WO2009074245A2 - Vorrichtung und verfahren zur charakterisierung von zellen - Google Patents

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WO2009074245A2
WO2009074245A2 PCT/EP2008/010177 EP2008010177W WO2009074245A2 WO 2009074245 A2 WO2009074245 A2 WO 2009074245A2 EP 2008010177 W EP2008010177 W EP 2008010177W WO 2009074245 A2 WO2009074245 A2 WO 2009074245A2
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attachment
cells
reaction
central hydrophilic
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Marianna Alunni-Fabbroni
Karin GÖRNER
Michael Riepl
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Olympus Life Science Research Europa Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00138—Slides

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for the characterization of cells and in particular for the multiplication of cells and for the subsequent characterization of the cells.
  • Corresponding devices are used in biological and medical research in order to initially multiply cells before they are subsequently characterized, for example, by an enzyme reaction or by an immunoassay.
  • These devices usually comprise a substrate, for example a glass slide, as well as an attachment in which individual separate chambers are provided. After the attachment has been applied to the slide, cell suspension is introduced into the individual chambers and the device is incubated at a suitable temperature until the cells have multiplied sufficiently and adhered to the slide. Subsequently, the liquid medium and the attachment are removed before the individual cell samples can be further examined on the slide.
  • a disadvantage of these known devices is that the individual cell samples can be examined only to a limited extent on the slide. This is because most characterization methods, such as enzymatic reactions or immunoassays, require the addition of fluid to the individual cell samples present on the slide. However, if individual drops of liquid are applied to a glass slide, there is the danger that the individual drops of liquid run together. Therefore, even if only very small amounts of liquid are applied to the slide to characterize the cells, care must be taken. For larger amounts of liquid these devices are in any case unsuitable, which is why characterizations which require such larger amounts of liquid must be carried out in other reaction vessels.
  • this object is achieved by providing a device for characterizing cells, in particular for increasing cells and for subsequent characterization of the cells, which comprises:
  • each of the at least one reaction site comprising a central hydrophilic area surrounded on the outside by a first hydrophobic area, which in turn is surrounded on the outside by a central hydrophilic area which is on the outside of one second hydrophobic area is surrounded, as well
  • An essay which is releasably connectable to the substrate and which has at least one upper opening and a lower opening having passage, wherein, when the attachment is connected to the substrate, at least one of the substrate facing the lower opening (s) of at least a passageway of the attachment is disposed on a central hydrophilic region of a reaction site such that liquid in the at least one passageway can wet at least a portion of the central hydrophilic region of the reaction site
  • Liquid however, can not wet the surrounding central hydrophilic region of the reaction site.
  • the at least one reaction site has a central hydrophilic area which is surrounded on the outside by a first hydrophobic area, which in turn is surrounded on the outside by a central hydrophilic area which is surrounded on the outside by a second hydrophobic area, the task of comparatively large amounts of liquid on the allows at least one reaction site to form adhering to the substrate liquid drops, so that On the reaction sites of the substrate also large quantities of liquid requiring cell characterization can be performed without the need for a transfer of the individual cell samples into a closed reaction vessel or the like.
  • a through-channel is understood to be a cavity which, when the attachment to the substrate is connected from the substrate, extends from the bottom upwards through the attachment, the cavity being open at the top and bottom, but otherwise through one or more side walls is limited.
  • the cavity can assume any cross-sectional shape and can therefore be circular, elliptical, rectangular or square in cross-section, for example.
  • the cross-sectional area of the changing the channel from top to bottom may have a larger cross-sectional area than the lower and upper openings of the passageway.
  • At least two reaction sites are provided on the substrate and the attachment has at least two through-openings each having an upper opening and a lower opening, wherein, when the attachment is connected to the substrate, the openings facing the substrate tions of the through-channels of the attachment are arranged on the central hydrophilic regions of the reaction sites such that liquid located in the through-channels can wet at least a portion of the central hydrophilic regions of the reaction sites, but the liquid can not wet the central hydrophilic regions of the reaction sites.
  • the cross-sectional shape of the lower openings of the at least one passageway of the cap corresponds to the cross-sectional shape of the central hydrophilic areas of the at least one reaction site.
  • the cross-sectional area of the lower openings of the at least one through-channel is equal to or at least substantially equal to the cross-sectional area of the central hydrophilic areas of the at least one reaction site.
  • the lower openings of the passage channels can be arranged accurately over the central hydrophilic regions of the reaction sites, so that on the one hand in the through-channels liquid has contact with the entire surface of the central hydrophilic regions of the reaction sites, but on the other hand reliably prevented
  • the liquid can be mixed with other areas of the body Reaction sites, such as the first hydrophobic areas or the central hydrophilic areas, comes into contact, so that a functional impairment of these other areas of the reaction sites is reliably avoided.
  • the central hydrophilic region of the reaction site or the central hydrophilic regions of the reaction sites are substantially circular and are each concentrically surrounded by a substantially annular first hydrophobic region which is externally of a substantially annular central hydrophilic area is concentrically surrounded.
  • a particularly stable formation of liquid droplets on the reaction sites is achieved if the hydrophilicity of the central hydrophilic areas of the at least one reaction site and the hydrophobicity of the surrounding first hydrophobic areas are adjusted so that when applied by less than 10 .mu.l of water on the Reaction sites a water droplet with a contact angle of 20 to 70 °, preferably from 30 to 60 ° and particularly preferably from 40 to 50 ° forms.
  • the diameter of the central hydrophilic region of the reaction site or the diameter of the central hydrophilic regions of the reaction sites, if these, as is preferred, in are formed substantially circular, between 0, 1 and 5 mm, more preferably between 0.3 and 3 mm and most preferably between 1 and 2 mm.
  • the substrate has 2 to 384, preferably 24 to 96, more preferably 36 to 60 and most preferably 48 reaction sites and the attachment one of the number of reaction sites having corresponding number of passageways.
  • the planar substrate may consist of all materials which give the substrate sufficient rigidity and which withstand the conditions required for the characterization of the cells, in particular a PCR, to be carried out with the substrate.
  • the substrate may be e.g. Made of a variety of plastics or glass.
  • the substrate is a glass slide.
  • the central hydrophilic areas of the reaction sites of the substrate it is possible to use all substances known to the person skilled in the art which promote adhesion of cells to these areas.
  • peptides and components of the extracellular matrix may be mentioned in this context, although other substances may also be used.
  • good results are achieved when the central hydrophilic regions of the reaction sites are coextruded with one of collagen, fibronectin, laminin, lemonotin, gelatin, synthetic cell adhesion peptides, basement membrane matrices, polyphenolic proteins, polylysine, polyornithine, and any combinations of two or more of the aforementioned compounds existing group selected compound are coated.
  • the cell adhesive fibronectin domain and cell adherent laminin may be used 1 domain, wherein an example of a Basement- membrane matrix is from Becton Dickinson commercially displaced persons Matrigel ® and an example of a polyphenolic protein which is commercially marketed by Becton Dickinson Cell Tak® .
