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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1
sowie eine entsprechende Verfahrenseinheit gemäss Anspruch 15 und ein automatisches
System gemäss
dem Oberbegriff des Anspruchs 17 für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben,
Proteinen und Gewebeschnitten.
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Die
Verwendung von DNA-Proben (DNA = Desoxyribosenukleinsäure) und
insbesondere von Mikroarrays solcher Proben stellt der Forschung
eine wichtige Technik zur gleichzeitigen bzw. simultanen Analyse
von Tausenden von Genen zur Verfügung. Diese
Technik umfasst die Immobilisierung von DNA-Proben aus vielen Genen
auf einer festen Substrat-Oberfläche,
wie z.B. auf einem gläsernen
Objektträger
für ein
Lichtmikroskop. Die DNA-Proben werden bevorzugt in einem Array von
Probenflecken oder "spots", d.h. in einem zweidimensionalen
Gitter auf dem Substrat angeordnet und man kann später – ausgehend
von einer bestimmten Position innerhalb eines solchen Arrays auf
den Ursprung der entsprechenden DNA-Probe zurückschliessen. Die Technik umfasst
typischerweise die Kontaktierung des DNA-Proben-Arrays mit RNA-Muster-Suspensionen bzw.
-Lösungen
(RNA = Ribosenukleinsäure)
um damit spezifische Nukleotidsequenzen in den DNA-Proben nachzuweisen.
Diese RNA-Muster werden oft mit einem sogenannten "tag" oder "label", d.h. einem Molekül versehen,
welches z.B. ein Fluoreszenzlicht mit einer spezifischen Wellenlänge aussendet.
Immobilisierte Proben können
auch aminosäurehaltige (z.B.
Proteine, Peptide) oder nukleinsäurehaltige (z.B.
cDNA, RNA) Proben umfassen. Zu den immobilisierten Proben zugegebene
Muster können
beliebige Moleküle
bzw. chemische Verbindungen umfassen, welche mit den immobilisierten
Proben hybridisieren oder sich sonstwie mit diesen verbinden.
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Unter
guten experimentellen Bedingungen hybridisieren bzw. binden RNA-Muster
an immobilisierten DNA-Proben und bilden mit diesen zusammen hybride
DNA-RNA-Stränge. Für jede der
immobilisierten DNA-Proben und für
spezielle RNA-Muster kann
man Unterschiede in der Hybridisierung unter den DNA-Proben durch
die Messung der Intensität und
der Wellenlängenabhängigkeit
der Fluoreszenz jedes einzelnen Mikroarray-Elements feststellen
und so herausfinden, ob der Grad der Genexpression in den untersuchten
DNA-Proben variiert. Mit der Verwendung von DNA-Mikroarrays können somit über die
Expression von grossen Mengen von Genen und über deren Expressionsmuster
umfassende Aussagen gemacht werden, obwohl nur geringe Mengen an biologischem
Material eingesetzt werden müssen.
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DNA-Mikroarrays
haben sich als erfolgreiche Werkzeuge etabliert und die Geräte zur Durchführung der
DNA-Hybridisierung wurden laufend verbessert (vgl. z.B.
US 6,238,910 oder US 2003/0013184 A1
bzw.
EP 1 260 265 A1 des
aktuellen Anmelders). Diese Dokumente offenbaren eine Vorrichtung
zum Bereitstellen eines Hybridisierraums für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben
auf einem Objektträger,
welche gegenüber
diesem Objektträger
bewegbar ausgebildet ist und eine ringförmige Dichtung zum Abschliessen
des Hybridisierraums durch Beaufschlagen einer Oberfläche dieses
Objektträgers umfasst.
Zudem umfasst die offenbarte Vorrichtung Leitungen zum Zu- bzw.
Ableiten von Medien in den Hybridisierraum hinein bzw. aus dem Hybridisierraum
heraus sowie eine Probenzuführung.
Eine verbesserte Temperaturkontrolle und eine Bewegung der Flüssigkeit
mit den RNA-Mustern gegenüber
den auf dem Objektträger
immobilisierten DNA-Proben sind ebenfalls offenbart. Allerdings
dauert es zu lange, bis eine einigermassen gute Verteilung der Musterflüssigkeit
gegenüber
den an der Ober fläche
der Objektträger
immobilisierten Proben erreicht wird, zudem wird der Verbrauch an
Musterflüssigkeit
als zu hoch betrachtet.
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Es
kommt einerseits immer wieder vor, dass Luftblasen beim Einfüllen von
Flüssigkeiten
oder auch später
in der Hybridisierkammer entstehen. Andererseits wurde versucht
(vgl. z.B.
US 6,186,659 ), Luftblasen
gezielt als Agitationsmittel einzusetzen, um in der Hybridisierkammer
eine gründlichere Durchmischung
der Reagenzien zu erzielen. Im allgemeinen sind aber im Hybridisiermedium
anwesende Luftblasen nicht erwünscht,
weil diese den meist sehr dünnen
Flüssigkeitsfilm über den
immobilisierten Proben stören.
Dies kann zu einer Inhomogenität der
Verteilung von Reagenzien im Hybridisiermedium und damit zu einer
Verfälschung
der Hybridisier-Resultate führen;
schlimmstenfalls verdrängen
grössere Luftblasen
sogar das Hybridisiermedium von Teilen der auf dem Objektträger immobilisierten
Proben.
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Aus
dem Stand der Technik sind zudem zahlreiche Methoden bekannt, um
das spontane Auftreten von Luftblasen oder das Verbleiben derselben
in der Kammer zu behindern. So wurde z.B. ein nichtparalleles Anordnen
der die Hybridisierkammer definierenden Objektträger und Deckel vorgeschlagen
(vgl.
US 5,922, 591 ),
oder die Hybridisiermedien werden während dem ganzen Hybridisierprozess
aus der Kammer hinaus und wieder hinein befördert. Andere mischen die Oberflächenspannung
reduzierende Agenzien in das Hybridisiermedium oder behandeln die
Oberflächen
der Kammer mit wasserabstossenden chemischen Verbindungen.
