbereiten einer Vielzahl von Proben zu ermöglichen, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, dass das Substrat 2 bis 384, vorzugsweise 24 bis 96, besonders bevorzugt 36 bis 60 und ganz besonders bevorzugt 48 Reaktionsstellen aufweist und der Aufsatz eine der Anzahl der Reaktionsstellen entsprechende Anzahl von Durchgangskanälen aufweist.
Besonders gute Ergebnisse werden beispielsweise erreicht, wenn das Substrat 48 Reaktionsstellen aufweist, welche jeweils einen kreisförmigen, zentralen hydrophilen Bereich aufweisen, und der Aufsatz 48, im Querschnitt kreisförmige Durchgangskanäle aufweist, welche den gleichen Durchmesser aufweisen wie die zentralen hydrophilen Bereiche, wobei die Durchgangskanäle, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, genau über den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen angeordnet sind.
Grundsätzlich kann das planare Substrat aus allen Materialien bestehen, welche dem Substrat eine ausreichende Steifheit verleihen und welche den für die mit dem Substrat vorzunehmende Charakterisierung der Zellen, insbesondere einer PCR, erforderlichen Bedingungen standhalten. Demnach kann das Substrat z. B. aus einer Vielzahl von Kunststoffen oder aus Glas bestehen. Vorzugsweise ist das Substrat ein Objektträger aus Glas.
Um eine gute Zellanhaftung an den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen zu gewährleisten, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, die zentralen hydrophilen Bereiche der wenigs tens einen Reaktionsstelle mit einer die Zellanhaftung daran verstärkenden Substanz zu beschichten.
Zur Beschichtung der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen des Substrats können alle dem Fachmann bekannten Substanzen eingesetzt werden, welche eine Anhaftung von Zellen auf diesen Bereichen fördern. Lediglich beispielsweise seien in diesem Zusammenhang Peptide und Komponenten der extrazellulären Matrix genannt, wobei jedoch auch andere Substanzen eingesetzt werden können. Gute Ergebnisse werden insbesondere erzielt, wenn die zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen mit einer aus der aus Kollagen, Fibronektin, Laminin, Vitronectin, Gelatine, synthetischen Zelladhäsionspeptiden, Basement-Membranmatrizes, polyphenolischen Proteinen, Polylysin, Polyornithin und beliebigen Kombinationen von zwei oder mehr der vorgenannten Ver bindungen bestehenden Gruppe ausgewählten Verbindung beschichtet sind. Als synthetischen Zelladhäsionspeptide können beispielsweise RGD, die zellanhaftende Fibronektin-Domäne und die zellanhaftende Laminin 1-Domäne eingesetzt werden, wobei ein Beispiel für eine Basement-Membranmatrix das von der Firma Becton Dickinson kommerziell vertrie bene Matrigel^® ist und ein Beispiel für ein polyphenolisches Protein das von der Firma Becton Dickinson kommerziell vertriebene Cell Tak^® ist.
Alternativ dazu kann auf den zentralen Bereichen der Reaktionsstellen beispielsweise zur Selektion von Zellen ein für bestimmte Zellen selektiver Antikörper immobilisiert werden. Auf eine solche Reaktionsstelle können dann Zellgemische aufgegeben werden, von denen die Zielzellen an die Antikörper binden, so dass nach anschließendem Waschen der Reaktionsstellen auf den zentralen Bereichen der Reaktionsstellen nur die zu selektierenden Zielzellen verbleiben.
Auch bezüglich des Materials, aus dem der Aufsatz besteht, ist die vorliegende Erfindung nicht besonders limitiert. Insbesondere kann der Aufsatz aus jedem beliebigen steifen oder flexiblen bzw. elastischen Material bestehen, sofern dieses gewährleistet, dass der aus diesem Material bestehende Aufsatz gut auf das Substrat aufgebracht und von diesem ohne Beschädigung der Reaktionsstellen wieder entfernt werden kann. Beispiele für geeignete Materialien sind Gummi, Polypropylen oder Polycarbonat, wobei Gummi aufgrund seiner Elastizitätseigenschaften besonders bevorzugt ist.
