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Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zum Vorlagern wenigstens eines Reagenzes in einem mikrofluidischen System, insbesondere in einem Lab-on-Chip-System sowie einem mikrofluidischen System nach Gattung der unabhängigen Ansprüche.
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Stand der Technik
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Die
EP 2 080 554 B1 offenbart ein Verfahren zum Aufbewahren eines Reagenzes in einer mikrofluidischen Vorrichtung.
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Offenbarung der Erfindung
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Vor diesem Hintergrund wird mit dem hier vorgestellten Ansatz ein Verfahren zum Vorlagern wenigstens eines Reagenzes in einem mikrofluidischen System, insbesondere in einem Lab-on-Chip-System, vorgestellt. Das Verfahren weist einen Schritt des Einbringens des Reagenzes in eine Kavität des mikrofluidischen Systems sowie einen Schritt des Aufbringens einer Schutzschicht auf das Reagenz auf, so dass das Reagenz wenigstens teilweise durch die Schutzschicht bedeckt wird.
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Unter einem Vorlagern eines Reagenzes kann hierbei ein vorheriges Einbringen oder Befüllen der Kavität in dem mikrofluidischen System, wie bspw. einem mikrofluidischen Kanal, einer mikrofluidischen Kammer oder einem sonstigen mikrofluidischen Reaktionsvolumen vor einer eigentlichen, insbesondere nachfolgenden, Nutzung des Reagenzes verstanden werden. Unter einem Reagenz kann ein Stoff verstanden werden, der bei Kontakt mit bestimmten anderen Stoffen oder Materialien eine spezifische Reaktion zeigt. Es kann sich hierbei um ein Synthesereagenz und insbesondere um ein Nachweisreagenz handeln.
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Durch die Schutzschicht wird das Reagenz wenigstens temporär vor äußeren Einflüssen geschützt. So können bspw. unerwünschte chemische Reaktionen des Reagenzes mit Stoffen aus seiner direkten Umgebung verhindert oder wenigstens verzögert werden. Weiterhin bietet die Schutzschicht auch Schutz vor mechanischem Abtragen des Reagenzes durch bspw. Flüssigkeitsströme und/oder Gasströme, mit welchen das mikrofluidische System, insbesondere die darin befindlichen Kanäle, Kavitäten und/oder Reaktionsvolumina, gespült werden, um bspw. Luftblasen aus dem mikrofluidischen System zu entfernen.
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Indem die Schutzschicht das Reagenz wenigstens teilweise bedeckt, kann ein vorzeitiges Auflösen des Reagenzes durch einen das mikrofluidische System spülenden Fluidstrom in vorteilhafterweise verhindert oder wenigstens verzögert werden. Weiterhin kann hierdurch erreicht werden, dass bei einem Spülen des mikrofluidischen Systems mit dem Fluidstrom Teile des Reagenzes in weitere Kanäle, Kavität und/oder Reaktionsvolumina des mikrofluidischen Systems gelangen, diese somit kontaminieren und dort ablaufende Prozesse stören.
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In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann die Schutzschicht auch vollständig auf das Reagenz, auf weitere Kavitäten und/oder auf eine gesamte Oberfläche des mikrofluidischen Systems aufgebracht werden. Indem die Schutzschicht auf einen definierten Teil der Oberfläche des Reagenzes aufgebracht wird, kann die Art und Weise, wie sich das Reagenz in einem für nachfolgende Prozesse notwendigen Lösemittel in der Kavität löst, gezielt eingestellt werden.
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Indem die Schutzschicht in flüssiger Form aufgebracht wird, kann in einfacher Weise eine genau dosierte Menge eines die spätere Schutzschicht bildenden Materials auf das Reagenz aufgetragen werden. Dies kann bspw. mittels Spotting (wie bei der Herstellung von Microarrays eingesetzt), Micordispensing, Mikrodosierung, manuellem oder automatisiertem Pipettieren, Inkjet-Verfahren, Siebdruckverfahren und/oder Spraycoating-Verfahren erfolgen.
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Es ist von Vorteil, wenn die Schutzschicht ein Polyether aufweist. Denn Polyether können in einfacher Weise mit gezielt einstellbaren chemischen und physikalischen Eigenschaften hergestellt werden. So kann bspw. ein Schmelzpunkt und/oder eine Löslichkeit des Polyethers bspw. in Wasser gezielt bei der Herstellung des Polyethers beeinflusst werden. Es ist insbesondere von Vorteil, wenn das Polyether ein Polyethylenglycol (PEG) ist. PEG ist ein flüssiges oder festes, wasserlösliches und nicht toxisches Polymer, dessen Eigenschaften durch eine gezielte Einstellung der Kettenlänge des Polymers einstellbar ist. Insbesondere kann es sich bei dem PEG um das PEG 6000 handeln. PEG 6000 weist eine zahlenmittlere Masse von 6000 g pro mol auf.
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Durch die Verwendung von PEG 6000 kann in besonders einfacher und günstiger Weise eine Schutzschicht auf das Reagenz aufgebracht werden.
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Ferner ist es vorteilhaft, wenn der Polyether in wässeriger Lösung vorliegt. Denn hierdurch kann er in einfacher Weise als Schutzschicht auf das Reagenz aufgebracht werden. Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn der Polyether in wässeriger Lösung mit einer Konzentration in einem Bereich von 2 % bis 40 %, bevorzugt in einem Bereich von 10% bis 30 % und besonderes bevorzugt in einem Bereich von 15 % bis 25 % vorliegt. Denn dieser Bereich eignet sich besonders dazu, den Polyether als Schutzschicht auf das Reagenz aufzubringen.
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Ferner ist es vorteilhaft, wenn nach dem Schritt des Aufbringens der Schutzschicht ein Schritt des Eintrocknens der Schutzschicht erfolgt. Denn hierdurch bildet sich eine gegenüber äußeren Einflüssen besonders stabile Schutzschicht aus.
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Unter dem Eintrocknen der Schutzschicht kann hierbei das Entweichen des in der wässrigen Lösung bzw. in der Schutzschicht enthaltenen Wasser verstanden werden. Insbesondere kann darunter ein Verdunsten des Wassers verstanden werden. Vorzugsweise kann darunter ein Verdunsten des Wassers an Luft verstanden werden. Alternativ oder zusätzlich kann der Schritt des Eintrocknens einen Schritt des Lyophilisierens bzw. des Gefriertrocknens aufweisen. Hierbei wird die noch flüssige Schutzschicht zuerst soweit herabgekühlt, dass das in ihr enthaltene Wasser gefriert, und nachfolgend wird durch eine Absenkung eines Umgebungsdrucks das gefrorene Wasser aus der Schutzschicht sublimiert.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Reagenz in flüssiger Form aufgebracht werden. Hierdurch kann das Reagenz in besonders einfacher Weise in die Kavität bzw. in das mikrofluidische System eingebracht werden. Es ist vorteilhaft, wenn nach dem Schritt des Einbringens des Reagenzes in flüssiger Form ein Schritt des Eintrocknens des in flüssiger Form vorliegenden Reagenzes erfolgt. Unter dem Eintrocknen des Reagenzes kann hierbei das Entweichen des in dem insbesondere in wässriger Lösung vorliegenden Reagenz enthaltenen Wassers verstanden werden. Insbesondere kann darunter ein Verdunsten des Wassers verstanden werden. Vorzugsweise kann darunter ein Verdunsten des Wassers an Luft verstanden werden. Alternativ oder zusätzlich kann der Schritt des Eintrocknens des Reagenzes einen Schritt des Erwärmens des Reagenzes aufweisen, so dass ein Verdunsten bzw. Verdampfen des Wassers aus dem insbesondere in wässriger Lösung vorliegenden Reagenz unterstützt wird.
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Denn hierdurch wird gewährleistet, dass das Reagenz in der Kavität bzw. in dem mikrofluidischen System an dem Ort seines Einbringens verbleibt, und sich nicht ungewollt innerhalb des mikrofluidischen Systems verteilt. Hierdurch kann die Schutzschicht das Reagenz zielgerichtet und besonders effektiv bedecken.
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Ferner ist es zweckmäßig, wenn in den Schritten des Eintrocknens das Reagenz und/oder die Schutzschicht gefriergetrocknet werden. Denn hierdurch wird in besonders einfacher Weise das Reagenz und/oder die Schutzschicht von dem darin enthaltenen Wasser befreit, so dass sich ein festes Reagenz und/oder eine feste Schutzschicht ausbilden.
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Es ist weiterhin von Vorteil, wenn die mikrofluidische Vorrichtung wenigstens zwei Kavitäten umfasst und im Schritt des Einbringens jeweils wenigstens ein Reagenz in die wenigstens zwei Kavitäten eingebracht wird. Mit anderen Worten kann die mikrofluidische Vorrichtung eine Vielzahl von Kavitäten umfassen und wenigstens zwei oder mehrere Kavitäten können jeweils wenigstens ein Reagenz enthalten. Es ist daher auch möglich, das bspw. in einer Kavität zwei oder mehrere Reagenzien enthalten sind. Optional kann vorgesehen sein, dass sich die Reagenzien in den verschiedenen Kavitäten unterscheiden. Hierdurch können verschiedene Reagenzien in unterschiedlichen Kavitäten der mikrofluidischen Vorrichtung bzw. des mikrofluidischen Systems vorgelagert werden, um sie ihrer späteren Verwendung zu gegebenen, bestimmbaren Zeitpunkten zuzuführen.
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Indem jedes der Mehrzahl an Reagenzien in der Mehrzahl an Kavitäten mit der Schutzschicht bedeckt sind, werden Querkontaminationen zwischen den einzelnen Kavitäten durch die verschiedenen vorgelagerten Reagenzien wirkungsvoll verhindert. Insbesondere dadurch, dass die Schutzschicht alle Reagenzien bedeckt, bevorzugt alle Kavitäten bedeckt und besonders bevorzugt das ganze mikrofluidische System bedeckt, kann das mikrofluidische System vor seiner Verwendung mit einer Flüssigkeit vorgespült werden, um eingeschlossene Luft aus den Kavitäten des Systems zu verdrängen.
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Ferner ist es von Vorteil, wenn der Schritt des Einbringens des Reagenzes wenigstens einmal wiederholt wird. Optional kann hierbei auch der Schritt des Trocknens des Reagenzes wenigstens einmal wiederholt werden. Hierdurch kann in vorteilhafterweise eine Menge des einzubringenden bzw. eingebrachten Reagenzes in die Kavität kontrolliert werden.
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Weiterhin ist es von Vorteil, wenn der Schritt des Aufbringens der Schutzschicht auf das Reagenz jeweils wenigstens einmal wiederholt wird. Denn hierdurch kann in einfacher Weise eine Dicke der Schutzschicht im Wesentlichen variabel eingestellt werden. Durch die Dicke der Schutzschicht kann wenigstens bereichsweise eine mechanische Widerstandsfähigkeit der Schutzschicht und damit die Schutzwirkung für das darunterliegende Reagenz eingestellt werden. Insbesondere kann über die Dicke der Schutzschicht eine Dauer eingestellt werden, nach welcher das vorgelagerte Reagenz seiner späteren Verwendung in dem mikrofluidischen System zugeführt wird
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Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass die Schritte des Einbringens des Reagenzes und des Aufbringens der Schutzschicht auf das Reagenz jeweils wenigstens einmal wiederholt werden. Hierdurch kann erreicht werden, dass mehrere Reagenzien jeweils durch eine Schutzschicht voneinander getrennt stapelartig übereinander angeordnet werden. Hierdurch können die so jeweils von einer Schutzschicht überdeckten Reagenzien zeitlich nacheinander ihrer späteren Verwendung in dem mikrofluidischen System zugeführt werden.
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Die zuvor genannten Vorteile gelten in entsprechender Weise auch für ein mikrofluidisches System, insbesondere Lab-on-Chip-System, zum Vorlagern wenigstens eines Reagenzes. Das mikrofluidische System umfasst wenigstens eine Kavität zur Aufnahme des wenigstens einen Reagenzes und ist dazu eingerichtet, die Schritte des Verfahrens gemäß einer der zuvor beschriebenen Ausführungsformen durchzuführen.
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Figurenliste
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Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
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Es zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung eines mikrofluidischen Systems zum Vorlagern wenigstens eines Reagenzes gemäß einem Ausführungsbeispiel;
- 2 eine schematische Darstellung einer Kavität des mikrofluidischen Systems gemäß einem Ausführungsbeispiel;
- 3 eine schematische Darstellung einer Kavität des mikrofluidischen System gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel; sowie
- 4 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum Vorlagern wenigstens eines Reagenzes in einem mikrofluidischen System gemäß einem Ausführungsbeispiel.
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In 1 ist eine schematische Darstellung einer Draufsicht auf einen Teilbereich eines mikrofluidischen Systems 1 dargestellt. Das mikrofluidische System weist eine Mehrzahl als mikrofluidischen Kanäle 2a, 2b, 2c, 2d und als eine Reaktionskammer 3 ausgestaltete Kavitäten auf. Die Kanäle 2a, 2b, 2c sind hierbei ausgebildet, um ein Fluid und etwaige darin gelöste Stoffe, wie bspw. Reagenzien, der Reaktionskammer 3 zuzuführen. Die Reaktionskammer 3 ist für eine chemische, biochemische und/oder biomolekulare Reaktion zwischen verschiedenen, aus den Kanälen 2a, 2b, 2c zugeführten Fluiden eingerichtet. Über den Kanal 2d können etwaige Reaktionsprodukte bzw. die zuvor zugeführten Fluide aus der Reaktionskammer 3 abgeführt werden.
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Vor einer Verwendung des mikrofluidischen Systems 1 können die Kavitäten mit einer Flüssigkeit vorgespült werden, um eingeschlossene Luft aus den Kanälen 2a, 2b, 2c, 2d und/oder der Reaktionskammer 3 zu verdrängen. Hierdurch wird das Risiko einer Verschleppung der Luftblasen in einem späteren Prozess verringert. Es kann hierbei vorteilhaft sein, bereits vor diesem Spülvorgang Reagenzien in den mikrofluidischen Kanälen 2a, 2b, 2c, 2d, vorzulagern.
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Um nun zu verhindern, dass das Reagenz bzw. die Reagenzien in den Kanälen 2a, 2b, 2c durch den Spülvorgang frühzeitig aufgelöst werden oder in benachbarte Kanäle 2a, 2b, 2c, 2d oder weitere Reaktionskammern in dem mikrofluidischen System 1 gelangen, wo sie zu Querkontaminationen führen, wird das Reagenz durch eine Schutzschicht wenigstens teilweise bedeckt.
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In 2 ist eine schematische Darstellung eines Querschnitts einer der Kanäle 2a, 2b, 2c aus 1 gezeigt. In dem Kanal 2 ist ein Reagenz 10 eingebracht bzw. vorgelagert. Um das Reagenz 10 chemisch und/oder mechanisch zu schützen, wird das Reagenz 10 wenigstens teilweise durch eine Schutzschicht 20 bedeckt.
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Das Reagenz 10 kann bspw. Oligonukleotide, insbesondere Primer und/oder Sonden, umfassen. Das Reagenz 10 kann bspw. als Feststoff in den Kanal 2 eingebracht werden. Alternativ kann das Reagenz 10 in flüssiger Form, insbesondere als wässrige Lösung, in den Kanal 2 eingebracht werden. Das Reagenz 10 wird nunmehr durch eine Schutzschicht 20 wenigstens teilweise, insbesondere vollständig, bedeckt.
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In 3 ist eine Weiterbildung der in 2 beschriebenen Ausführungsform gezeigt. Das in den Kanal 2 eingebrachte Reagenz 10 ist mit einer Schutzschicht 20 überdeckt. Auf die Schutzschicht 20 ist ein weiteres Reagenz 11 eingebracht, welches seinerseits durch eine weitere Schutzschicht 21 überdeckt ist. Bei den Reagenzien 10, 11 kann es sich um die gleichen Reagenzien handeln. Alternativ kann vorgesehen sein, dass sich die Reagenzien 10, 11 unterscheiden.
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Durch diese Anordnung sind die Reagenzien 10, 11 in einer Art Stapelform in dem Kanal 2 angeordnet und durch die Schutzschichten 20, 21 in sich gekapselt. Je nach Dicke der Schutzschicht 20, 21 kann eine Schutzdauer der Schutzschicht 20, 21 für die Reagenzien 10, 11 eingestellt werden. Hierdurch kann gewährleistet werden, dass die Reagenzien 10, 11 durch einen vorherigen Spülprozess des mikrofluidischen Systems nicht frühzeitig abgelöst und dadurch ausgeschwemmt werden, und dass die Reagenzien 10, 11 ihrer eigentlichen Verwendung zum jeweiligen gewünschten bzw. bestimmten Zeitpunkt zugeführt werden.
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In 4 ist ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 100 zum vorlagern wenigstens eines Reagenzes 10, 11 in einem mikrofluidischen System 1 dargestellt. Hierbei wird in einem ersten Verfahrensschritt 110 ein Reagenz 10 in einen Kanal 2 eines mikrofluidischen Systems 1 eingebracht. In einem zweiten Verfahrensschritt 120 wird einen Schutzschicht 20 auf das Reagenz 10 aufgebracht. Hierbei erfolgt das Aufbringen der Schutzschicht 20 derart, dass das Reagenz 10 wenigstens teilweise durch die Schutzschicht 20 bedeckt ist.
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Das Reagenz 10 kann hierbei sowohl in fester als auch in flüssiger Form in den Kanal 2 eingebracht werden. In dem Fall, dass das Reagenz 10 in flüssiger Form in den Kanal 2 eingebracht wird, kann nachfolgend ein Trocknungsschritt erfolgen, bei dem das Reagenz 10 eingetrocknet wird. Der Trocknungsschritt kann hierbei ein Erwärmen und/oder ein Gefriertrocknen des Reagenzes beinhalten.
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Die Schutzschicht kann hierbei aus einem Polyether bestehen, welches in wässriger Lösung vorliegt. Insbesondere kann die Schutzschicht 20 ein Polyethylenglycol (PEG) aufweisen. Nach dem Aufbringen der Schutzschicht 20 kann optional ein Schritt des Eintrocknens der Schutzschicht 20 analog zu dem fakultativen Schritt des Eintrocknens des Reagenzes 10 erfolgen. Das Verfahren 100 kann hierbei nacheinander oder gleichzeitig an verschiedenen Bereichen des mikrofluidischen Systems 1, insbesondere an verschiedenen Kanälen 2 des mikrofluidischen Systems 1 erfolgen, so dass das Verfahren 100 in einfacher Weise in eine Serienproduktion integrierbar ist.
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In einer alternativen Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass das Reagenz 10, insbesondere in flüssiger Form, mehrmals hintereinander in einen Kanal 2 eingebracht wird, um die Menge des insgesamt eingebrachten Reagenzes 10 zu erhöhen. Weiterhin kann in einer alternativen Ausführungsform der Erfindung vorgesehen sein, dass die Schutzschicht 20 mehrfach auf das Reagenz 10 aufgebracht wird. Hierdurch erhöht sich eine Schichtdicke der Schutzschicht 20 entsprechend und somit wird die Schutzdauer der Schutzschicht 20 dementsprechend erhöht.
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In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Schritte des Einbringens 110 der Reagenzes 10 und des Aufbringens 120 der Schutzschicht 20 mehrfach hintereinander ausgeführt werden. Hierdurch wird ein Stapel an jeweils in sich gekapselten Reagenzien 10, 11 erreicht, welche zeitlich nacheinander ihrem jeweiligen Prozess zugeführt werden können.
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Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel kann vorgesehen sein, dass 3,6 Mikroliter einer Primer- und/oder Sondenlösung als Reagenz in einer Konzentration von 10 µM in den Kanal 2 des mikrofluidischen Systems 1 pipettiert werden. Danach erfolgt ein Eintrocknen der Primer- und/oder Sondenlösung für ca. zwei Stunden. Durch eine Erhöhung der Temperatur auf ca. 60 Grad Celsius kann das Eintrocknen der Primer- und/oder Sondenlösung beschleunigt werden. Anschließend wird ein µl einer wässrigen PEG 6000-Lösung in einer Konzentration von 20 % (w/v) (weight/volume) als Schutzschicht 20 auf das eingetrocknete Reagenz 10 gegeben. Danach erfolgt ebenfalls ein Eintrocknen der PEG 6000-Lösung für ca. eine Stunde, so dass sich die Schutzschicht 20 aus PEG 6000 ausbildet. Hierbei kann durch Wärmezufuhr der Eintrocknungsvorgang beschleunigt werden.
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In einer weiteren Ausführungsform, die sich insbesondere für Mikrokavitäten eignen, werden 20 nl der Primer- und/oder Sondenlösung in einer Konzentration von einem µM in die Mikrokavität eingebracht und eingetrocknet. Aufgrund der geringen Menge der Primer- und/oder Sondenlösung erfolgt das Eintrocknen bei Raumtemperatur innerhalb von wenigen Sekunden bis Minuten. Nachfolgend werden 50 nl einer PEG 6000-Lösung Lösung in einer Konzentration von 5 % (w/v) (weight/volume) auf die Primer- und/oder Sondenlösung aufgetragen und ebenfalls eingetrocknet. Hierdurch kann das Reagenz 10 auch in sehr geringen Mengen mit PEG 6000 als der Schutzschicht 20 geschützt werden.
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In einer weiteren, alternativen Ausführungsform können andere Polyethylenglycole, wie bspw. PEG 1000, PEG 2000, PEG 3000, PEG 4000, PEG 5000 oder auch Polyethylenglycole mit mittleren Molekülmassen von größer als 6000 g pro mol verwendet werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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