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Aus
US 6,458,526 ist eine Anordnung
bekannt, mir welcher in den Hybridisierraum hineinragende „Blasenhälften" aus einem mit Lösungsmittel gesättigten
Gas erzeugt werden. Es handelt sich bei diesen „Blasenhälften" eigentlich um kalottenförmige Grenzflächen von
Gasräumen
mit einem definierten Krümmungsradius.
Diese „Blasenhälften" befinden sich an
definierten Stellen der Kammer, wo sie die Hybridisierung der Proben
nicht stören
können.
In einem vom Hybridisierraum abgetrennten Kompartiment befindet
sich ein Lösungsmittel,
welches im Hybridisiermedium enthalten ist. Über diesem Lösungsmittel
wird eine gesättigte
Atmosphäre
aufrecht erhalten, welche konstant mit den Gasräumen hinter den „Blasenhälften" verbunden ist. Damit
wird konstant eine mit dem Lösungsmittel gesättigte Atmosphäre an die
kalottenförmigen
Grenzflächen
gebracht und dadurch der Partialdruck des im Hybridisiermedium anwesenden
Lösungsmittel
so beeinflusst, dass allenfalls vorhandene Luftblasen schrumpfen
und eliminiert werden. Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass diese
kalottenförmigen
Grenzflächen
mittels speziellen Vorrichtungen geschaffen und aufrechterhalten
werden müssen.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft das Bereitstellen einer
alternativen Vorrichtung mit welcher Luftblasen in einer Hybridisierkammer auf
einfache Art und Weise beeinflusst werden können.
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Diese
Aufgabe wird mit der Merkmalskombination des unabhängigen Anspruchs
1 gelöst
und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen spaltförmigen Hybridisierraum
begrenzt, der an einer gegen das Innere dieses Hybridisierraums
gerichteten Oberfläche
der Vorrichtung und/oder des Objektträgers Reliefstrukturen zum Leiten
und/oder Blockieren von Luftblasen aufweist. Vorteilhafte Weiterbildungen
und zusätzliche
Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Überlegung zu Grunde, dass einerseits
Gasmoleküle
der Umgebungsluft in die Hybridisierkammer diffundieren können und
so Luftblasen gebildet werden. Andererseits können sich, z.B. in Folge einer
Veränderungen der
Löslichkeit
von Gasen, spontan Gasblasen im Hybridisiermedium bilden. Im Zusammenhang
mit dieser Erfindung werden deshalb alle Gasblasen im Hybridisiermedium – ungeachtet
des Entstehungsprozesses in der Hybridisierkammer – als „Luftblasen" bezeichnet.
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Die
Erfindung soll nun an Hand von schematischen und beispielhaften
Zeichnungen, welche den Umfang der Erfindung nicht beschränken sollen,
näher erläutert werden.
Dabei zeigt:
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1A einen senkrechten Längsschnitt durch
eine Anordnung zum Bereitstellen einer Hybridisierkammer mit aufgeklappter
Vorrichtung;
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1B einen senkrechten Längsschnitt durch
die Anordnung von 1A mit
heruntergeklappter Vorrichtung bzw. geschlossener Hybridisierkammer;
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2A eine schematische Ansicht
einer Hybridisierkammer zwischen einer Vorrichtung und einem Objektträger, auf
den diese Vorrichtung aufgesetzten ist, wobei die Vorrichtung eine
Anordnung von Reliefstrukturen zum Blockieren von Luftblasen gemäss einer
ersten Variante aufweist;
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2B eine schematische Ansicht
einer Hybridisierkammer gemäss 2A, wobei die Vorrichtung
eine Anordnung von Reliefstrukturen zum Blockieren von Luftblasen
gemäss
einer zweiten und dritten Variante aufweist;
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2C eine schematische Ansicht
einer Hybridisierkammer gemäss 2A, wobei die Vorrichtung
eine Anordnung von Reliefstrukturen zum Blockieren von Luftblasen
gemäss
einer vierten und fünften
Variante aufweist;
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3A eine schematische Ansicht
einer Hybridisierkammer zwischen einer Vorrichtung und einem Objektträger, auf
den diese Vorrichtung aufgesetzten ist, wobei die Vorrichtung eine
Anordnung von Reliefstrukturen zum Leiten von Luftblasen gemäss einer
ersten Variante aufweist;
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3B eine schematische Ansicht
einer Hybridisierkammer, wobei die Vorrichtung eine Anordnung von
Reliefstrukturen zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen gemäss der jeweils
ersten Variante aufweist;
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3C eine schematische Ansicht
einer Hybridisierkammer, wobei die Vorrichtung eine alternative
Anordnung von Reliefstrukturen zum Leiten und zum Blockieren von
Luftblasen aufweist;
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4A einen senkrechten Teilschnitt
durch die Anordnung gemäss 1B mit heruntergeklappter
Vorrichtung bzw. geschlossener Hybridisierkammer; wobei die Vorrichtung
eine Ausbildung von Reliefstrukturen zum Leiten von Luftblasen gemäss einer ersten
Variante aufweist;
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4B einen senkrechten Teilschnitt
entsprechend 4A; wobei
die Vorrichtung eine Ausbildung von Reliefstrukturen zum Leiten
von Luftblasen gemäss
einer zweiten Variante aufweist;
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4C einen senkrechten Teilschnitt
entsprechend 4A; wobei
die Vorrichtung eine Ausbildung von Reliefstrukturen zum Leiten
von Luftblasen gemäss
einer dritten Variante aufweist;
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4D einen senkrechten Teilschnitt
entsprechend 4A; wobei
die Vorrichtung eine Ausbildung von Reliefstrukturen zum Leiten
von Luftblasen gemäss
einer vierten Variante aufweist;
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5 eine schematische Teilansicht
einer Hybridisierkammer zwischen einer Vorrichtung und einem Objektträger, auf
den diese Vorrichtung aufgesetzt ist, wobei die Vorrichtung eine
Anordnung von Reliefstrukturen zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen
gemäss
einer jeweils ersten Variante und eine Ausbildung dieser Reliefstrukturen
gemäss
der vierten Variante aufweist.
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1 zeigt einen der
7 von US 2003/0013184 A1 bzw.