Um ein gutes Wachstum bzw. eine gute Vermehrung der Zellen in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu ermöglichen, sollten der mit dem Kultivierungsmedium zu befüllende Durchgangskanal bzw. die mit dem Kultivierungsmedium zu befüllenden Durchgangskanäle des Aufsatzes ein hinreichend großes Innenvolumen, vorzugsweise ein Innenvolumen von 1 bis 1.000 μl, insbesondere von 10 bis 500 μl, besonders bevorzugt von 20 bis 200 μl und ganz besonders bevorzugt von 50 bis 100 μl aufweisen. Dies kann zum einen dadurch erreicht werden, dass der Aufsatz bei einer vorgegebenen Geometrie der Durchgangskanäle und bei einer vorgegebenen Querschnittsfläche der Durchgangskanäle eine hinreichende Höhe aufweist.
Alternativ dazu ist es auch möglich, dass der Durchgangskanal bzw. die Durchgangskanäle des Aufsatzes ein geringeres Innenvolumen als zum optimalen Wachstum bzw. zur optimalen Vermehrung der Zellen erforderlich aufweisen und auf dem Durchgangskanal bzw. auf den Durchgangskanälen auf der dem Substrat abgewandten Seite jeweils ein oder mehrere Verlängerungsgefäße vorgesehen sind, so dass die Summe des Innenvolumens eines Durchgangskanals und des Innenvolumens eines Verlänge rungsgefäßes beispielsweise 50 bis 100 μl beträgt.
Um einerseits eine lösbare Verbindung des Aufsatzes mit dem Substrat zu ermöglichen und andererseits einen Übertritt von in den Durchgangskanälen befindlicher Flüssigkeit von den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen zu den ersten hydrophoben Bereichen und den mittleren hydrophilen Bereichen zu verhindern, wird der Aufsatz vorzugsweise mit einem Klebstoff auf das Substrat aufgebracht, wobei sich für diesen Zweck insbesondere doppelseitige Klebstoffstreifen, wie die von der Fima Biolink kommerziell vertriebenen Klebebänder, als besonders geeignet erwiesen haben.
Zudem können auf dem Substrat, vorzugsweise an den Übergängen von den zentralen hydrophilen Bereichen zu den ersten hydrophoben Bereichen der Reaktionsstellen, eine Dichtung oder mehrere Dichtungen vorgesehen sein, mit denen der Aufsatz gegenüber dem Substrat zusätzlich abgedichtet werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen unter Verwendung der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung. Erfindungsgemäß umfasst dieses Verfahren die nachfolgenden Schritte:

a) Verbinden des Aufsatzes mit dem Planaren Substrat, so dass wenigstens eine der unteren Öffnungen des wenigstens einen Durchgangskanals des Aufsatzes über einem zentralen hydrophilen Bereich der wenigstens einen Reaktionsstelle angeordnet ist,
b) Zugabe wenigstens einer Zelle und von Zellkulturmedium in den wenigstens einen Durchgangskanal des Aufsatzes,
c) Inkubieren der Vorrichtung bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitspanne, um eine Vermehrung der Zellen und eine Anhaftung der Zellen auf den Reaktionsstellen zu erreichen,
d) Entnehmen des Zellkulturmediums aus dem wenigstens einen Durchgangskanal,
e) Entfernen des Aufsatzes von dem Substrat sowie
f) Charakterisierung der Zellen auf der wenigstens einen Reaktionsstelle des Substrats mittels Polymerasekettenreaktion.

Die Zugabe der wenigstens einen Zelle und von Zellkulturmedium in die Durchgangskanäle des Aufsatzes kann in dem Verfahrensschritt b) beispielsweise dadurch erfolgen, dass die wenigstens eine Zelle und das Zellkulturmedium als Zellsuspension in die Durchgangskanäle gegeben werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt, bei der auf dem Substrat wenigstens zwei Reaktionsstellen vorgesehen sind und bei welcher der Aufsatz wenigstens zwei jeweils eine obere Öffnung sowie eine untere Öffnung aufweisende Durchgangskanäle aufweist, wobei, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, die dem Substrat zugewandten Öffnungen der Durchgangskanäle des Aufsatzes über den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen derart angeordnet sind, dass in den Durchgangskanälen befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktions stellen benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht die mittleren hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen benetzen kann.