  • an antibody specific for certain cells can be immobilized on the central regions of the reaction sites, for example for the selection of cells.
  • Cell mixtures can then be applied to such a reaction site, of which the target cells bind to the antibodies, so that after subsequent washing of the reaction sites on the central regions of the reaction sites, only the target cells to be selected remain.
  • the present invention is not particularly limited.
  • the attachment can be made of any rigid or flexible or elastic material, provided that ensures that the existing of this material essay well on the substrate and from this without
  • Suitable materials are rubber, polypropylene or polycarbonate, rubber being particularly preferred because of its elasticity properties.
  • the through-channel to be filled with the culture medium or the through-channels of the attachment to be filled with the culture medium should have a sufficiently large internal volume, preferably an internal volume of 1 to 1000 ⁇ l , in particular from 10 to 500 .mu.l, more preferably from 20 to 200 ul and most preferably from 50 to 100 ul.
  • This can be achieved, on the one hand, in that the attachment has a sufficient height for a given geometry of the through-channels and for a given cross-sectional area of the through-channels.
  • the through-channel or the through-channels of the attachment have a smaller internal volume than necessary for optimal growth or for optimal propagation of the cells and on the passageway or on the passageways on the side facing away from the substrate one or both a plurality of extension vessels are provided, so that the sum of the inner volume of a through-passage and of the inner volume of a dilation vessel is, for example, 50 to 100 ⁇ l.
  • the attachment is preferably on with an adhesive applied to the substrate, in particular double-sided adhesive strips, such as the commercially sold by the Biolink adhesive tapes, have proven particularly suitable for this purpose.
  • a seal or a plurality of seals can be provided on the substrate, preferably at the junctions from the central hydrophilic regions to the first hydrophobic regions of the reaction sites, with which the attachment can additionally be sealed relative to the substrate.
  • Another object of the present invention is a method for the characterization of cells, in particular for the multiplication of cells and for subsequent characterization of the cells using the device according to the invention described above. According to the invention, this method comprises the following steps:
  • Passageway e) removing the attachment from the substrate, and f) characterizing the cells on the at least one reaction site of the substrate.
  • step f) is performed before steps c), d) and e), between steps c), d) and e) or after steps c), d) and e).
  • the addition of the at least one cell and of cell culture medium into the through-channels of the attachment can be carried out in method step b), for example, by adding the at least one cell and the cell culture medium as a cell suspension into the through-channels.
  • the method is carried out in a device according to the invention, in which at least two reaction sites are provided on the substrate and wherein the attachment has at least two in each case an upper opening and a lower opening having passage channels, wherein, when the attachment is connected to the substrate, the substrate-facing openings of the through-channels of the attachment are arranged on the central hydrophilic regions of the reaction sites such that liquid located in the through-channels at least a part of the central hydrophilic regions of the reaction can wet, but the liquid can not wet the central hydrophilic areas of the reaction sites.
  • the characterization of the cells according to method step f) can be, for example, any examination which allows conclusions to be drawn regarding the genotype or the phenotype of the cells examined.
  • a PCR, an RT-PCR or an in situ analysis of protein, preferably an immunofluorescence analysis, as a characterization method is suitable for the method according to the invention.
  • Other examples are GFP ("green fluorescence protein", green fluorescent protein) -
  • the characterization may also include checking if the cells have transfected.
  • the cells can be transfected during the process, for example after process step b) or during process step c), before they are incubated according to process step c) and investigated after process step c) with respect to the transfection efficiency.
  • Suitable transfection onsstoff are for example the products commercialized fu Gene ⁇ (Roche), Lipofectamine (Invinc trogen) and Effectene ® (Qiagen).
  • the cells can be transfected stably, ie they must be selected with a selection marker and propagated.
  • the individual characterizations can also be combined with one another, for example by carrying out a GFP with cells present on individual reaction sites of a substrate, whereas, for example, the cells present on the other reaction sites of the same substrate are subjected to a PCR.
  • the inventive method is not limited. Accordingly, all prokaryotic and eukaryotic cells can be used, the method according to the invention being suitable in particular for eukaryotic cells, such as stem cells, primary cells, hybridoma cells (for the selection of monoclonal antibodies) or embryonic stem cells (for example for the generation of transgenic mice). , suitable.
  • the same cell suspension can be added to each of the through-channels in method step b) and in each of the reaction sites a PCR is carried out in method step f), wherein identical and / or different primer pairs are used for each reaction site. It is also possible in method step b) to add a different cell suspension to each of the through-channels and to carry out a PCR on each of the reaction sites in step f). Of course, it is also possible to add in each of the through-channels the same cell suspension and to add other cell suspensions into other through-channels of the same attachment.
  • FIG. 1a is a plan view of a substrate of the device according to the invention according to an embodiment of the present invention
  • Fig. Ib a reaction point of the substrate shown in Fig. Ia
  • Fig. 2 is a longitudinal section of a device according to the invention according to a first embodiment of the present invention
  • Fig. 3 is a longitudinal section of a device according to the invention according to a second embodiment of the present invention.
  • the substrate 10 shown in FIG. 1 a is a glass slide designed in a rectangular manner and has a total of 48 reaction sites 12, which are distributed over 4 mutually arranged rows each having 12 reaction sites 12.
  • each reaction site 12 has a central, circularly configured hydrophilic area 14.
  • This central hydrophilic region 14 is surrounded on the outside concentrically by an annular first hydrophobic region 16, which in turn is surrounded on the outside by an annular central hydrophilic region 18 concentrically.
  • the middle hydrophilic region 18 is surrounded on the outside by a second hydrophobic region 20.
  • This second hydrophobic region 20 need not be a concentric ring, as shown in FIG. 1b, but may be the entire surface of the substrate.
  • the central hydrophilic regions 14 are coated with a cell adhesion enhancing substance, for example collagen.
  • the device according to the invention shown in longitudinal section in FIG. 2 according to a first exemplary embodiment of the present invention, comprises a glass slide as substrate 10 corresponding to the slide shown in FIG. 1a, and an attachment 22, rather on the substrate 10 via double-sided adhesive strips 24, 24 ' bar is attached.
  • the attachment 22 has 48 hollow-cylindrical through-channels 26 which each have an upper circular opening 28 and a lower circular opening 30, wherein in each case 12 through-channels 26 (of which only eight are shown in FIG. 2) are arranged in 4 rows.
  • Passage channels 26 each have the same diameter as the circular central hydrophilic regions 14 on the substrate 10.
  • the cap 22 is positioned on the substrate 10 such that the bottom openings 30 of the through channels 26 are each positioned exactly over the central hydrophilic areas 14 of the substrate 10.
  • a cell suspension of, for example, eukaryotic cells in a suitable cell culture medium is introduced into the individual passageways 26 and the filled device is incubated at 37 ° C. for 24 hours, for example, to allow an increase of the cells in the individual passageways 26 adhere to the central hydrophilic regions 14 of the reaction sites 12 of the substrate 10.
  • the cell culture media are withdrawn from the individual passageways 26, for example with a pipette, and the attachment 22 is removed from the substrate 10.
  • the individual cell-grown reaction sites 12 of the substrate 10 are then each pipetted with PCR liquid (for example 1 ⁇ l) containing the PCR primers, PCR buffer and polymerase, and the liquid droplets that form are each oiled (for example 5 ⁇ l). Subsequently, the substrate is transferred to a thermal cycler (not shown) and subjected to PCR.
  • PCR liquid for example 1 ⁇ l
  • PCR buffer and polymerase for example 5 ⁇ l
  • the device shown in Fig. 3 differs from that shown in FIG. 2 in that on each of the upper openings 28 of the passageways 26, an extension vessel 32 is arranged.
  • an extension vessel 32 is arranged at each that of the extension vessels 32 at each that of the extension vessels 32.
  • a hollow cylindrical vessel having a larger diameter than that of the passageways 26, wherein at the lower end of the extension vessel 32, a fitting into the upper openings 28 of the passageways 26 adapter is provided.
  • HEK cells human embryonic kidney cells
  • FCS fetal calf serum
  • DMEM medium containing antibiotics Gibco, Invitrogen
  • a PCR was carried out with the substrate.
  • primer pairs and Taq polymerase-containing PCR solution were applied to the dried, cell-covered reaction sites before the forming liquid drops were each overlaid with 5 .mu.l of oil to the evaporation of the PCR prevent liquid phase.
  • the Substrate transferred to a thermal cycler and subjected to a PCR. After completion of the PCR, the individual reaction products were examined on a polyacrylamide gel.

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Abstract

Eine Vorrichtung zur Charakterisierung von Zellen, insbesondere zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen, umfasst: ein planares Substrat, auf dem wenigstens eine Reaktionsstelle vorgesehen ist, wobei jede der wenigstens einen Reaktionsstelle einen zentralen hydrophilen Bereich umfasst, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist, sowie einen Aufsatz, welcher mit dem Substrat lösbar verbindbar ist und welcher wenigstens einen eine obere Öffnung sowie eine untere Öffnung aufweisenden Durchgangskanal aufweist, wobei, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, wenigstens eine der dem Substrat zugewandten unteren Öffnung(en) des wenigstens einen Durchgangskanals des Aufsatzes auf einem zentralen hydrophilen Bereich einer Reaktionsstelle derart angeordnet ist, dass in dem wenigstens einen Durchgangskanal befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil des zentralen hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht den diesen umgebenden mittleren hydrophilen Bereich der Reaktionsstelle benetzen kann.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Charakterisierung von Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Charakterisierung von Zellen und insbesondere zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen.
Entsprechende Vorrichtungen werden in der biologischen und medizinischen Forschung eingesetzt, um Zellen zunächst zu vermehren, bevor diese anschließend beispielsweise durch eine Enzymreaktion oder durch einen Immunoassay charakterisiert werden. Diese Vorrichtungen umfassen üblicherweise ein Substrat, beispielsweise einen Objektträger aus Glas, sowie einen Aufsatz, in dem einzelne voneinander getrennte Kammern vorgesehen sind. Nachdem der Aufsatz auf den Objektträger aufge- bracht worden ist, wird in die einzelnen Kammern Zellsuspension eingefüllt und die Vorrichtung solange bei einer geeigneten Temperatur inkubiert, bis sich die Zellen ausreichend vermehrt und an den Objektträger angehaftet haben. Anschließend werden das flüssige Medium sowie der Aufsatz entfernt, bevor die einzelnen Zellproben auf dem Objektträger weiter untersucht werden können.
Ein Nachteil dieser bekannten Vorrichtungen liegt jedoch darin, dass die einzelnen Zellproben, nur in begrenztem Umfang auf dem Objektträger untersucht werden können. Dies liegt daran, dass die meisten Charakteri- sierungsverfahren, wie beispielsweise enzymatische Reaktionen oder Im- munoassays, die Zugabe von Flüssigkeit auf die einzelnen, auf dem Objektträger vorliegenden Zellproben erfordern. Werden allerdings einzelne Flüssigkeitstropfen auf einen Objektträger aus Glas aufgebracht, besteht die Gefahr, dass die einzelnen Flüssigkeitstropfen miteinander verlaufen. Daher muss, selbst wenn zur Charakterisierung der Zellen nur sehr geringe Flüssigkeitsmengen auf den Objektträger aufgebracht werden, sehr vorsichtig gearbeitet werden. Für größere Flüssigkeitsmengen sind diese Vorrichtungen ohnehin ungeeignet, weswegen Charakterisierungen, welche solche größeren Flüssigkeitsmengen erfordern, in anderen Reaktionsgefäßen durchgeführt werden müssen. Zudem kann mit diesen bekannten Vorrichtungen keine PCR ("polymerase chain reaction", Polymeraseketten- reaktion) durchgeführt werden, so dass auch in diesem Fall die Charakte- risierung in anderen Reaktionsgefäßen durchgeführt werden muss. Dies erfordert eine Überführung der einzelnen Zellproben von dem Objektträger in Reaktionsgefäße, was zusätzliches Material erfordert und sowohl zeit- als auch kostenintensiv ist. Zudem übt die Überführung auf die einzelnen Zellen Stress aus, der wiederum z.B. die Expression einzelner Gene in den Zellen beeinflussen und so das spätere Charakterisierungsergebnis verfälschen kann. Daher werden die bisher bekannten Vorrichtungen oftmals als unbefriedigend empfunden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung einer Vor- richtung zur Charakterisierung von Zellen, insbesondere zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen, mit der vorzugsweise mehrere Zellproben auf einem Substrat gleichzeitig vermehrt werden können und die einzelnen Zellproben anschließend auf diesem Substrat, auch unter Einsatz einer PCR oder von anderen, vergleichsweise große Flüssigkeitsmengen erfordernden Verfahren, bei einfacher Handhabung charakterisiert werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Bereitstellung einer Vorrichtung zur Charakterisierung von Zellen, insbesondere zur Vermeh- rung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen, welche umfasst:
- ein planares Substrat, auf dem wenigstens eine Reaktionsstelle vorgesehen ist, wobei jede der wenigstens einen Reaktionsstelle einen zentralen hydrophilen Bereich umfasst, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist, sowie
- einen Aufsatz, welcher mit dem Substrat lösbar verbindbar ist und welcher wenigstens einen eine obere Öffnung sowie eine untere Öffnung aufweisenden Durchgangskanal aufweist, wobei, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, wenigstens eine der dem Substrat zugewandten unteren Öffnung(en) des wenigstens einen Durchgangskanals des Aufsatzes auf einem zentralen hydrophilen Bereich einer Reaktionsstelle derart angeordnet ist, dass in dem wenigstens einen Durchgangskanal befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil des zentralen hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle benetzen kann, die
Flüssigkeit jedoch nicht den diesen umgebenden mittleren hydrophilen Bereich der Reaktionsstelle benetzen kann.
Indem die wenigstens eine Reaktionsstelle einen zentralen hydrophilen Bereich aufweist, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist, wird die Aufgabe vergleichsweise großer Flüssigkeitsmengen auf die wenigstens eine Reaktionsstelle unter Ausbildung von an dem Substrat fest haftenden Flüssigkeitstropfen ermöglicht, so dass auf den Reaktionsstellen des Substrats auch große Flüssigkeitsmengen erfordernde Zellcharakterisierungen durchgeführt werden können, ohne dass eine Überführung der einzelnen Zellproben in ein geschlossenes Reaktionsgefäß oder dergleichen erforderlich ist. Dadurch werden zum einen arbeite- und zeitaufwendige Transfer schritte vermieden und ferner wird es dadurch ermöglicht, dass auf dem Substrat mehrere Proben parallel aufbereitet werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass sich die räumlich eng beieinander liegenden Flüssigkeitstropfen bei geringfügigen Erschütterungen oder aufgrund des Verlaufene von Flüssigkeitstropfen infolge zu hohen Tropfenvolumens miteinander vermischen. Desweiteren wird durch die vorgenannte Ausbildung der Reaktionsstellen erreicht, dass einzelne auf den Reaktionsstellen befindliche Flüssigkeitstropfen mit Öltropfen stabil überschichtet werden können, ohne dass die Flüssigkeit verläuft, so dass mit dem Substrat mit den auf den Reaktionsstellen abge- legten Zellproben auch eine PCR durchgeführt werden kann. Schließlich ermöglicht die erfindungsgemäße Positionierung des Aufsatzes auf dem Substrat, dass die mittleren hydrophilen Bereiche der einzelnen Reaktionsstellen nicht mit in den Durchgangskanälen des Aufsatzes befindlicher Flüssigkeit in Kontakt kommen, so dass eine Zerstörung oder anderweiti- ge Funktionsbeeinträchtigung der mittleren hydrophilen Bereiche bei der Verwendung der Vorrichtung zuverlässig vermieden wird.
Unter einem Durchgangskanal wird im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Hohlraum verstanden, welcher sich, bei Verbindung des Aufsatzes mit dem Substrat von dem Substrat aus gesehen, von unten nach oben durch den Aufsatz erstreckt, wobei der Hohlraum oben und unten offen ist, aber ansonsten durch eine oder mehrere Seitenwände begrenzt ist. Dabei kann der Hohlraum jede beliebige Querschnittsform annehmen und kann mithin beispielsweise im Querschnitt kreisrund, elliptisch, rechteckig oder quadratisch sein. Zudem kann sich die Querschnittsfläche des Durch- gangskanals von oben nach unten verändern; beispielsweise kann der Hohlraum in dem Aufsatz eine größere Querschnittsfläche aufweisen als die untere und die obere Öffnung des Durchgangskanals.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind auf dem Substrat wenigstens zwei Reaktionsstellen vorgesehen und der Aufsatz weist wenigstens zwei jeweils eine obere Öffnung sowie eine untere Öffnung aufweisende Durchgangskanäle auf, wobei, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, die dem Substrat zugewandten Öff- nungen der Durchgangskanäle des Aufsatzes auf den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen derart angeordnet sind, dass in den Durchgangskanälen befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht die mittleren hydrophilen Bereiche der Reaktionsstel- len benetzen kann.
Vorzugsweise entspricht die Querschnittsform der unteren Öffnungen des wenigstens einen Durchgangskanals des Aufsatzes der Querschnittsform der zentralen hydrophilen Bereiche der wenigstens einen Reaktionsstelle. Zudem ist es bevorzugt, dass die Querschnittsfläche der unteren Öffnungen des wenigstens einen Durchgangskanals gleich oder zumindest im Wesentlichen gleich groß wie die Querschnittsfläche der zentralen hydrophilen Bereiche der wenigstens einen Reaktionsstelle ist. Dadurch wird erreicht, dass die unteren Öffnungen der Durchgangskanäle passge- nau über den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen angeordnet werden können, so dass einerseits in den Durchgangskanälen befindliche Flüssigkeit Kontakt mit der gesamten Fläche der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen hat, andererseits jedoch zuverlässig verhindert werden kann, dass die Flüssigkeit außer mit den zentra- len hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen mit anderen Bereichen der Reaktionsstellen, wie den ersten hydrophoben Bereichen oder den mittleren hydrophilen Bereichen, in Berührung kommt, so dass eine Funktionsbeeinträchtigung dieser anderen Bereiche der Reaktionsstellen zuverlässig vermieden wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der zentralen hydrophile Bereich der Reaktionsstelle bzw. sind die zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen im Wesentlichen kreisförmig ausgebildet und sind jeweils von einem im Wesentlichen kreisringförmigen ersten hydrophoben Bereich konzentrisch umgeben, welcher außenseitig von einem im Wesentlichen kreisringförmigen mittleren hydrophilen Bereich konzentrisch umgeben ist.
Eine besonders stabile Ausbildung von Flüssigkeitstropfen auf den Reak- tionsstellen wird erreicht, wenn die Hydrophilie der zentralen hydrophilen Bereiche der wenigstens einen Reaktionsstelle und die Hydrophobie der diese umgebenden ersten hydrophoben Bereiche derart eingestellt sind, dass sich bei Auftrag von weniger gleich 10 μl Wasser auf die Reaktionsstellen ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel von 20 bis 70°, bevor- zugt von 30 bis 60° und besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet.
Dadurch wird gewährleistet, dass sich auf den Reaktionsstellen des Substrats stabile Flüssigkeitstropfen ausbilden, die fest an den Reaktionsstellen haften, so dass sich die Flüssigkeitstropfen nicht schon bei geringsten Vibrationen des Substrats, wie diese etwa beim Transport des Substrats beispielsweise innerhalb eines Labors vorkommen, von dem Substrat lösen oder auf dem Substrat verlaufen.
Vorzugsweise beträgt der Durchmesser des zentralen hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle bzw. der Durchmesser der zentralen hydrophi- len Bereiche der Reaktionsstellen, sofern diese, wie dies bevorzugt ist, im Wesentlichen kreisförmig ausgestaltet sind, zwischen 0, 1 und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 0,3 und 3 mm und ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 2 mm.
Um das parallele Aufbereiten einer Vielzahl von Proben zu ermöglichen, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, dass das Substrat 2 bis 384, vorzugsweise 24 bis 96, besonders bevorzugt 36 bis 60 und ganz besonders bevorzugt 48 Reaktionsstellen aufweist und der Aufsatz eine der Anzahl der Reaktionsstellen entsprechende Anzahl von Durchgangskanälen aufweist.
Besonders gute Ergebnisse werden beispielsweise erreicht, wenn das Substrat 48 Reaktionsstellen aufweist, welche jeweils einen kreisförmigen, zentralen hydrophilen Bereich aufweisen, und der Aufsatz 48, im Quer- schnitt kreisförmige Durchgangskanäle aufweist, welche den gleichen
Durchmesser aufweisen wie die zentralen hydrophilen Bereiche, wobei die Durchgangskanäle, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, genau über den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen angeordnet sind.
Grundsätzlich kann das planare Substrat aus allen Materialien bestehen, welche dem Substrat eine ausreichende Steifheit verleihen und welche den für die mit dem Substrat vorzunehmende Charakterisierung der Zellen, insbesondere einer PCR, erforderlichen Bedingungen standhalten. Dem- nach kann das Substrat z.B. aus einer Vielzahl von Kunststoffen oder aus Glas bestehen. Vorzugsweise ist das Substrat ein Objektträger aus Glas.
Um eine gute Zellanhaftung an den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen zu gewährleisten, wird in Weiterbildung des Erfindungs- gedankens vorgeschlagen, die zentralen hydrophilen Bereiche der wenigs- tens einen Reaktionsstelle mit einer die Zellanhaftung daran verstärkenden Substanz zu beschichten.
Zur Beschichtung der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen des Substrats können alle dem Fachmann bekannten Substanzen eingesetzt werden, welche eine Anhaftung von Zellen auf diesen Bereichen fördern. Lediglich beispielsweise seien in diesem Zusammenhang Peptide und Komponenten der extrazellulären Matrix genannt, wobei jedoch auch andere Substanzen eingesetzt werden können. Gute Ergebnisse werden insbesondere erzielt, wenn die zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen mit einer aus der aus Kollagen, Fibronektin, Laminin, Vitronec- tin, Gelatine, synthetischen Zelladhäsionspeptiden, Basement- Membranmatrizes, polyphenolischen Proteinen, Polylysin, Polyornithin und beliebigen Kombinationen von zwei oder mehr der vorgenannten Ver- bindungen bestehenden Gruppe ausgewählten Verbindung beschichtet sind. Als synthetischen Zelladhäsionspeptide können beispielsweise RGD, die zellanhaftende Fibronektin-Domäne und die zellanhaftende Laminin 1 -Domäne eingesetzt werden, wobei ein Beispiel für eine Basement- Membranmatrix das von der Firma Becton Dickinson kommerziell vertrie- bene Matrigel® ist und ein Beispiel für ein polyphenolisches Protein das von der Firma Becton Dickinson kommerziell vertriebene Cell Tak® ist.
Alternativ dazu kann auf den zentralen Bereichen der Reaktionsstellen beispielsweise zur Selektion von Zellen ein für bestimmte Zellen selektiver Antikörper immobilisiert werden. Auf eine solche Reaktionsstelle können dann Zellgemische aufgegeben werden, von denen die Zielzellen an die Antikörper binden, so dass nach anschließendem Waschen der Reaktionsstellen auf den zentralen Bereichen der Reaktionsstellen nur die zu selektierenden Zielzellen verbleiben. Auch bezüglich des Materials, aus dem der Aufsatz besteht, ist die vorliegende Erfindung nicht besonders limitiert. Insbesondere kann der Aufsatz aus jedem beliebigen steifen oder flexiblen bzw. elastischen Material bestehen, sofern dieses gewährleistet, dass der aus diesem Material beste- hende Aufsatz gut auf das Substrat aufgebracht und von diesem ohne
Beschädigung der Reaktionsstellen wieder entfernt werden kann. Beispiele für geeignete Materialien sind Gummi, Polypropylen oder Polycarbonat, wobei Gummi aufgrund seiner Elastizitätseigenschaften besonders bevorzugt ist.
Um ein gutes Wachstum bzw. eine gute Vermehrung der Zellen in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu ermöglichen, sollten der mit dem Kultivierungsmedium zu befüllende Durchgangskanal bzw. die mit dem Kultivierungsmedium zu befüllenden Durchgangskanäle des Aufsatzes ein hinreichend großes Innenvolumen, vorzugsweise ein Innenvolumen von 1 bis 1.000 μl, insbesondere von 10 bis 500 μl, besonders bevorzugt von 20 bis 200 μl und ganz besonders bevorzugt von 50 bis 100 μl aufweisen. Dies kann zum einen dadurch erreicht werden, dass der Aufsatz bei einer vorgegebenen Geometrie der Durchgangskanäle und bei einer vorgegebe- nen Querschnittsfläche der Durchgangskanäle eine hinreichende Höhe aufweist.
Alternativ dazu ist es auch möglich, dass der Durchgangskanal bzw. die Durchgangskanäle des Aufsatzes ein geringeres Innenvolumen als zum optimalen Wachstum bzw. zur optimalen Vermehrung der Zellen erforderlich aufweisen und auf dem Durchgangskanal bzw. auf den Durchgangskanälen auf der dem Substrat abgewandten Seite jeweils ein oder mehrere Verlängerungsgefäße vorgesehen sind, so dass die Summe des Innenvolumens eines Durchgangskanals und des Innenvolumens eines Verlänge- rungsgefäßes beispielsweise 50 bis 100 μl beträgt. Um einerseits eine lösbare Verbindung des Aufsatzes mit dem Substrat zu ermöglichen und andererseits einen Übertritt von in den Durchgangskanälen befindlicher Flüssigkeit von den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen zu den ersten hydrophoben Bereichen und den mittleren hydrophilen Bereichen zu verhindern, wird der Aufsatz vorzugsweise mit einem Klebstoff auf das Substrat aufgebracht, wobei sich für diesen Zweck insbesondere doppelseitige Klebstoffstreifen, wie die von der Fima Biolink kommerziell vertriebenen Klebebänder, als besonders geeignet erwiesen haben.
Zudem können auf dem Substrat, vorzugsweise an den Übergängen von den zentralen hydrophilen Bereichen zu den ersten hydrophoben Bereichen der Reaktionsstellen, eine Dichtung oder mehrere Dichtungen vorge- sehen sein, mit denen der Aufsatz gegenüber dem Substrat zusätzlich abgedichtet werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Charakterisierung von Zellen, insbesondere zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen unter Verwendung der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung. Erfindungsgemäß umfasst dieses Verfahren die nachfolgenden Schritte:
a) Verbinden des Aufsatzes mit dem planaren Substrat, so dass we- nigstens eine der unteren Öffnungen des wenigstens einen Durchgangskanals des Aufsatzes über einem zentralen hydrophilen Bereich der wenigstens einen Reaktionsstelle angeordnet ist, b) Zugabe wenigstens einer Zelle und von Zellkulturmedium in den wenigstens einen Durchgangskanal des Aufsatzes, c) Inkubieren der Vorrichtung bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitspanne, um eine Vermehrung der Zellen und/ oder eine Anhaftung der Zellen auf den Reaktionsstellen zu erreichen, d) Entnehmen des Zellkulturmediums aus dem wenigstens einen
Durchgangskanal, e) Entfernen des Aufsatzes von dem Substrat sowie f) Charakterisierung der Zellen auf der wenigstens einen Reaktionsstelle des Substrats.
Vorzugsweise wird der Schritt f) vor den Schritten c), d) und e), zwischen den Schritten c), d) und e) oder nach den Schritten c), d) und e) durchgeführt.
Die Zugabe der wenigstens einen Zelle und von Zellkulturmedium in die Durchgangskanäle des Aufsatzes kann in dem Verfahrensschritt b) beispielsweise dadurch erfolgen, dass die wenigstens eine Zelle und das Zellkulturmedium als Zellsuspension in die Durchgangskanäle gegeben werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt, bei der auf dem Substrat wenigstens zwei Reaktionsstellen vorgesehen sind und bei welcher der Aufsatz wenigstens zwei jeweils eine obere Öffnung sowie eine untere Öffnung aufweisende Durchgangskanäle aufweist, wobei, wenn der Aufsatz mit dem Substrat verbunden ist, die dem Substrat zugewandten Öffnungen der Durchgangskanäle des Aufsatzes auf den zentralen hydrophilen Bereichen der Reaktionsstellen derart angeordnet sind, dass in den Durchgangskanälen befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil der zentralen hydrophilen Bereiche der Reaktions- stellen benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht die mittleren hydrophilen Bereiche der Reaktionsstellen benetzen kann.
Die Charakterisierung der Zellen gemäß dem Verfahrensschritt f) kann beispielsweise jede Untersuchung sein, welche Rückschlüsse auf den Genotyp oder den Phänotyp der untersuchten Zellen zulässt. Insbesondere eignet sich für das erfindungsgemäße Verfahren eine PCR, eine RT-PCR oder eine in situ Analyse von Protein, vorzugsweise eine Immunofluores- zenzanalyse, als Charakterisierungsmethode. Andere Beispiele hierfür sind GFP ("green fluorescence protein"; grünes Fluoreszenzprotein) -
Analyse oder die beispielsweise mikroskopische Untersuchung der Anzahl und der Vitalität der Zellen, wobei nach diesen beiden Charakterisierungen optional jeweils eine PCR durchgeführt werden kann. Ferner kann die Charakterisierung auch die Überprüfung umfassen, ob bei den Zellen eine Transfektion stattgefunden hat. Zu diesem Zweck können die Zellen während des Verfahrens, beispielsweise nach dem Verfahrensschritt b) oder während des Verfahrensschritts c), transfiziert werden, bevor diese gemäß dem Verfahrensschritt c) inkubiert und nach dem Verfahrensschritt c) bzgl. der Transfektionseffizienz untersucht werden. Geeignete Transfekti- onsmittel sind beispielsweise die kommerziell vertriebenen Produkte Fu- Geneό (Roche), Lipofectamine (Invi trogen) und Effectene® (Qiagen). Alternativ dazu können die Zellen stabil transfiziert werden, d.h. diese müssen mit einem Selektionsmarker selektiert und vermehrt werden. Die einzelnen Charakterisierungen können auch miteinander kombiniert werden, indem beispielsweise mit auf einzelnen Reaktionsstellen eines Substrats vorliegenden Zellen eine GFP durchgeführt wird, wohingegen beispielsweise die auf den anderen Reaktionsstellen desselben Substrats vorliegenden Zellen einer PCR unterworfen werden. Auch bezüglich der eingesetzten Zellen ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht limitiert. Demnach können alle prokaryontischen und eukaryon- tischen Zellen eingesetzt werden, wobei sich das erfϊndungsgemäße Verfahren insbesondere für eukaryontische Zellen, wie Stammzellen, Primär- zellen, Hybridomazellen (zur Selektion monoklonaler Antikörper) oder embryonale Stammzellen (beispielsweise für die Erzeugung von transge- nen Mäusen), eignet.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in dem Verfahrensschritt b) in jeden der Durchgangskanäle jeweils die gleiche Zellsuspension zugegeben werden und in dem Verfahrensschritt f) auf jeder der Reaktionsstellen eine PCR durchgeführt werden, wobei für jede Reaktionsstelle gleiche und/ oder unterschiedliche Primerpaare eingesetzt werden. Ebenso ist es möglich in dem Verfahrensschritt b) in jeden der Durchgangskanäle jeweils eine andere Zellsuspension zuzugeben und in dem Schritt f) auf jeder der Reaktionsstellen eine PCR durchzuführen. Selbstverständlich ist es auch möglich, in einige der Durchgangskanäle jeweils die gleiche Zellsuspension zuzugeben und in andere Durchgangskanäle desselben Aufsatzes andere Zellsuspensionen zuzugeben.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung rein beispielhaft anhand vorteilhafter Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Dabei zeigen:
Fig. Ia eine Draufsicht eines Substrats der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß eines Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, Fig. Ib eine Reaktionsstelle des in der Fig. Ia gezeigten Substrats, Fig. 2 einen Längsschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß eines ersten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung und
Fig. 3 einen Längsschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß eines zweiten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung.
Das in der Fig. Ia dargestellte Substrat 10 ist ein rechteckig ausgebildeter Glasobjektträger und weist insgesamt 48 Reaktionsstellen 12 auf, welche auf 4 untereinander angeordnete Reihen mit jeweils 12 Reaktionsstellen 12 verteilt sind.
Wie in der Fig. Ib zu erkennen ist, weist jede Reaktionsstelle 12 einen zentralen, kreisförmig ausgestalteten hydrophilen Bereich 14 auf. Dieser zentrale hydrophile Bereich 14 ist außenseitig konzentrisch von einem kreisringförmigen ersten hydrophoben Bereich 16 umgeben, welcher wiederum außenseitig von einem kreisringförmigen mittleren hydrophilen Bereich 18 konzentrisch umgeben ist. Schließlich ist der mittlere hydrophile Bereich 18 außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich 20 umgeben. Dieser zweite hydrophobe Bereich 20 muss kein kon- zentrischer Ring sein, wie in der Fig. Ib dargestellt, sondern kann die gesamte Fläche des Substrats ausmachen.
Die zentralen hydrophilen Bereiche 14 sind mit einer die Zellanhaftung daran verstärkenden Substanz, beispielsweise Kollagen, beschichtet.
Die in der Fig. 2 im Längsschnitt dargestellte erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß eines ersten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung umfasst einen dem in der Fig. Ia dargestellten Objektträger entsprechenden Objektträger aus Glas als Substrat 10 sowie einen Aufsatz 22, wel- eher auf dem Substrat 10 über doppelseitige Klebstoffstreifen 24, 24' lös- bar befestigt ist. Dabei weist der Aufsatz 22 48 hohlzylindrische Durchgangskanäle 26 auf, welche jeweils eine obere kreisrunde Öffnung 28 und eine untere kreisrunde Öffnung 30 aufweisen, wobei jeweils 12 Durchgangskanäle 26 (von denen in der Fig. 2 nur acht dargestellt sind) in 4 Reihen angeordnet sind. Dabei weisen die unteren Öffnungen 30 der
Durchgangskanäle 26 jeweils den gleichen Durchmesser wie die kreisrunden zentralen hydrophilen Bereiche 14 auf dem Substrat 10 auf. Der Aufsatz 22 ist so auf dem Substrat 10 positioniert, dass die unteren Öffnungen 30 der Durchgangskanäle 26 jeweils exakt über den zentralen hydrophilen Bereichen 14 des Substrats 10 positioniert sind.
Beim Betrieb der Vorrichtung wird eine Zellsuspension aus beispielsweise eukaryontischen Zellen in einem geeigneten Zellkulturmedium in die einzelnen Durchgangskanäle 26 eingefüllt und wird die befüllte Vorrichtung beispielsweise für 24 Stunden bei 37 0C inkubiert, um eine Vermehrung der Zellen in den einzelnen Durchgangskanälen 26 zu ermöglichen, welche sich an den zentralen hydrophilen Bereichen 14 der Reaktionsstellen 12 des Substrats 10 anhaften. Nach Abschluss der Inkubation werden die Zellkulturmedien aus den einzelnen Durchgangskanälen 26 beispielsweise mit einer Pipette abgezogen und wird der Aufsatz 22 von dem Substrat 10 entfernt. Auf die einzelnen mit Zellen bewachsenen Reaktionsstellen 12 des Substrats 10 werden dann jeweils PCR-Flüssigkeit (beispielsweise 1 μl), welche die PCR-Primer, PCR-Puffer und Polymerase enthält, pipettiert und die sich bildenden Flüssigkeitstropfen werden jeweils mit Öl (bei- spielsweise 5 μl) überschichtet. Anschließend wird das Substrat auf einen Thermocycler (nicht dargestellt) transferiert und einer PCR unterworfen.
Die in der Fig. 3 dargestellte Vorrichtung unterscheidet sich von der in der Fig. 2 dargestellten dadurch, dass auf jeder der oberen Öffnungen 28 der Durchgangskanäle 26 ein Verlängerungsgefäß 32 angeordnet ist. Bei je- dem der Verlängerungsgefäße 32 handelt es sich um ein hohlzylindrisches Gefäß mit einem größeren Durchmesser als dem der Durchgangskanäle 26, wobei an dem unteren Ende des Verlängerungsgefäßes 32 ein in die oberen Öffnungen 28 der Durchgangskanäle 26 passender Adapter vorge- sehen ist.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand eines diese erläuternden, aber nicht einschränkenden Beispiels erläutert.
Beispiel
In einer der in der Fig. 2 dargestellten Vorrichtung entsprechenden Vorrichtung wurden jeweils 50.000 bis 100.000 HEK-Zellen (humane embryonale Nierenzellen) in einer Zellsuspension aus FCS (fötales Kälberserum) und Antibiotika enthaltendem DMEM Medium (Gibco, Invitrogen) über die Durchgangskanäle des Aufsatzes auf jeweils eine Reaktionsstelle des Substrats aufgebracht. Anschließend wurde die Vorrichtung in einem Inkubator für 24 Stunden bei 37 0C in einer 5 % CO2 enthaltenden Atmosphäre inkubiert, wonach die Zellen ausreichend konfluent waren. Danach wurde das Zellkulturmedium aus den Durchgangskanälen abgezogen, das Substrat anschließend zweimal mit lxPBS-Lösung gewaschen und der Aufsatz von dem Substrat entfernt, bevor die Reaktionsstellen schließlich getrocknet wurden.
Nachfolgend wurde mit dem Substrat eine PCR durchgeführt. Hierzu wurden zunächst auf die getrockneten, mit Zellen bewachsenen Reaktionsstellen jeweils 1 μl einer PCR-Puffer, Primerpaare und Taq-Polymerase enthaltenden PCR-Lösung aufgegeben, bevor die sich bildenden Flüssigkeitstropfen jeweils mit 5 μl Öl überschichtet wurden, um bei der PCR eine Verdampfung der flüssigen Phase zu verhindern. Anschließend wurde das Substrat auf einen Thermocycler überführt und einer PCR unterworfen. Nach Abschluss der PCR wurden die einzelnen Reaktionsprodukte auf einem Polyacrylamidgel untersucht.
Alle PCR-Reaktionen ergaben die gewünschten Amplifikationsprodukte. Insbesondere fand keine Kontamination einzelner Proben mit auf benachbarten Reaktionsstellen abgelegten Zellen statt.
Bezugszeichenliste:
10 Substrat 12 Reaktionsstelle
14 zentraler hydrophiler Bereich
16 erster hydrophober Bereich
18 mittlerer hydrophiler Bereich
20 zweiter hydrophober Bereich 22 Aufsatz
24, 24' doppelseitiger Klebstoffstreifen
26 Durchgangskanal
28 obere Öffnung des Durchgangskanals
30 untere Öffnung des Durchgangskanals 32 Verlängerungsgefäß

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Charakterisierung von Zellen, insbesondere zur
Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen, umfassend:
- ein planares Substrat (10), auf dem wenigstens eine Reaktionsstelle (12) vorgesehen ist, wobei jede der wenigstens einen Reak- tionsstelle (12) einen zentralen hydrophilen Bereich (14) umfasst, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich (16) umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich (18) umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich (20) umgeben ist, sowie - einen Aufsatz (22), welcher mit dem Substrat (10) lösbar verbindbar ist und welcher wenigstens einen eine obere Öffnung (28) sowie eine untere Öffnung (30) aufweisenden Durchgangskanal (26) aufweist, wobei, wenn der Aufsatz (22) mit dem Substrat (10) verbunden ist, wenigstens eine der dem Substrat (10) zugewandten unteren Öffnung(en) (30) des wenigstens einen
Durchgangskanals (26) des Aufsatzes (22) auf einem zentralen hydrophilen Bereich (14) einer Reaktionsstelle (12) derart angeordnet ist, dass in dem wenigstens einen Durchgangskanal (26) befindliche Flüssigkeit zumindest einen Teil des zentralen hydrophilen Bereichs (14) der Reaktionsstelle (12) benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht den diesen umgebenden mittleren hydrophilen Bereich (18) der Reaktionsstelle (12) benetzen kann.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Substrat (10) wenigstens zwei Reaktionsstellen (12) vorgesehen sind und der Aufsatz (22) wenigstens zwei jeweils eine obere Öffnung (28) sowie eine untere Öffnung (30) aufweisende Durch- gangskanäle (26) aufweist, wobei, wenn der Aufsatz (22) mit dem
Substrat (10) verbunden ist, die dem Substrat (10) zugewandten Öffnungen (30) der Durchgangskanäle (26) des Aufsatzes (22) auf den zentralen hydrophilen Bereichen (14) der Reaktionsstellen (12) derart angeordnet sind, dass in den Durchgangskanälen (26) befind- liehe Flüssigkeit zumindest einen Teil der zentralen hydrophilen Bereiche (14) der Reaktionsstellen (12) benetzen kann, die Flüssigkeit jedoch nicht die mittleren hydrophilen Bereiche (18) der Reaktionsstellen (12) benetzen kann.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Querschnittsform der unteren Öffnungen (30) des wenigstens einen Durchgangskanals (26) der Querschnittsform der zentralen hydrophilen Bereiche (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) entspricht.
4. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Querschnittsfläche der unteren Öffnungen des wenigstens einen Durchgangskanals (26) der Querschnittsfläche des zentralen hydrophilen Bereichs (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) entspricht.
5. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) im Wesentlichen kreisförmig ausgebildet ist und dieser von einem im Wesentlichen kreisringförmigen ersten hydrophoben Bereich (16) konzentrisch umgeben ist, welcher außenseitig von ei- nem im Wesentlichen kreisringförmigen mittleren hydrophilen Bereich (18) konzentrisch umgeben ist.
6. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrophilie der zentralen hydrophilen Bereiche (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) und die Hydrophobie der diese umgebenden ersten hydrophoben Bereiche (16) derart eingestellt sind, dass sich bei Auftrag von weniger gleich 10 μl Wasser auf die Reaktionsstellen (12) ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel von 20 bis 70°, bevorzugt von 30 bis 60° und besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet.
7. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) im Wesentlichen kreisförmig ausgestaltet ist und einen Durchmesser zwischen 0,1 und 5 mm, bevorzugt zwischen 0,3 und 3 mm und besonders bevorzugt zwischen 1 und 2 mm aufweist.
8. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (10) 2 bis 384, vorzugsweise 24 bis 96, besonders bevorzugt 36 bis 60 und ganz besonders bevorzugt 48 Reaktionsstellen (12) aufweist und der Aufsatz (22) eine der Anzahl der Reaktionsstel- len (12) entsprechende Anzahl von Durchgangskanälen (26) aufweist.
9. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (10) 48 Reaktionsstellen (12) aufweist, welche jeweils einen kreisförmigen, zentralen hydrophilen Bereich (14) aufweisen und der Aufsatz (22) 48, im Querschnitt kreisförmige Durchgangskanäle (26) aufweist, welche den gleichen Durchmesser aufweisen wie die zentralen hydrophilen Bereiche (14), wobei die Durchgangskanäle (26), wenn der Aufsatz (22) mit dem Substrat (10) verbunden ist, genau über den zentralen hydrophilen Bereichen (14) der Reaktionsstellen (12) angeordnet sind.
10. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (10) ein Objektträger aus Glas ist.
11. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) mit einer die Zellanhaftung daran verstärkenden Substanz beschichtet ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) mit einer aus der aus Kollagen, Fibronektin, Laminin, Vitronectin, Gelatine, synthetischen Zelladhäsionspeptiden, Base- ment-Membranmatrizes, polyphenolischen Proteinen, Polylysin, Po- lyornithin und beliebigen Kombinationen von zwei oder mehr der vorgenannten Verbindungen bestehenden Gruppe ausgewählten Verbindung beschichtet ist.
13. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufsatz (22) aus Gummi, Polypropylen oder Polycarbonat besteht.
14. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Durchgangskanal (26) ein Innenvolumen von 1 bis 1.000 μl, vorzugsweise von 10 bis 500 μl, besonders bevorzugt von 20 bis 200 μl und ganz besonders bevorzugt von 50 bis 100 μl aufweist.
15. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem wenigstens einen Durchgangskanal (26) des Aufsatzes (22) auf der dem Substrat (10) abgewandten Seite ein Verlängerungsgefäß (32) vorgesehen ist.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Durchgangskanal (26) zusammen mit dem Verlängerungsgefäß (32) ein Innenvolumen von 1 bis 1.000 μl, vorzugsweise von 10 bis 500 μl, besonders bevorzugt von 20 bis 200 μl und ganz besonders bevorzugt von 50 bis 100 μl aufweist.
17. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass auf dem Substrat (10) ein Klebstoff, vorzugsweise in der Form eines doppelseitigen Klebstoffstreifens (24, 24'), vorgesehen ist, mit dem der Aufsatz (22) mit dem Substrat (10) lösbar verbunden werden kann.
18. Vorrichtung nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass auf dem Substrat (10) eine Dichtung oder mehrere Dichtungen vor- gesehen sind, mit denen der Aufsatz (22) gegenüber dem Substrat
(10) abgedichtet werden kann.
19. Verfahren zur Charakterisierung von Zellen, insbesondere zur Vermehrung von Zellen und zur anschließenden Charakterisierung der Zellen unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, umfassend die Schritte: a) Verbinden des Aufsatzes (22) mit dem planaren Substrat (10), so dass wenigstens eine der unteren Öffnungen (30) des wenigstens einen Durchgangskanals (26) des Aufsatzes (22) über einem zentralen hydrophilen Bereich (14) der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) angeordnet ist, b) Zugabe wenigstens einer Zelle und von Zellkulturmedium in den wenigstens einen Durchgangskanal (26) des Aufsatzes (22), c) Inkubieren der Vorrichtung bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitspanne, um eine Vermehrung der Zellen und/ oder eine Anhaftung der Zellen auf den Reaktionsstellen zu erreichen, d) Entnehmen des Zellkulturmediums aus dem wenigstens einen Durchgangskanal (26), e) Entfernen des Aufsatzes (22) von dem Substrat (10) sowie f) Charakterisierung der Zellen auf der wenigstens einen Reaktionsstelle (12) des Substrats (10).
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt f) vor den Schritten c), d) und e), zwischen den Schritten c), d) und e) oder nach den Schritten c), d) und e) durchgeführt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Zelle und das Zellkulturmedium in dem Schritt b) in der Form einer Zellsuspension zugegeben werden.
22. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Charakterisierung der Zellen gemäß dem Schritt f) eine PCR, eine RT-PCR oder eine in situ Analyse von Protein, vorzugsweise eine Immunofluoreszenzanalyse, ist.
23. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Schritt b) zugegebenen Zellen eukaryontische Zellen, vorzugsweise Stammzellen, Primärzellen, Hybridomazellen oder embryonale Stammzellen sind.
24. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt b) in jeden der Durchgangskanäle (26) jeweils die gleiche Zellsuspension zugegeben wird und in dem Schritt f) auf je- der der Reaktionsstellen (12) eine PCR durchgeführt wird, wobei für jede Reaktionsstelle gleiche und/ oder unterschiedliche Primerpaare eingesetzt werden.
25. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt b) in jeden der Durchgangskanäle (26) jeweils eine andere Zellsuspension zugegeben wird und in dem Schritt f) auf jeder der Reaktionsstellen (12) eine PCR durchgeführt wird.
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