EP 1 260 265 A1 des
aktuellen Anmelders entsprechenden, senkrechten Längsschnitt
durch eine Vorrichtung
1 für die Hybridisierung von Nukleinsäureproben,
Proteinen und Gewebeschnitten. Diese Vorrichtung
1 ist
wie ein Deckel gegenüber
einem Objektträger
3 bewegbar
(hier um eine Achse
34 schwenkbar ausgebildet, so dass
der Hybridisierraum
2 durch eine einfache Bewegung geöffnet (vgl.
1A) und geschlossen (vgl.
1B) werden kann. Eine ringförmige Dichtung
bzw. Dichtfläche
4 dient
zum Abschliessen des Hybridisierraums
2 durch Beaufschlagen
einer Oberfläche
5 dieses
Objektträgers
3.
Diese Dichtfläche
4 kann
eine abgesetzte Oberfläche
oder Stufe
104 des Deckels bzw. der Vorrichtung
1 sein,
welche flach auf der Oberfläche
5 des
Objektträgers
3 liegt;
alternativ dazu kann z.B. auch ei ne Lippendichtung verwendet werden.
Bevorzugt wird jedoch eine O-Ring-Dichtung
103 als Dichtfläche
4.
Die Anordnung umfasst Leitungen
6,
6' zum Zu- bzw. Ableiten von Medien in den Hybridisierraum
2 hinein
bzw. aus dem Hybridisierraum
2 heraus. Solche Medien können Reagenzien zum
Durchführen
der Hybridisierungsreaktion, wie z.B. Waschflüssigkeiten oder Puffer-Lösungen,
aber auch inerte Gase (wie z.B. Stickstoff) zum Trocknen der Hybridisierungsprodukte
auf den Objektträgern
3 bzw.
zum Ausblasen der Hybridisierkammern
2 und der Medienleitungen
6,
6' sein. Diese
Zu- bzw. Ableitungen
6,
6' für Hybridisiermedien münden bevorzugt in
je einen Agitationsraum
11,
11'. Die Anordnung umfasst zudem eine
verschliessbare Musterzuführung
7,
durch welche von Hand RNA-enthaltende Flüssigkeiten
oder andere Musterflüssigkeiten
zupipettiert werden können.
Die Musterzuführung
7 wird vorzugsweise
mit einem Kunststoffpfropfen (nicht gezeigt) verschlossen. Alternativ
dazu kann eine automatische bzw. robotisierte Musterzuführung vorgesehen
werden, wie diese in unterschiedlichen Ausführungsformen in US 2003/0013184
A1 bzw.
EP 1 260 265
A1 des aktuellen Anmelders offenbart sind, auf die hier
ausdrücklich
Bezug genommen wird.
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Bevorzugt
sind die Vorrichtungen 1 parallel zueinander und in einer
Vierergruppe angeordnet, weil diese Anordnung gerade ein Mass für eine Temperaturkontrollplatte 20 zulässt, auf
welche ein Rahmen 21 in der Grösse einer Mikroplatte mit vier
parallel zu einander angeordneten Objektträgern 3 passt. Jede
dieser Vierergruppen ist einer an ein Temperatursteuergerät angeschlossenen
Temperaturkontrollplatte 20 zugeordnet. Eine Temperaturkontrollplatte 20 ist
zur flächigen
Aufnahme eines vier Objektträger 3 tragenden
Rahmens 21 ausgebildet. Weil die Objektträger 3 im
Rahmen 21 sanft federnd gehalten sind und weil die Temperaturkontrollplatte 20 so
ausgebildet ist, dass der Rahmen ihr gegenüber etwas abgesenkt werden
kann, liegen die Objektträger 3 direkt
auf der Oberfläche
der Temperaturkontrollplatte 20. Jede Vierergruppe einer
Verfahrenseinheit 18 umfasst eine um eine Achse 34 schwenkbare
und gegenüber
einer Grundplatte 35 verriegelbare Halterung 36 mit
vier Sitzen 37, wobei in jeden dieser Sitze 37 eine
Vorrichtung 1 einlegbar ist. Jede Verfahrenseinheit 18 umfasst
zudem eine Anschlussplatte 22 zum dichtenden Verbinden
der Einheitsleitungen 23,23',23" des Systems 38 mit den
Leitungen 6,6',6" der Vorrichtungen 1.
Als Dichtungen für
diese Verbindungen werden O-Ringe bevorzugt (nicht gezeigt).
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Die
Anordnung umfasst vorzugsweise eine medientrennende Agitationseinrichtung 8 zum
Bewegen von Flüssigkeiten
gegenüber
auf der Oberfläche 5 der
Objektträger 3 immobilisierten
nukleinsäure- bzw.
aminosäurehaltigen
Proben oder Gewebeschnitten. In der in 1 gezeigten Ausführungsform umfasst die Agitationseinrichtung 8 der
Anordnung eine Membran 9. Diese Membran 9 trennt
einen Druckraum 10, der über eine Druckleitung 6" mit einem Druckfluid
(Gas oder Flüssigkeit)
befüllbar
ausgebildet ist, von einem Agitationsraum 11, der über eine
Agitationsleitung 12 mit dem Hybridisierraum 2 verbunden
ist. Nach dem Erreichen des thermischen Gleichgewichtes der Anordnung,
dem Zugeben eines bestimmten Volumens an RNA-Musterflüssigkeit
und dem Verschliessen der Musterzuführung 7 wird über die
Druckleitung 6" vorzugsweise
Luft oder ein anderes Gas (es könnte
aber auch eine Flüssigkeit
sein) stossweise in den Druckraum 10 gebracht (Überduckversion)
oder daraus abgesogen (Unterdruckversion), so dass sich die Membran 9 im
gleichen Rhythmus durchbiegt und entsprechend den Agitationsraum 11 verkleinert
bzw. vergrössert.
Dadurch wird die Musterflüssigkeit
im gleichen Rhythmus des Über-
bzw. Unterdrucks und Entspannens im Hybridisierraum 2 gegen
das eine oder das andere Ende bewegt, wo sich vorzugsweise an der
gegen das Innere des Hybridisierraums 2 gerichteten Oberfläche 14 des
Deckels bzw. der Vorrichtung 1 je ein Querströmkanal 15,15' befindet.