Auch bezüglich der eingesetzten Zellen ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht limitiert. Demnach können alle prokaryontischen und eukaryontischen Zellen eingesetzt werden, wobei sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere für eukaryontische Zellen, wie Stammzellen, Primärzellen oder Hybridomazellen (zur Selektion monoklonaler Antikörper), eignet.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in dem Verfahrensschritt b) in jeden der Durchgangskanäle jeweils die gleiche Zellsuspension zugegeben werden und in dem Verfahrensschritt f) auf jeder der Reaktionsstellen eine PCR durchgeführt werden, wobei für jede Reaktionsstelle gleiche und/oder unterschiedliche Primerpaare eingesetzt werden. Ebenso ist es möglich in dem Verfahrensschritt b) in jeden der Durchgangskanäle jeweils eine andere Zellsuspension zuzugeben und in dem Schritt f) auf jeder der Reaktionsstellen eine PCR durchzuführen. Selbstverständlich ist es auch möglich, in einige der Durchgangskanäle jeweils die gleiche Zellsuspension zuzugeben und in andere Durchgangskanäle desselben Aufsatzes andere Zellsuspensionen zuzugeben.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung rein beispielhaft anhand vorteilhafter Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Dabei zeigen:
1a eine Draufsicht eines Substrats der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung,
1b eine Reaktionsstelle des in der 1a gezeigten Substrats,
2 einen Längsschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß eines ersten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung und
3 einen Längsschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß eines zweiten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung.
Das in der 1a dargestellte Substrat 10 ist ein rechteckig ausgebildeter Glasobjektträger und weist insgesamt 48 Reaktionsstellen 12 auf, welche auf 4 untereinander angeordnete Reihen mit jeweils 12 Reaktionsstellen 12 verteilt sind.
Wie in der 1b zu erkennen ist, weist jede Reaktionsstelle 12 einen zentralen, kreisförmig ausgestalteten hydrophilen Bereich 14 auf. Dieser zentrale hydrophile Bereich 14 ist außenseitig konzentrisch von einem kreisringförmigen ersten hydrophoben Bereich 16 umgeben, welcher wiederum außenseitig von einem kreisringförmigen mittleren hydrophilen Bereich 18 konzentrisch umgeben ist. Schließlich ist der mittlere hydrophile Bereich 18 außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich 20 umgeben. Dieser zweite hydrophobe Bereich 20 muss kein konzentrischer Ring sein, wie in der 1b dargestellt, sondern kann die gesamte Fläche des Substrats ausmachen.
Die zentralen hydrophilen Bereiche 14 sind mit einer die Zellanhaftung daran verstärkenden Substanz, beispielsweise Kollagen, beschichtet.
Die in der 2 im Längsschnitt dargestellte erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß eines ersten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung umfasst einen dem in der 1a dargestellten Objektträger entsprechenden Objektträger aus Glas als Substrat 10 sowie einen Aufsatz 22, welcher auf dem Substrat 10 über doppelseitige Klebstoffstreifen 24, 24 lös bar befestigt ist. Dabei weist der Aufsatz 22 48 hohlzylindrische Durchgangskanäle 26 auf, welche jeweils eine obere kreisrunde Öffnung 28 und eine untere kreisrunde Öffnung 30 aufweisen, wobei jeweils 12 Durchgangskanäle 26 (von denen in der 2 nur acht dargestellt sind) in 4 Reihen angeordnet sind. Dabei weisen die unteren Öffnungen 30 der Durchgangskanäle 26 jeweils den gleichen Durchmesser wie die kreisrunden zentralen hydrophilen Bereiche 14 auf dem Substrat 10 auf. Der Aufsatz 22 ist so auf dem Substrat 10 positioniert, dass die unteren Öffnungen 30 der Durchgangskanäle 26 jeweils exakt über den zentralen hydrophilen Bereichen 14 des Substrats 10 positioniert sind.
