DE112015007082B4 - Zellanalyseeinrichtung, Vorrichtung und ein diese verwendendes Zellanalyseverfahren - Google Patents

Zellanalyseeinrichtung, Vorrichtung und ein diese verwendendes Zellanalyseverfahren Download PDF

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Abstract

Zellanalyseeinrichtung umfassend:einen Lösungseinführungskanal zum Einführen einer Zellen enthaltenden Lösung;ein Substrat mit einer Mehrzahl von Sätzen aus einem Zelleinfangteil und einem Nukleinsäureeinfangteil, wobei das Zelleinfangteil mit dem Lösungseinführungskanal in Kontakt ist und eine Konkavität aufweist, die in der Lage ist, eine einzelne Zelle einzufangen, und das Nukleinsäureeinfangteil in entsprechender Weise im Hinblick auf die Konkavität des Zelleinfangteils vorgesehen ist und eine Nukleinsäure einfängt, die aus der mittels des Zelleinfangteils eingefangenen Zelle extrahiert wurde;einen Ableitkanal, der benachbart dem Nukleinsäureeinfangteil des Substrats vorgesehen ist und eine Lösung des Nukleinsäureeinfangteils ableitet; undein Drucksteuermittel, das in dem Ableitkanal vorgesehen ist,wobei das Substrat eine abstoßende Kraft in einer Richtung aufweist, die die Zellen vom Substrat trennt, unddas Drucksteuermittel eine Steuerung derart vornimmt, dass, wenn die Zelle vom Zelleinfangteil eingefangen wird, eine Kraft in der Richtung vom Zelleinfangteil zum Nukleinsäureeinfangteil als erster Druck dient, der höher als die abstoßende Kraft ist.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die technischen Gebiete der Genexpressionsanalyse, der Zellfunktionsanalyse, des biologischen Gewebeanalyseverfahrens, der Diagnose von Krankheiten, der Arzneimittelforschung und dergleichen, und betrifft insbesondere eine Zellanalyseeinrichtung, eine Vorrichtung und ein Zellanalyseverfahren, das diese verwendet und die Genanalyse für eine einzelne Zelle möglich macht.
  • Stand der Technik
  • Bei der Einzelzellenanalyse handelt es sich um eine Technik zum Erfassen und/oder Quantifizieren von Biomolekülen in Zellen für jede einzelne Zelle mit hoher Genauigkeit. Um die Einzelzellanalyse durchzuführen, ist es notwendig, Zellen für separate Behandlungen zu isolieren, zu messende Nukleinsäuren aus den Zellen wirksam zu extrahieren, eine komplementäre Kette (zum Beispiel cDNA) zu synthetisieren und, falls erforderlich, eine Sequenzanalyse eines durch Amplifikation erhaltenen Produkts durchzuführen.
  • Das Patentdokument 1 offenbart eine Einrichtung, die so konfiguriert ist, dass sie jeweilige Zellen in allen Poren einer porösen Anordnungsfolie einfängt, anschließend eine Nukleinsäure einfängt, die aus der Zelle mit einer DNA-Sonde gewonnen wird, die in der Pore immobilisiert ist und die für jede Pore eine unterschiedliche Tag-Sequenz aufweist, um cDNA zu synthetisieren, so dass ein Produkt für die Sequenzanalyse erhalten werden kann, damit es möglich ist zu unterscheiden, aus welcher Zelle die eingefangene Nukleinsäure gewonnen wurde. Die grundlegende Konfiguration (entsprechend 8 des Patentdokuments 1) einer solchen Einrichtung ist in 1 gezeigt.
  • In der Einrichtung der 1 wird eine Zelllösung, die Zellen 101 enthält, von einem Einlass 106 her eingeführt. Die Zelllösung wird von einem oberen Auslass 107 angesaugt, um einen oberen Bereich 104 einer porösen Membran 102 mit einer planaren Substratform mit der Zelllösung zu füllen. Wenn durch Ansaugen der Lösung von einem unteren Auslass 108 ein Unterdruck angelegt wird, wird die Zelllösung durch die poröse Membran 102 angesaugt, und die Zellen 101 werden zu einem Zelleinfangteil 103 geführt. Die Zellen 101 werden durch einen gitterförmigen Zelleinfangteil 103 eingefangen, der auf der porösen Membran eingerichtet wird, und dann werden durch Aufbrechen der Zellen die Nukleinsäuren (zum Beispiel mRNA) in den Zellen von einer DNA-Sonde (zum Beispiel einer poly-T Sonde) eingefangen, die in der porösen Membran direkt unter den Zellen immobilisiert ist.
  • Durch die Verwendung einer Einrichtung, wie in 1 gezeigt, können die Nukleinsäuren, die aus den eingefangenen Zellen extrahiert werden, so eingefangen werden, dass sie kaum einen Kontakt mit Bereichen haben, bei denen es sich nicht um die Innenwand der porösen Membran, die der Reaktionsbereich ist, handelt, so dass die Nukleinsäure (zum Beispiel cDNA), die der eingefangenen Nukleinsäure entspricht, synthetisiert werden kann. Daher kann die Wahrscheinlichkeit, dass Nukleinsäuren an der Innenwand der Einrichtung adsorbiert werden, die mit der Reaktion in keinem Zusammenhang stehen, reduziert werden, und ein Produkt für die Sequenzanalyse kann hochwirksam hergestellt werden.
  • Dokument des Standes der Technik
  • Patentdokument
  • Patentdokument 1: WO2014/020657 A
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Durch die Erfindung zu lösendes Problem
  • Um Nukleinsäuren in der in 1 gezeigten Einrichtung wirksam einzufangen, ist es notwendig, dass der durchschnittliche Porendurchmesser der Poren, die die poröse Membran 102 bilden, mehrere µm oder weniger beträgt, und insbesondere ist er bevorzugt 1 µm oder weniger. Weiter ist es wünschenswert, dass die Dicke der porösen Membran 102 10 µm oder mehr, insbesondere mehrere zehn µm oder mehr, beträgt. Wenn allerdings eine solche poröse Membran verwendet wird, wird der Druckverlust beim Hindurchleiten der Zelllösung hoch. Wenn der Druckverlust hoch wird, nimmt die Ansaugrate beim Ansaugen der Lösung vom unteren Auslass 108 ab. Dies führt dazu, dass die Ansaugrate beim Ansaugen der Zellen 101 in das Zelleinfangteil 103 abnimmt. Daher wird das Phänomen beobachtet, dass eine relativ große Anzahl von Zellen sich unter Einwirkung der Schwerkraft absetzt und in den anderen Bereichen auf der Einrichtung bleibt, bevor sie das Zelleinfangteil 103 erreicht. Die in 1 mit 109 angegebene Zelle ist ein Beispiel für eine Zelle, die einen solchen Zelleinfangteil 103 nicht erreicht hat.