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Diese
Querströmkanäle 15,15' erleichtern
einerseits das Querverteilen von in der Musterlösung enthaltenen RNA-Molekülen. Dadurch
wird bewirkt, dass die Musterflüssigkeit
bzw. die Waschflüssigkeiten
homogen über
das gesamte im Hybridisierraum 2 anwesende Volumen verteilt
werden. Andrerseits dienen die Querströmkanäle 15,15' auch als Flüssigkeits-Reservoir,
so dass bei der durch die in der Vorrichtung eingebauten Agitationseinrichtung 8 erzeugte
Pendelbewegung der Musterlösung
nicht dazuführt,
dass Teile des Hybridisierraums 2 unbeabsichtigt trocken
liegen.
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Vorzugsweise
ist ein zweiter, ebenfalls mit einer Membran 9' versehener
Agitationsraum 11' über eine
zweite Agitationsleitung 12' mit
dem Hybridisierraum 2 verbunden. Wenn jetzt ein auf den
Druckraum 10 abgegebener Druckstoss die erste Membran 9 in den
ersten Agitationsraum 11 drückt, wird dieser Impuls über die
erste Agitationsleitung 12 auf die Musterflüssigkeit
im Hybridisierraum 2 übertragen.
Die Musterflüssigkeit
weicht etwas gegen die zweite Agitationsleitung 12' aus (kann diese
sogar zum Teil füllen)
und erhöht
den Druck im zweiten Agitationsraum 11'. Dadurch biegt sich die zweite
Membran 9' nach oben
und wird dabei elastisch gedehnt. Sobald der Überdruck im Druckraum 10 nachlässt, federn
beide Membranen 9,9' in
ihre Ruheposition zurück
und bewegen die Musterflüssigkeit
im Hybridisierraum 2 in die entgegengesetzte Richtung.
Durch diese Pendelbewegung kann mit der gezeigten Anordnung eine Musterflüssigkeit
mit einem minimalen Volumen (im Bereich von ca. 100 μl) in weniger
als einer Minute praktisch homogen im Hybridisierraum 2 verteilt
werden. Vorzugsweise wird unmittelbar anschliessend an den Druckabbau
im Druckraum 10 ein Unterdruck im Druckraum 10 erzeugt,
so dass die dem vorangehenden Druckstoss entgegengesetzte Rückwärtsbewegung
der Musterflüssigkeit
im Hybridisierraum 2 noch verstärkt wird.
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Währenddem 1A eine offene Halterung 36 darstellt,
zeigt 1B einen Vertikalschnitt
durch eine Verfahrenseinheit 18 zum Hybridisieren von Nukleinsäureproben,
Proteinen oder Gewebeschnitten mit geschlossener Halterung 36.
Alle vier Hybridisierräume 2 dieser
Vierergruppen sind einer an ein Temperatursteuergerät angeschlossenen
Temperaturkontrollplatte 20 zugeordnet. Um sicherzustellen, dass
die Vorrichtungen 1 planparallel zu den Objektträgern 3 platziert
werden können,
weist die Halterung 36 zudem noch ein Mittelgelenk (nicht
gezeigt) mit einer zur Achse 34 parallelen Beweglichkeit
auf. Damit die Dichtungen 4 die Hybridisierräume 2 zuverlässig abschliessen,
wird über
die Halterung 36 ein zusätzlicher Druck auf die Vorrichtungen 1 ausgeübt, dies
kann über
Schrauben, Kipphebel oder ähnliche bekannte
Vorrichtungen (nicht gezeigt) bewerkstelligt werden. Jede Verfahrenseinheit 18 umfasst
zudem eine Anschlussplatte 22 zum dichtenden Verbinden der
Einheitsleitungen 23,23',23" mit den Leitungen 6,6',6" der Vorrichtungen 1.
Als Dichtungen für
diese Verbindungen werden O-Ringe bevorzugt (nicht gezeigt).
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Die 2 und 3 zeigen schematische Ansichten auf die
geschlossene Anordnung von 1B,
von unten gesehen. Dabei ist die spaltförmige Hybridisierkammer 2 zwischen
einer Vorrichtung 1 und einem Objektträger 3, auf den diese
Vorrichtung 1 aufgesetzt ist, in ihrem Volumen definiert.
Die O-Ring-Dichtung 103 begrenzt lateral den Hybridisierraum 2,
der an seinen einander entgegengesetzten Enden vorzugsweise je einen
Querströmkanal 15,15' aufweist, welche
als Vertiefung in der Oberfläche 14 des
Deckels bzw. der Vorrichtung 1 vorgesehen sind. Der Objektträger 3 (hier
ein Glasobjektträger
für die Lichtmikroskopie)
und dessen optionales Griff- und/oder Barcodefeld 33 sind
gestrichelt eingezeichnet. Klar ersichtlich ist auch eine Abdrückfeder 17, welche
auf das Grifffeld 33 des Objektträgers 3 drückt. Es
können
auch mehrere Abdrückfedern
vorgesehen sein (nicht gezeigt). Zusätzlich können – bevorzugt auf den Seitenflanken
der Vorrichtung – 1 Zentrierfedern
angeordnet sein (nicht gezeigt) mit welchen Objektträger mit
speziellen Formaten on der Vorrichtung 1 zentriert werden,
so dass eine maximale Ausnützung
der Objektträgeroberfläche gewährleistet
ist. Beim Öffnen
des Hybridisierraums 2 erleichtert diese Abdrückfeder 17 die
automatische Trennung des Objektträgers 3 vom Deckel
bzw. von der Vorrichtung 1. Ebenfalls ersichtlich sind
die Öffnungen
der Einlassleitung 6 und der Auslassleitung 6' sowie der Musterzuführung 7,
die in einen der beiden Querströmkanäle 15,15' münden.
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2A zeigt eine Vorrichtung 1 mit
einer Anordnung von Reliefstrukturen 101 zum Blockieren von
Luftblasen 102 gemäss
einer ersten Variante. Diese Reliefstrukturen 101 sind
hier als Vertiefungen 105 ausgebildet und in Grenzbereichen 106 des
Hybridisierraums 2 entlang zumindest eines Teils der Dichtfläche 4 angeordnet.
