DE102006056694A1

DE102006056694A1 - Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion

Info

Publication number: DE102006056694A1
Application number: DE102006056694A
Authority: DE
Inventors: Christoph Dr. Gauer; Wolfgang Dr. Mann; Marianna Dr. Alunni-Fabbroni
Original assignee: Advalytix AG
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2026-12-01
Also published as: DE102006056694B4; JP2010510782A; EP2089547A2; WO2008064730A2; WO2008064730A3; US20110081684A1

Abstract

Ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion, insbesondere zum Durchführen einer PCR, umfasst die Entnahme wenigstens einer Eukaryontenzelle aus einem Ausgangsmaterial, das Anfärben des Zellkerns bzw. der Zellkerne der Eukaryontenzelle(n), das Ablegen wenigstens einer Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle eines festen Substrats in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 10 µl, das Detektieren, ob wenigstens ein gefärbter Zellkern auf einer Reaktionsstelle des Substrats vorliegt, die anschließende Zugabe von Enzym und gegebenenfalls Reaktionspuffer zu der/den Eukaryontenzelle(n) sowie abschließend den Start der enzymatischen Reaktion. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Einsatz eines Durchflusszytometers durchgeführt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion, insbesondere zum Durchführen einer Einzelzell-Polymerase-Kettenreaktion, sowie ein Substrat, auf dem eine oder mehrere Eukaryontenzellen vorgesehen sind.
Aufgrund der Empfindlichkeit von Enzymen gegenüber Kontaminanten, wie Salz, organischen Lösemitteln und dergleichen, müssen in enzymatischen Reaktionen aufgereinigte Proben eingesetzt werden, um einen effektiven Ablauf der enzymatischen Reaktion zu gewährleisten. Dies gilt insbesondere auch für enzymatische Reaktionen, bei denen das Substrat des Enzyms eine Nukleinsäure, beispielsweise DNA, ist. Beispiele für solche enzymatische Reaktionen sind Restriktionshydrolysen, Ligationen und Amplifikationsreaktionen, wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Um für eine enzymatische Reaktion DNA mit einer hinreichenden Reinheit herzustellen, sind eine Reihe von Verfahren bekannt. Zudem werden eine Vielzahl an entsprechenden Kits zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere DNA, wie beispielsweise das QIAamp^® DNA Blood Kit zur Aufreinigung von genomischer DNA aus Blut, kommerziell angeboten. Ziel dieser Verfahren und Kits ist es, eine spätere enzymatische Reaktion störende Zellbestandteile, wie Lipide, Proteine – beispielsweise DNA-Nukleasen – und dergleichen, von der DNA abzutrennen. Die Reinheit von Nukleinsäurelösungen wird regelmäßig über den Quotienten der Absorption bei 260 nm geteilt durch die Absorption bei 280 nm ausgedrückt und dieser Quotient sollte für den Einsatz der Nukleinsäurelösungen in enzymatischen Reaktionen größer als 1,8 sein. Weitere, enzymatische Reaktionen inhibierende Kontaminanten neben Proteinen, Salzen und organischen Lösungsmitteln sind beispielsweise die Häm-Gruppen des Hämoglobins menschlicher Erythrozyten, deren zentrales Porphyringerüst geeignet ist, enzymatische Cofaktoren, wie Mg² ⁺, zu komplexieren und damit die enzymatische Reaktion zu unterbinden. Aufgrund des Hämoglobins sind eine PCR oder ähnliche Amplifikationsreaktionen aus Vollblut nicht möglich.
Aus den vorgenannten Gründen gliedert sich die klassische molekularbiologische Diagnostik bzw. Humangenetik heute in die Bereiche Probenvorbereitung, nämlich regelmäßig Extraktion der Nukleinsäuren aus Zellen, Durchführen der enzymatischen Reaktion, beispielsweise Amplifikation, wie PCR, sowie Detektion, welche beispielsweise über Fluoreszenz erfolgt. Wirtschaftlich gesehen stellt die Probenvorbereitung meist den größten Kostenfaktor des Gesamtverfahrens dar, da die anderen Schritte, nämlich die Durchführung der enzymatischen Reaktion sowie die anschließende Detektion, besser als die Probenvorbereitung miniaturisierbar sind, wodurch die Kosten für die vorgenannten Schritte reduziert werden können.
In jüngerer Zeit wurden auch Verfahren zur Durchführung enzymatischer Reaktionen vorgeschlagen, in denen als Enzymsubstrat anstelle von isolierter und aufgereinigter Nukleinsäure einzelne Zellen eingesetzt werden. Dies hat den Vorteil, dass auf eine kostenträchtige Probenvorbereitung verzichtet werden kann. Da eine einzelne Zelle das ganze Genom eines Organismus enthält, reichen wenige Zellen oder theoretisch gar eine einzige Zelle aus, um eine enzymatische Reaktion durchzuführen. Diese Verfahren führen jedoch nur in etwa 50 % der Fälle zu einem positiven Ergebnis, d.h. in etwa der Hälfte aller Fälle findet die enzymatische Reaktion nicht statt. Dies liegt in einer Vielzahl der Fälle darin begründet, dass bei der Isolierung der einzelnen Zelle häufig signifikante Mengen an Kontaminanten in der Probe verbleiben, welche die nachfolgende Enzymreaktion inhibieren.
Ein weiteres, in der Praxis bei an Einzelzellen durchgeführten enzymatischen Reaktionen auftretendes Problem sind falsch negative Ergebnisse. Bei einer an Einzelzellen durchgeführten enzymatischen Reaktion muss vor der Durchführung der Reaktion geprüft werden, ob in dem Reaktionsgefäß eine Zelle in einer für die Enzymreaktion zugänglichen Form vorliegt, um in dem Fall, dass in der Enzymreaktion, bspw. einer PCR, kein Reaktionsprodukt, bspw. kein PCR-Produkt, erhalten wird, eindeutig folgern zu können, dass in der DNA der vorgelegten Zelle keine Bindungsstellen für die in der PCR eingesetzten Primer vorhanden sind. Wird diese Prüfung nicht vorgenommen, kann das Fehlschlagen der PCR auch darin begründet liegen, dass aufgrund von Präparationsfehlern in dem Reaktionsgefäß keine Zelle abgelegt wurde. Allerdings kommt es bei den bekannten Verfahren, selbst wenn vor der Durchführung der enzymatischen Reaktion geprüft wird, ob in dem Reaktionsgefäß eine Zelle vorliegt, oft zu falschen Ergebnissen. Diese Prüfung wird häufig so in das Verfahren integriert, dass zunächst die Zelle bspw. mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper für ein Oberflächenprotein der Zellmembran markiert und mit einem FACS-Durchflusszytometer sortiert und auf einem Glasträger oder einem ähnlichen Substrat abgelegt wird, bevor der Glasträger mit einem Mikroskop bezüglich des Vorliegens einer Zelle untersucht wird, um anschließend nach Zugabe der erforderlichen Puffer und des Enzyms die enzymatische Reaktion durchzuführen.