  • Die Zellen, die in den Bereichen bleiben, bei denen es sich nicht um das Zelleinfangteil 103 handelt, reduzieren nicht nur den Anteil der Zellen, die analysiert werden können, sondern verursachen auch ein zusätzliches Problem. Das bedeutet, wenn Nukleinsäuren aus Zellen extrahiert werden, ist ein Schritt zum Aufbrechen der Zellen notwendig. Allerdings werden damit Zellen, die sich in Bereichen befinden, bei denen es sich nicht um das Zelleinfangteil 103 handelt, auch aufgebrochen. Aufgrund dessen entsteht ein Problem dahingehend, dass die Nukleinsäuren, die aus den Zellen extrahiert werden, in eine Mehrzahl der Zelleinfangteile 103 strömen und es schwierig wird, eine präzise Einzelzellanalyse durchzuführen.
  • Die obigen Probleme werden durch einen Anstieg des Druckverlusts aufgrund des Anstiegs der Membrandicke und einer Abnahme des Porendurchmessers der porösen Membran 102 verursacht, die die Wirksamkeit beim Einfangen der Nukleinsäure verbessern sollen. Daher liegt das Problem im Wesentlichen darin, dass sich die Verbesserung der Nukleinsäureeinfangwirksamkeit und die Verbesserung der Zelleinfangwirksamkeit in einer Kosten-Nutzen-Beziehung befinden.
  • Weiterhin ist ein Nukleinsäureamplifikationsschritt notwendig, um nach dem Einfangen der Nukleinsäure eine Sequenzanalyse durchzuführen. In diesem Schritt ist es erforderlich, dass das Nukleinsäureamplifikationsprodukt aus dem Nukleinsäureeinfangteil freigesetzt wird (wie im Patentdokument 1 beschrieben), zur Außenseite der Einrichtung als Lösungsprobe extrahiert wird und eine Sequenzanalyse durchgeführt wird. Es kann ein Problem dahingehend entstehen, dass das Amplifikationsprodukt in dieser Lösung an die Innenwand der Einrichtung adsorbiert wird. Die Ausbeute des Nukleinsäureamplifikationsprodukts, das für die Sequenzanalyse notwendig ist, wird durch Adsorption verringert. Darüber hinaus kann, da die Adsorptionsraten in Übereinstimmung mit dem Unterschied hinsichtlich das Basenlänge der Nukleinsäuren unterschiedlich sind, die Sequenzanalyse möglicherweise mit einer Zusammensetzung durchgeführt werden, die sich von der Zusammensetzung der ursprünglichen Nukleinsäure in der Zelle unterscheidet.
  • Mittel zum Lösen des Problems
  • Die vorliegenden Erfinder haben die oben erwähnten Probleme untersucht und im Ergebnis folgendes festgestellt. Es ist effektiv, den Aufbau dieser Einrichtung so zu gestalten, dass auf die Zellen eine abstoßende Kraft ausgeübt wird, die bewirkt, dass die Zellen dem Bereich, bei dem es sich nicht um den Zelleinfangteil handelt, auf dem Substrat nicht näherkommen, wenn eine Zelllösung von der Rückseite des Substrats (zum Beispiel der porösen Membran) angesaugt wird, auf der das Nukleinsäureeinfangteil vorgesehen ist. Als ein Beispiel ist nämlich die Einrichtung effektiv, die so konfiguriert ist, dass auf die Zellen die Schwerkraft in einer Richtung ausgeübt wird, die entgegengesetzt zur Ansaugrichtung zu den Zellen ist, wie in 2 gezeigt ist. Zusätzlich zur Schwerkraft, wie in 2 veranschaulicht, kann eine elektrostatische Kraft, die durch die Oberflächenbehandlung oder eine elektrophoretische Kraft verursacht wird, effektiv als eine solche abstoßende Kraft genommen werden.
  • Weiter haben die vorliegenden Erfinder festgestellt, dass das Verfahren, das eine zweite dreidimensionale poröse Membran (dreidimensionales poröses Element) verwendet, wie in 3 gezeigt ist, die Ansaugkraft stärkt und dadurch aufgrund von anderen Kräften eine Adsorption in den Bereichen verhindert, bei denen es sich nicht um das Zelleinfangteil handelt. Da allerdings die Innenwand der zweiten dreidimensionalen porösen Membran hydrophil sein muss, ist es sehr wahrscheinlich, dass ein DNA-Strang mit einer negativen Ladung an die Innenwand adsorbiert wird. Daher kann die Ausbeute des erhaltenen Amplifikationsprodukts sinken und eine Änderung der Ausbeute aufgrund der Länge des DNA-Amplifikationsprodukts kann auftreten, so dass die Analyse der Nukleinsäurezusammensetzung in einer einzelnen Zelle schwierig sein kann. Um diesen Punkt weiter zu verbessern, ist festgestellt worden, dass es effektiv ist, ein Mittel zum Trennen der hydrophilen dreidimensionalen porösen Membran und der Lösung des Nukleinsäureeinfangteils zur Verfügung zu stellen, welches das Amplifikationsreaktionsteil im Amplifikationsreaktionsprozess wird. Es ist festgestellt worden, dass es effektiv ist, als Mittel zum Durchführen einer solchen Trennung ein Mittel zum Injizieren von Luft oder einem unpolaren Lösungsmittel, wie beispielsweise einem Öl, zu einer geeigneten Zeit zwischen einer ersten porösen Membran (oder einem Substrat, d.h. de zweidimensionalen Array-Chip), bei der es sich um das Nukleinsäureeinfangteil handelt, und einer zweiten hydrophilen dreidimensionalen porösen Membran als Ansaughilfe vorzusehen oder einen Aktuator im Inneren der Einrichtung vorzusehen, der bewirkt, dass der Abstand zwischen der platzierten ersten und der zweiten porösen Membran in einer vertikalen Richtung in Bezug auf die Membranen groß wird. Weiterhin ist festgestellt worden, dass es effektiv ist, eine Trennmembran, wie beispielsweise eine Ultrafiltrationsmembran oder eine Gelmembran, zwischen der ersten und zweiten porösen Membran zu verwenden, so dass das Amplifikationsprodukt die zweite poröse Membran nicht erreicht.