Beim Betrieb der Vorrichtung wird eine Zellsuspension aus beispielsweise eukaryontischen Zellen in einem geeigneten Zellkulturmedium in die einzelnen Durchgangskanäle 26 eingefüllt und wird die befüllte Vorrichtung beispielsweise für 24 Stunden bei 37°C inkubiert, um eine Vermehrung der Zellen in den einzelnen Durchgangskanälen 26 zu ermöglichen, welche sich an den zentralen hydrophilen Bereichen 14 der Reaktionsstellen 12 des Substrats 10 anhaften. Nach Abschluss der Inkubation werden die Zellkulturmedien aus den einzelnen Durchgangskanälen 26 beispielsweise mit einer Pipette abgezogen und wird der Aufsatz 22 von dem Substrat 10 entfernt. Auf die einzelnen mit Zellen bewachsenen Reaktionsstellen 12 des Substrats 10 werden dann jeweils PCR-Flüssigkeit (beispielsweise 1 μl), welche die PCR-Primer, PCR-Puffer und Polymerase enthält, pipettiert und die sich bildenden Flüssigkeitstropfen werden jeweils mit Öl (beispielsweise 5 μl) überschichtet. Anschließend wird das Substrat auf einen Thermocycler (nicht dargestellt) transferiert und einer PCR unterworfen.
Die in der 3 dargestellte Vorrichtung unterscheidet sich von der in der 2 dargestellten dadurch, dass auf jeder der oberen Öffnungen 28 der Durchgangskanäle 26 ein Verlängerungsgefäß 32 angeordnet ist. Bei je dem der Verlängerungsgefäße 32 handelt es sich um ein hohlzylindrisches Gefäß mit einem größeren Durchmesser als dem der Durchgangskanäle 26, wobei an dem unteren Ende des Verlängerungsgefäßes 32 ein in die oberen Öffnungen 28 der Durchgangskanäle 26 passender Adapter vorgesehen ist.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand eines diese erläuternden, aber nicht einschränkenden Beispiels erläutert.
Beispiel
In einer der in der 2 dargestellten Vorrichtung entsprechenden Vorrichtung wurden jeweils 50.000 bis 100.000 HEK-Zellen (humane embryonale Nierenzellen) in einer Zellsuspension aus FCS (fötales Kälberserum) und Antibiotika enthaltendem DMEM Medium (Gibco, Invitrogen) über die Durchgangskanäle des Aufsatzes auf jeweils eine Reaktionsstelle des Substrats aufgebracht. Anschließend wurde die Vorrichtung in einem Inkubator für 24 Stunden bei 37°C in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre inkubiert, wonach die Zellen ausreichend konfluent waren. Danach wurde das Zellkulturmedium aus den Durchgangskanälen abgezogen, das Substrat anschließend zweimal mit 1 × PBS-Lösung gewaschen und der Aufsatz von dem Substrat entfernt, bevor die Reaktionsstellen schließlich getrocknet wurden.
Nachfolgend wurde mit dem Substrat eine PCR durchgeführt. Hierzu wurden zunächst auf die getrockneten, mit Zellen bewachsenen Reaktionsstellen jeweils 1 μl einer PCR-Puffer, Primerpaare und Taq-Polymerase enthaltenden PCR-Lösung aufgegeben, bevor die sich bildenden Flüssigkeitstropfen jeweils mit 5 μl Öl überschichtet wurden, um bei der PCR eine Verdampfung der flüssigen Phase zu verhindern. Anschließend wurde das Substrat auf einen Thermocycler überführt und einer PCR unterworfen. Nach Abschluss der PCR wurden die einzelnen Reaktionsprodukte auf einem Polyacrylamidgel untersucht.
Alle PCR-Reaktionen ergaben die gewünschten Amplifikationsprodukte. Insbesondere fand keine Kontamination einzelner Proben mit auf benachbarten Reaktionsstellen abgelegten Zellen statt.