Allerdings kommt es bei dieser Vorgehensweise, wie man durch Kontrollproben feststellen kann, häufig vor, dass man unter dem Mikroskop Fluo reszenz detektiert, aber eine nachfolgende PCR negativ verläuft, obwohl die in der PCR eingesetzten Primer definitiv zu der in der Zelle enthaltenden Nukleinsäure kompatibel sind, d.h. die Nukleinsäure Bindungsstellen für die in der PCR eingesetzten Primer aufweist. Ursache für dieses falsche Ergebnis sind in diesem Fall Fluoreszenzartefakte, die sich bspw. aufgrund des Zusammenlagerns von Antikörpern gebildet haben, ohne dass auf dem Substrat eine Zelle abgelegt wurde. Der Anwender wäre in diesem Fall also zu dem falschen Ergebnis gelangt, dass die Zelle keine zu den eingesetzten Prümern kompatible DNA enthält, obwohl das fehlende PCR-Produkt lediglich darauf zurückzuführen ist, dass auf dem Substrat keine Zelle abgelegt wurde.
Oftmals wird bei der vorgenannten Vorgehensweise unter dem Mikroskop auch keine Fluoreszenz detektiert (woraus fälschlicherweise zu folgern wäre, dass auf dem Substrat keine Zelle abgelegt wurde), obgleich in einer nachfolgenden PCR PCR-Produkte erhalten werden. Dieses falsche Ergebnis ist in den häufigsten Fällen darauf zurückzuführen, dass die Zelle beim Auftreffen auf das Substrat mechanisch zerstört wurde und daher unter dem Mikroskop nicht mehr zu erkennen war, obgleich die DNA der eingesetzten, nunmehr zerstörten Zelle auf dem Substrat in einer für die nachfolgende PCR zugänglichen Form vorlag.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion bereitzustellen, bei dem auf eine Extraktion von Nukleinsäuren aus Zellen verzichtet werden kann, welches einfach und schnell durchzuführen ist und welches insbesondere auch bei Einsatz weniger Zellen, insbesondere einer Zelle, zu einem eindeutigen Ergebnis führt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 und insbesondere durch ein Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion, insbesondere einer PCR, mit einer wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Probe umfassend die nachfolgenden Schritte:

a) Bereitstellen eines wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Ausgangsmaterials,
b) Entnahme von wenigstens einer Eukaryontenzelle aus dem Ausgangsmaterial,
c) Anfärben des Zellkerns bzw. der Zellkerne der Eukaryontenzelle(n),
d) Ablegen wenigstens einer Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle eines festen Substrats in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 10 μl,
e) Detektieren, ob wenigstens ein gefärbter Zellkern auf einer Reaktionsstelle des Substrat vorliegt, sowie
f) Durchführen einer enzymatischen Reaktion mit der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf dem Substrat,

Indem in dem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst der Zellkern der auf einer Reaktionsstelle des Substrats abzulegenden Eukaryontenzelle(n) gefärbt wird und das Substrat in dem Verfahrensschritt e) auf Zellkernfärbung bzw. auf das Vorliegen wenigstens eines gefärbten Zellkerns untersucht wird, kann eindeutig festgestellt werden, ob auf dem Substrat vor der Durchführung der enzymatischen Reaktion DNA in einer für das in der enzymatischen Reaktion eingesetzte Enzym zugänglichen Form vor liegt, und zwar unabhängig davon, ob die Zelle beim Ablegen auf das Substrat mechanisch lysiert wurde oder nicht. Gleichermaßen können durch diesen Verfahrensschritt falsche Ergebnisse aufgrund etwaiger Fluoreszenzartefakte ausgeschlossen werden. Mithin werden durch das erfindungsgemäße Verfahren die vorstehend beschriebenen, bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren auftretenden Fälle von falsch positiven Ergebnissen zuverlässig ausgeschlossen, so dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eindeutige Ergebnisse erhalten werden. Zudem kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, indem ein oder mehrere Eukaryontenzellen, welche das gesamte genetische Material eines Organismus aufweisen, eingesetzt werden, auf eine zeitaufwendige und kostenintensive Extraktion von Nukleinsäuren aus den Zellen verzichtet werden.
Erfindungsgemäß können die Verfahrensschritte b), c) und d) in jeder beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden. Insbesondere kann die Kernfärbung gemäß Verfahrensschritt c) vor oder nach dem Ablegen der Eukaryontenzellen) auf einer Reaktionsstelle des Substrats gemäß Verfahrensschritt d) und insbesondere auch vor oder nach der Entnahme wenigstens einer Eukaryontenzelle aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für die Durchführung einer enzymatischen Reaktion, insbesondere einer PCR, an einzelnen Eukaryontenzellen oder wenigen Eukaryontenzellen. Vorzugsweise werden bei dem Verfahrensschritt d) maximal 10 Eukaryontenzellen, besonders bevorzugt zwischen 1 und 5 Zellen, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 3 Zellen und höchst bevorzugt 1 oder 2 Zellen pro Reaktionsstelle des Substrats abgelegt. Insbesondere bevorzugt ist die Durchführung einer Einzelzellreaktion, wobei in diesem Fall genau eine Zelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt wird. Durch den Einsatz we niger Eukaryontenzelle in der enzymatischen Reaktion wird gewährleistet, dass nur minimale Mengen der in der intrazellulären Flüssigkeit vorliegenden Kontaminanten auf das Substrat gelangen, auf dem später die enzymatische Reaktion stattfindet. Dies sei an dem nachfolgenden Rechenbeispiel verdeutlicht. Menschliche Zellen oder grundsätzlich Säugetierzellen weisen Größenunterschiede auf. Erythrozyten beispielsweise haben einen durchschnittlichen Zelldurchmesser von 7,5 μm, während Granulozyten einen Zelldurchmesser zwischen 9 und 16 μm aufweisen und der Zelldurchmesser bei Lymphozyten, je nach Organismus, 5 bis 18 μm beträgt. Bakterienzellen hingegen weisen einen durchschnittlichen Zelldurchmesser zwischen 1 und 5 μm auf. Ausgehend von einem durchschnittlichen Zelldurchmesser von 10 μm beträgt das Volumen einer Zelle unter Annahme einer Kugelform der Zelle 4/3·π·r³, also ca. 4200 μm³. Wird demnach eine Zelle in einer PCR mit einem Standardreaktionsvolumen von 1 μl entsprechend 10⁹ μm³ eingesetzt, beträgt das Verhältnis des Zellvolumens zu dem gesamten Reaktionsvolumen etwa 0,00042 %. Werden hingegen in demselben Reaktionsvolumen 10, 100 oder gar 1.000 Zellen eingesetzt, vergrößert sich das vorgenannte Verhältnis von Zellvolumen zu dem gesamten Reaktionsvolumen auf 0,0042 % für 10 Zellen, auf 0,042 % für 100 Zellen und 0,42 % für 1.000 Zellen. Dieser Zusammenhang ist in der 1 dargestellt. Da Zellen neben den Nukleinsäuren, welche das spätere Substrat für die enzymatische Reaktion sind, hauptsächlich aus potentiell die enzymatische Reaktion störenden Kontaminanten, wie Proteinen, Lipiden und dergleichen, bestehen, wird durch die Reduktion des Quotienten von Zellvolumen zu Reaktionsvolumen der Anteil der in den Zellen intrazellulär vorliegenden und in die enzymatische Reaktion eingebrachten Kontaminanten drastisch abgesenkt.
Die Entnahme der einzelnen Eukaryontenzelle(n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) kann mit jedem dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren erfolgen. Beispielsweise können die einzelnen Eukaryontenzellen mit einer Glaskapillare aus einer Zellsuspension, welche ggf. vor der Entnahme auf einen geeigneten Wert verdünnt wurde und ausschließlich Eukaryontenzellen oder eine Mischung von Eukaryontenzen und Prokaryontenzellen enthalten kann, entnommen werden. Beispielsweise hat sich der mmi Cellector^® der Firma MMI Molecular Machines & Industries AG für die mikromechanische Entnahme der einzelnen Eukaryontenzelle(n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) mit einer Kapillare als besonders geeignet erwiesen.