  • Daher lautet die Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung wie folgt:
    • (1) Zellanalyseeinrichtung umfassend:
      • einen Lösungseinführungskanal zum Einführen einer Zellen enthaltenden Lösung;
      • ein Substrat mit einer Mehrzahl von Sätzen aus einem Zelleinfangteil und einem Nukleinsäureeinfangteil, wobei das Zelleinfangteil mit dem Lösungseinführungskanal in Kontakt ist und eine Konkavität aufweist, die in der Lage ist, eine einzelne Zelle einzufangen, und das Nukleinsäureeinfangteil in entsprechender Weise im Hinblick auf die Konkavität des Zelleinfangteils vorgesehen ist und eine Nukleinsäure einfängt, die aus der mittels des Zelleinfangteils eingefangenen Zelle extrahiert wurde;
      • einen Ableitkanal, der benachbart dem Nukleinsäureeinfangteil des Substrats vorgesehen ist und eine Lösung des Nukleinsäureeinfangteils ableitet; und
      • ein Drucksteuermittel, das in dem Ableitkanal vorgesehen ist,
      • wobei das Substrat eine abstoßende Kraft in einer Richtung aufweist, die die Zellen vom Substrat trennt, und
      • das Drucksteuermittel eine Steuerung derart vornimmt, dass, wenn die Zelle vom Zelleinfangteil eingefangen wird, eine Kraft in der Richtung vom Zelleinfangteil zum Nukleinsäureeinfangteil als erster Druck dient, der höher als die abstoßende Kraft ist.
    • (2) Zellanalyseeinrichtung nach (1), wobei das Drucksteuermittel eine Steuerung derart vornimmt, dass, wenn die Nukleinsäurereaktion im Nukleinsäureeinfangteil durchgeführt wird, die Kraft in der Richtung vom Zelleinfangteil zum Nukleinsäureeinfangteil größer als die Schwerkraft und kleiner als der erste Druck ist.
    • (3) Zellanalyseeinrichtung nach (1), wobei ein Bereich, der sich auf dem Substrat befindet, bei dem es sich nicht um die Konkavität handelt, und der mit der die Zellen enthaltenden Lösung in Kontakt ist, ein Bereich ist, der eine abstoßende Kraft auf die Zellen ausübt.
    • (4) Zellanalyseeinrichtung nach (1), wobei die abstoßende Kraft eine abstoßende Kraft ist, die dadurch bewirkt wird, dass das Substrat derart angeordnet wird, dass das Zelleinfangteil die Zelle in der Richtung entgegengesetzt zur Schwerkraft einfängt.
    • (5) Zellanalyseeinrichtung nach (1), wobei die abstoßende Kraft eine abstoßende Kraft ist, die dadurch bewirkt wird, dass die Oberfläche des Substrats einer Behandlung unterzogen wurde, die die Adsorption von Zellen verhindert.
    • (5-1) Zellanalyseeinrichtung nach (5), wobei die Behandlung, die die Adsorption von Zellen verhindert, eine Oberflächenbehandlung mit einem Überzugsmittel, beispielsweise einem MPC-Polymer, ist.
    • (6) Zellanalyseeinrichtung nach (1), weiter umfassend ein Elektrodenpaar, das so vorgesehen ist, dass das Substrat dazwischen eingelegt wird, wobei das Nukleinsäureeinfangteil Mikropartikel aus Metall umfasst und die abstoßende Kraft eine abstoßende Kraft ist, die hervorgerufen wird durch eine Spannung, die an das Elektrodenpaar angelegt wird, und eine dielektrische Kopplung durch die Mikropartikel aus Metall.
    • (6-1) Zellanalyseeinrichtung nach(6), wobei die Metall-Mikropartikel Gold-Mikropartikel sind und/oder das Substrat ein Platinsubstrat ist.
    • (7) Zellanalyseeinrichtung, umfassend:
      • einen Lösungseinführungskanal zum Einführen einer Zellen enthaltenden Lösung,
      • einen zweidimensionalen Array-Chip mit einer Mehrzahl von Zelleinfangteilen und Nukleinsäureeinfangteilen, wobei die Zelleinfangteile benachbart dem Lösungseinführungskanal vorgesehen und jeweils in der Lage sind, eine einzelne Zelle einzufangen, und wobei jedes der vorgesehenen Nukleinsäureeinfangteile mit jedem Zelleinfangteil aus der Mehrzahl der Zelleinfangteile übereinstimmt und eine Nukleinsäure einfängt, die aus der Zelle extrahiert wird, die vom Zelleinfangteil eingefangen wurde,
      • einen Ableitkanal mit einem dreidimensionalen porösen Körper, der eine Lösung absorbiert, die im Nukleinsäureeinfangteil zurückgehalten wird, und zum Ableiten der Lösung dient, und
      • ein Trennsteuerteil zum Steuern der Trennung zwischen dem Nukleinsäureeinfangteil und dem Ableitkanal,
      • wobei das Trennsteuerteil eine Trennsteuerung so durchführt, dass, nachdem die Nukleinsäure vom Nukleinsäureeinfangteil eingefangen wurde, ein Produkt, das aus der eingefangenen Nukleinsäure amplifiziert wird, nicht in den Ableitkanal eingeleitet wird.