10: Substrat
12: Reaktionsstelle
14: zentraler hydrophiler Bereich
16: erster hydrophober Bereich
18: mittlerer hydrophiler Bereich
20: zweiter hydrophober Bereich
22: Aufsatz
24, 24': doppelseitiger Klebstoffstreifen
26: Durchgangskanal
28: obere Öffnung des Durchgangskanals
30: untere Öffnung des Durchgangskanals
32: Verlängerungsgefäß

Claims

Vorrichtung zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen, umfassend: – ein planares Substrat (10), auf dem wenigstens eine Reaktionsstelle (12) vorgesehen ist, wobei jede der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) einen zentralen hydrophilen Bereich (14) umfasst, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich (16) umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich (18) umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich (20) umgeben ist, sowie – einen Aufsatz (22), welcher mit dem Substrat (10) lösbar verbindbar ist und welcher wenigstens einen eine obere Öffnung (28) sowie eine untere Öffnung (30) aufweisenden Durchgangskanal (26) aufweist, wobei, wenn der Aufsatz (22) mit dem Substrat (10) verbunden ist, wenigstens eine der dem Substrat (10) zugewandten unteren Öffnungen) (30) des wenigstens einen Durchgangskanals (26) des Aufsatzes (22) über einem zentralen hydrophilen Bereich (14) einer Reaktionsstelle (12) derart angeordnet ist, dass in dem wenigstens einen Durchgangskanal (26) befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil des zentralen hydrophilen Bereichs (14) der Reaktionsstelle (12) benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht den diesen umgebenden mittleren hydrophilen Bereich (18) der Reaktionsstelle (12) benetzen kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Substrat (10) wenigstens zwei Reaktionsstellen (12) vorgesehen sind und der Aufsatz (22) wenigstens zwei jeweils eine obere Öffnung (28) sowie eine untere Öffnung (30) aufweisende Durchgangskanäle (26) aufweist, wobei, wenn der Aufsatz (22) mit dem Substrat (10) verbunden ist, die dem Substrat (10) zugewandten Öffnungen (30) der Durchgangskanäle (26) des Aufsatzes (22) über den zentralen hydrophilen Bereichen (14) der Reaktionsstellen (12) derart angeordnet sind, dass in den Durchgangskanälen (26) befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil der zentralen hydrophilen Bereiche (14) der Reaktionsstellen (12) benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht die mittleren hydrophilen Bereiche (18) der Reaktionsstellen (12) benetzen kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Querschnittsform der unteren Öffnungen (30) des wenigstens einen Durchgangskanals (26) der Querschnittsform der zentralen hydrophilen Bereiche (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) entspricht.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Querschnittsfläche der unteren Öffnungen des wenigstens einen Durchgangskanals (26) der Querschnittsfläche des zentralen hydrophilen Bereichs (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) entspricht.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) kreisförmig ausgebildet ist und dieser von einem kreisringförmigen ersten hydrophoben Bereich (16) konzentrisch umgeben ist, welcher außenseitig von einem kreisringförmigen mittleren hydrophilen Bereich (18) konzentrisch umgeben ist.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrophilie der zentralen hydrophilen Bereiche (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) und die Hydrophobie der diese umgebenden ersten hydrophoben Bereiche (16) derart eingestellt sind, dass sich bei Auftrag von weniger gleich 10 μl Wasser auf die Reaktionsstellen (12) ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel von 20 bis 70°, bevorzugt von 30 bis 60° und besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) kreisförmig ausgestaltet ist und einen Durchmesser zwischen 0,1 und 5 mm, bevorzugt zwischen 0,3 und 3 mm und besonders bevorzugt zwischen 1 und 2 mm aufweist.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (10) 2 bis 384, vorzugsweise 24 bis 96, besonders bevorzugt 36 bis 60 und ganz besonders bevorzugt 48 Reaktionsstellen (12) aufweist und der Aufsatz (22) eine der Anzahl der Reaktionsstel len (12) entsprechende Anzahl von Durchgangskanälen (26) aufweist.