Um in dem Verfahrensschritt d) die Anzahl der auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegten Eukaryontenzellen kontrollieren bzw. steuern zu können, wird vor oder während des Ablegens der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats vorzugsweise die absolute Anzahl der pro Reaktionsstelle abzulegenden bzw. abgelegten Eukaryontenzelle(n) bestimmt. Dies kann beispielsweise mikroskopisch erfolgen, wobei sich insbesondere eine lichtmikroskopische oder fluoreszenzmikroskopische Quantifizierung der absoluten Anzahl der auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegten Eurkaryontenzelle(n) als besonders geeignet erwiesen hat.
Auch bezüglich der Art der Zellkernfärbung bzw. des eingesetzten Färbemittels in Verfahrensschritt c) ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht besonders beschränkt. Gute Ergebnisse werden insbesondere mit Färbemitteln erhalten, welche für den Zellkern spezifisch sind, also neben dem Zellkern andere Zellstrukturen gar nicht oder nur in einem untergeordneten Ausmaß anfärben. Beispiele für geeignete Färbemittel sind solche, welche aus der aus Hämatoxylin, Alaunkarmin, alkoholische Boraxaminlösung, Parakarmin, Naphthazarin, Karminessigsäure und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind. Insbesondere haben sich für diesen Zweck auch Fluoreszenzfarbstoffe bewährt, vorzugsweise solche ausgewählt aus der aus 7-Aminoactinomycin D (7-AAD), Acridine orange, BOBO-1, BOBO-3, DAPI Nucleic Acid Stain, Dihydroethidium, Ethidiumbromid, Ethidium Homodimer-1, Hexidiumiodid, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, LDS 751, Nissl substance, Nuclear yellow, Propidiumiodid, SYTO 11, SYTO 13, SYTO 16, SYTOX Green stain, SYTOX Orange, TO-PRO-3, TOTO-3, VO-PRO-1, YOYO-1 und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) auf einen, von einem hydrophoben Bereich umgebenen, inneren hydrophilen Bereich einer Reaktionsstelle des Substrats abzulegen. Durch die Ablage wenigstens einer Eukaryontenzelle auf einem von einem hydrophoben Bereich umgebenen hydrophilen Bereich einer Reaktionsstelle eines Substrats wird die Ausbildung eines aus der an der wenigstens einen Eukaryontenzelle haftenden oder aus der der wenigstens einen Eukaryontenzelle nach dem Ablegen auf der Reaktionsstelle zugefügten Flüssigkeit gebildeten Flüssigkeitstropfens ermöglicht, der vergleichsweise fest an dem Substrat haftet, so dass die nachfolgende Enzymreaktion direkt auf der Reaktionsstelle durchgeführt werden kann, ohne dass die Eukaryontenzelle in ein geschlossenes Reaktionsgefäß oder dergleichen überführt werden muss. Dadurch werden zum einen arbeits- und zeitaufwendige Transferschritte vermieden. Ferner wird dadurch ermöglicht, dass auf dem Substrat umfassend eine entsprechende Anzahl an voneinander räumlich getrennten hydrophilen Reaktionsstellen mehrere Proben parallel aufbereitet werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass sich die räumlich eng beieinander liegenden Flüssigkeitstropfen bei geringfügigen Erschütterungen oder aufgrund des Verlaufens von Flüssigkeitstropfen infolge zu hohen Tropfenvolumens miteinander vermischen.
Zudem hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der innere hydrophile Bereich der Reaktionsstelle(n) auf dem Substrat im Wesentlichen kreisförmig ausgebildet und von einem im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophoben Bereich, vorzugsweise konzentrisch, umgeben ist/sind.
Eine noch bessere Ausbildung von Flüssigkeitstropfen auf dem Substrat wird erreicht, wenn der den inneren hydrophilen Bereich der Reaktionsstelle umgebende hydrophobe Bereich auf dem Substrat außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, welcher vorzugsweise im Wesentlichen kreisringförmig ist und den hydrophoben Bereich, besonders bevorzugt, konzentrisch, umgibt. Bevorzugt ist auch der mittlere hydrophile Kreisring außenseitig von einem äußeren hydrophoben Bereich umgeben. Somit besteht eine besonders bevorzugte Anordnung aus einem von zwei Kreisringen konzentrisch umgebenen kreisförmigen hydrophilen Bereich, wobei der innere der beiden Kreisringe hydrophob und der äußere der beiden Kreisringe hydrophil ist, wobei der äußere hydrophile Kreisring außenseitig von einem hydrophoben Bereich umgeben ist.
Besonders gute Ergebnisse werden insbesondere erhalten, wenn die Hydrophilie des inneren hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle und die Hydrophobie des diesen umgebenden Bereichs derart eingestellt werden, dass sich bei Auftrag von weniger 10 μl Wasser auf die Reaktionsstelle ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel von 20 bis 70°, bevorzugt von 30 bis 60° und besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet. Dadurch wird gewährleistet, dass sich ein stabiler Flüssigkeitstropfen ausbildet, der fest an der Reaktionsstelle haftet, so dass sich der Flüssigkeitstropfen nicht schon bei geringsten Vibrationen des Substrats, wie diese etwa beim Transport des Substrats beispielsweise innerhalb eines Labors vorkommen, von der Glasplatte löst oder auf der Glasplatte verläuft.
Vorzugsweise beträgt der Durchmesser des inneren hydrophilen Bereichs der Reaktionsstelle, sofern dieser, wie dies bevorzugt ist, im Wesentlichen kreisförmig ausgestaltet ist, zwischen 0,3 und 3 mm.
Um das parallele Aufbereiten mehrerer Proben zu ermöglichen, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, auf dem Substrat 2 bis 1.000, vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz besonders bevorzugt 48 verschiedene, jeweils im Wesentlichen kreisförmige innere hydrophile Bereiche umfassende Reaktionsstellen vorzusehen, wobei die inneren hydrophilen Bereiche jeweils konzentrisch von einem im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophoben Bereich umgeben sind, welcher außenseitig von einem im Wesentlichen kreisringförmigen mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, an den sich außenseitig vorzugsweise wiederum ein äußerer hydrophober Bereich anschließt.
Bezüglich der Art des eingesetzten Substrats ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht limitiert. Beispielsweise kann es sich bei dem Substrat um ein Reaktionsgefäß aus Kunststoff handeln. Ebenso gut ist es jedoch möglich, als Substrat eine Mikrotiterplatte, beispielsweise eine 96-well, 128-well, 256-well oder 528-well Mikrotiterplatte, einzusetzen. Alternativ dazu hat es sich als vorteilhaft erwiesen, als Substrat einen Objektträger vorzusehen, besonders bevorzugt einen Objektträger, dessen Oberfläche mit Epoxy beschichtet und mit lithographisch herstellten hydrophilen und hydrophoben Bereichen in einzelne Reaktionsstellen bzw. Ankerplätze unterteilt ist. Solche Objektträger werden beispielsweise von der Firma Advalytix unter dem Handelsnamen AmpliGrid^TM kommerziell vertrieben. Vorzugsweise wird als Substrat ein Objektträger oder eine Mikrotiterplatte eingesetzt, wobei insbesondere ein AmpliGrid^TM, welcher die zuvor beschriebenen Reaktionsstellen aus kreisförmigen hydrophilen und hydrophoben Bereichen umfasst, als Substrat besonders geeignet ist.
Um die Menge etwaiger aus der Probenpräparation stammender Kontaminanten, welche die nachfolgende enzymatische Reaktion stören könnten, auf dem Träger zu minimieren, wird die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) vorzugsweise in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 5 μl, besonders bevorzugt von weniger als 2 μl und ganz besonders bevorzugt von weniger als 1 μl auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt.
Aus dem gleichen Grund ist es insbesondere bevorzugt, die wenigstens eine Eukaryontenzelle in dem Verfahrensschritt d) in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 100 nl, bevorzugt von weniger als 10 nl und besonders bevorzugt von maximal 1 nl auf einer Reaktionsstelle des Substrats abzulegen. Diese Ausführungsform gewährleistet, dass die in der enzymatischen Reaktion eingesetzten Zellen hinreichend wenig, die enzymatische Reaktion inhibierende Kontaminanten enthalten. Dies ist ein weiterer, besonderer Vorteil gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Einzelzellverfahren, bei denen die Isolierung einzelner Zellen üblicherweise durch Entnahme einer Teilmenge einer Suspension von Zellen in Zellmedium erfolgt, wonach die Teilmenge auf ein Substrat, auf dem bzw. in dem die spätere enzymatische Reaktion stattfinden soll, aufgetragen wird. Zur Durchführung der enzymatischen Reaktion muss der Teilmenge der Suspension noch Enzym sowie Reaktionspuffer zugegeben werden, um die für die enzymatische Reaktion optimalen Salzbedingungen und den optimalen pH-Wert einzustellen. Um das Reaktionsvolumen der enzymatischen Reaktion möglichst klein zu halten, wird bei einigen Verfahren vor Zugabe des Enzyms und des Reaktionspuffers die auf dem Substrat aufgetragene Zellsuspension eingedampft, um die die Zellen umgebende Flüssigkeit zu verdampfen. Dabei verdampft jedoch nur die die Zellen umgebende Flüssigkeit, wohingegen in der Flüssigkeit vorhandene Kontaminanten, wie in der Flüssigphase der Suspension vorhandene Salze oder etwaige Proteasen, Lipide, Nukleasen und dergleichen, auf dem Substrat verbleiben. Diese Kontaminanten können dann die spätere enzymatische Reaktion stören. Dieses Problem wird bei der vorgenannten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf einfache Weisen gelöst, da die Zellen bereits weitestgehend ohne zusätzliche bzw. extrazelluläre Flüssigkeit auf eine Reaktionsstelle des Substrats aufgegeben werden, so dass die enzymatische Reaktion in einem minimalen Reaktionsvolumen durchgeführt werden kann, ohne dass überflüssige extrazellulär vorliegende Flüssigkeit beispielsweise durch Verdampfung entfernt werden muss. Indem die Zellen keine oder nur minimale Mengen an extrazellulärer Flüssigkeit aufweisen, wird die Anzahl an in dem späteren Reaktionsvolumen vorliegenden Kontaminanten auf ein Minimum, nämlich die Menge der in den Zellen selbst vorliegenden Kontaminanten, beschränkt. Zudem kann auf vorherige zeitaufwändige Waschschritte verzichtet werden, da die Zellen aufgrund der allenfalls minimalen Menge an extrazellulärer Flüssigkeit bereits in reiner Form auf das Substrat aufgegeben werden. Insgesamt ergibt sich somit ein einfaches, kostengünstiges und schnelles Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei dem sichergestellt ist, dass die enzymatische Reaktion effizient abläuft.
Um eine etwaige Zersetzung der als Substrat für die enzymatische Reaktion dienenden Zellbestandteile, insbesondere Nukleinsäuren, vor der Zugabe des Enzyms zu vermeiden, werden vorzugsweise auf das Substrat Eukaryontenzelle(n) aufgegeben, die nicht-lysiert sind. So wird vermieden, dass vor Beginn der enzymatischen Reaktion durch freigesetzte Proteasen oder Nukleasen das Substrat für die spätere enzymatische Reaktion chemisch zersetzt wird.
Bezüglich der Art der enzymatischen Reaktion ist die vorliegende Erfindung nicht beschränkt. Lediglich beispielsweise seien enzymatische Reaktionen, wie Restriktionshydrolysen, Ligationen oder gängige Amplifikationsreaktionen, insbesondere PCR (Polymerase-Kettenreaktion), LCR (Ligase-Kettenreaktion) oder RCA (Rolling-Circle-Amplifikation), genannt. Bei einer PCR wird die Reaktionsmischung wiederholt Temperaturzyklen unterworfen, wobei jeder Temperaturzyklus aus einem Denaturierungsschritt bei 94°C zum Auftrennen der Doppelstrang-DNA in Einzelstrang-DNA, einem Anlagerungsschritt üblicherweise bei einer Temperatur zwischen 40 und 60°C zur Anlagerung der PCR-Primer an die Matrizen-DNA und einem Verlängerungsschritt bei 72°C, bei dem die Taq-Polymerase den Einbau von Nukleotiden in den auf der Matrizen-DNA gebundenen Primer katalysiert, besteht. Da durch den initialen Denaturierungsschritt bei 94°C die auf dem Substrat vorgesehenen Zellen platzen, wird die Nukleinsäure der Zellen für die Taq-Polymerase zugänglich.
Zum Ablegen der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats können prinzipiell alle dem Fachmann bekannten Verfahren eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Ablegen der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats dadurch, dass eine wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltende Flüssigkeitssuspension durch eine Düse geführt wird, der Flüssigkeitsstrom bzw. Strom der Flüssigkeitssuspension an der Düse in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen aufgetrennt wird, wobei die einzelnen Flüssigkeitstropfen jeweils eine vor bestimmte Anzahl an Eukaryontenzellen enthalten, alle oder einzelne Flüssigkeitstropfen nach der Abtrennung von der Düse elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen durch ein elektrisches Feld geführt werden, wodurch ein oder mehrere elektrisch aufgeladene Flüssigkeitstropfen auf eine oder mehrere Reaktionsstellen des Substrats gelenkt werden, bevor anschließend den abgelegten Eukaryontenzellen Enzym und gegebenenfalls ebenfalls Reaktionspuffer zugegeben wird und abschließend die enzymatische Reaktion, beispielsweise durch Einstellen der Reaktionslösung auf eine geeignete Temperatur, gestartet wird. Indem der die Eukaryontenzellen) enthaltende Flüssigkeitsstrom an der Düse in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen aufgetrennt wird, kann durch Einstellung der Konzentration der Eukaryontenzellen in der Flüssigkeitssuspension und durch Einstellung der Größe der einzelnen Flüssigkeitstropfen auf einfache Art und Weise gewährleistet werden, dass in den einzelnen Flüssigkeitstropfen eine vorbestimmte Anzahl an Eukaryontenzellen, beispielsweise genau eine Eukaryontenzelle pro Flüssigkeitstropfen, enthalten ist. Durch elektrisches Aufladen einzelner Flüssigkeitstropfen nach der Abtrennung von der Düse und anschließendes Führen durch ein elektrisches Feld können die einzelnen Flüssigkeitstropfen voneinander getrennt werden, so dass selektiv einzelne Flüssigkeitstropfen oder ein gezielter Flüssigkeitstropfen enthaltend die Zielzellen auf einer Reaktionsstelle des Substrats aufgebracht werden können. Wenn die Flüssigkeitssuspension genetisch unterschiedliche Zellen enthält, ist es beispielsweise möglich, statistisch willkürlich einen Flüssigkeitstropfen elektrisch aufzuladen, wohingegen die anderen Flüssigkeitstropfen nicht elektrisch aufgeladen werden.
Werden die einzelnen Flüssigkeitstropfen anschließend durch das elektrische Feld geführt, wird nur der elektrisch aufgeladene Tropfen abgelenkt und auf das entsprechend positionierte Substrat aufgebracht. Aufgrund der Ablenkung durch das elektrische Feld und insbesondere durch die Geschwindigkeiten der Flüssigkeitstropfen wird gewährleistet, dass die Eukaryontenzelle(n), wenn diese auf das Substrat auftreffen, weitestgehend keine extrazelluläre Flüssigkeit mehr enthalten. Vorzugsweise werden die Parameter beim Führen der Flüssigkeitssuspension durch die Düse, bei der Auftrennung der Flüssigkeitstropfen an der Düse und bei der Führung der Flüssigkeitstropfen durch das elektrische Feld so eingestellt, dass wenigstens eine Eukaryontenzelle in einem Volumen von weniger als 100 nl, bevorzugt von weniger als 10 nl und besonders bevorzugt von maximal 1 nl auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt wird.
Vorzugsweise werden die Eukaryontenzelle(n) hydrodynamisch durch die Düse geführt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Flüssigkeitssuspension durch eine Kanüle geführt wird und aus dieser über eine kreisförmige Öffnung austritt und nach dem Austreten aus der Kanüle durch einen Mantelstrom einer zweiten Flüssigkeit fokussiert und durch die unterhalb der Kanülenöffnung angeordnete Düse geführt wird.
Um eine gute Auftrennung der einzelnen Flüssigkeitstropfen zu erreichen, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, dass die Düse einen Innendurchmesser zwischen 1 μm und 1 mm aufweist. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn der Innendurchmesser der Düse zwischen 10 μm und 500 μm und insbesondere zwischen 50 μm und 100 μm beträgt.
Zur Auftrennung der Flüssigkeitssuspension an der Düse in einzelne Tropfen können alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren eingesetzt werden. Lediglich beispielsweise sei die Auftrennung der Flüssigkeitssuspension an der Düse durch piezoelektrische Modulation genannt. Bei der piezoelektrischen Modulation wird auf den durch die Düse strömenden Flüssigkeitsstrahl eine periodische Druckschwankung ausgeübt, aufgrund der sich an der Düse Flüssigkeitstropfen mit einer definierten und reproduzierbaren Größe ausbilden und diese von dem Flüssigkeitsstrahl abreißen. Durch entsprechende Einstellung der Konzentration der Eukaryontenzellen in der Flüssigkeitssuspension, der Strömungsgeschwindigkeit der Suspension und entsprechende Einstellung der piezoelektrischen Modulation kann erreicht werden, dass jeder Flüssigkeitstropfen definierter und reproduzierbarer Größe eine vorbestimmte Anzahl an Eukaryontenzellen, beispielsweise genau eine Eukaryontenzelle, enthält. Die Abtrennung der Tropfen von der Düse erfolgt aufgrund des Impulses der Druckschwankungen unterstützt durch die Schwerkraft.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl zum Ablegen einer bestimmten Anzahl genetisch gleicher Eukaryontenzellen aus beispielsweise einem Zellkulturmedium enthaltend ausschließlich genetisch gleiche Zellen, beispielsweise Zellen eines Klones, auf einer Reaktionsstelle eines Substrats als auch zum Ablegen einer bestimmten Anzahl genetisch gleicher Eukaryontenzellen aus einer Mischung von genetisch unterschiedlichen Zellen auf einem Substrat. Zudem kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch eine bestimmte Anzahl genetisch unterschiedlicher Eukaryontenzellen aus einer entsprechenden Zellmischung auf dem Substrat abgelegt und dort einer enzymatischen Reaktion unterworfen werden.
Die erstgenannte Verfahrensvariante lässt sich beispielsweise dadurch realisieren, dass in der Flüssigkeitssuspension nur genetisch gleiche Eukaryontenzellen vorhanden sind, der Flüssigkeitsstrom an der Düse so in einzelne Flüssigkeitstropfen aufgetrennt wird, dass jeder Flüssigkeitstropfen genau eine Eukaryontenzelle enthält, und so viele Flüssigkeitstropfen elektrisch aufgeladen werden, wie Eukaryontenzellen auf dem Substrat benötigt werden. Bei der anschließenden Führung der Flüssigkeitstropfen durch das elektrische Feld werden nur die elektrisch aufgeladenen Tropfen abgelenkt und auf ein entsprechend positioniertes Substrat aufgebracht. Die entsprechende Ablenkung der elektrisch aufgeladenen Flüssigkeitstropfen kann beispielsweise durch Führung der Flüssigkeitstropfen durch einen Kondensator erfolgen.
Alternativ dazu kann die zweitgenannte Verfahrensvariante dadurch realisiert werden, dass in der Flüssigkeitssuspension genetisch verschiedene Zellen, beispielsweise Eukaryontenzellen und Prokaryontenzellen, vorhanden sind, eine einzelne Zelle oder mehrere Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper oder einem fluoreszierenden Farbstoff markiert werden, der Flüssigkeitsstrom an der Düse in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen aufgetrennt wird, die einzelnen an der Düse von dem Flüssigkeitsstrom abgetrennten Flüssigkeitstropfen durch einen Laserstrahl geführt werden, durch den die Fluoreszenz der einzelnen Tropfen gemessen wird, anschließend die einzelnen Flüssigkeitstropfen in Abhängigkeit von der Fluoreszenz der darin enthaltenen Zelle(n) mit einer bestimmten elektrischen Ladung elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen so durch ein elektrisches Feld geführt werden, dass die Flüssigkeitstropfen mit einer in einem vorgewählten Bereich liegenden elektrischen Ladung auf das Substrat gelenkt werden.
Während fluoreszenzmarkierte Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden, wenn die genetisch verschiedenen Zellen Zellen unterschiedlicher Organismen sind, hat sich die Markierung einzelner Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff insbesondere als geeignet erwiesen, wenn die genetisch verschiedenen Zellen aus demselben Organismus stammen. Der Farbstoff kann in diesem Fall beispielsweise mit einer DNA-Sonde verbun den sein, die für ein Gen oder einen Genabschnitt einer bestimmten Zellsorte spezifisch ist. Genauso gut ist es möglich, mehrere verschiedene fluoreszenzmarkierte Antikörper oder mehrere verschiedene fluoreszierende Farbstoffe einzusetzen, um genetisch verschiedene Zellen jeweils mit einem spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörper oder einem spezifischen fluoreszierenden Farbstoff zu markieren. So können durch den Laser zwei oder mehr verschiedene Zelltypen erkannt, diese später unterschiedlich elektrisch aufgeladen werden und auf verschiedene Substrate abgelenkt werden. Die entsprechende selektive Ablenkung in dem entsprechenden elektrischen Feld kann in dem Falle von zwei in dem elektrischen Feld aufzutrennenden unterschiedlichen Zellen beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Flüssigkeitstropfen mir dem einen Zieltyp positiv und die Flüssigkeitstropfen mir dem anderen Zieltyp negativ aufgeladen werden. Bei mehr als zwei Zelltypen kann die selektive Auftrennung dadurch erreicht werden, dass die einzelnen unterschiedlichen Zellen jeweils mit einer unterschiedlichen Menge an elektrischer Ladung versehen werden, beispielsweise die Zelle I mit einer elektrischen Ladung von X C, die Zelle II mit einer elektrischen Ladung von 2·X C, die Zelle III mit einer elektrischen Ladung von 3·X C und so weiter.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Eukaryontenzelle(n) mittels eines Durchflusszytometers auf einer oder mehreren Reaktionstelle(n) des Substrats aufgegeben. Diese, auch Fluoreszenz aktivierte Zellsortierer (FACS bzw. Fluorescence Activated Cell Sorter) genannten Geräte werden beispielsweise von den Firmen Beckton & Dickinson und Dako kommerziell vertrieben.
Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn als Durchflusszytometer ein FACS-Vantage SE Durchflusszytometer eingesetzt wird.
Alternativ zu der vorgenannten Ausführungsform kann das Ablegen der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats gemäß Schritt d) und/oder die Entnahme der Eukaryontenzelle(n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) auch durch Laser-Mikrodissektion ("Laser Capture Microdissection"; LCM) oder durch Laser-Druck-Katapultation ("Laser Pressure Catapultation"; LPC) erfolgen. Geeignete Geräte für die erstgenannte Technologie sind beispielsweise das Veritas^TM Microdissection Instrument der Firma Arcturus, welche Teil der Firma Molecular Devices ist, oder Leica LMD6000 der Firma Leica, während eine für die LPC Technik geeignete Vorrichtung das PALM laser capture microdissection System der Firma P.A.L.M. in Wolfratshausen ist.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, als Substrat wenigstens ein AmpliGrid^TM einzusetzen, wobei der wenigstens eine AmpliGrid^TM in einem Rahmen positioniert ist, welcher vorzugsweise eine Kapazität für vier verschiedene AmpliGrid's^TM aufweist. Ein solcher Rahmen kann zum Beispiel als Hohlrahmen ausgestaltet sein, wobei die einzelnen Aussparungen des Hohlrahmens jeweils die Form und Größe eines AmpliGrid's^TM aufweisen.
Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein oder mehr Substrate eingesetzt, welche jeweils 2 bis 1.000, vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz besonders bevorzugt 48 verschiedene, jeweils einen inneren hydrophilen Bereich umfassende Reaktionsstellen aufweisen, wobei die jeweiligen Anzahlen der in dem Verfahrensschritt d) pro Reaktionsstelle abgelegten Eukaryontenzelle(n) während oder nach dem Verfahrensschritt d) auf einem Datenträger, beispielsweise einer Festplatte, gespeichert werden.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Detektion in dem Verfahrensschritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens mikroskopisch, bevorzugt lichtmikroskopisch oder fluoreszenzmikroskopisch, vorzunehmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion unter Einsatz aller bekannten Eukaryontenzelltypen. Insbesondere ist es für enzymatische Reaktionen von humanen Zellen geeignet, wobei sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion an Erythrozyten, Granulozyten, Lymphozyten, Thrombozyten und Krebszellen als besonders geeignet erwiesen hat.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung rein beispielhaft anhand vorteilhafter Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Dabei zeigen:
1 die Abhängigkeit des Verhältnisses des Quotienten Zellvolumen durch Reaktionsvolumen von der eingesetzten Zellzahl,
2 eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung,
3a eine Draufsicht eines zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignetes Substrat gemäß eines Ausführungsbeispiels und
3b eine Reaktionsstelle des in der 3a gezeigten Substrats.
In der 1 ist die Abhängigkeit des Verhältnisses des Quotienten des Zellvolumens pro Reaktionsvolumen von der eingesetzten Zellzahl für Zellen mit einem Durchmesser von 10 μm und bei einem Reaktionsvolumen von 1 μl dargestellt. Unter Annahme einer kugelförmigen Zellform ergibt sich für eine Zelle mit einem Zelldurchmesser von 10 μm ein Zellvolumen von ca. 4200 μm³. Da ein Reaktionsvolumen von 1 μl 10⁹ μm³ entspricht, beträgt das Verhältnis Zellvolumen durch Reaktionsvolumen für eine wie vorstehend proportionierte Zelle in einem PCR-Standardreaktionsvolumen von 1 μl etwa 0,004 %. Sofern die Reaktionsmischung mehr als eine Zelle enthält, vergrößert sich dieses Verhältnis proportional mit der eingesetzten Zellzahl. Bei Einsatz von zehn Zellen beträgt das entsprechende Verhältnis im vorgenannten Fall bereits 0,004 % und bei Einsatz von 1.000 Zellen sogar 0,4 %. Da die Zellen neben der als Substrat für die Taq-Polymerase dienenden DNA weitere Bestandteile, wie Proteine, Lipide und dergleichen, enthalten, welche die Taq-Polymerase inhibieren können, bedeutet ein größeres Verhältnis Zellvolumen zu Reaktionsvolumen auch die steigende Gefahr, dass die PCR inhibiert wird oder zumindest nicht optimal verläuft. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren maximal 10 Eukaryontenzellen auf einer Reaktionsstelle des Substrats abzulegen. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn maximal 5 Eukaryontenzellen und insbesondere maximal 3 Eukaryontenzellen auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt werden. Beste Ergebnisse werden erhalten, wenn genau eine Zelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats abgelegt wird.
Die in der 2 dargestellte Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse 1, in dem sich eine Kammer 2 für einen Flüssigkeitsmantelstrom befindet. Des Weiteren weist die Vorrichtung eine Kanüle 3 zum Durchleiten einer Zell suspension, d.h. einer Suspension von Zellen in Flüssigkeit, auf. Die Kammer 2 für den Mantelstrom verjüngt sich nach unten zu einer Düse 4. Am Kopf der Vorrichtung ist eine Piezokeramik 5 vorgesehen, welche an der Düse 4 periodische Druckschwankungen ausüben kann.
Des Weiteren umfasst die Vorrichtung eine Laserquelle (nicht dargestellt), welche unterhalb der Düse 4 einen Laserstrahl 6 erzeugt. Unterhalb des Laserstrahls 6 sind Ablenkplatten 7 vorgesehen, an die zwecks Erzeugung eines elektrischen Feldes zwischen den Ablenkplatten 7 eine elektrische Spannung angelegt werden kann.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Zellsuspension mit einer vorbestimmten Zellkonzentration, beispielsweise eine Suspension von Zellen in Zellkulturmedium, über die Kanüle 3 in die Vorrichtung geführt und über einen Auslass 8 in die Kammer 2 geführt. Parallel dazu wird Mantelflüssigkeit durch den Einlass 9 mit einem hohen Druck in die Kammer 2 geführt und durch diese hindurch geströmt. Aufgrund des Drucks der Mantelflüssigkeit wird der aus dem Auslass 8 austretende Flüssigkeitsstrahl hydrodynamisch fokussiert und zu der Düse 4 geführt.
Durch die Piezokeramik 5 ist an der Düse 4 eine piezoelektrische Modulation angelegt, durch welche die Düse 4 periodischen Druckschwankungen ausgesetzt ist. Aufgrund dieser Druckschwankungen werden an der Düse 4 einzelne Flüssigkeitstropfen 10 von dem Flüssigkeitsstrahl abgetrennt. Danach fallen die Tropfen 10 aufgrund der Schwerkraft nach unten und passieren den Laserstrahl 6, durch den etwaig an die Zellmembran gebundene fluoreszenzmarkierte Antikörper oder in die Zellen eingebaute fluoreszierende Farbstoffe detektiert werden können. Vor dem Passieren oder nach dem Passieren des Laserstrahls 6 werden die einzelnen Flüssig keitstropfen 10 mittels einer entsprechenden Vorrichtung (nicht dargestellt) selektiv oder unterschiedlich elektrisch aufgeladen. Das heißt, einzelne Flüssigkeitstropfen 10 erhalten eine elektrische Ladung, während andere Flüssigkeitstropfen 10 elektrisch neutral bleiben, oder einzelne Flüssigkeitstropfen 10 erhalten eine positive elektrische Ladung, wohingegen die übrigen Flüssigkeitstropfen 10 eine negative elektrische Ladung erhalten, oder die einzelnen Flüssigkeitstropfen 10 erhalten jeweils eine unterschiedliche Menge an elektrischer Ladung, wobei die Menge an pro Flüssigkeitstropfen 10 angelegter elektrischer Ladung beispielsweise proportional zu der Intensität der durch den Laserstrahl detektierten Fluoreszenz pro Flüssigkeitstropfen 10 ist. Anschließend werden die einzelnen Flüssigkeitstropfen 10 durch ein durch Ablenkplatten 7 erzeugtes elektrisches Feld geführt, in dem elektrisch geladene Flüssigkeitstropfen 10 abgelenkt werden. Unterhalb der Ablenkplatten 7 befindet sich ein Substrat 11 in Form eines Objektträgers, das so angeordnet ist, dass Flüssigkeitstropfen 10 mit einer bestimmten elektrischen Ladung auf eine Reaktionsstelle 12 dieses Substrat 11 abgelenkt werden.
Dabei werden die Parameter beim Führen der Flüssigkeitssuspension durch die Düse 4, bei der Abtrennung der Flüssigkeitstropfen 10 von der Düse 4 und bei der Führung der Flüssigkeitstropfen 10 durch das elektrische Feld so eingestellt, dass die auf der Reaktionsstelle 12 des Substrats 11 auftreffenden Eukaryontenzelle(n) keine umgebende Flüssigkeit mehr aufweisen oder zumindest weitestgehend keine extrazelluläre Flüssigkeit aufweisen.
Das in der 3a dargestellte Substrat 11 ist rechteckig ausgebildet und weist insgesamt 48 Reaktionsstellen 12 auf, welche auf 6 untereinander angeordnete Reihen mit jeweils 8 Reaktionsstellen 12 verteilt sind.
Wie in der 3b zu erkennen, weist jede Reaktionsstelle 12 einen inneren bzw. zentralen, kreisförmig ausgestalteten hydrophilen Bereich 13 auf. Dieser innere hydrophile Bereich 13 ist außenseitig konzentrisch von einem kreisringförmigen (inneren) hydrophoben Bereich 14 umgeben, welche wiederum außenseitig von einem kreisringförmigen (mittleren) hydrophilen Bereich 15 konzentrisch umgeben ist. Schließlich ist der (mittlere) hydrophile Bereich 15 außenseitig von einem (äußeren) hydrophoben Bereich 16 umgeben.
Durch diese Ausgestaltung der Reaktionsstellen 12 wird erreicht, dass sich nach Ablage wenigstens einer Eukaryontenzelle hierauf aus der an der wenigstens einen Eukaryontenzelle haftenden oder aus der der wenigstens einen Eukaryontenzelle nach dem Ablegen auf der Reaktionsstelle zugefügten Flüssigkeit Flüssigkeitstropfen bilden, die vergleichsweise fest an dem Substrat haften, so dass die nachfolgende Enzymreaktion direkt auf den Reaktionsstellen durchgeführt werden kann, ohne dass die Eukaryontenzellen in ein geschlossenes Reaktionsgefäß oder dergleichen überführt werden müssen. Dadurch werden zum einen arbeits- und zeitaufwendige Transferschritte vermieden. Ferner wird dadurch ermöglicht, dass auf dem Substrat 11 mehrere Proben parallel aufbereitet werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass sich die räumlich eng beieinander liegenden Flüssigkeitstropfen bei geringfügigen Erschütterungen oder aufgrund des Verlaufens von Flüssigkeitstropfen infolge zu hohen Tropfenvolumens miteinander vermischen.

1: Gehäuse
2: Kammer für Mantelstrom
3: Kanüle für Zellsuspension
4: Düse
5: Piezokeramik
6: Laserstrahl
7: Ablenkplatten
8: Auslass der Kanäle
9: Kammereinlass
10: Flüssigkeitstropfen
11: Substrat
12: Reaktionsstelle
13: innerer hydrophiler Bereich
14: innerer hydrophober Bereich
15: mittlerer hydrophiler Bereich
16: äußerer hydrophober Bereich

Claims

Verfahren zum Durchführen einer enzymatischen Reaktion mit einer wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Probe umfassend die nachfolgenden Schritte: a) Bereitstellen eines wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltenden Ausgangsmaterials, b) Entnahme von wenigstens einer Eukaryontenzelle aus dem Ausgangsmaterial, c) Anfärben des Zellkerns bzw. der Zellkerne der Eukaryontenzelle(n), d) Ablegen wenigstens einer Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle (12) eines festen Substrats (11) in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 10 μl, e) Detektieren, ob wenigstens ein gefärbter Zellkern auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrat (11) vorliegt, sowie f) Durchführen einer enzymatischen Reaktion mit der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf dem Substrat (11), wobei der Verfahrensschritt e) nach den Verfahrensschritten c) und d) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Verfahrensschritt d) maximal 10 Eukaryontenzellen pro Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Verfahrensschritt d) zwischen 1 und 5 Eukaryontenzellen, bevorzugt zwischen 1 und 3 Eukaryontenzellen, besonders bevorzugt 1 oder 2 Eukaryontenzellen und ganz besonders bevorzugt genau 1 Eukaryontenzelle pro Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt c) vor oder nach dem Verfahrensschritt d) und vor oder nach dem Verfahrensschritt b) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder während des Ablegens der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) gemäß Verfahrensschritt d) die absolute Anzahl der pro Reaktionsstelle (12) abzulegenden bzw. abgelegten Eukaryontenzelle(n) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung der absoluten Anzahl der wenigstens einen Eukaryontenzelle mikroskopisch, bevorzugt lichtmikroskopisch oder fluoreszenzmikroskopisch, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Anfärben des wenigstens einen Zellkerns in Verfahrensschritt c) eine aus der aus Hämatoxylin, Alaunkarmin, alkoholische Boraxaminlösung, Parakarmin, Naphthazarin, Karminessigsäure, 7-Amino-actinomycin D (7-AAD), Acridine orange, BOBO-1, BOBO-3, DAPI Nucleic Acid Stain, Dihydroethidium, Ethidi umbromid, Ethidium Homodimer-1, Hexidiumiodid, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, LDS 751, Nissl substance, Nuclear yellow, Propidiumiodid, SYTO 11, SYTO 13, SYTO 16, SYTOX Green stain, SYTOX Orange, TO-PRO-3, TOTO-3, YO-PRO-1, YOYO-1 und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte Verbindung eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) auf den von einem hydrophoben Bereich (14) umgebenen inneren hydrophilen Bereich (13) einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der innere hydrophile Bereich (13) der Reaktionsstelle (12) auf dem Substrat (11) im Wesentlichen kreisförmig ausgebildet und von einem im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophoben Bereich (14), vorzugsweise konzentrisch, umgeben ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der den inneren hydrophilen Bereich (13) der Reaktionsstelle (12) umgebende hydrophobe Bereich (14) auf dem Substrat (11) außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich (15) umgeben ist, welcher vorzugsweise im Wesentlichen kreisringförmig ist und den hydrophoben Bereich (14) besonders bevorzugt konzentrisch umgibt, und der äußere hydrophile Bereich (15) außenseitig von einem äußeren hydrophoben Bereich (16) umgeben ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrophilie des inneren hydrophilen Bereichs (13) der Reaktionsstelle (12) und die Hydrophobie des diesen umgebenden Bereichs (14) derart eingestellt werden, dass sich bei Auftrag von weniger als 10 μl Wasser auf die Reaktionsstelle (12) ein Wassertropfen mit einem Kontaktwinkel von 20 bis 70°, bevorzugt von 30 bis 60° und besonders bevorzugt von 40 bis 50° ausbildet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der innere hydrophile Bereich (13) der Reaktionsstelle (12) im Wesentlichen kreisförmig ausgestaltet ist und einen Durchmesser zwischen 0,3 und 3 mm aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (11) 2 bis 1.000, vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz besonders bevorzugt 48 verschiedene, jeweils einen im Wesentlichen kreisförmigen inneren hydrophilen Bereich (13) umfassende Reaktionsstellen (12) aufweist, wobei die inneren hydrophilen Bereiche (13) jeweils konzentrisch von einem im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophoben Bereich (14) umgeben sind, welcher außenseitig von einem mittleren, im Wesentlichen kreisringförmigen hydrophilen Bereich (15) umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem äußeren hydrophoben Bereich (16) umgeben ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (11) ein Objektträger oder eine Mikrotiterplatte, vorzugsweise ein AmpliGrid^TM, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 5 μl, bevorzugt von weniger als 2 μl und besonders bevorzugt von weniger als 1 μl auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) in einem Flüssigkeitsvolumen von weniger als 100 nl, bevorzugt von weniger als 10 nl und besonders bevorzugt von maximal 1 nl auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatischen Reaktion in Verfahrensschritt I) eine PCR, LCR oder RCA ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird, indem eine die wenigstens eine Eukaryontenzelle enthaltende Flüssigkeitssuspension durch eine Düse (4) geführt wird, der Flüssigkeitsstrom an der Düse in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen (10) aufgetrennt wird, wobei die einzelnen Flüssigkeitstropfen (10) jeweils eine vorbestimmte Anzahl an Eukaryontenzellen enthalten, alle oder einzelne Flüssigkeitstropfen (10) nach der Abtrennung von der Düse (4) elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen (10) durch ein elektrisches Feld geführt werden, wodurch ein oder mehrere elektrisch aufgeladene Flüssigkeitstropfen (10) auf eine oder mehrere Reaktionsstellen (12) des Substrats (11) gelenkt werden, anschließend den Eukaryontenzellen Enzym und ggf. Reaktionspuffer zugegeben wird und abschließend die enzymatische Reaktion gestartet wird.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Parameter beim Führen der Flüssigkeitssuspension durch die Düse (4), bei der Auftrennung der Flüssigkeitstropfen (10) an der Düse (4) und bei der Führung der Flüssigkeitstropfen (10) durch das elektrische Feld so eingestellt werden, dass wenigstens eine Eukaryontenzelle in einem Volumen von weniger als 100 nl, bevorzugt von weniger als 10 nl und besonders bevorzugt von maximal 1 nl auf einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Eukaryontenzelle(n) hydrodynamisch durch die Düse (4) geführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Düse (4) einen Innendurchmesser zwischen 1 μm und 1 mm, bevorzugt zwischen 10 μm und 500 μm und besonders bevorzugt zwischen 50 μm und 100 μm aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Eukaryontenzelle(n) an der Düse (4) durch piezoelektrische Modulation in einzelne voneinander getrennte Flüssigkeitstropfen (10) aufgetrennt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass in der Flüssigkeitssuspension nur genetisch gleiche Eukaryontenzellen vorhanden sind, der Flüssigkeitsstrom (10) an der Düse (4) so in einzelne Flüssigkeitstropfen (10) aufgetrennt wird, dass jeder Flüssigkeitstropfen (10) genau eine Eukaryontenzelle ent hält, und so viele Flüssigkeitstropfen (10) elektrisch aufgeladen werden wie Eukaryontenzellen auf dem Substrat (11) benötigt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass in der Flüssigkeitssuspension genetisch verschiedene Zellen vorhanden sind, eine einzelne Zelle oder mehrere Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper oder einem fluoreszierenden Farbstoff markiert werden, der Flüssigkeitsstrom oder die einzelnen Flüssigkeitstropfen (10) durch einen Laserstrahl geführt werden, durch den die Fluoreszenz der einzelnen Zellen gemessen wird, die einzelnen von dem Flüssigkeitsstrom abgetrennten Flüssigkeitstropfen (10) in Abhängigkeit von der Fluoreszenz der darin enthaltenen Zelle(n) mit einer bestimmten elektrischen Ladung elektrisch aufgeladen werden und die einzelnen Flüssigkeitstropfen (10) so durch ein elektrisches Feld geführt werden, dass der bzw. die Flüssigkeitstropfen (10) mit einer vorgewählten elektrischen Ladung auf das Substrat (11) gelenkt wird/werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Eukaryontenzelle in Verfahrensschritt d) mittels eines Durchflusszytometers auf wenigstens einer Reaktionsstelle (12) des Substrats (11) abgelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchflusszytometer ein FACS-Vantage SE Durchflusszytometer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Ablegen der wenigstens einen Eukaryontenzelle auf einer Reaktionsstelle des Substrats gemäß Schritt d) und/oder die Entnahme der Eukaryontenzelle(n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) durch Laser-Mikrodissektion ("Laser Capture Microdissection") oder durch Laser-Druck-Katapultation ("Laser Pressure Catapultation"), vorzugsweise mit einem Veritas^TM Microdissection Instrument der Firma Arcturus, einem Leica LMD6000 der Firma Leica oder einem PALM laser capture microdissection System der Firma P.A.L.M., erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Entnahme der Eukaryontenzelle(n) aus dem Ausgangsmaterial gemäß Verfahrensschritt b) mikromechanisch mit einer Kapillare, vorzugsweise mit einem mmi Cellector^® der Firma MMI Molecular Machines & Industries AG, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat (11) wenigstens ein AmpliGrid^TM eingesetzt wird, wobei der wenigstens eine AmpliGrid^TM in einem Rahmen positioniert ist, welcher vorzugsweise eine Kapazität für vier verschiedene AmpliGrid's^TM aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehr Substrate (11) eingesetzt werden, welche jeweils 2 bis 1.000, vorzugsweise 12 bis 256, besonders bevorzugt 24 bis 96 und ganz besonders bevorzugt 48 verschiedene, jeweils einen inneren hydrophilen Bereich (13) umfassende Reaktionsstellen (12) aufweisen und dass die einzelnen Anzahlen der in dem Verfahrensschritt d) pro Reaktionsstelle (12) abgelegten Eukaryontenzelle(n) während oder nach dem Verfahrensschritt d) auf einem Datenträger gespeichert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion in Verfahrensschritt e) mikroskopisch, bevorzugt lichtmikroskopisch oder fluoreszenzmikroskopisch, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Verfahrensschritt e) abgelegte wenigstens eine Eukaryontenzelle wenigstens eine humane Zelle ist, welche bevorzugt aus der aus Erythrozyten, Granulozyten, Lymphozyten, Thrombozyten und Krebszellen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Substrat (11) mit wenigstens einer Reaktionsstelle (12), auf dem eine oder mehrere Zellen vorgesehen sind, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32.