    • (8) Zellanalyseeinrichtung nach (7), wobei das Trennsteuerteil ein Ansaugdruckanwendungsmittel ist, das im Ableitkanal vorgesehen ist.
    • (9) Zellanalyseeinrichtung nach (7), wobei eine Ultrafiltrationsmembran oder eine Gelmembran zum Verhindern des Durchlassens von Molekülen mit der Molekülgröße des amplifizierten Produkts zwischen dem zweidimensionalen Array-Chip und dem dreidimensionalen porösen Körper angeordnet ist.
    • (10) Zellanalyseeinrichtung nach (7), wobei das Trennsteuerteil ein Mittel zum Einführen eines Trennlösungsmittels oder von Luft zwischen das Nukleinsäureeinfangteil und den Ableitkanal ist.
    • (10-1) Zellanalyseeinrichtung nach (10), wobei das Trennlösungsmittel Mineralöl ist.
    • (11) Zellanalyseeinrichtung nach (1) oder (7), wobei das Nukleinsäureeinfangteil eine Nukleinsäuresonde zum Einfangen einer Nukleinsäure umfasst, und die Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäureeinfangsequenz, die mit der aus der Zelle extrahierten Nukleinsäure hybridisiert, und eine Zellerkennungssequenz umfasst, die sich entsprechend dem jeweiligen Zelleinfangteil unterscheidet.
    • (12) Zellanalyseverfahren, das die Zellanalyseeinrichtung nach (1) verwendet, umfassend die folgenden Schritte:
      • Füllen des Substrats mit einer Zellen enthaltenden Lösung; und Anlegen eines Unterdrucks an das Zelleinfangteil, Ansaugen der Lösung, die die Zellen enthält, in Richtung des Substrats und Einfangen einer einzelnen Zelle auf dem Zelleinfangteil.
    • (13) Zellanalyseverfahren nach (12), weiter umfassend die Schritte des Aufbrechens der einzelnen Zelle, die auf dem Zelleinfangteil eingefangen wurde, in einem Zustand, in dem ein Unterdruck an das Zelleinfangteil angelegt wird, und Einfangen der aus der Zelle extrahierten Nukleinsäure mittels des Nukleinsäureeinfangteils.
    • (14) Analyseverfahren nach (13), weiter umfassend einen Schritt des Zuführens zum Nukleinsäureeinfangteil einer zweiten Nukleinsäuresonde, die eine Sequenz hat, die mit der vom Nukleinsäureeinfangteil eingefangenen Nukleinsäure hybridisiert, und eines Enzyms und eines Substrats für die komplementäre Strangsynthese, die die eingefangene Nukleinsäure als Matrize verwendet, um eine komplementäre Strangsynthese durchzuführen.
    • (15) Zellanalyseverfahren unter Verwendung der Zellanalyseeinrichtung nach (7), umfassend die folgenden Schritte:
      • Füllen einer Lösung, die Zellen enthält, auf den zweidimensionalen Array-Chip; und
      • Anlegen eines Unterdrucks an das Zelleinfangteil, Ansaugen der die Zellen enthaltenden Lösung vom Ableitkanal, der mit dem dreidimensionalen porösen Körper ausgestattet ist, und Einführen eines Reagens für die Nukleinsäureamplifikation in das Nukleinsäureeinfangteil durch Ansaugen in der gleichen Weise wie die die Zellen enthaltende Lösung und dann Trennen des Nukleinsärueeinfangteils oder des zweidimensionalen Array-Chips vom dreidimensionalen porösen Körper bis vor den Beginn der Amplifikationsreaktion oder nach dem Beginn und bis vor dem Ende der Amplifikationsreaktion.
    • (15-1) Zellanalyseverfahren nach (15), weiter umfassend einen Schritt zum Aufbrechen der einzelnen Zelle, die auf dem Zelleinfangteil eingefangen wurde, in einem Zustand, in dem ein Unterdruck an das Zelleinfangteil angelegt wird, und Einfangen der aus der Zelle extrahierten Nukleinsäure durch das Nukleinsäureeinfangteil.
    • (15-2) Analyseverfahren nach (15-1), weiter umfassend einen Schritt des Zuführens zum Nukleinsäureeinfangteil der zweiten Nukleinsäuresonde, die eine Sequenz aufweist, die mit der durch das Nukleinsäureeinfangteil eingefangenen Nukleinsäure hybridisiert, sowie eines Enzyms und eines Substrats für die komplementäre Strangsynthese, die die eingefangene Nukleinsäure als Matrize verwendet, um eine komplementäre Strangsynthese durchzuführen.
    • (16) Zellanalysegerät, umfassend die Zellanalyseeinrichtung nach einem von (1) bis (11), und Zellbeobachtungsmittel (zum Beispiel ein Fluoreszenzmikroskop).
  • Wirkung der Erfindung
  • Mit der Zellanalyseeinrichtung, der Vorrichtung und dem Zellanalyseverfahren der vorliegenden Erfindung ist es gelungen, die Zelleinfangwirksamkeit im Zelleinfangteil im Vergleich zu herkömmlichen Techniken zu verbessern, und zwar unter Beibehaltung der Nukleinsäureeinfangwirksamkeit im Nukleinsäureeinfangteil, wenn eine Nukleinsäure aus Zellen eingefangen wird. Im Ergebnis wird es möglich, eine Probe für eine Einzelzellanalyse herzustellen, bei der der Grad der Trennung der jeweiligen Zellen präzise gegenüber dem erhöht wird, der bei herkömmlichen Einrichtungen und dergleichen verwendet wird. Weiter wird es gemäß der Zellanalyseeinrichtung, der Vorrichtung und dem Zellanalyseverfahren der vorliegenden Erfindung möglich, das Amplifikationsprodukt mit hoher Wirksamkeit zu sammeln, wenn die Amplifikationsreaktion innerhalb der Einrichtung durchgeführt wird.
  • Daher es ist gemäß der Zellanalyseeinrichtung, der Vorrichtung und dem Zellanalyseverfahren der vorliegenden Erfindung möglich, mit hoher Wirksamkeit und hoher Präzision nicht nur das Expressionsniveau von Genen als Durchschnitt der Gewebe sondern auch die Gehalte der jeweiligen, die Gewebe bildenden Zellen quantitativ zu analysieren. Durch das Durchführen einer Einzelzellanalyse, die auf dem Einzelzellniveau Gene (zum Beispiel mRNA) misst, die im lebenden Gewebe aktiv sind, ist es möglich, verschiedene Phänomene, die in vivo auftreten, im Detail zu kennen, einschließlich die Wechselwirkung zwischen Zellen. Es wird erwartet, dass dies eine große Wirkung auf das Gebiet der Biowissenschaften, insbesondere der Medizin, Arzneimittelforschung, Diagnose, Grundlagenforschung lebenswichtiger Phänomene und dergleichen hat.
  • Figurenliste
    • 1 ist eine Figur, die eine grundlegende Konfiguration der im Patentdokument 1 beschriebenen Einrichtung zeigt, bei der es sich um eine Technologie handelt, die auf die vorliegende Erfindung bezogen ist.
    • 2 ist eine Figur, die eine Ausführungsform zeigt, die die Konfiguration einer Zellanalyseeinrichtung gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung zeigt.
    • 3 ist eine Figur, die eine Ausführungsform zeigt, die die Konfiguration der Zellanalyseeinrichtung gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung zeigt.
    • 4 ist ein Fließdiagramm eines Zellanalyseverfahrens, das die Zellanalyseeinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, und eine Figur, die den Zeitablauf der Trennung zeigt.
    • 5 ist eine Figur, die einen Überblick über die Konfiguration der im Beispiel 1-1 hergestellten Einrichtung zeigt.
    • 6 ist eine Figur, die einen Prozess des Behandelns einer Nukleinsäure im Analyseverfahren unter Anwendung der Zellanalyseeinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
    • 7 ist eine Figur, die einen Überblick über die Konfiguration der im Beispiel 1-4 hergestellten Einrichtung zeigt.
    • 8-1 ist eine Figur, die einen Überblick über die Konfiguration der Einrichtung gemäß Beispiel 2 zeigt.
    • 8-2 ist die Fortführung der 8-1.
    • 9 ist eine Figur, die einen Überblick über die Konfiguration der im Beispiel 2-2 hergestellten Einrichtung zeigt.
    • 10 ist eine Figur, die einen Überblick über die Konfiguration der Vorrichtung gemäß Beispiel 3 zeigt.
  • Methoden zum Durchführen der Erfindung
  • Wenn die Zellen in das Zelleinfangteil des zweidimensionalen Array-Chips eingesaugt werden, verhindert gemäß einem Aspekt die Zellanalyseeinrichtung der vorliegenden Erfindung die Adsorption der Zellen auf dem zweidimensionalen Array-Chip durch Ansaugen der Zellen in Konkurrenz zu einer abstoßenden Kraft (zum Beispiel Schwerkraft) in der Richtung, die die Zellen vom Substrat des zweidimensionalen Array-Chips trennt. Insbesondere weist die Zellanalyseeinrichtung der vorliegenden Erfindung auf: einen Lösungseinführungskanal zum Einführen einer Zellen enthaltenden Lösung; ein Substrat, das eine Mehrzahl von Sätzen aus einem Zelleinfangteil und einem Nukleinsäureeinfangteil aufweist, wobei das Zelleinfangteil mit dem Lösungseinführungskanal in Kontakt ist und eine Konkavität aufweist, mit der eine einzelne Zelle eingefangen werden kann, und das Nukleinsäureeinfangteil in einer Weise vorgesehen ist, mit dem es in Bezug auf die Konkavität des Zelleinfangteils übereinstimmt, und eine Nukleinsäure einfangen kann, die aus der Zelle, die vom Zelleinfangteil eingefangen wurde, extrahiert wird; einen Ableitkanal, der benachbart dem Nukleinsäureeinfangteil des Substrats vorgesehen ist und eine Lösung des Nukleinsäureeinfangsteils ableitet; und ein Drucksteuermittel, das im Ableitkanal vorgesehen ist. Das Substrat hat eine abstoßende Kraft in einer Richtung, die die Zellen vom Substrat trennt. Das Drucksteuermittel nimmt eine Steuerung in einer solchen Weise vor, dass, wenn die Zelle vom Zelleinfangteil eingefangen wird, eine Kraft in der Richtung vom Zelleinfangteil zum Nukleinsäureeinfangteil als ein erster Druck dient, der größer als die abstoßende Kraft ist.
  • 2 ist eine Figur, die eine Ausführungsform der Konfiguration der Zellanalyseeinrichtung gemäß dem obigen Aspekt der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei (a) eine Ansicht von unten (Draufsicht von unten gesehen) zeigt, (b) eine Querschnittsansicht im 2A-2A' Querschnitt zeigt, und (c) eine Querschnittsansicht im 2B-2B' Querschnitt zeigt. Weiter ist (d) eine vergrößerte Ansicht des Bereichs 2C in der Querschnittsansicht (c).
  • Die Zellanalyseeinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung weist ein Substrat (nachstehend als zweidimensionaler Array-Chip (213) bezeichnet) auf, der Sätze aus folgendem aufweist: einer Mehrzahl von Zelleinfangteilen 203, die jeweils eine einzelne Zelle einfangen können; und Nukleinsäureeinfangteilen 210, die in Übereinstimmung mit den jeweiligen Zelleinfangteilen angeordnet sind und Nukleinsäuren einfangen, die aus den von den Zelleinfangteilen eingefangenen Zellen extrahiert werden. Ein unterer Bereich 214, der eine Zelllösung enthält, die von einer Zelleinführungsanschluss 211 vor dem Ansaugen eingeführt wird, ist benachbart dem zweidimensionalen Array-Chip vorgesehen. Ein oberer Bereich 215 der gegenüberliegenden Seite ist mit einem oberen Auslass 207 auf der oberen Seite verbunden. Eine Pumpe oder eine Spritze ist mit dem oberen Auslass 207 verbunden. Durch Anlegen eines Unterdrucks an den oberen Auslass 207 kann ein Unterdruck an die Nukleinsäureeinfangteile 210 und die Zelleinfangteile 203 auf dem zweidimensionalen Array-Chip angelegt werden, und die Zelllösung im Bereich 214 wird in die Zelleinfangteile 203 eingesaugt. Wie in vergrößerter Querschnittsansicht von (d) gezeigt, wirkt eine Kraft auf die Zellen in einer aufwärtigen Richtung (der Richtung des Pfeils 216) aufgrund der Viskosität der Lösung während des Ansaugens der Zelllösung, während die Schwerkraft in der Richtung 217 wirkt, bei der es sich um eine Richtung handelt, die zur Ansaugrichtung entgegengesetzt ist. Das Absetzen der Zellen, das durch die Schwerkraft verursacht wird, wirkt in einer solchen Richtung, dass die Zellen vom zwei-dimensionalen Array-Chip getrennt werden. Daher wirkt die Ansaugkraft für die Zellen nur an den Zelleinfangteilen 203, wodurch eine Zelladsorption an Bereiche verhindert wird, bei denen es sich nicht um das Zelleinfangteil auf dem zweidimensionalen Array-Chip handelt. Während diese Ausführungsform die Schwerkraft als abstoßende Kraft in der Richtung verwendet, die die Zellen vom zweidimensionalen Array-Chip trennt, wird die Verwendung anderer abstoßender Kräfte nachfolgend beschrieben.
  • Das Nukleinsäureeinfangteil 210 kann aus einem porösen Material oder Kügelchen (vorzugsweise magnetischen Kügelchen) und dergleichen bestehen, und eine Nukleinsäuresonde zum Einfangen der Nukleinsäuren, die aus den Zellen extrahiert werden, kann immobilisiert sein. Die Nukleinsäuresonde weist eine Nukleinsäureeinfangsequenz, die mit den aus den Zellen extrahierten Nukleinsäuren hybridisiert und eine Zellerkennungssequenz auf, die entsprechend den jeweiligen Zelleinfangteilen unterschiedlich ist. Die Einzelzellanalyse ist möglich, indem das Produkt verwendet wird, bei dem die Nukleinsäuren, die von einer solchen Nukleinsäuresonde eingefangen werden, amplifiziert werden. Die Nukleinsäuresonde kann von einem Fachmann in Übereinstimmung mit dem Zweck der Analyse, dem zu analysierenden Ziel (mRNA, genomische DNA, ncRNA und dergleichen), der Konfiguration der zu verwendenden Einrichtung, der Art der Amplifikationsreaktion und dergleichen in geeigneter Weise konstruiert werden.
  • Die Zelllösung wird vom Zelleinführungsanschluss 211 eingeführt. In diesem Fall wird der Bereich 214 mit der Zelllösung in einer vertikal umgekehrten Form in Bezug auf das herkömmliche, in 1 gezeigte Beispiel gefüllt, und die Zelllösung wird vom Probensammelanschluss 212 angesaugt. Anschließend wird eine einzelne Zelle auf die Zelleinfangteile 203 adsorbiert, indem ein Unterdruck angelegt wird, um die Lösung vom oberen Auslass 207 anzusaugen, wobei dieses Merkmal dasselbe wie die Einrichtung des herkömmlichen Beispiels ist. Allerdings unterscheidet sich die Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung von der Einrichtung des herkömmlichen Beispiels darin, dass die Einrichtung so gesteuert wird, dass die Schwerkraft in einer geeigneten Richtung wirkt.
  • Die Ansaugkraft, die bewirkt, dass sich die Zellen während des Ansaugens der Zellen dem zweidimensionalen Array-Chip nähern, muss stärker als die Schwerkraft sein, die in der entgegengesetzten Richtung ausgeübt wird. Dieses starke Ansaugen ist wirksam, insbesondere wenn der Unterdruck, der an den oberen Auslass angelegt wird, nahe 1 atm beträgt und der Druck auf das Innere des Bereichs 215 auf unterhalb des gesättigten Dampfdrucks der Zelllösung eingestellt wird. Ein kontinuierliches Ansaugen kann notwendig sein, um den Innendruck niedriger als den gesättigten Dampfdruck werden zu lassen, so dass eine Pumpe mit kontinuierlicher Ansaugung, wie beispielsweise eine Membranpumpe, wirksamer als eine Pumpe sein kann, die eine Spritze mit einem begrenzten Ansaugvolumen verwendet. Ein anderes Verfahren zum Realisieren einer starken Ansaugkraft, das die Schwerkraft überwindet, ist ein Verfahren, bei dem ein dreidimensionales poröses Element anordnet. Beim Anordnen im Bereich 215 hat das dreidimensionale poröse Element die Eigenschaften, dass die kontaktierte wässrige Lösung aufgrund des Kapillarphänomens schnell absorbiert wird, und die absorbierte wässrige Lösung nach außen abgeleitet werden kann, insbesondere in eine Richtung, in der sie nicht mit dem Nukleinsäureeinfangteil 210 in Kontakt ist. Durch Ableiten der absorbierten wässrigen Lösung kann die Lösungsabsorptionsleistung aufgrund des Kapillarphänomens des dreidimensionalen porösen Elements aufrechterhalten werden. Durch die Anwendung des Kapillarphänomens des dreidimensionalen porösen Elements kann die in dem Nukleinsäureeinfangteil 210 zurückgehaltene Lösung schneller angesaugt werden als in dem Fall, in dem nur ein Unterdruck im herkömmlichen Beispiel, das in 1 gezeigt ist, angelegt wird, und weiter kann die Fähigkeit, dass die Zelleinfangteile 203 Zellen absorbieren, verbessert werden. Die Ausführungsform, die das dreidimensionale poröse Element verwendet, wird in der Beschreibung der Konfiguration zum wirksamen Sammeln des Nukleinsäureamplifikationsprodukts erläutert, wenn die Schritte bis zur Nukleinsäureamplifikation auf der Einrichtung durchgeführt werden.
  • Die Kraft, die an die Zellen in der Richtung angelegt wird, die die Zellen vom zweidimensionalen Array-Chip trennt, ist nicht auf die Schwerkraft beschränkt. Zum Beispiel ist es möglich, eine abstoßende kraft an die Zellen in der Nachbarschaft des zweidimensionalen Array-Chips anzulegen, um die Adsorption von Zellen auf dem zweidimensionalen Array-Chip zu verhindern, indem der zweidimensionale Array-Chip (Substrat) einer Oberflächenbehandlung mit einer negativen Ladung in Bezug auf den zweidimensionalen Array-Chip unterzogen wird. Weiter kann dies selbst durch Überziehen der Oberfläche mit einem Überzugsmittel, wie beispielsweise einem MPC-Polymer oder Polyethylenglycol, realisiert werden.
  • Weiterhin ist es auch möglich, eine Kraft in der Richtung auszuüben, die Zellen vom zweidimensionalen Array-Chip durch Dielektrophorese trennt. Dies wird ausführlich in Beispiel 1-4 beschrieben.
  • Weiter kann in einem anderen Aspekt das dreidimensionale poröse Element benachbart dem zweidimensionalen Array-Chip vorgesehen sein, durch den die Zellanalyseeinrichtung der vorliegenden Erfindung die Ansaugung von Zellen aufgrund des kapillaren Phänomens beschleunigt und den Einfluss des Absetzens reduziert, der durch die Schwerkraft auf die Zellen bewirkt wird. Die Zellanalyseeinrichtung der vorliegenden Erfindung sieht bei Ausstattung mit einem dreidimensionalen porösen Element in ähnlicher Weise ein Mittel zum Trennen des zweidimensionalen Array-Chips und des dreidimensionalen porösen Elements während der Amplifikationsreaktion vor, so dass das Amplifikationsprodukt, das auf dem zweidimensionalen Array-Chip amplifiziert wird, nicht auf das dreidimensionale poröse Element adsorbiert wird. Insbesondere umfasst die Zelleanalyseeinrichtung der vorliegenden Erfindung einen Lösungseinführungskanal zum Einführen einer Zellen enthaltenden Lösung; einen zweidimensionaler Array-Chip mit einer Mehrzahl von Zelleinfangteilen und Nukleinsäureeinfangteilen, wobei die Zelleinfangteile benachbart dem Lösungseinführungskanal vorgesehen und jeweils in der Lage sind, eine einzelne Zelle einzufangen und jede der Nukleinsäureeinfangteile in Übereinstimmung mit jedem Zelleinfangteil der Mehrzahl von Zelleinfangteilen vorgesehen ist und eine Nukleinsäure einfängt, die aus der Zelle extrahiert wurde, die vom Zelleinfangteils eingefangen wurde; ein Ableitkanal mit einem dreidimensionalen porösen Körper, der eine Lösung absorbiert, die in dem Nukleinsäureeinfangteil zurückgehalten wird und zum Ableiten der Lösung dient; und ein Trennsteuerteil zum Steuern der Trennung zwischen dem Nukleinsäureeinfangteil und dem Ableitkanal. Das Trennsteuerteil führt eine Trennungsteuerung so durch, dass, nachdem die Nukleinsäure vom Nukleinsäureeinfangteil eingefangen wurde, ein Produkt, das aus der eingefangenen Nukleinsäure amplifiziert wurde, nicht in den Ableitkanal eingeführt wird.
  • 3 ist eine Figur, die eine Ausführungsform der Konfiguration der Zellanalyseeinrichtung des zuvor erwähnten Aspekts der vorliegenden Erfindung zeigt, worin (a) eine Ansicht von unten (eine Aufsicht von unten aus gesehen) zeigt, (b) eine Querschnittsansicht im 3A-3A' Querschnitt zeigt und (c) und (d) Querschnittsansichten im 3B-3B' Querschnitt zeigen.
  • Die Zellanalyseeinrichtung gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Konfiguration, die sich durch das Vorsehen eines Mittels auszeichnet, das wirksam das Amplifikationsprodukt aus den aus Zellen nach außen extrahierten Nukleinsäuren sammeln kann. Es wird auf dieselbe Weise wie gemäß dem obigen Aspekt ein zweidimensionaler Array-Chip (313) mit einer Mehrzahl von Zelleinfangteilen 303 und Nukleinsäureeinfangteilen 310 vorgesehen, wobei jedes der Zelleinfangteile in der Lage ist, eine einzelne Zelle einzufangen, und jedes der Nukleinsäureeinfangteile in Übereinstimmung mit den jeweiligen Zelleinfangteilen vorgesehen und in der Lage ist, eine Nukleinsäure einzufangen, die aus den Zellen extrahiert wird, die auf den Zelleinfangteilen eingefangen wurden. Es ist auch dasselbe wie beim obigen Aspekt, dass ein unterer Bereich 314, der eine Zelllösung enthält, die von einem Zelleinführungsanschluss 311 eingeführt wird, benachbart dem zweidimensionalen Array-Chip angeordnet wird, und ein oberer Bereich 315 der gegenüberliegenden Seite mit einem oberen Auslass 307 verbunden ist. Weiter ist auch gleich bzw. ähnlich, dass eine Pumpe oder eine Spritze mit dem oberen Auslass 307 verbunden ist, ein Unterdruck an das Nukleinsäureeinfangteil 310 und die Zelleinfangteile 303 auf dem zweidimensionalen Array-Chip angelegt werden kann, indem ein Unterdruck an den oberen Auslass 307 angelegt wird, und die Zelllösung im Bereich 314 in die Zelleinfangteile 303 eingesaugt wird. Allerdings unterscheidet sich der vorliegende Aspekt in dem Punkt, dass ein Mittel zum Trennen des dreidimensionalen porösen Elements aus dem zweidimensionalen Array-Chip in einer Konfiguration zum Einfangen von Zellen durch Erhöhen des Ansaugdrucks vorgesehen ist, indem das dreidimensionale poröse Element im oberen Bereich angeordnet ist. Ein „Speichertank“ (der Raum zum Einführen von Luft oder einem Trennlösungsmittel, wie beispielsweise einem unpolaren Lösungsmittel (zum Beispiel Mineralöl)) 323 der 3 und eine Spritze 333 als Mittel zum Injizieren von Luft oder einem Trennlösungsmittel in den Bereich zwischen dem dreidimensionalen porösen Element und dem zweidimensionalen Array-Chip sind als Trennmittel vorgesehen. Im vorliegenden Aspekt kann der zweidimensionale Array-Chip mit einem nachgiebigen Material (hier einem PDMS-Kunststoff) hergestellt werden, so dass durch Anlegen eines Unterdrucks zum Ansaugen an den oberen Auslass 307 der zweidimensionale Array-Chip durch die Unterdruck-Anwendung so gebogen wird, dass er sich in engem Kontakt mit dem dreidimensionalen porösen Element 319 wie im zweidimensionalen Array-Chip befindet, wie in 313 in 3(C) gezeigt ist. Das Ansaugen durch den Kapillareffekt des dreidimensionalen porösen Elements wird durch einen solchen engen Kontakt möglich. Durch Beenden des Anlegens eines Unterdrucks und Injizieren von Luft oder einem Trennlösungsmittel zwischen das dreidimensionale poröse Element 319 und den zweidimensionalen Array-Chip 313 aus dem „Speichertank“ 323 des jeweiligen Elements wird eine Wanderung einer Substanz durch die Lösung blockiert. Die Adsorption von DNA, die das Amplifikationsprodukt ist, an die Innenwand des dreidimensionalen porösen Elements kann durch dieses Blockieren verhindert werden.