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (10) 48 Reaktionsstellen (12) aufweist, welche jeweils einen kreisförmigen, zentralen hydrophilen Bereich (14) aufweisen und der Aufsatz (22) 48, im Querschnitt kreisförmige Durchgangs kanäle (26) aufweist, welche den gleichen Durchmesser aufweisen wie die zentralen hydrophilen Bereiche (14), wobei die Durchgangskanäle (26), wenn der Aufsatz (22) mit dem Substrat (10) verbunden ist, genau über den zentralen hydrophilen Bereichen (14) der Reaktionsstellen (12) angeordnet sind.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (10) ein Objektträger aus Glas ist.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) mit einer die Zellanhaftung daran verstärkenden Substanz beschichtet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) mit einer aus der aus Kollagen, Fibronektin, Laminin, Vitronectin, Gelatine, synthetischen Zelladhäsionspeptiden, Basement-Membranmatrizes, polyphenolischen Proteinen, Polylysin, Po lyornithin und beliebigen Kombinationen von zwei oder mehr der vorgenannten Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählten Verbindung beschichtet ist.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufsatz (22) aus Gummi, Polypropylen oder Polycarbonat besteht.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Durchgangskanal (26) ein Innenvolumen von 1 bis 1.000 μl, vorzugsweise von 10 bis 500 μl, besonders bevorzugt von 20 bis 200 μl und ganz besonders bevorzugt von 50 bis 100 μl aufweist.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem wenigstens einen Durchgangskanal (26) des Aufsatzes (22) auf der dem Substrat (10) abgewandten Seite ein Verlängerungsgefäß (32) vorgesehen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Durchgangskanal (26) zusammen mit dem Verlängerungsgefäß (32) ein Innenvolumen von 10 bis 500 μl, bevorzugt von 20 bis 200 μl und besonders bevorzugt von 50 bis 100 μl aufweist.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Substrat (10) ein Klebstoff, vorzugsweise in der Form eines doppelseitigen Klebstoffstreifens (24, 24'), vorgesehen ist, mit dem der Aufsatz (22) mit dem Substrat (10) lösbar verbunden werden kann.
Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Substrat (10) eine Dichtung oder mehrere Dichtungen vorgesehen sind, mit denen der Aufsatz (22) gegenüber dem Substrat (10) abgedichtet werden kann.
Verfahren zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, umfassend die Schritte: a) Verbinden des Aufsatzes (22) mit dem planaren Substrat (10), so dass wenigstens eine der unteren Öffnungen (30) des wenigstens einen Durchgangskanals (26) des Aufsatzes (22) über einem zentralen hydrophilen Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) angeordnet ist, b) Zugabe wenigstens einer Zelle und von Zellkulturmedium in den wenigstens einen Durchgangskanal (26) des Aufsatzes (22), c) Inkubieren der Vorrichtung bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitspanne, um eine Vermehrung der Zellen und eine Anhaftung der Zellen auf den Reaktionsstellen zu erreichen, d) Entnehmen des Zellkulturmediums aus dem wenigstens einen Durchgangskanal (26), e) Entfernen des Aufsatzes (22) von dem Substrat (10) sowie f) Charakterisierung der Zellen auf der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) des Substrats (10) mittels Polymerasekettenreaktion.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Zelle und das Zellkulturmedium in dem Schritt b) in der Form einer Zellsuspension zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Schritt b) zugegebenen Zellen eukaryontische Zellen, vorzugsweise Stammzellen, Primärzellen oder Hybridomazellen sind.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt b) in jeden der Durchgangskanäle (26) jeweils die gleiche Zellsuspension zugegeben wird und in dem Schritt f) auf jeder der Reaktionsstellen (12) eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird, wobei für jede Reaktionsstelle gleiche und/oder unterschiedliche Primerpaare eingesetzt werden.
Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt b) in jeden der Durchgangskanäle (26) jeweils eine andere Zellsuspension zugegeben wird und in dem Schritt f) auf jeder der Reaktionsstellen (12) eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird.