WO2012100764A1

WO2012100764A1 - Verfahren und vorrichtung zur automatisierten präparation von zellen für molekularbiologische untersuchungen

Info

Publication number: WO2012100764A1
Application number: PCT/DE2011/075276
Authority: WO
Inventors: Michael FORGBER; Jens Eberhardt
Original assignee: Als Automated Lab Solutions Gmbh
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2012-08-02

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Vorrichtung zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, umfassend eine mittels eines Robotsystems (8) bewegliche Entnahmeeinheit (7) zur Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien (31) aus einem Probenbehälter (3) und Ablage der Zellen oder Zellkolonien (31) an einer vorgegebenen Ablageposition (5, 9), wobei die Entnahmeeinheit (7) mindestens eine Kapillare oder Kanüle (12) zur Aufnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien (31) aus dem Probenbehälter (3) aufweist. Dabei ist vorgesehen, dass die Kapillare oder Kanüle (12) der Entnahmeeinheit (7) vor der Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien (31) aus dem Probenbehälter (3) zumindest ein Medium enthält, das ein Vorbereitungsmedium (22, 23, 25), das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien (31) benötigt wird, ist.

Description

Beschreibung

Verfahren und Vorrichtung zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, insbesondere der PCR- Analyse. Sie betrifft ferner die Verwendung der Vorrichtung zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, insbesondere der PCR-Analyse.

In der molekularbiologischen Forschung sind sowohl die Fähigkeit zur Anpassung von Organismen, Geweben oder Einzelzellen in Reaktion auf wechselnde Umweltbedingungen als auch die Mechanismen der Zell-Zell-Kommunikation und der Entwick- lungsphysiologie von herausragender Bedeutung. Komplexe molekulare Regelkreise sorgen dafür, das bedarfsabhängig bestimmte Gene an- oder abgeschaltet werden, was durch hochsensitive PCR- Verfahren (Polymerase-Kettenreaktion; englisch: Polymerase Chain Reaction, PCR) bis auf die Ebene von einzelnen Zellen analysiert wird. Die üblichen bisher zur Analyse von Zellmaterial entwickelten und etablierten Me- thoden sind aus Gründen der Sensitivität auf die Untersuchung von vielen Zellen angewiesen. Dabei werden Ergebnisse jedoch gemittelt, d. h. eine Analyse individueller Eigenschaften einer Zelle ist unmöglich. Auftretende Effekte einer oder weniger Zellen in der untersuchten Population werden dadurch abgeschwächt und sind nur schwer detektierbar. Ähnlich wie bei eineiigen Zwillingen, können auch einzelne Zellen, ob- gleich genetisch identisch, durch epigenetische Veränderungen auf Umwelteinflüsse unterschiedlich reagieren. So ist die Analyse von Proteinen, mit denen Zellen auf Umweltveränderungen reagieren, von Interesse.

Die methodische Herausforderung ergibt sich daraus, dass der überwiegende Anteil der zellulären Proteine sogenannte„housekeeping proteins" sind, die in allen Zellen gleich und zahlenmäßig in großen Mengen vorkommen (high copy proteins). Die Charakterisierung spezieller Proteine, wie z.B. sensorische Proteine oder signalüber- tragende Transmitterproteine, ist daher aufwendig, da diese vom restlichen„noise" zu trennen sind und oft nur in geringsten Konzentrationen in der Zelle vorkommen (low copy proteins). Es ist daher sinnvoll, Methoden zu entwickeln, die die Grundbausteine komplexer Organismen in höherer Auflösung charakterisieren, als dies bisher möglich ist. Die dafür nötigen Methoden zur Isolation und Analyse der Biomoleküle (DNA, RNA, Proteine u.a.) müssen aufgrund der niedrigen Konzentrationen hoch sensitiv sein und bedürfen im ersten Schritt einer ebenso sensiblen Isolation der einzelnen Zelle. So liegen 95 % der Transkripte (RNA) einer Zelle nur in ein bis fünfzig Kopien vor, und nicht jeder Zelltyp kommt in großer Zahl im Organismus oder der verfügba- ren Probe vor. Jede Beschädigung der Zelle, mechanischer oder anderer physikalischer oder chemischer Stress durch den Transfer, kann die Genaktivität und damit auch das RNA- und Proteinprofil innerhalb der Zelle in hohem Maße verändern oder zum Verlust von Biomolekülen und damit wichtiger Informationen führen. Um das komplexe Netzwerk aus Signal wegen, ihrer räumlichen Kompartimentierung, die Ab- hängigkeit von beteiligten Molekülen mit ihrer extrem geringer Konzentration verstehen und über die Zeit darstellen zu können, ist es nötig, die Methoden zur Analyse der Zusammenhänge mehrdimensional an einer Zelle führen zu können. Mehrere Methoden mit ein und derselben Zelle zu unternehmen ergibt also ein detaillierteres Bild über die komplexen Vorgänge innerhalb einer Zelle.

Die Auswahl und Präparation einzelner und spezifischer zu analysierenden Zellen ist jedoch noch immer mit einem hohen personellen und apparativen Aufwand verbunden. Die Generierung von verlässlichen Daten war lange von einer Mindestmenge an Zellmaterial abhängig. Verbesserungen der Spezifität von PCR- Analysen lassen ver- lässliche Analysen auch auf Einzelzellebene zu. Besonders in der onkologischen Forschung bilden Einzelzellanalysen zunehmend eine wichtige Methode zur Charakterisierung von verschiedenen Zellpopulationen, insbesondere bei Krebstypen mit einem variablen Metastasierungspotential . Für Einzelzell-PCR-Analysen müssen einzelne Zellen aus Kulturschalen entnommen und anschließend in einer Inkubationslösung für die PCR-Reaktion vorbereitet wer- den. Es gibt derzeit kein Verfahren, durch welches automatisch Zellen ohne Vorbehandlung direkt aus der Kulturschale heraus selektiert und isoliert und für die PCR präpariert werden könnten. Molekularbiologische Untersuchungen nehmen einen immer größeren Stellenwert in der biologischen Forschung und Gentechnik ein. Vor al- lern die Charakterisierung von Eigenschaften einzelner Zellen wird immer wichtiger. Während die Analyseverfahren selbst weitgehend automatisiert sind, ist eine durchgängige Zellseparation und Probenvorbereitung zur molekularbiologischen Analyse nicht vorhanden. Lediglich Teilbereiche der kompletten Verfahrenskette können automatisiert betrieben werden.

Derzeit werden diese vorbereitenden Arbeiten wie folgt durchgeführt:

Beim nicht automatisierten Arbeiten müssen durch den Experimentator unter„manueller" Beobachtung einzelne, ausgewählte Zellen oder Zellcluster freihändig mit Pipetten unter dem Mikroskop aus Kulturschalen entnommen und in ein Zielgefäß über- führt werden. Auch die sich anschließende Präparation von solchen Einzelzellanalysen ist aufwendig und verlangt speziell ausgebildetes Personal. Es schließen sich mehrere Pipettiervorgänge an.

Seit einiger Zeit sind Mikromanipulatorsysteme in den Laboren verbreitet, welche ein motorisch unterstütztes manuelles Arbeiten unter dem Mikroskop ermöglichen. Die Arbeiten zur Zellseparation wurden damit erleichtert und die Ausführung präziser im Vergleich zur vollständigen manuellen Zellseparation. Die Tätigkeiten sind aber immer noch durch manuelles Arbeiten gekennzeichnet und dementsprechend zeit- und personalintensiv und nicht standardisiert.

In letzter Zeit werden verstärkt automatisierte Verfahren auf dem Gebiet der gezielten Auswahl und Separation von einzelnen Zellen und Zellclustern eingesetzt. Hier finden Verfahren der Durchflusszytometrie (FACS, MACS) aber auch automatisierte konventionelle Verfahren mit Kanülen vermehrt Verwendung. Eine Möglichkeit der schonenden Separation einzelner Zellen und Zellcluster beschreibt die Offenlegungsschrift WO 2008/034868 A4.

Aus diesem technischen Stand ergeben sich viele Nachteile, welche durch die hier be- schriebene Erfindung beseitigt werden.

Die manuellen Tätigkeiten sind sehr komplex, verbunden mit hohem personellem Aufwand an eingehend geschultem Fachpersonal. Durch den hohen manuellen Anteil und die Komplexität sind Ungenauigkeiten und erhöhte Fehlerquoten bei Zellseparation und Präparation gegeben, welche Testergebnisse verfälschen können. Auf Grund der wachsenden Bedeutung der molekularbiologischen Untersuchungen wird die manuelle Tätigkeit auf Grund der begrenzten personellen Ressourcen zum Engpass bei der Bereitstellung ausreichender Kapazitäten. Durch Verwendung gängiger automatisierter Verfahren wie FACS oder MACS werden die Zellen zwar recht zielsicher und schnell separiert, die Zellen selbst aber stark belastet (z. B. durch Laserstrahlung) und sind für die weiteren Kultivierungen und Untersuchungen oftmals untauglich. Hinzu kommen ein hoher Aufwand zur Vorbereitung dieser automatisierten Separationsverfahren und die benötigte hohe Anzahl von Ausgangszellmaterial in der Ausgangskultur. Ebenso lassen sich bei den Durchflussverfahren nur Zellen selektieren, welche sich in Suspension befinden. Adhärente Zellen und Zellcluster scheiden für diese Verfahren völlig aus.

Bei der Probenvorbereitung für Einzellzell-PCR-Analysen müssen die isolierten Zel- len mit den Komponenten der PCR- Reaktion gemischt werden. Die Zelle wird entweder direkt in einer vorgelegten Menge PCR-Mix abgelegt oder das PCR-Mix wird im Anschluss an die Zellisolation zur Zelle dazugegeben. Egal welche Strategie gewählt wird, es ist ein zusätzlicher Pipettierschritt erforderlich, welcher auch hier auf zwei Wegen erfolgen kann: (a) Manuell: personalintensiv, keine Standardisierung und damit fehlerbehaftet, kein

Dauerbetrieb möglich

(b) Automatisch: durch Pipettierroboter, dadurch erhöhte Kosten durch ein zusätzliches System.

Hinzu kommt die Änderung von Konzentrationen der Lösungen durch Verdunstungsprozesse auf Grund von Wartezeiten zwischen den Prozessschritten.

Eine durchgängige Automatisierung von der Auswahl der Zelle und/oder Zellkolo- nien, deren Separation und sofortigen Präparation für nachfolgende Schritte bei der Abgabe der Zellen / Zellkolonien ist nicht bekannt.

Aufbauend auf die in der Offenlegungsschrift WO 2008/034868 A4 genannten Verfahren und Vorrichtungen beseitigt die nachfolgend beschriebene Erfindung die ge- nannten Nachteile der bisherigen Verfahren und Vorrichtungen.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, insbesondere der PCR- Analyse, angegeben werden. Ferner soll eine Verwendung der Vorrichtung zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, insbesondere der PCR- Analyse, angegeben werden. Ziel der Erfindung ist insbesondere die schonende Detektion und Separation von einzelnen Zellen oder Zellclustern mit der sich sofort anschließenden Vorbereitung für molekularbiologische Untersuchungen, wie z. B. der PCR- Analyse. Ferner soll jede Beschädigung der Zelle, mechanischer oder anderer physikalischer oder chemischer Stress durch den Transfer vermieden werden. Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 , 8 und 18 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche. Ein Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, umfassend eine mittels eines Robotsystems bewegliche Entnahmeeinheit zur Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien aus einem Probenbehälter und Ablage der Zellen oder Zellkolonien an einer vorgegebenen Ablageposition, wobei die Entnahmeeinheit mindestens eine Kapillare oder Kanüle zur Aufnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien aus dem Probenbehälter aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare oder Kanüle der Entnahmeeinheit vor der Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien aus dem Probenbehälter zumindest ein Medium enthält, das ein Vorbereitungsmedium, das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien benötigt wird, ist.

Vorzugsweise enthält die Kapillare oder Kanüle der Entnahmeeinheit vor der Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien aus dem Probenbehälter folgende Medien: - das zumindest eine Vorbereitungsmedium, das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien benötigt wird; und

- ein Schutzmedium für das Vorbereitungsmedium und/oder eine Systemflüssigkeit, die für das Aufnehmen von Medien in die Kapillare oder Kanüle oder das Abgeben von Medien aus der Kapillare oder Kanüle benötigt wird.

Bei den Zellen kann es sich um beliebige biologische Zellen handeln, insbesondere um Zellen humaner, tierischer, pflanzlicher, bakterieller wie auch pilzlicher Herkunft. Mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, aus den Zellen, die als Probe in einem Probengefäß enthalten sind, selektiv einzelne Zellen (die in der Fachsprache auch als Einzelzellen bezeichnet werden) oder Zellkolonien (die in der Fach- spräche auch als Zell-Cluster bezeichnet werden) zu entnehmen. Erfindungsgemäß werden die einzelnen Zellen oder Zellkolonien mittels einer Kapillare oder Kanüle aus dem Probengefäß entnommen, die bereits Medien enthält, die für die nachfolgende biologische Untersuchung benötigt werden. Das bietet mehrere Vorteile: Zum einen wird ein Kontakt der zu entnehmenden einzelnen Zellen oder Zellkolonien mit der Umgebung vermieden. Die entnommenen einzelnen Zellen oder Zellkolonien liegen zu keinem Zeitpunkt frei. Damit ist auch eine Zeitersparnis verbunden. Eine gesonderte Behandlung der entnommenen einzelnen Zellen oder Zellkolonien am Ablageort zur Vorbereitung der biologischen Untersuchung ist nicht länger erforderlich oder mi- nimiert. Zum anderen wird eine weitere Automatisierung der Entnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien möglich. Da die für die Entnahme erforderlichen Medien, d. h. die Vorbereitungsmedien, bereits in der Kapillare oder Kanüle enthalten sind, werden Fehler beim Pipettieren vermieden. Schließlich werden Beschädigungen der Zellen bei der Entnahme aus dem Probengefäß oder bei der Ablage an einer Zielposi- tion verhindert.

Für die Anwendung molekularbiologischer Methoden ist es wichtig, dass die geringen Volumina exakt pipettiert werden und das Zellmaterial so schnell wie möglich zugeführt wird. Eine Kombination der Aufnahme von Vorbereitungsmedien wie Analy- seflüssigkeiten, beispielsweise Enzymlösungen etc., und Zellmaterial in einem Arbeitsschritt stellt daher eine qualitative Verbesserung der Methoden und der daraus generierten Daten dar.

Der Begriff „einzelne Zellen oder Zellkolonien" bezieht sich in einer Ausführungs- form der Erfindung auf Zellen, die aus einer Probe, die eine Vielzahl von Zellen enthalten kann, entnommen werden sollen. Bei einer„einzelnen Zelle" kann es sich um eine oder mehrere Zellen handeln, die zumindest ein gemeinsames Merkmal aufweisen, das sie von den anderen Zellen der Probe unterscheidet. Dieses Merkmal wird vom Anwender der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgegeben. Durch Abscannen des Probengefäßes mittels einer bildgebenden optischen Einrichtung können die Zellen, die das vorgegebene Merkmal aufweisen, detektiert werden. Dabei kann ein Bild der Probe erhalten werden, das einer Bildanalyse zur Selektion der detektierten Zellen unterzogen wird. Dabei können beispielsweise Positionsdaten der detektierten Zellen ermittelt werden. Selbstverständlich können die Positionsdaten auch auf andere, dem Fachmann bekannte Weise ermittelt werden. Anschließend können die detektierten und selektierten Zellen mittels der Kapillare oder Kanüle der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus dem Probengefäß entnommen werden. Handelt es sich bei einer Zelle um eine Zelle, die keine benachbarte Zelle mit dem vorgegebenen Merkmal aufweist, so ist die Zelle eine„einzelne Zelle". Eine Probe kann mehrere„einzelne Zellen" enthalten. Handelt es sich bei einer Zelle um eine Zelle, die zumindest eine benachbarte Zel- le mit dem vorgegebenen Merkmal aufweist, so ist die Zelle zusammen mit der benachbarten Zelle eine„Zellkolonie". Handelt es sich um zumindest zwei benachbarte Zellen, die zusammen ein vorgegebenes Merkmal (beispielsweise ist das Merkmal: Zelle vom Typ A, die an eine Zelle von Typ B angrenzt) aufweisen, so kann es sich ebenfalls um eine„Zellkolonie" handeln. Eine Probe kann mehrere„Zellkolonien" enthalten. Eine Probe kann sowohl„einzelne Zellen" als auch„Zellkolonien" enthalten. Mittels einer der Kapillaren oder Kanülen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann (i) eine einzige einzelne Zelle (ii) mehrere einzelne Zellen, (iii) eine einzige Zellkolonie, (iv) mehrere Zellkolonien oder (v) einzelne Zellen und Zellkolonien aufgenommen werden. Dabei kann im Gegensatz zur Aufnahme nur einer einzelnen Zel- le oder nur einer Zellkolonie eine Neupositionierung der Entnahmeeinheit mittels des Robotsystems erforderlich sein. Bei dem vorgegebenen Merkmal kann es sich beispielsweise um ein geometrisches Merkmal wie Form, Größe oder Formfaktor der Zelle und/oder eine physikalische Eigenschaft der Zelle wie Fluoreszenzverhalten o- der Lumineszenz handeln. Die Aufzählung der Merkmale ist nicht abschließend. Wird in der vorliegenden Erfindung der Begriff„einzelne Zellen oder Zellkolonien" verwendet, so soll er auch den Fall einschließen, dass in die Kapillare oder Kanüle nur eine einzige einzelne Zelle oder Zellkolonie aufgenommen und daraus abgegeben wird. Die Zellen, die aus der Probe entnommen werden sollen, sind Zielzellen, die anderen Zellen sind Nicht-Zielzellen. Die Probe kann die Zellen in einem Medium oder ohne ein Medium enthalten. Dieses Medium wird zur Unterscheidung von dem Medium, das in der Kapillare oder Kanüle vor der Aufnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien enthalten ist, auch als„Probenmedium" bezeichnet. Liegen die Zellen in der Probe in einem Probenmedium vor, so kann bei der Entnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien auch ein Teil des Probenmediums in die Kapillare oder Kanüle gelangen.

Unter einer biologischen Untersuchung wird insbesondere eine molekularbiologische Untersuchung, beispielsweise eine PCR- Analyse verstanden.

Der Begriff„Vorbereitungsmedium" bezieht sich auf Reagenzien, die für die nachfolgende biologische Untersuchung, beispielsweise die PCR- Analyse, benötigt werden. Wird beispielsweise für die PCR- Analyse ein spezielles Medium benötigt, in dem sich die entnommene einzelne Zellen oder Zellkolonien befinden sollen, so werden erfin- dungsgemäß die einzelnen Zellen oder Zellkolonien aus dem Probengefäß mit einer Kapillare oder Kanüle entnommen, die das spezielle Medium enthält. Da dieses Medium ausgewählt wird, um die biologische Untersuchung der entnommenen einzelnen Zellen oder Zellkolonien vorzubereiten, wird das spezielle Medium als„Vorbereitungsmedium" bezeichnet. Die Kapillare oder Kanüle kann mehr als ein Vorberei- tungsmedium oder ein Gemisch verschiedener Vorbereitungsmedien enthalten. Die Vorbereitungsmedien liegen typischerweise als flüssige Vorbereitungsmedien vor. Es ist nicht erforderlich, dass alle Reagenzien, die für die nachfolgende biologische Untersuchung benötigt werden, als Vorbereitungsmedien in der Kapillare oder Kanüle bereitgestellt werden. Es ist jedoch das Ziel, möglichst viele, vorzugsweise alle für die nachfolgende biologische Untersuchung benötigte Reagenzien als Vorbereitungsmedien bereitzustellen.

Der Begriff „Schutzmedium für das Vorbereitungsmedium", im Folgenden auch als „Schutzmedium" bezeichnet, bezieht sich auf ein Medium, das das Vorbereitungsme- dium und damit die einzelne Zellen oder Zellkolonien gegen Einflüsse der Umgebung, beispielsweise die Verdunstung des Vorbereitungsmediums, schützt. Bei dem Schutzmedium handelt es sich vorzugsweise um eine hydrophobe, biologisch inerte Flüssigkeit, beispielsweise um eine hydrophobe, biologisch inerte Lösung. Dabei kann es sich um Öl handeln. Zur Ablage der aus dem Probengefäß entnommenen einzelnen Zellen oder Zellkolonien wird die Kapillare oder Kanüle mittels der Entnah- meeinheit, die von dem Robotsystem bewegt wird, zu einer Zielposition geführt. Bei der Ablage werden die einzelnen Zellen oder Zellkolonien auf der Oberfläche eines Trägers, beispielsweise eines Objektträgers oder eines Gefäßbodens, abgelegt. Dabei verlassen die einzelnen Zellen oder Zellkolonien die Kapillare oder Kanüle zuerst, weil sie erst nach den Medien in die Kapillare oder Kanüle gelangten. Die Medien verlassen im Wesentlichen erst nach den einzelnen Zellen oder Zellkolonien die Kapillare oder Kanüle. Anschließend verlässt das Schutzmedium die Kapillare oder Kanüle. Ist beispielsweise das Vorbereitungsmedium eine hydrophile Flüssigkeit und das Schutzmedium eine hydrophobe Flüssigkeit, so überschichtet das Schutzmedium das Vorbereitungsmedium und schließt das Vorbereitungsmedium auf diese Weise gegen die Umgebung ab, wodurch das Schutzmedium eine Verdunstung des Vorbereitungsmediums verhindert. Das Schutzmedium wird daher auch als Überschichtungsflüssig- keit bezeichnet. Ist das Schutzmedium ein Öl, so wird es im Folgenden auch als Über- schichtungsöl bezeichnet. Der Begriff „Systemflüssigkeit" bezieht sich auf eine Flüssigkeit, die für das Aufnehmen von Medien in die Kapillare oder Kanüle oder das Abgeben von Medien aus der Kapillare oder Kanüle benötigt wird. Es kann vorteilhaft sein, dass sich in der Kapillare oder Kanüle, in den Zuleitungen, die eine Pumpe oder Spritze mit der Kapillare oder Kanüle verbinden, oder in Hohlräumen in der Pumpe oder Spritze keine Luft be- findet. Aus diesem Grund kann eine Systemflüssigkeit vorgesehen sein, die den Betrieb der Pumpe oder Spritze und damit das Ansaugen und die Abgabe von Medien, einzelner Zellen oder Zellkolonien in bzw. aus der Kapillare oder Kanüle ermöglicht. Bei der Systemflüssigkeit kann es sich um ein Öl, beispielsweise ein Hydrauliköl, handeln. Das Öl kann ein Siliconöl sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ent- hält die Kapillare oder Kanüle vor der Entnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien neben dem Vorbereitungsmedium sowohl ein Schutzmedium als auch eine Sys- temflüssigkeit. In einer anderen Ausführungsform enthält die Kapillare oder Kanüle vor der Entnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien neben dem Vorbereitungsmedium nur Schutzmedium oder nur Systemflüssigkeit. Ist die Systemflüssigkeit ein Öl, so kann sie gleichzeitig als Schutzmedium dienen.

Erfindungsgemäß wird zur Entnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien aus einem Probenbehälter eine Kapillare oder Kanüle verwendet, die zumindest ein Vorbereitungsmedium und optional ein Schutzmedium und/oder eine Systemflüssigkeit enthält. Der Probenbehälter wird im Folgenden auch als Probengefäß bezeichnet. Bei dem Probenbehälter kann es sich beispielsweise um Petrischalen, andere Zellkulturgefäße, Multi wellplatten oder Objektträger handeln.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann einen Motortisch umfassen, auf dem der Probenbehälter mit den zu untersuchenden Zellen platziert werden kann. Der Motor- tisch kann verfahrbar sein. Ein Beispiel eines Motortisches ist ein Kreuztisch.

Ferner kann die erfindungsgemäße Vorrichtung eine bildgebende optische Einheit umfassen, welche Bilder der Zellen, die sich in dem Probenbehälter befinden, an ein Bildanalysesystem liefert. Die bildgebende optische Einheit kann eine bildgebende optische Einheit mit optischer Bildvergrößerung sowie einer Kamera sein. Beispielsweise kann die bildgebende optische Einheit ein Mikroskop oder ein Mikroskop mit einer Kamera sein. Die Bilder können von der bildgebenden optischen Einheit in variabler Vergrößerung an das Bildanalysesystem geliefert werden. Dieses Bildanalysesystem ist zweckmäßigerweise in der Lage, aufgrund der gelieferten Bilddaten spezi- fische Zellen zu erkennen und zu klassifizieren.

Zusätzlich kann die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Lichtquelle und einer optischen Filtereinheit ausgestattet sein, um Licht in einer frei definierbaren Wellenlänge (Anregungsstrahlung) auf das Probengefäß, das die Probe mit den zu entneh- menden einzelnen Zellen oder Zellkolonien enthält und das sich auf dem Motortisch befindet, zu lenken und von der Probe emittiertes Licht einer anderen Wellenlänge (Emissionsstrahlung) zur bildgebenden optischen Einheit zu leiten, um beispielsweise Lumineszenzstrahlung, insbesondere Fluoreszenzstrahlung der Probe aufzunehmen. Die optische Filtereinheit kann beispielsweise aus einem vorzugsweise dichroitischen Strahlteiler bestehen, der die Anregungsstrahlung weitgehend in Richtung der Probe reflektiert, von der Probe kommende Emissionsstrahlung jedoch transmittiert. Zur weiteren Verbesserung der Trennung von Anregungsstrahlung und Emissionsstrahlung können weitere Sperrfilter im optischen Strahlengang der bildgebenden optischen Einheit vorgesehen sein. Das Robotsystem der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist vorzugsweise ein automatisches Robotsystem, das mindestens eine Entnahmeeinheit zur Entnahme und Verbringung der einzelnen Zellen oder Zellkolonien aufweist. Diese Entnahmeeinheit besitzt mindestens eine Kapillare oder Kanüle, über welche die einzelnen Zellen oder Zellkolonien aus dem Probengefäß aufgenommen und später wieder abgegeben werden. Mittels der Entnahmeeinheit wird die aus dem Probenbehälter entnommene Probe zu der Zielposition transportiert und dort abgelegt. Die Entnahmeeinheit wird im Folgenden auch als Werkzeug bezeichnet. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann mehr als eine Entnahmeeinheit umfassen. Jede Entnahmeeinheit kann eine oder mehrere Kapillaren oder Kanülen tragen.

Die Zielposition wird im Folgenden auch als Ablageposition bezeichnet. An der Zielposition werden von der Kapillare oder Kanüle aufgenommene einzelne Zellen oder Zellkolonien sowie die Vorbereitungsmedien und, falls vorhanden, das Schutzmedium in einem Schritt abgelegt. Es können mehrere, verschiedene Zielpositionen vorgese- hen sein. Die Zielposition wird im Folgenden auch als Ablageposition bezeichnet. Die Ablage der einzelnen Zellen oder Zellkolonien, des Vorbereitungsmediums und, falls vorhanden, des Schutzmediums an der Zielposition erfolgt vorzugsweise in einem Schritt. Zweckmäßigerweise umfasst die Vorrichtung ferner Vorratsbehälter für die Medien. Dabei wird in der vorliegenden Erfindung die Gesamtheit aller Vorratsbehälter auch als Vorlagenaufnahme bezeichnet. In den Vorratsbehältern befinden sich die Vorbereitungsmedien. Es können Vorratsbehälter für alle oder nur einen Teil der Reagenzien vorgesehen sein, die für die nachfolgende biologische Untersuchung benötigt werden.

Es kann vorteilhaft sein, wenn sich sowohl wenigstens eine Zielposition als auch ein Teil oder alle Vorratsbehälter auf dem Kreuztisch der erfindungsgemäßen Vorrichtung befinden. Auf diese Weise ist es möglich, direkt auf dem Kreuztisch die Entnahme eines Mediums aus einem Vorratsbehälter, der sich auf dem Kreuztisch befin- det, und dessen Transfer zu der Zielposition, die sich ebenfalls auf dem Kreuztisch befindet, oder von einem Loch („Well") einer Multi wellplatte, die sich auf dem Kreuztisch befindet, in ein anderes Loch der Multiwellplatte durchzuführen.

Vorzugsweise ist zumindest einer der Vorratsbehälter auf der Entnahmeeinheit ange- ordnet. Dieser Vorratsbehälter kann beispielweise das Schutzmedium enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung sind alle Vorratsbehälter auf der Entnahmeeinheit angeordnet.

Ferner kann die Vorrichtung eine Pumpe oder Spritze für das Aufnehmen der Medien in die Kapillare oder Kanüle und das Abgeben der aufgenommen Medien aus der Kapillare oder Kanüle umfassen. Die Pumpe kann darüber hinaus für das Aufnehmen der einzelnen Zellen oder Zellkolonien in die Kapillare oder Kanüle und das Abgeben der aufgenommen einzelnen Zellen oder Zellkolonien aus der Kapillare oder Kanüle vorgesehen sein. Bei der Pumpe oder Spritze kann es sich um eine Spritzenpumpe han- dein. Die Pumpe oder Spritze ist vorteilhafterweise auf der Entnahmeeinheit angeordnet. Die Pumpe oder Spritze ist zweckmäßigerweise eine automatische Pumpe oder Spritze, d. h. die Bewegungen des Kolbens der Pumpe oder Spritze werden mittels Aktoren gesteuert. Die Pumpe oder Spritze sorgt für die Aufnahme der Medien sowie der einzelnen Zellen oder Zellkolonien in den jeweils vorgegebenen Mengen in die Kapillare oder Kanüle. Auf der Entnahmeeinheit kann ein Ventil angeordnet sein, das die Entnahme eines Mediums aus dem Vorratsbehälter, der ebenfalls auf der Entnahmeeinheit angeordnet ist, und die Abgabe des entnommen Mediums in die Kapillare oder Kanüle ermöglicht. Es kann vorgesehen sein, dass für jeden Vorratsbehälter, der auf der Entnahme- einheit angeordnet ist, ein gesondertes Ventil vorgesehen ist, das ebenfalls auf der Entnahmeeinheit angeordnet ist.

In einer Ausführungsform der Erfindung weist die Pumpe oder Spritze einen Hohlraum auf, in dem das Medium nach dessen Entnahme aus einem Vorratsbehälter, der auf der Entnahmeeinheit angeordnet ist, und vor der Abgabe in die Kapillare oder Kanüle zwischengespeichert ist.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann ferner Einrichtungen zum Temperieren des Probengefäßes und damit der darin enthaltenen Zellen, zum Temperieren zumindest eines Vorratsgefäßes und damit des darin enthaltenen Mediums und/oder zum Temperieren zumindest einer Zielposition umfassen.

Außerdem kann die erfindungsgemäße Vorrichtung einen integrierten Apparat zur thermischen Manipulation von Zellen in dem Probengefäß umfassen. Alternativ kann sie einen externen Apparat zur thermischen Manipulation von Zellen in dem Probengefäß und einen Handler umfassen, der das Probengefäß zwischen dem Kreuztisch und dem externen Apparat zur thermischen Manipulation transportiert.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann überdies eine Datenverarbeitungsanlage (umfassen, die die Bildanalyse mittels einer Bildverarbeitungssoftware durchführt und optional auch die Komponenten der erfindungsgemäßen Vorrichtung steuert. Bei der Datenverarbeitungsanlage kann es sich um einen Personal Computer (PC) handeln. Die Datenverarbeitungsanlage wird in der vorliegenden Erfindung auch als Bildauswerteeinheit oder Bildverarbeitungseinheit oder Bildanalysesystem bezeichnet. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass alle oder ein Teil der beschriebenen Komponenten der erfindungsgemäße Vorrichtung entweder in einem als Einheit konzipierten Apparat verbaut sind oder dass die Komponenten als externe Einzelkomponenten aufgebaut sind und ein automatisierbares Robotsystem die Proben zwischen den Einzelkomponenten verbringt, um weiterhin die Prozessautomatisierung zu gewährleisten.

Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, insbesonde- re mittels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien aus einem Probenbehälter mittels einer Kapillare oder Kanüle, die ein Medium enthält, das ein Vorbereitungsmedium, das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien benötigt wird, ist.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die Kapillare oder Kanüle, mit der einzelne Zellen oder Zellkolonien aus einem Probenbehälter entnommen werden, folgende Medien: - das zumindest eine Vorbereitungsmedium, das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien benötigt wird; und

Zweckmäßigerweise werden die Medien mittels einer Pumpe oder Spritze, die auf einer mittels eines Robotsystems beweglichen Entnahmeeinheit angeordnet ist, aus Vorratsbehältern entnommen und von der Kapillare oder Kanüle aufgenommen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann die Schritte (a) Aufnehmen von Systemflüssigkeit in die Kapillare oder Kanüle aus einem ersten Vorratsbehälter; (b) Aufnehmen eines Schutzmediums in die Kapillare oder Kanüle, in der sich bereits die Systemflüssigkeit befindet, aus einem zweiten Vorratsbehälter;

(c) Aufnehmen eines Vorbereitungsmediums in die Kapillare oder Kanüle, in der sich bereits die Systemflüssigkeit und das Schutzmedium befinden, aus einem dritten Vorratsbehälter; und

(d) ein- oder mehrfaches Wiederholen von Schritt (c), falls ein weiteres Vorbereitungsmedium in die Kapillare oder Kanüle aufgenommen werden soll, umfassen, wobei die Medien in der folgenden Reihenfolge in der Kapillare oder Kanüle enthalten sind: Vorbereitungsmedium oder -medien/Schutzmedium/System- flüssigkeit.

Ist keine Systemflüssigkeit vorgesehen, so kann das erfindungsgemäße Verfahren al- ternativ die Schritte

(a) Aufnehmen eines Schutzmediums (21) in die Kapillare oder Kanüle (12) aus einem ersten Vorratsbehälter; (b) Aufnehmen eines Vorbereitungsmediums (22, 23) in die Kapillare oder Kanüle (12), in der sich bereits das Schutzmedium (21) befindet, aus einem dritten Vorratsbehälter;

(c) Wiederholen von Schritt (b), falls ein weiteres Vorbereitungsmedium in die Ka- pillare oder Kanüle (12) aufgenommen werden soll, umfassen, wobei die Medien in der folgenden Reihenfolge in der Kapillare oder Kanüle enthalten sind: Vorbereitungsmedium oder -medien/Schutzmedium.

Vorzugsweise wird zumindest eines der Medien aus einem Vorratsbehälter entnom- men, der auf der Entnahmeeinheit angeordnet ist. Dieser Vorratsbehälter kann beispielweise das Schutzmedium enthalten. Es kann vorgesehen sein, dass das Medium aus dem Vorratsbehälter in einen Hohlraum der Pumpe oder Spritze geführt und von dort in die Kapillare oder Kanüle geführt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst ferner die Aufnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien mittels der Kapillare oder Kanüle, die zumindest das Vorbereitungsmedium enthält, und die Abgabe der aufgenommenen einzelnen Zellen oder Zellkolonien aus der Kapillare oder Kanüle an einer vorgegebenen Zielposition. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren vor der Aufnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien mittels der Kapillare oder Kanüle die folgenden Schritte umfassen:

(a) das Abscannen eines Probengefäßes, das die einzelnen Zellen oder Zellkolonien enthält, mittels einer bildgebenden optischen Einheit unter Erhalt einen Bildes; und

(b) Selektion der einzelnen Zellen oder Zellkolonien mittels eines Bildanalysesystems anhand des in Schritt (a) erhaltenen Bildes. Zweckmäßigerweise umfasst Schritt (b) die Bestimmung von Positionsdaten der zu selektierenden einzelnen Zellen oder Zellkolonien, anhand der die Kapillare oder Kanüle, die zumindest das Vorbereitungsmedium enthält, mittels der von dem Robotsystems bewegten Entnahmeeinheit nacheinander zu den selektierten einzelnen Zellen oder Zellkolonien in dem Probengefäß geführt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann demnach in einer Ausführungsform der Erfindung die folgenden Schritte umfassen:

(i) Bereitstellen einer Probe in einem Probengefäß, vorzugsweise auf dem Kreuz- tisch der erfindungsgemäßen Vorrichtung;

(ii) Abscannen des Probengefäßes mittels der bildgebenden optischen Einheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung; (iii) Detektieren und Selektieren der einzelnen Zellen oder Zellkolonien, die mittels der Entnahmeeinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung aufgenommen werden sollen, unter Bestimmung von Positionsdaten;

(iv) Isolation der selektierten einzelnen Zellen oder Zellkolonien mittels einer Kapillare oder Kanüle der Entnahmeeinheit, die zumindest ein Vorbereitungsmedium enthält, anhand der Positionsdaten; und

(v) Ablage der isolierten einzelnen Zellen oder Zellkolonien mit dem Vorbereitungsmedium und, falls vorhanden, des Schutzmediums in einem Schritt an der Zielposition.

Die Positionsdaten können anhand des in Schritt (ii) von der bildgebenden optischen Einheit erhaltenen Bildes beispielsweise durch eine Bildanalyse erhalten werden. Liegen Positionsdaten bereits vor, so kann auf die Schritte (ii) und (iii) verzichtet werden.

Nach der Ablage der isolierten einzelnen Zellen oder Zellkolonien mit dem Vorbereitungsmedium und, falls vorhanden, des Schutzmediums in einem Schritt an der Zielposition in Schritt (iv) können sich die einzelnen Zellen oder Zellkolonien mit dem Vorbereitungsmedium durchmischen . Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind unter den nachfolgenden Ziffern (1) bis (18) dargestellt, wobei die Gegenstände untereinander und jeder dieser Gegenstände mit den oben angegebenen Gegenständen kombiniert werden können.

(1) Ein Verfahren zur automatischen Präparation von Einzelzellen oder Zell- Clustern aus humaner, tierischer, pflanzlicher, bakterieller wie auch pilzlicher Herkunft für die molekularbiologische Untersuchung (z.B. PCR- Analyse), gekennzeichnet durch die Abfolge an Schritten:

(a) Abscannen eines Probengefäßes als Ausgangsprobe auf einem motorisierten Kreuztisch über ein optisches Kamerasystem.

(b) Detektion und Selektion der einzelnen Zielzellen und/oder Zellkolonien durch ein automatisierbares Bildanalysesystem über optische Merkmale der Zelle.

(c) Isolation der einzelnen Zielzellen und/oder Zellkolonien durch ein Robotsystem.

(d) Zielzellablage inkl. Durchmischung mit den für die molekularbiologischen Untersuchungen notwendigen Reagenzien durch ein Robotsystem in einem Schritt. unter Verwendung eines Gerätes bestehend aus

(e) Einem verfahrbaren Motortisch, auf welchem ein Gefäß mit den zu untersuchenden Zellen positioniert werden kann.

(f) Einer bildgebenden optischen Einheit mit optischer Bildvergrößerung sowie einer Kamera, welche Bilder in variabler Vergrößerung an ein Bildanalysesystem liefert. Dieses Bildanalysesystem ist in der Lage, aufgrund der gelieferten Bilddaten bestimmte Zellen zu erkennen und zu klassifizieren.

(g) Einem automatischen Robotsystem mit mindestens einer Entnahmeeinheit zur Entnahme und Verbringung der einzelnen Zellen und/oder Zellkolonien. Diese Entnahmeeinheit besitzt mindestens eine Kapillare oder Kanü- le, über welche die einzelnen Zellen und/oder Zellkolonien aus dem Probengefäß aufgenommen und später wieder abgegeben werden.

(h) Einer Vorlagenaufnahme, auf welcher teilweise oder alle für die Vorbereitung nachfolgender molekularbiologischer Prozesse notwendigen Reagenzien vorrätig gehalten werden.

(i) Einer Ablageposition, auf welcher die aufgenommenen einzelnen Zielzellen und/oder Zellkolonien sowie die benötigten Reagenzien in einem Schritt abgelegt werden.

(2) Verfahren nach Ziffer (1) unter Verwendung von Fluoreszenzmerkmalen der Ausgangsprobe zur Unterscheidung von Zielzellen und Nicht-Zielzellen.

(3) Verfahren nach Ziffer (1), wobei jedoch anstatt eines Scans (la) vorher aufgenommene Bilder als Ausgangsquelle für Detektion und Selektion (lb) verwendet werden.

(4) Verfahren nach Ziffer (1), wobei jedoch anstatt eines Scans (la) und einer Detektion und Selektion (lb) eine Liste mit gewünschten Partikelpositionen als Ausgangsquelle für die Isolation der Zellen (lc) verwendet wird.

(5) Verfahren nach den Ziffern (1) bis (4), bei denen mehrere Ausgangsgefäße, Entnahmeeinheiten, Vorlagenaufnahmen und/oder Ablagepositionen verwendet werden.

(6) Verfahren nach den Ziffern (1) bis (5), bei denen einzelne oder alle Entnahmeeinheiten mehrere Kapillaren oder Kanülen zur Aufnahme besitzen.

(7) Verfahren nach den Ziffern (1) bis (6), bei denen mehrere Zellen und/oder Zellkolonien in die gleiche Kapillare oder Kanüle aufgenommen werden. (8) Verfahren nach den Ziffern (1) bis (7), bei denen mehrere Zellen und/oder Zellkolonien gleichzeitig auf unterschiedliche Zielpositionen abgegeben werden können.

(9) Verfahren nach den Ziffern (1) bis (8), bei denen alle oder einzelne Reagenzien, Ausgangsprobengefäße sowie Ablagepositionen temperiert werden können.

(10) Verfahren nach den Ziffern (1) bis (9), bei dem im Anschluss an die Ablage der einzelnen Zellen und/oder Zellkolonien und deren nachfolgender Durchmischung mit den Reagenzien die Probe wahlweise zum Schutz vor Verdunstung mit einer hydrophoben, biologisch inerten Lösung überschichtet werden kann und anschließend die Reaktion gestartet wird unter Verwendung von:

(a) Einem integrierten Apparat zur thermischen Manipulation von Zellen in einem Probengefäß.

(b) Einem externen Apparat zur thermischen Manipulation von Zellen in einem Probengefäß.

(11) Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, bei denen alle für das Verfahren beschriebenen Schritte entweder in einem als Einheit konzipierten integrierten Apparat oder in verschiedenen Apparaten durchgeführt werden, bei welchen dann jedoch eine automatische Verbringung der Zellen und/oder Probengefäße stattfindet, um weiterhin die Prozessautomatisierung zu gewährleisten.

(12) Ein Gerät zur automatischen Präparation von Einzelzellen oder Zell-Clustern aus humaner, tierischer, pflanzlicher, bakterieller wie auch pilzlicher Herkunft für die molekularbiologische Untersuchung (z.B. PCR- Analyse) bestehend aus

(a) Einem verfahrbaren Motortisch, auf welchem ein Gefäß mit den zu untersuchenden Zellen platziert werden kann.

(b) Einer bildgebenden optischen Einheit mit optischer Bildvergrößerung sowie einer Kamera, welche Bilder in variabler Vergrößerung an ein Bildanalysesystem liefert. Dieses Bildanalysesystem ist in der Lage, aufgrund der gelieferten Bilddaten spezifische Zellen zu erkennen und zu klassifizieren.

(c) Einem automatischen Robotsystem mit mindestens einer Entnahmeeinheit zur Entnahme und Verbringung der einzelnen Zellen und oder Zellkolo- nien. Diese Entnahmeeinheit besitzt mindestens eine Kapillare oder Kanüle, über welche die einzelnen Zellen und/oder Zellkolonien aus dem Probengefäß aufgenommen und später wieder abgegeben werden.

(d) Einer Vorlagenaufnahme, auf welcher teilweise oder alle für die Vorbereitung nachfolgender molekularbiologischer Prozesse notwendigen Reagen- zien vorrätig gehalten werden.

(e) Einer Ablageposition, auf welcher die aufgenommenen Zellen sowie die benötigten Reagenzien in einem Schritt abgelegt werden.

(13) Gerät nach Ziffer (12), welches jedoch zusätzlich mit einer Lichtquelle und einer optischen Filtereinheit ausgestattet ist, um Licht in einer frei definierbaren Wellenlänge auf die Probe zu lenken und in einer anderen Wellenlänge zum Kamerasystem zu leiten (Fluoreszenzfilter, Filtereinheit und -Lichtquelle) bzw. um Lumineszenzen der Probe aufzunehmen.

(14) Gerät nach den Ziffern (12) bis (13), bei dem mehrere Ausgangsgefäße, Entnahmeeinheiten, Vorlagenaufnahmen und/oder Ablagepositionen vorhanden sind.

(15) Gerät nach den Ziffern (12) bis (14), bei dem einzelne oder alle Entnahmeein- heiten mehrere Kapillaren oder Kanülen zur Aufnahme besitzen.

(16) Gerät nach den Ziffern (12) bis (15), bei dem alle oder einzelne Reagenzien, Ausgangsprobengefäße sowie Ablagepositionen temperiert werden können. (17) Gerät nach den Ziffern (12) bis (16), bei dem die Ablage der Zellen, Durchmischung der Zellen mit den Reagenzien sowie wahlweise eine Überschichtung der Zellen mit einer hydrophoben, biologisch inerten Lösung zum Schutz vor Verdunstung auf einer Ablageposition stattfindet, welche in der Lage ist, eine thermische Manipulation der Zellen zum Start der Reaktion durchzuführen. Hierzu wird das Gerät aus den Ziffern (12) bis (16) erweitert um

(a) Einen integrierten Apparat zur thermischen Manipulation von Zellen in einem Probengefäß.

(b) Einen externen Apparat zur thermischen Manipulation von Zellen in einem Probengefäß und einem Handler zwischen dem Gerät aus Ziffer (12) bis (16) und dem externen Apparat zur thermischen Manipulation.

(18) Gerät nach den Ziffern (12) bis (17), bei dem alle oder eine Vielzahl der beschriebenen Komponenten entweder in einem als Einheit konzipierten Apparat verbaut werden, oder als externe Einzelkomponenten aufgebaut sind und ein automatisierbares Robotsystem die Proben zwischen den Einzelkomponenten ver- bringt, um weiterhin die Prozessautomatisierung zu gewährleisten.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die zugehörige erfindungsgemäße Vorrichtung können im molekularbiologischen Bereich vielfältig in der Vorbereitung von Zellen und Zellkolonien für nachgelagerte Untersuchungen oder Prozesse Anwendung finden und die notwendigen Arbeiten wesentlich vereinfachen, effektiver und sicherer gestalten.

Anwendungen sind im Bereich der Einzelzell-PCR, entsprechenden Expressions ana- lysen und gentechnischen Nachweisen zu sehen, wie z. B: DNA-Methylierungsstatus, mRNA-Transkriptionsaktivität über Reverse Transkription und PCR, qualitativer und quantitativer Nachweis der Genaktivität, t-RNA-FRET (2-Komponenten- Fluoreszenzmarker wird erst ausgelöst, wenn spezifische markierte t-RNA am Ribo- som aneinandergeraten), Proteomics (Nachweis des Proteins, das von integrierter DNA oder RNA Spezies (z. B. Komponenten von Retroviren) kodiert wird), DNA, RNA, Protein-Sequencing, spektrometrische Analysen, HPLC-Methoden und in der Forensic. Weitere Gebiete der denkbaren Anwendung sind die Transfektion und Mu- tagenese (gezielte Veränderung von Genen), beispielsweise die Nucleotransfection- Methode (Vorlage der DNA-Nanotubes, Ablage der Zelle und dann Druckanwendung oder Zentrifugation um Nanotubes in die Zelle zu bringen), die physiologische Analytik (Chemotaxis, Wachstum, Zelltod, Produktion spezifischer Proteine (Antikörper, antivirale Proteine), Evolutionsstudien, Resistenzanalysen oder die Vorbehandlung von Zellen und Zellkolonien vor Einbringung in Lab-on-Chip-Systeme.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren können vorteilhaft in der Tumorforschung, beispielsweise für die Analyse zirkulierender Tumor- zellen aus Patientenblut, und in der Immunologie, beispielsweise zur Charakterisierung bestimmter Zelltypen des Immunsystems, angewendet werden.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die einzelne Zelle von der die Zelle enthaltenden Probe (Patientenprobe, Zell-Co- Kulturen) bis zur Analyse mit einem automatisierbaren System gehandhabt werden. Dies wird insbesondere ermöglicht durch die Ein-Schritt-Präparation der zuvor selektierten und isolierten Zelle für molekularbiologische Untersuchungen, d. h. die Aufnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien mit einer Kapillare oder Kanüle, in der sich bereits zumindest ein Vorbereitungsmedium befindet und die Abgabe der aufge- nommenen einzelnen Zellen oder Zellkolonien gemeinsam mit dem Vorbereitungsmedium und, falls vorhanden, dem Schutzmedium aus der Kapillare oder Kanüle. Diese gemeinsame Abgabe der aufgenommenen einzelnen Zellen oder Zellkolonien, dem Vorbereitungsmedium und, falls vorhanden, dem Schutzmedium, erfolgt somit gleichzeitig oder mit anderen Worten in einem Schritt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen, die die Erfindung nicht einschränken sollen, unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigen Fig. 1 eine perspektivische Darstellung einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung; eine perspektivische Darstellung eines ersten Werkzeuges der in Fig. 1 gezeigten ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung; eine perspektivische Teildarstellung eines zweiten Werkzeuges der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung; eine schematische Darstellung des Funktionsprinzips des in Fig. 3a gezeigten zweiten Werkzeugs; eine perspektivische Teildarstellung eines zweiten Werkzeuges bei der Aufnahme von Reagenzien aus Vorratsbehältern; eine zweite perspektivische Teildarstellung des zweiten Werkzeuges; eine dritte Teildarstellung des zweiten Werkzeuges; einen schematischen Schnitt eines erfindungsgemäß abgelegten Tropfens mit einer separierten Zelle oder Zellkolonie; eine perspektivische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. eine perspektivische Darstellung einer dritten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Die in Fig. 1 gezeigte erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst eine bildgebende optische Einheit 1 , beispielsweise ein Mikroskop, insbesondere ein Mikroskop mit Kamera. Unter Nutzung der bildgebenden optischen Einheit 1 und einer daran angeschlossenen Bildauswerteeinheit 2, die eine Bildverarbeitungs- Software ausführen kann, erfolgt das Abscannen der die zu separierenden Zellen enthaltenden Probenbehälter 3 (z. B. Petrischalen, Multi wellplatten oder Objektträger), welche sich auf einem motorisierten Kreuztisch 4 befinden. Bei der Bildauswerteeinheit 2, die auch als Bildverarbeitungseinheit bezeichnet wird, kann es sich um einen Personal Computer (PC) mit Bildverarbeitungssoftware handeln.

Anhand definierter geometrischer (z. B. Form, Größe, Formfaktor usw.) und/oder physikalischer Eigenschaften (z.B. Fluoreszenzverhalten, Lumineszenz) werden die zu separierenden einzelnen Zellen oder Zellcluster detektiert und ihre Lage im Pro- benbehälter 3 erfasst. Im Mittelpunkt der Separation stehen verschiedene Werkzeuge 7 für die unterschiedlichen Anforderungen der zu separierenden Zellen und/oder Zellkulturen. So finden Kapillaren Einsatz bei Zellen oder Zellclustern in Suspension oder leichter Anhaftung dieser am Probengefäß. Durch Ansaugen der zu separierenden Zellen oder Zellcluster in die Spitze der Kapillare können diese aus dem Kultur- gefäß gezielt entnommen werden.

Im Unterschied zu dem Verfahren und dem Aufbau der Vorrichtung, die aus WO 2008/034868 A4 bekannt sind, werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren und bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung vor der Zellseparation vorberei- tende Schritte durchgeführt, welche dazu führen, dass nach der Zellseparation die separierten Zellen und/oder Zellkolonien am Zielort sofort mit der Abgabe zur nachfolgenden Analyse vorbereitet werden können, indem sie mit den dafür vorgesehenen Vorbereitungsmedien definiert abgelegt und gegebenenfalls mit einem Schutzmedium, beispielsweise einer Überschichtungsflüssigkeit, gekapselt werden (siehe auch Fig. 7). In Fig. 1 ist der Zielort als Zielposition 5 gezeigt. Dabei kann es sich beispielsweise um einen oder mehrere Objektträger handeln.

Hierzu können mittels eines Werkzeuges 7, das - wie in Fig. 2 gezeigt - eine Pumpe 11 , beispielsweise eine Spritzenpumpe, und eine daran angeschlossenen Kapillare oder Kanüle 12 aufweist, aus Vorratsbehältern 6 die zur Vorbereitung der zur molekularbiologischen Untersuchung benötigten Vorbereitungsmedien in umgekehrter Rei- henfolge in die Kapillare oder Kanüle aufgenommen werden (siehe Fig. 4), in welcher diese Vorbereitungsmedien später die separierte Zelle oder den separierten Zellcluster umschließen sollen. So können z. B. zuerst ein Überschichtungsöl 21 aus einem Vorratsbehälter 6 und einen PCR-Mastermix aus einem anderen Vorratsbehälter 6 nach- einander in die Kapillare oder Kanüle 12 mittels der angeschlossenen Pumpe 11 aufgenommen werden.

Das in Fig. 3a gezeigte zweite Werkzeug 7 entspricht dem in Fig. 2 gezeigten Werkzeug 7, außer dass zusätzlich zu der Pumpe 11 , beispielsweise einer Spritzenpumpe, und einer daran angeschlossenen Kapillare oder Kanüle 12 eine oder mehrere über Ventile angeschlossene Vorratsbehälter 14 vorgesehen sind. Das in Fig. 3 gezeigte zweite Werkzeug ermöglicht die Arbeit z. B. mit dem Überschichtungsöl 21 als Systemflüssigkeit und erspart damit auch diesen Schritt, d. h. die Aufnahme der Systemflüssigkeit 21 oder zusätzlich auch von Vorbereitungsmedien aus den Vorratsbehäl- tern 6. Vielmehr sind einer oder mehrere, bevorzugt alle Vorratsbehälter in das Werkzeug 7 integriert.

Wie in Fig. 3b gezeigt, wird die Systemflüssigkeit 21 aus dem Vorratsbehälter 14 über das Ventil 13 mittels der Pumpe 11 in die Kapillare/Kanüle 12 gegeben. Die benötig - ten Vorbereitungsmedien 22, 23 befinden sich nun in der richtigen Reihenfolge und Menge in der Kapillare oder Kanüle 12 (siehe Fig. 5). Bei der Kapillare oder Kanüle 12 kann es sich beispielsweise um eine Glaskapillare handeln. Bei dem in Fig. 5 gezeigten Beispiel befinden sich folgende Medien in der folgenden Reihenfolge in der Kapillare oder Kanüle 12, beginnend an dem freien Ende der Kapillare oder Kanü- le 12, d. h. der Spitze: erstes Vorbereitungsmedium 22/zweites Vorbereitungsmedium 23/Überschichtungsöl 21.

Um die Systemflüssigkeit 21 aus dem Vorratsbehälter 14 aufzunehmen, ist, wie in Fig. 3b gezeigt, ein Ventil 13 vorgesehen. Dieses Ventil 13 stellt in seiner Stellung A eine Verbindung a zwischen dem Vorratsbehälter 14 und der Pumpe 11 her, während die Verbindung b zwischen der Pumpe 11 und der Kapillare oder Kanüle 12 ver- schlössen ist. Wird nun mittels der Pumpe 11 , beispielsweise durch eine Hubbewegung eines Kolbens (Pfeil B), ein Unterdruck erzeugt, so kann eine vorgegebene Menge der Systemflüssigkeit 21 aus dem Vorratsbehälter 14 in den Hohlraum der Pumpe 11 gesaugt werden (Pfeil A). Anschließend wird mittels des Ventils 13 die Verbindung a verschlossen und die Verbindung b geöffnet. Nun kann mittels der Pumpe 11 , beispielsweise durch eine Senkbewegung des Kolbens (Pfeil B), ein Überdruck erzeugt werden, der die zuvor angesaugte Menge an Systemflüssigkeit 21 aus dem Hohlraum der Pumpe 11 in die Kapillare oder Kanüle 12 drückt. Die benötigten Vorbereitungsmedien 22, 23 können anschließend aus Vorratsbehältern 6 entnommen werden, die nicht auf dem Werkzeug 7 angeordnet sind. Zur Entnahme der Vorbereitungsmedien 21 , 22 ist eine Bewegung des Werkzeuges 7 mittels des Robotsystems 8, das Teil der Vorrichtung ist (siehe Fig. 1), erforderlich. Dabei wird das Werkzeug 7 so geführt, dass die Kapillare oder Kanüle 12 in Kontakt mit einem zweiten Vorbereitungsmedium 23, das sich in einem ersten Vorratsbehälter 6 befindet, gelangt (siehe Fig. 4). Mittels der Pumpe 11 wird dann das zweite Vorbereitungsmedium 22 in einer vorgegebenen Menge aus dem Vorratsbehälter 6 in die Kapillare oder Kanüle 12 gesaugt, in der sich bereits eine vorgegebene Menge an Systemflüssigkeit 21 befindet. Schließlich wird das Werkzeug 7 mittels des Robotsystems 8 zu einem zweiten Vorratsbehälter 6, in dem sich ein erstes Vorbereitungsmedium 22 (Medium 1) zur Vor- bereitung nachfolgender Prozesse befindet, bewegt, so dass mittels der Pumpe 11 erstes Vorbereitungsmedium in einer vorgegebenen Menge in die Kapillare oder Kanüle 12 gesaugt werden kann, in der sich bereits die Systemflüssigkeit 21 und das zweite Vorbereitungsmedium 23 befinden. Es ist in Fig. 3 zu erkennen, dass die Pumpe 11 über eine Zuleitung 15 mit der Pumpe 11 verbunden ist. Die Zuleitung 15 umfasst dabei einen ersten Abschnitt 15a, der sich von dem Ventil 13 zur Kapillare oder Kanüle 12 erstreckt, sowie einen zweiten Abschnitt 15b, der sich vom Ventil 13 zur Pumpe 11 erstreckt. Die Zuleitung 15 ist geöffnet, wenn sich das Ventil in Stellung b befindet, d. h. die Verbindung b geöffnet und die Verbindung a geschlossen ist. Bei der in Fig. 2 gezeigten Ausführangsform des Werkzeuges 7 müssen hingegen die Systemflüssigkeit 21 und die Vorbereitungsmedien 22, 23 aus Vorratsbehälter 6 entnommen werden, die nicht auf dem Werkzeug 7 selbst angeordnet sind. Zur Entnahme der Systemflüssigkeiten 21 ist bei diesem Werkzeug 7 eine Positionierung des Werkzeuges 7 mittels des Robotsystems 8 erforderlich. Dabei wird das Werkzeug 7 so geführt, dass die Kapillare oder Kanüle 12 in Kontakt mit der Systemflüssigkeit 21 , die sich in einem Vorratsbehälter 6 befindet, gelangt. Mittels der Pumpe 11 wird dann Systemflüssigkeit 21 in einer vorgegebenen Menge aus dem Vorratsbehälter in die Kapillare oder Kanüle 12 gesaugt. Anschließend wird mittels des Robotsystems 8 das Werkzeug 7 zu einem zweiten Vorratsbehälter 6, in dem sich ein zweites Vorbereitungsmedien 22 (Medium 2) zur Vorbereitung nachfolgender Prozesse befindet, bewegt, so dass mittels der Pumpe 11 zweites Vorbereitungsmedium in einer vorgegebenen Menge in die Kapillare oder Kanüle 12 gesaugt werden kann. Schließlich wird das Werkzeug 7 mittels des Robotsystems 8 zu einem dritten Vorratsbehälter 6, in dem sich ein erstes Vorbereitungsmedium 22 (Vorbereitungsmedium 1) zur Vorbereitung nachfolgender Prozesse befindet, bewegt, so dass mittels der Pumpe 11 erstes Vorbereitungsmedium in einer vorgegebenen Menge in die Kapillare oder Kanüle 12 gesaugt werden kann. Damit befinden sich die benötigten Medien nun auch bei Verwendung des in Fig. 2 gezeigten Werkzeuges 7 in der richtigen Reihenfolge und Menge in der Kapillare oder Kanüle 12 (siehe Fig. 5).

Es ist in Fig. 2 zu erkennen, dass eine Zuleitung 15 vorgesehen ist, die die Pumpe 11 mit der Kapillare oder Kanüle 12 verbindet. In der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung befinden sich die Vorratsbehälter 6 auf der Oberseite des Gehäuses des Robotsystems 8.

Im nächsten Schritt erfolgt die Separation der einzelnen Zelle 31 oder des Zellclusters durch Aufsaugen in die Kapillare oder Kanüle 12. Dabei kann ein vorheriger Kratz- Vorgang zur Lockerung adhärenter Zellkolonien vorgesehen sein. Den Füllzustand der Kapillare oder Kanüle 12 nach erfolgreicher Aufnahme der Zelle oder Zellkolonie 31 stellt Fig. 6 dar. In der Kapillare oder Kanüle 12 befinden sich dann, ausgehend von der in Fig. 5 gezeigten Reihenfolge, folgende Substanzen in der folgenden Reihenfolge, beginnend an dem freien Ende der Kapillare oder Kanüle 12, d. h. der Spitze: Probenmedium 24 mit Zelle oder Zellkolonie 31/erstes Vorbereitungsmedium 22/zweites Vorbereitungsmedium 23/Überschichtungsöl 21.

Wird eine Kapillare oder Kanüle 12 eingesetzt, die vor der Aufnahme der Zelle oder Zellkolonie 31 mit anderen Medien und/oder einer anderen Reihenfolge der Substanzen gefüllt worden ist, so kann sich eine abweichende Füllung der Kapillare oder Ka- nüle 12 ergeben. Enthielt die Kapillare oder Kanüle 12 vor Aufnahme der Zelle oder Zellkolonie 31 folgende Medien in der folgenden Reihenfolge, ausgehend von der Spitze: Vorbereitungsmedium /Überschichtungsöl/Systemflüssigkeit, so wird nach der Aufnahme der Zelle oder Zellkolonie 31 in die Kapillare oder Kanüle 12 folgende Reihenfolge enthalten, ausgehend von der Spitze: Probenmedium mit Zelle oder Zell- kolonie/ Vorbereitungsmedium/Überschichtungsöl/Systemflüssigkeit. In diesem Fall ist eine gesonderte Systemflüssigkeit vorgesehen, die von dem Überschichtungsöl verschieden ist.

Bei der sich anschließenden Abgabe der separierten Zelle oder Zellkolonie 31 werden in einem Schritt die bereits in der Kapillare oder Kanüle 12 vorgehaltenen Vorbereitungsmedien zur Vorbereitung der molekularbiologischen Untersuchungen über der zuerst austretenden Zelle/Zellkolonie als Tropfen abgegeben (und ggf. durchmischt) und diese Vorbereitungsmedien ggf. mit einem geeigneten Schutzmedium (z. B. Überschichtungsöl) von der Umgebung weitgehend abgeschlossen. Den Zustand nach der Abgabe zeigt Fig. 7.

Es ist in Fig. 7 zu erkennen, dass sich die Substanzen, die in der Kapillare oder Kanüle 12 enthalten waren, nun in umgekehrter Reigenfolge an der Zielposition 5, beispielsweise auf einem Gefäßboden oder auf einem Objektträger befinden. Ausge- nommen davon ist vorzugsweise die Systemflüssigkeit, soweit nicht das Überschich- tungsöl 21 als Systemflüssigkeit eingesetzt wurde. Die Systemflüssigkeit sollte in der Kapillare oder Kanüle 12 verbleiben.

In Fig. 7 liegt die separierte Zelle oder Zellkolonie 31 unmittelbar auf der Oberseite des Gefäßbodens oder auf einem Objektträger auf. Die Medien 22, 23, 24 sind vermischt und umgegeben als Gemisch 25, das auch als Medienmix bezeichnet werden kann, die Zelle oder Zellkolonie 31 in Form eines Tropfens. Die der Zelle oder Zellkolonie 31 abgewandte Seite des Tropfens aus dem Gemisch 25 ist mit dem Über- schichtungsöl 21 überschichtet. Bei der Verwendung mehrerer Vorbereitungsmedien 22, 23 kommt es nach der Abgabe der Zelle oder Zellkolonie 31 an der Zielposition 5 zu einer gewünschten Vermischung der Vorbereitungsmedien 22, 23 und der anschließenden Überschichtung.

Es muss sich nicht zwingend um ein Gemisch 25 aus Vorbereitungsmedien handeln. Enthält die Kapillare oder Kanüle 12 vor Aufnahme der Zelle oder Zellkolonie 31 nur ein Vorbereitungsmedium und ist dieses Vorbereitungsmedium chemisch identisch mit dem Probenmedium 24, das die Zelle oder Zellkolonie 31 enthält, so ist die Zelle oder Zellkolonie 31 auf dem Gefäßboden 32 oder auf einem Objektträger nur mit einem Vorbereitungsmedium überschichtet, das wiederum von dem Überschichtungs- öl 21 überschichtet sein kann.

Ein weiterer Vorteil der sofortigen Überschichtung der separierten Probe, d. h. der Zelle oder Zellkolonie 31 , ist deren sofortiger Abschluss von der Umgebung. Dadurch können z. B. Verdunstungsprozesse der die Zelle und Zellkolonie umgebende Vorbe- reitungsflüssigkeit 22, 23, 25 (z. B. PCR-Mastermix) verhindert werden, wodurch stabile Konzentrationen dieser Vorbereitungsmedien 22, 23, 25 erreicht und mit Konzentrationsänderungen oftmals einhergehende Verfälschungen der Ergebnisse der nachfolgenden molekularbiologischen Untersuchung vermieden werden. Die mit dem beschriebenen Verfahren vorbereiteten Proben können nun molekularbiologischen Analysen, wie sie z.B. in Thermocyclern erfolgt, direkt zugeführt werden. Beispielsweise besteht die Möglichkeit, das Zielgefäß direkt in einem Thermocycler zu beschicken, indem dieser in die erfindungsgemäße Vorrichtung integriert wird. Die in Fig. 8 gezeigte zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung um- fasst demgemäß einen Thermocycler. Abgesehen davon entspricht die zweite Ausfüh- rungsform der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform, wobei die Zielposition nun nicht mehr die in Fig. 1 gezeigte Zielposition 5 mit Objektträgern, sondern ein Zielgefäß direkt in dem Thermocycler (Bezugszeichen 9 in Fig. 8) ist.

Weitere Ausbaustufen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Aufbauten, welche beispielsweise das gezielte Entnehmen der Proben im Anschluss an die thermische Vervielfältigung der DNA/RNA-Sequenzen ermöglichen und deren Verbringung in Gelkammern zur Elektrophorese oder in Geldokumentationssysteme zur Auswertung übernehmen, so dass der gesamte Prozess von der Selektion über die Separation und Probenvorbereitung bis zur Probenauswertung in einem Aufbau voll automatisiert ab- laufen kann (siehe Fig. 9). Die in Fig. 9 gezeigte, dritte Ausführungsform entspricht der zweiten Ausführungsform, außer dass zusätzlich eine Analysevorbereitung oder ein Analysesystem 10, beispielsweise eine Gelkammer oder ein Geldokumentationssystem, vorgesehen sind. Anwendungen sind im Bereich der Einzelzell-PCR, entsprechenden Expressions ana- lysen und gentechnischen Nachweisen zu sehen, wie z. B: DNA-Methylierungsstatus, mRNA-Transkriptionsaktivität über Reverse Transkription und PCR, qualitativer und quantitativer Nachweis der Genaktivität, t-RNA-FRET (2-Komponenten- Fluoreszenzmarker wird erst ausgelöst, wenn spezifische markierte t-RNA am Ribo- som aneinandergeraten), Proteomics (Nachweis des Proteins, das von integrierter DNA oder RNA Spezies (z. B. Komponenten von Retroviren) kodiert wird), DNA, RNA, Protein-Sequencing, spektrometrische Analysen, HPLC-Methoden und in der Forensic. Weitere Gebiete der denkbaren Anwendung sind die Transfektion und Mu- tagenese (gezielte Veränderung von Genen), beispielsweise die Nucleotransfection- Methode (Vorlage der DNA-Nanotubes, Ablage der Zelle und dann Druckanwendung oder Zentrifugation um Nanotubes in die Zelle zu bringen), die physiologische Analy- tik (Chemotaxis, Wachstum, Zelltod, Produktion spezifischer Proteine (Antikörper, antivirale Proteine), Evolutionsstudien, Resistenzanalysen oder die Vorbehandlung von Zellen und Zellkolonien vor Einbringung in Lab-on-Chip-Systeme. Beispiel 1

Es wurde 120 Proben in separaten Probengefäßen bereitgestellt. Aus jedem Probenbehälter sollten einzelne Zellen mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens entnommen werden. Mit den entnommenen Zellen wurden zwei aufeinanderfolgende biologische Untersuchungen durchgeführt. Die ers- te biologische Untersuchung war eine RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase- Kettenreaktion). Dabei wurde der in den entnommenen Zellen vorhandene mRNA- Pool in DNA umgeschrieben. Die zweite biologische Untersuchung war eine qRT- PCR (Real time quantitative PCR), wobei über die Quantifizierung vorbestimmter DNA-Moleküle mittels selektiv wirkender Primer Aussagen darüber gewonnen wer- den können, ob bestimmte Gene in den zu analysierenden Zellen gerade aktiv waren.

Für die RT-PCR wurde ein Vorbereitungsmedium hergestellt, das die in Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung hatte. Ein solches Vorbereitungsmedium für eine RT-PCR wird dort als„Reverse Transcription Master Mix" bezeichnet. Das Vorbereitungsme- dium wurde in einen Vorratsbehälter der erfindungsgemäßen Vorrichtung gegeben.

Tabelle 1: Zusammensetzung des Vorbereitungsmedium für RT-PCR

Komponente 1 Probe 120 Proben

2x Single Cell RT Reaction Buffer 0,50 μΐ 60,0 μΐ

RNase Inhibitor (10 U/ L) 0,02 μΐ 2,4 μΐ

5x Single Cell RT Enhancer 0,15 μΐ 18,0 μΐ

RT Primer mix (20 μΜ ) 0,02 μΐ 2,4 μΐ

Single Cell RT Enzyme Mix 0,04 μΐ 4,8 μΐ

Nuclease-freies Wasser 0,07 μΐ 8,4 μΐ

Gesamtvolumen 0,8 ^1 96 μ\ Es ist Tabelle 1 zu entnehmen, dass aus dem Vorratsgefäß für das Vorbereitungsmedium mittels der Kapillare oder Kanüle des Werkzeuges jeweils das Volumen an Vorbereitungsmedium aus dem Vorratsbehälter aufgenommen wurde, das für die erste biologische Untersuchung erforderlich war (0,8 il). Anschließend wurde jeweils eine detektierte und selektierte einzelne Zelle dieser Probe mit der Kapillare oder Kanüle in einem Volumen von 0,2 μ\ aufgenommen. Schließlich wurde die aufgenommene einzelne Zelle an der Zielposition zusammen mit dem Vorbereitungsmedium (d.h. entsprechend einem Gesamtvolumen von 1 μ\) in einem Schritt abgelegt und dort der RT-PCR unterzogen. Die RT-PCR wurde in einem in der erfindungsgemäßen Vor- richtung integrierten Thermocycler bei 42° C für 10 min, bei 50 °C für 10 min und bei 58°C für 30 min durchgeführt.

Mehrere Zellen wurden parallel untersucht. Dazu wurden die isolierten einzelnen Zellen an unterschiedlichen Zielpositionen abgelegt. Die Zielpositionen konnten sich auf PCR-Platten oder speziellen Objektträgern mit hydrophilen Ankerpositionen befinden.

Die anschließende qRT-PCR war eine Standard-qRT-PCR, die in einem kommerziell erhältlichen qRT-PCR-Cycler durchgeführt wurde. Dazu wurden im Anschluss an die RT-PCR qRT-PCR-Reaktionsansätze vorbereitet, indem jeweils 3 μΐ PCR-reines Wasser in Vertiefungen einer Multi wellplatte bzw. PCR-Platte vorgelegt und mit 9 μ\ eines gemäß Tabelle 2 hergestellten qRT-PCR-Mastermixes vermischt wurde. Jeweils 1 uL cDNA-Gemisch wurde für jede qRT-PCR von den Zielpositionen der ersten biologischen Untersuchung, d.h. der RT-PCR, entnommen und zu dem jeweiligen qRT- PCR-Reaktionsansatz zugegeben. Die qRT-PCR schließlich wurde nach dem in Tabelle 3 angegebenen Programm durchgeführt.

Tabelle 2: Mastermix qRT-PCR

Komponente 1 Probe 10 Proben

Brilliant® II FAST SYBR® Green QPCR Master Mix (2x) 5,0 /d 50 /d

Primer sense (10 μΜ) 0,6 /d 6 μ\ Primer antisense (10 μΜ) 0,6 /d 6 μ\

PCR-reines Wasser 2,8 /il 28 /d

Gesamt 9 μΙ 90 /d

Tabelle 3: qRT-PCR

Temperatur Zeit Anmerkung

95 °C 2 min

95°C 5 sec 45 Zyklen

60 °C 20 sec

Dis soziationskurve :

95 °C 1 min

55 °C bis zu 95 °C

Bezugszeichenliste

1 bildgebende optische Einheit

2 Bildauswerteeinheit

3 Probenbehälter

4 Kreuztisch

5 Zielposition, z. B. Objektträger

6 Vorratsbehälter mit Reagenzien zur Vorbereitung nachfolgender Reaktionen

7 Werkzeug

8 Robotsystem zur Positionierung des Werkzeuges

9 Zielposition Thermocycler

10 Analysevorbereitung oder Analysesystem (z. B. Gelkammer oder Geldokumentationssystem)

11 Spritze oder Pumpe

12 Kapillare oder Kanüle

13 Ventil

14 Vorratsbehälter

15 Zuleitung zur Pumpe oder Spritze

21 Systemflüssigkeit oder Überschichtungsöl

22 Medium 1 zur Vorbereitung nachfolgender Prozesse (Vorbereitungsmedium 1)

23 Medium 2 zur Vorbereitung nachfolgender Prozesse (Vorbereitungsmedium 2)

24 Probenmedium mit Zelle oder Zellkolonie 31

25 Medienmix oder Vorbereitungsmedium 31 Zelle oder Zellkolonie

32 Gefäßboden

Claims

Patentansprüche

1. Vorrichtung zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, umfassend eine mittels eines Robotsystems (8) bewegliche Entnahmeeinheit (7) zur Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien (31) aus einem Probenbehälter (3) und Ablage der Zellen oder Zellkolonien (31) an einer vorgegebenen Ablageposition (5, 9), wobei die Entnahmeeinheit (7) mindestens eine Kapillare oder Kanüle (12) zur Aufnahme der einzelnen Zellen o- der Zellkolonien (31) aus dem Probenbehälter (3) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare oder Kanüle (12) der Entnahmeeinheit (7) vor der Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien (31) aus dem Probenbehälter (3) zumindest ein Medium enthält, das ein Vorbereitungsmedium (22, 23, 25), das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien (31) benötigt wird, ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare oder Kanüle (12) der Entnahmeeinheit (7) vor der Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien (31) aus dem Probenbehälter (3) folgende Medien enthält:

- das zumindest eine Vorbereitungsmedium (22, 23, 25), das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien (31) benötigt wird; und

- ein Schutzmedium (21) für das Vorbereitungsmedium (22, 23, 25) und/oder eine Systemflüssigkeit, die für das Aufnehmen von Medien (21 , 22, 23, 25) in die Kapillare oder Kanüle (12) oder das Abgeben von Medien (21 , 22, 23, 25) aus der Kapillare oder Kanüle (12) benötigt wird.

3. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner Vorratsbehälter (6, 14) für die Medien umfasst, wobei zumindest einer der Vorratsbehälter (14) auf der Entnahmeeinheit (7) angeordnet ist.

Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ferner eine Pumpe oder Spritze (11) für das Aufnehmen von Medien in die Kapillare oder Kanüle (12) und das Abgeben von Medien aus der Kapillare oder Kanüle (12) umfasst.

Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Pumpe oder Spritze (11) auf der Entnahmeeinheit (7) angeordnet ist.

Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Entnahmeeinheit (7) ein Ventil (13) angeordnet ist, das die Entnahme eines Mediums aus dem Vorratsbehälter (14) und die Abgabe des entnommenen Mediums in die Kapillare oder Kanüle (12) ermöglicht.

Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Pumpe oder Spritze (11) einen Hohlraum aufweist, in dem das Medium nach dessen Entnahme aus dem Vorratsbehälter (14) und vor der Abgabe in die Kapillare oder Kanüle (12) zwischengespeichert ist.

Verfahren zur automatisierten Präparation von Zellen für molekularbiologische Untersuchungen, insbesondere mittels einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die Entnahme einzelner Zellen oder Zellkolonien (31) aus einem Probenbehälter (3) mittels einer Kapillare oder Kanüle (12) umfasst, die ein Medium enthält, das ein Vorbereitungsmedium (22, 23, 25), das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien (31) benötigt wird, ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare oder Kanüle (12), mit der einzelne Zellen oder Zellkolonien (31) aus einem Probenbehälter (3) entnommen werden, folgende Medien enthält: - das zumindest eine Vorbereitungsmedium (22, 23, 25), das für eine molekularbiologische Untersuchung der zu entnehmenden Zellen oder Zellkolonien (31) benötigt wird; und

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Medien (21 , 22, 23) mittels einer Pumpe oder Spritze (11), die auf einer mittels eines Robotsystems (8) beweglichen Entnahmeeinheit (7) angeordnet ist, aus Vorratsbehältern (6, 14) entnommen und von der Kapillare oder Kanüle (12) aufgenommen werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst:

(a) Aufnehmen von Systemflüssigkeit in die Kapillare oder Kanüle (12) aus einem ersten Vorratsbehälter;

(b) Aufnehmen von Schutzmedium (21) in die Kapillare oder Kanüle (12), in der sich bereits die Systemflüssigkeit befindet, aus einem zweiten Vorratsbehälter;

(c) Aufnehmen eines Vorbereitungsmediums (22, 23) in die Kapillare oder Kanüle (12), in der sich bereits die Systemflüssigkeit und das Schutzmedium (21) befinden, aus einem dritten Vorratsbehälter;

(d) ein- oder mehrfaches Wiederholen von Schritt (c), falls ein weiteres Vorbereitungsmedium in die Kapillare oder Kanüle (12) aufgenommen werden soll, wobei die Medien in der folgenden Reihenfolge in der Kapillare oder Kanüle (12) enthalten sind: Vorbereitungsmedium oder -medien (22, 23 )/Schutzmedium (21 )/S y stemflüssigkeit .

12. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst:

(a') Aufnehmen von Schutzmedium (21) in die Kapillare oder Kanüle (12) aus einem ersten Vorratsbehälter;

(b') Aufnehmen eines Vorbereitungsmediums (22, 23) in die Kapillare oder Kanüle (12), in der sich bereits das Schutzmedium (21) befindet, aus einem dritten Vorratsbehälter;

(c') ein- oder mehrfaches Wiederholen von Schritt (b'), falls ein weiteres Vorbereitungsmedium in die Kapillare oder Kanüle (12) aufgenommen werden soll, wobei die Medien in der folgenden Reihenfolge in der Kapillare oder Kanüle (12) enthalten sind: Vorbereitungsmedium oder -medien (22, 23 )/Schutzmedium .

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eines der Medien aus einem Vorratsbehälter (14) entnommen wird, der auf der Entnahmeeinheit (7) angeordnet ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium aus dem Vorratsbehälter (14) in einen Hohlraum der Pumpe oder Spritze (11) geführt und von dort in die Kapillare oder Kanüle (12) geführt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es das Aufnehmen der einzelnen Zellen oder Zellkolonien (31) mittels der Kapillare oder Kanüle (12), die zumindest das Vorbereitungsmedium enthält, und die Abgabe der aufgenommenen einzelnen Zellen oder Zellkolonien (31) aus der Kapillare oder Kanüle (12) an einer vorgegebenen Zielposition (5, 9) umfasst.

Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es vor der Aufnahme der einzelnen Zellen oder Zellkolonien (31) mittels der Kapillare oder Kanüle (12) die folgenden Schritte umfasst:

(a) das Abscannen eines Probengefäßes (3), das die einzelnen Zellen oder Zellkolonien (31) enthält, mittels einer bildgebenden optischen Einheit unter Erhalt einen Bildes; und (b) Selektion der einzelnen Zellen oder Zellkolonien (31) mittels eines Bildanalysesystems anhand des in Schritt (a) erhaltenen Bildes.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) die Bestimmung von Positionsdaten der zu selektierenden Zellen oder Zellkolonien (31) umfasst, anhand derer die Kapillare oder Kanüle (12), die zumindest das

Vorbereitungsmedium enthält, mittels der von dem Robotsystem (8) bewegten Entnahmeeinheit (7) zu den einzelnen Zellen oder Zellkolonien (31) in dem Probengefäß geführt wird.

18. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur automatisierten Präparation von Zellen für eine PCR- Analyse.