Wie gezeigt münden
keine Leitungen 6,6',7 in
diese Vertiefungen 105. Gemäss dieser bevorzugten ersten
Variante sind mehrere Vertiefungen in einer Reihe links und rechts
der Hybridisierkammer 2 angeordnet, wobei diese Reihen sich über den
ganzen Grenzbereich 106 zwischen den beiden endständigen Querströmkanälen 15,15' erstrecken.
Die Vertiefungen 105 befinden sich in unmittelbarer Nähe des O-Rings 103,
sie sind alle gleich lang und durch schmale Stege 107 unterbrochen,
so dass die Luftblasen 102 in der jeweiligen Vertiefung 105 gefangen
sind und sich nicht mit dem Objektträger 3 verbinden und
damit ein Hybridisieren der darunter liegenden Proben verhindern
oder behindern können.
Zudem können
sich so in den Vertiefungen 105 gefangene Luftblasen 102 nicht über den Hybridisierraum 2 verteilen.
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2B zeigt eine Anordnung
von Reliefstrukturen 101 zum Blockieren von Luftblasen 102 gemäss einer
zweiten und dritten Variante. Die Vertiefungen 105 befinden
sich in unmittelbarer Nähe des
O-Rings 103, sie sind alle gleich lang und durch schmale
Stege 107 unterbrochen, so dass die Luftblasen 102 in
der jeweiligen Vertiefung 105 gefangen sind. Gemäss der zweiten
Variante (links) sind nur wenige, lange Vertiefungen 105 vorgesehen;
es könnte
auch nur eine einzige Vertiefung auf jeder Seite der Hybridisierkammer 2 angeordnet
werden (nicht gezeigt), wichtig ist, dass ein Steg 107 diese
Vertiefungen 105 von den Querströmkanälen 15,15' trennt. Gemäss der dritten
Variante (rechts) sind sehr viele kurze (z.B. runde) Vertiefungen 105 vorgesehen. Diese
haben den Vorteil, dass sehr viele individuelle Kompartimente zum
Blockieren von Luftblasen 102 geschaffen werden.
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2C zeigt eine Anordnung
von Reliefstrukturen 101 zum Blockieren von Luftblasen 102 gemäss einer
vierten und fünften
Variante. Die Vertiefungen 105 befinden sich in unmittelbarer
Nähe des O-Rings 103,
sie weisen eine unterschiedliche Länge auf und sind durch schmale
Stege 107 unterbrochen, so dass die Luftblasen 102 in
der jeweiligen Vertiefung 105 gefangen sind. Gemäss der vierten
Variante (links) sind nur wenige, lange Vertiefungen 105 vorgesehen,
zwischen welchen kurze (z.B. runde) Vertiefungen angeordnet sein
können.
Gemäss
der fünften
Variante (rechts) sind mehrere Vertiefungen 105 mit zunehmender
Länge vorgesehen.
Die hier gezeigten Anordnungen haben den Vorteil, dass Kompartimente
zum Blockieren von Luftblasen 102 geschaffen werden, die
entsprechend von bestimmten Prozessparametern oder Kammereigenschaften
individuell verteilt sind. Z.B. lassen sich so Vertiefungen vorsehen,
welche entsprechend von erfahrungsgemäss auftretenden Gradienten
(im Hybridisiermedium und/oder im Auftreten der Luftblasen) angeordnet sind.
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Diese
gezeigten Anordnungen von als Vertiefungen 105 ausgebildeten
Reliefstrukturen 101 eignen sich besonders zum Blockieren
von durch Diffusion durch den O-Ring 103 entstandenen Luftblasen 102 und
zwar in unmittelbarer Nähe
ihres Entstehungsortes. Zusätzlich
zur Variation der Anzahl und Länge
der als Vertiefungen 105 ausgebildeten Reliefstrukturen 101 zum
Blockieren von Luftblasen 102, gehört auch die Variation der Breite
und/oder Tiefe solcher Vertiefungen 105 zum Umfang der
vorliegenden Erfindung. Es können
auch sogenannte Fangkanäle
für Luftblasen
entlang der seitlichen O-Ringe vorgesehen sein. Solche Fangkanäle (nicht
gezeigt) sind dann als eine einzige Vertiefung ausgebildet, welche
lediglich durch je einen dünnen
Steg von den beiden Querströmkanälen 15,15' getrennt ist.
Dabei ist zu erwähnen,
dass die erfindungsgemässen
Vertie fungen 105 auch in Hybridisierkammern 2 eingesetzt
werden können,
welche keine Agitationseinrichtung umfasst.
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3A zeigt eine Anordnung
von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer
ersten Variante. Die Reliefstrukturen 101 sind hier als
Erhebungen 108 zum Leiten von Luftblasen 102 ausgebildet
und im wesentlichen über
den ganzen Hybridisierraum 2 verteilt angeordnet. Bevorzugt
sind die Erhebungen 108 regelmässig und in einem verschränkten, orthogonalen
Raster 109 angeordnet. Speziell bevorzugt ist ein verschränkter, orthogonaler
Raster 109, der um 45 ° verdreht
zu einer Fliessachse 110 angeordnet ist. Abweichungen von der
orthogonalen Anordnung sind möglich,
so dass durch einen kleineren Winkel zur Fliessrichtung als 45 ° (steilere
Anordnung) das Abdrängen
erleichtert wird. Andererseits wird durch die Wahl von grösseren Winkeln
als 45 ° zur
Fliessrichtung (flachere Anordnung) eine grössere Distanz beim Abdrängen erreicht.
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3B zeigt eine Anordnung
von Reliefstrukturen 101 zum Leiten und zum Blockieren
von Luftblasen 102. Die blockierenden Reliefstrukturen 101 sind
als Vertiefungen 105 ausgebildet und in Grenzbereichen 106 des
Hybridisierraums 2 entlang zumindest eines Teils des O-Rings 103 angeordnet (vgl. 2A). Die leitenden Reliefstrukturen 101 sind als
Erhebungen 108 zum Leiten von Luftblasen 102 ausgebildet
und im wesentlichen über
den ganzen Hybridisierraum 2 verteilt angeordnet (vgl. 3A). Die Kombination von
blockierenden und leitenden Reliefstrukturen 101 ermöglicht auch
das Vereinigen der bereits beschriebenen positiven Effekte dieser Reliefstrukturen.
Dabei werden bevorzugt die Anordnung und die Grösse aller zum Beeinflussen
von Luftblasen 102 eingesetzten Reliefstrukturen 101 einander
angepasst. Wichtige Kriterien für
ein solches Anpassen sind das Volumen der Hybridisierkammer (bevorzugt
ca. 60 μl),
der Hub der Agitationseinrichtung (bevorzugt ca. 5 μl), die Länge der
Hybridisierkammer (bevorzugt ca. 50 mm) sowie die aus der Agitation
resultierende Pendelstrecke der Hybridisiermedien über den
immobilisierten Proben (bevorzugt ca. 5 mm). Zudem ist wünschbar,
dass die Frequenz der Agitationszyklen einstellbar ist. Das heisst, es
werden unterschiedlich lange Agitationszeiten mit unterschiedlichen
langen Zeiten ohne Agitation abgewechselt. Die Agitationszeiten
sind jedoch vorzugsweise so lange gewählt, dass sich eine grosse Zahl
von Agitationsbewegungen pro Minute und dadurch eine Mehrfachdurchmischung
des Kammervolumens ergibt. Mischversuche mit Farbstoffen haben gezeigt,
dass nach wenigen Minuten eine praktisch 100 %ige Durchmischung
stattfindet.
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3C eine alternative Anordnung
von Reliefstrukturen zum Leiten und zum Blockieren von Luftblasen.
Die blockierenden Reliefstrukturen 101 sind als kleinere
Vertiefungen 105 ausgebildet (vgl. 3B). Die leitenden Reliefstrukturen 101 sind
als feinere und engmaschiger verteilte Erhebungen 108 zum
leiten von Luftblasen 102 ausgebildet (vgl. 3B).
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4 zeigt senkrechte Teilschnitte
durch eine Anordnung gemäss 1B mit heruntergeklappter
Vorrichtung 1 bzw. geschlossener Hybridisierkammer 2.
Pfeile bezeichne die Fliessrichtung der Musterflüssigkeit gegenüber den
auf dem Objektträger 3 immobilisierten
Proben. Diese Bewegung der Musterflüssigkeit bewirkt in Wechselwirkung
mit den gezeigten Reliefstrukturen 101 ein Abdrängen der
Luftblasen 102 von der eigentlichen Fliessrichtung oder
Fliessachse 110.
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4A zeigt eine Ausbildung
von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer
ersten Variante. Diese Reliefstruktur ist als Vertiefung 105 ausgebildet,
welche eine flache und eine steile Flanke aufweist. Die Flanken
der Vertiefung 105 bilden je eine Schnittlinie mit der
Oberfläche 14 der
Vorrichtung 1. Bei konstanter Höhendifferenz und Flankenneigung
der Vertiefung 105 verlaufen diese Schnittlinien parallel
zu einander (vgl. 5).
Bei zunehmender Höhendifferenz
und konstanter Flankenneigung der Vertiefung 105 divergieren
diese Schnittlinien; so kann beispielsweise ein Fischschuppen ähnliches
Relief auf der Oberfläche 14 der
Vorrichtung 1 erzeugt werden. Der Neigungswinkel der steilen
Flanke und der Winkel zwischen der Fliessachse 110 und
der Schnittlinie zwischen der steilen Flanke und der Oberfläche 14 der
Vorrichtung 1 bestimmen zusammen den Einfluss auf eine Luftblase 102,
die gegen diese steile Flanke gespült wird. Diese beiden Winkel
sind erfindungsgemäss
so gewählt,
dass der Fliesswiderstand der Luftblase 102 gegenüber der
steilen Flanke in Richtung der Fliessachse 110 grösser ist
als in Richtung der Reliefstruktur 101. Dadurch erfolgt
ein Abdrängen
der Luftblase 102 von der allgemeinen Fliessrichtung. Dieses
Abdrängen
wird zusätzlich
durch die von der Reliefstruktur 101 verursachte, in die
gleiche Richtung abgelenkte, örtliche
Mikroströmung
unterstützt.
Diese Mikroströmungen
treten an allen in einem Winkel zur Fliessachse 110 angeordneten Reliefstrukturen 101 auf
und unterstützen
zusätzlich
eine effektivere Durchmischung der Musterflüssigkeit.
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Eine
weitere bevorzugte Variante (nicht gezeigt) umfasst das Ausbilden
von leitenden Vertiefungen 105, die an deren einem Ende
in den Vertiefungen 105 zum Blockieren der Luftblasen 102 beginnen und
die bis über
die Mitte des Hybridisierraums 2 (durch die in den 2 und 3 eingezeichnete Fliessache 110 markiert)
reichen. Diese leitenden Vertiefungen 105 sind ebenfalls
bevorzugt unter einem Winkel von 45 ° zur Fliessachse 110 orientiert
und abwechselnd von der linken oder rechten Seite der Hybridisierkammer 2 ausgehend
und unter 90 ° zu einander
liegend angeordnet. Diese leitenden Vertiefungen 105 können gleichbleibend
tief ausgebildet oder nach der Mitte des Hybridisierraums 2 spitz
zulaufend ausgebildet sein.
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4B zeigt eine Ausbildung
von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer
zweiten Variante. Diese Reliefstruktur ist als Erhebung 108 ausgebildet,
welche eine flache und eine steile Flanke aufweist. 4C zeigt eine Ausbildung von Reliefstrukturen 101 zum
Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer dritten Variante.
Diese Reliefstruktur ist teilweise als Vertiefung 105 und
teilweise als Erhebung 108 ausgebildet und weist zwei steile
und eine flache Flanke auf. Alle Bemerkungen zu 4A gelten sinngemäss auch für 4B und 4C.
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4D zeigt eine Ausbildung
von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102 gemäss einer
vierten Variante. Diese Reliefstruktur ist als Erhebung 108 ausgebildet
und weist zwei steile Flanken und eine flache (erhöhte) Oberfläche auf. Alle
Bemerkungen zu 4A gelten
sinngemäss auch
hier. Eine weitere Variante (nicht gezeigt) umfasst die Ausbildung
von Reliefstrukturen 101 zum Leiten von Luftblasen 102,
bei welcher diese Reliefstruktur 101 ist als Vertiefung 105 ausgebildet
ist und zwei steife Flanken und eine flache (vertiefte) Oberfläche aufweist.
Beiden Varianten ist gemeinsam, dass die Schnittlinien der steilen
Flanken mit der Oberfläche 14 der
Vorrichtung 1 einen parallelen Verlauf haben können, so
dass die Höhendifferenz
dieser Reliefstrukturen 101 konstant ist (gezeigt). Beiden
Varianten ist aber auch gemeinsam, dass die Schnittlinien der steilen
Flanken mit der Oberfläche 14 der
Vorrichtung 1 einen divergierenden Verlauf haben können, und
dass die Höhendifferenz
dieser Reliefstrukturen 101 trotzdem konstant ist (nicht
gezeigt).
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Abweichend
von den in 4 gezeigten
Reliefformen werden auch als Erhebungen 108 ausgebildeten
Reliefstrukturen 101 mit einem kalottenförmigen Querschnitt
bevorzugt (nicht gezeigt). Mit solchen Erhebungen 108 gehen
Luftblasen 102 mit einem Durchmesser von höchstens
etwa 50 μm
mit grösserer
Wahrscheinlichkeit lediglich eine Punktberührung ein. Somit bleiben die
Luftblasen schon bei relativ geringer Agitation nicht an den Erhebungen 108 hängen und
werden auch bis in die Querströmkanäle 15,15' weitergespült. Falls
die Luftblasen 102 nicht unterwegs in Vertiefungen 105 gefangen
bleiben, werden sie in den Querströmkanälen 15,15' gesammelt.
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Das
Anordnen von Vertiefungen 105 wird in den meisten Fällen den
Erhebungen 108 vorgezogen, weil Vertiefungen immer auch
eine Zunahme der Höhe
der bevorzugt ca. 60–70 μm hohen Hybridisierkammer 2 bedeuten.
Dadurch wird das Risiko vermindert, dass eine Luftblase die Hybridisierung
einer Probe beeinträchtigt.
Besonders bevorzugt wird ein zumindest annähernder, volumenmässiger Ausgleich von
Vertiefungen 105 und Erhebungen 108, so dass ein
definiertes Volumen für
den Spalt zwischen der Vorrichtung 1 und dem Objektträger 3 und
damit ein definiertes Volumen für
die Hybridisierkammer 2 eingehalten werden kann.
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Das
Blockieren von Luftblasen
102 mit erfindungsgemässen Vorrichtungen
1,
die Reliefstrukturen
101 gemäss einem der in
2 dargestellten Beispiele
aufweisen, funktioniert grundsätzlich
in Systemen, die mit oder ohne Agitationseinrichtung für das Bewegen
der Musterlösung
gegenüber
den immobilisierten Proben ausgestattet sind. Ist ein solches System
38 zum
Hybridisieren von Nukleinsäureproben,
Proteinen oder Gewebeschnitten jedoch mit einer Agitationseinrichtung
(beispielsweise wie in
1 gezeigt
und beschrieben) ausgestattet, so entsteht eine Pendelbewegung der
Musterflüssigkeit
gegenüber
den auf dem Objektträger
3 immobilisierten Proben.
In einem solchen System – wie
es beispielsweise in US 2003/0013184 A1 bzw.
EP 1 260 265 A1 des aktuellen
Anmelders offenbart ist – welches
mit erfindungsgemässen
Vorrichtungen
1 bestückt
ist, werden im Hybridisierraum
2 spontan entstehende oder
schon (durch Einschleppen) vorhandene Luftblasen
102 hin
und her bewegt und durch leitende Reliefstrukturen
101 in
Grenzbereiche
106 des Hybridisierraums
2 abgedrängt, wie
dies in der Folge erläutert
wird. Auf die veröffentlichten
Patentanmeldungen US 2003/0013184 A1 bzw.
EP 1 260 265 A1 des aktuellen
Anmelders wird hier ausdrücklich
Bezug genommen.
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5 zeigt eine schematische
Teilansicht einer Hybridisierkammer 2 zwischen einer Vorrichtung 1 und
einem Objektträger 3,
auf den diese Vorrichtung 1 aufgesetzt ist. Die Vorrichtung 1 weist
eine Anordnung von Reliefstrukturen 101 zum Leiten und zum
Blockieren von Luftblasen 102 gemäss einer jeweils ersten Variante
(vgl. 3B) und eine Ausbildung
dieser Reliefstrukturen 101 als Erhebungen 108 gemäss der vierten
Variante (vgl. 4D) auf. Die
Strecke, welche die Mustermoleküle
im Mittel während
einer durch eine Agitationseinrichtung erzeugten Pendelbewegung
zurücklegen
ist mit zwei einander entgegengesetzten Pfeilen markiert. Diese Strecke
kann auch wesentlich länger
aber nicht viel kürzer
sein, als dies in der schematischen Darstellung skizziert ist. Bevorzugt
wird eine Distanz von zwei hinter einander in Agitationsrichtung
liegenden, gleich gerichteten Reliefstrukturen von ca. 2/3 der Pendelbewegung
oder ca. 4 mm. Der typische Weg einer Luftblase 102 beginnt
an einer beliebigen Position (1) im Hybridisierraum 2.
Diese Luftblase 102 mit einem Durchmesser von höchstens
etwa 50 μm
(bei einer Kammerhöhe
bzw. Spalthöhe
von bevorzugt 30–200 μm) wird von
der (in der Skizze nach oben gerichteten) Strömung erfasst und im wesentlichen
in gerader Linie mitbewegt, bis sie an eine als Erhebung 108 ausgebildete,
erste Reliefstruktur 101 anstösst (2). Weil der
Widerstand für
ein Ausweichen der Luftblase 102 (hier: unter 45 ° nach rechts
oben) erheblich kleiner ist als ein Stehen bleiben, wird sie bis
an das Ende der Reliefstruktur 101 von der Strömung mitgezogen
(3,4). Darauf bewegt sich die Luftblase 102 wieder
geradlinig weiter, bis sie auf eine zweite Reliefstruktur 101 trifft
(5), von dieser wieder abgelenkt wird (hier: unter 45 ° nach links
oben) und nach dem Abbrechen der Strömung stehen bleibt (6).
Nun setzt die Strömung
in der Gegenrichtung ein und zieht die Luftblase 102 mit,
bis sie auf die Rückseite der
ersten Reliefstruktur 101 trifft (7), von dieser
erneut abgelenkt wird (hier: unter 45 ° nach links unten) und in die
als Vertiefung 105 ausgebildete Reliefstruktur 101 eintritt
(8). In dieser Vertiefung 105 ist die Luftblase 102 dann
gefangen und kann nur noch innerhalb dieser engen Grenzen der Pendelströmung folgen
(9). Sind bereits andere Luftblasen in der Vertiefung 105 blockiert,
so wird oft ein Aggregieren der vorhandenen Luftblasen oder sogar
ein Fusionieren derselben beobachtet. Diese beiden Vorgänge erhöhen zusätzlich die
Wahrscheinlichkeit, dass keine der Luftblasen die Vertiefung 105 wieder
verlassen kann.
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Die
erfindungsgemässen
Reliefstrukturen 101 (Erhebungen und Vertiefungen) am Deckel
bzw. an der Vorrichtung 1 weisen bevorzugt eine Höhendifferenz
zur sonst ebenen Oberfläche 14 des
Deckels bzw. der Vorrichtung 1 von maximal 1/3 der bevorzugten
Spalthöhe
von 30 μm
bis 200 μm
auf. Speziell bevorzugt sind Höhendifferenzen
von 30 μm
bei Vertiefungen und von 20 μm
bei Erhebungen. Diese Reliefstrukturen 101 können in
die Vorrichtung 1 während
dem Herstellungsprozess (z.B. Spritzguss, Bearbeitung von Stangenmaterial)
eingeformt werden. Vertiefungen können auch nachträglich eingearbeitet
(z.B. mittels Fräsen).
Auch Erhebungen können
nachträglich
zum eigentlichen Herstellungsprozess der Vorrichtung 1 aufgebracht
(z.B. mittels Kleben bzw. Deponieren von Harzen) werden. Dies kann z.B.
mittels einer Schablone oder mittels auf Haftstreifen vorgefertigten
Halbfabrikaten geschehen.
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Auch
Objektträger 3 können mit
Reliefstrukturen 101 versehen sein, seien dies nun Vertiefungen 105 und/oder
Erhebungen 108. Bevorzugt werden die Reliefstrukturen 101 auf
den Objektträgern 101 entsprechend
den zu erwartenden Probenverteilungen auf deren Oberfläche 5 angeordnet.
So können z.B.
quadratische sogenannte „low
density arrays" durch
kanalartige Vertiefungen getrennt sein. Auch können die Objektträger 3 eine
Dichtung umfassen, die ein Teil des Objektträgers ist oder die auf diesem angeordnet
ist. Solche Dichtungen können
z.B. im Zweikomponenten-Spritzgussverfahren mit Objektträgern aus
Kunststoff hergestellt werden. Das Aufspritzen von solchen, bevorzugt
weichen Dichtungen 4 auf Glasobjektträger ist ebenfalls möglich. Ergänzend kann
die Vorrichtung 1, bzw. der den Hybridisierraum 2 abschliessende
Deckel, eine harte Dichtung 4 zum Aufrechterhalten der
definierten Spaltbreite bzw. Höhe
des Hybridisierraums umfassen. Auch die Verwendung von z.B. ebenfalls
im Zweikomponenten-Spritzgussverfahren hergestellten Verbunddichtungen
mit einer weichen (dichtenden) Komponente und einer harten (die
Spalthöhe
definierenden) Komponente ist denkbar. Dabei spielt das Material
der Vorrichtung 1 (vorzugsweise Polysulfon) eine eher untergeordnete
Bedeutung.
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Jede
ringförmige
Anordnung bzw. Ring mit Dichtfunktion wird im Zusammenhang mit der
vorliegenden Erfindung als O-Ring bezeichnet. So ein O-Ring kann
wahlweise einen z.B. runden, elliptischen oder vieleckigen Querschnitt
aufweisen oder auch als Dichtlippe ausgeformt sein.
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Wesentlich
ist, dass zumindest im Bereich des Hybridisierraums 2 die
Oberfläche 5 des
Objektträgers 3 im
Mittel planparallel zu der Oberfläche 14 der Vorrichtung 1 angeordnet
ist. Grundsätzlich
ist der Hybridisierraum 2 jedoch nicht auf eine annähernd rechteckige
Grundfläche
angewiesen, wie dies in den 2 und 3 gezeigt wird. In von der
rechteckigen Grundfläche
abweichenden Hybridisierräumen mit
z.B. runder Form, können
die Vertiefungen 105 entsprechend entlang der Dichtung 4 angeordnet werden.
Auch Erhebungen 108 können
entsprechend der vorliegenden Erfindung in einer z.B. tangentialen
Agitationsrichtung angeordnet werden. Ebenso muss die Vorrichtung 1 für das Beeinflussen der
Luftblasen nicht unbedingt transparent sein oder transparente Teile
aufweisen.
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Falls
in einem Hybridisiermedium regelmässig besonders viele aber sehr
kleine Blasen auftreten, deren Durchmesser wesentlich kleiner ist
als der Abstand zwischen Vorrichtung 1 und Objektträger 3, können diese
Luftblasen durch ein in die Oberfläche der 14 Vorrichtung 1 eingekratztes
Gittermuster an der Stelle ihres Entstehens blockiert werden. So
wird verhindert, dass die kleinen Luftblasen durch Aggregation oder
Fusion grössere
Gebilde formen, welche die Hybridisierungsreaktion irritieren könnten.
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Die
Bezugszeichen bezeichnen jeweils gleiche Merkmale, auch wenn nicht
zu jeder Figur alle Merkmale ausdrücklich benannt werden. Beliebige Abwandlungen
und Kombinationen der hier offenbarten Varianten gehören mit
zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Insbesondere können die
Vorrichtung 1, der Objektträger 3, oder auch beide
dieser Komponenten Reliefstrukturen 101 aufweisen, seien dies
nun Vertiefungen 105 und/oder Erhebungen 108.