  • Um den Zustand aufrechtzuerhalten, in den die zahlreichen Kügelchen, die die Nukleinsäureeinfangteile 310 in dem zweidimensionalen Array-Chip bilden, gepackt sind, wird insbesondere eine Membran zum Verhindern des Ausströmens der Kügelchen (hydrophile poröse Membran) 318 in engen Kontakt mit der Rückseite des zweidimensionalen Array-Chips 313 gebracht. Der enge Kontakt des dreidimensionalen porösen Elements und des zweidimensionalen Array-Chips kann durch den engen Kontakt einer Kügelchenaufnahmemembran 318 und dem dreidimensionalen porösen Element präzise durchgeführt werden. Hier wirkt die Membran zum Verhindern des Ausströmens 318 von Kügelchen integral mit dem zweidimensionalen Array-Chip 313, und daher ist die Ansaugung durch den Kapillareffekt wirksam.
  • Als Trennmittel kann ein Aktuator mit dem dreidimensionalen porösen Element verbunden sein, um den Abstand zwischen dem dreidimensionalen porösen Element und dem zweidimensionalen Array-Chip so zu ändern, dass das dreidimensionale poröse Element und der zweidimensionale Array-Chip getrennt werden.
  • Weiterhin ist es auch möglich, das dreidimensionale poröse Element und den zweidimensionalen Array-Chip zu trennen, indem eine isolierende Membran so vorgesehen ist, dass das Amplifikationsprodukt die Oberfläche des dreidimensionalen porösen Elements nicht erreicht, während sie in engem Kontakt miteinander bleiben. Dieser Schritt kann zum Beispiel dadurch durchgeführt werden, dass zwischen dem dreidimensionalen porösen Element und dem zweidimensionalen Array-Chip eine Ultrafiltrationsmembran oder eine Gelmembran mit einer Porengröße angeordnet wird, die das Hindurchgelangen von Molekülen (zum Beispiel DNA-Molekül) mit der Molekülgröße des Amplifikationsprodukts verhindert.
  • Das dreidimensionale poröse Element, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ein beliebiges Material mit Poren im Größenbereich von mehreren zehn Nanometern bis Null Komma mehreren Mikrometern sein und eine Oberflächenhydrophilie in einem solchen Ausmaß haben, dass eine wässrige Lösung durch das Kapillarphänomen, das durch das Vorhandensein der Poren erzeugt wird, absorbiert werden kann. Spezielle Beispiele können ein poröses Glasmaterial, eine Glasfaseranordnung (zum Beispiel ein Material, bei dem Glasfasern in derselben Richtung angeordnet sind und gebündelt werden), eine Glaskügelchenanordnung (der durchschnittliche Partikeldurchmesser liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 30 µm) und dergleichen umfassen. Das dreidimensionale poröse Element kann vorzugsweise nicht leicht deformiert werden, um die Möglichkeit zu verringern, dass die absorbierte Lösung unabsichtlich abgeleitet wird und zu dem Nukleinsäureeinfangteil 310 und dem Zelleinfangteil 303 zurückfließt. Die hydrophile Oberfläche des dreidimensionalen porösen Elements kann sich entweder durch einen mittels reinem Wasser gemessenen Wasserkontaktwinkel von 90° oder weniger, vorzugsweise 80° oder weniger, besonders bevorzugt 50° oder weniger und ganz besonders bevorzugt 40° oder weniger auszeichnen, oder wenn 1 µl reines Wasser auf das dreidimensionale poröse Element mit einem Volumen, das ausreicht, um 1 µm Flüssigkeit aufzunehmen, tropfen gelassen wird, die fallengelassenen Tröpfchen innerhalb von 10 Sekunden, vorzugsweise innerhalb von 5 Sekunden, besonders bevorzugt innerhalb von 3 Sekunden und ganz besonders bevorzugt innerhalb von 1 Sekunde, absorbiert werden. Es ist zu beachten, dass der Ausdruck, dass die Tröpfchen von dem dreidimensionalen porösen Element absorbiert werden, bedeutet, dass das Vorhandensein der Tröpfchen nicht visuell bestätigt werden kann, wenn von einer Ebene aus beobachtet wird, die senkrecht zur Oberfläche des dreidimensionalen porösen Elements verläuft.
  • Weiter kann es bevorzugt sein, dass das dreidimensionale poröse Element, das das Lösungsaufnahmeteil 319 bildet, einen ausreichend größeren Porendurchmesser als die Poren hat, die zum Nukleinsäureeinfangteil 310 gehören, das aus der porösen Membran, Kügelchen etc. gebildet wird. Zum Beispiel kann der durchschnittliche Porendurchmesser vorzugsweise 0,2 µm oder mehr und insbesondere 3 µm oder mehr betragen. Wenn der Porendurchmesser eine solche Größe aufweist, tritt ein übermäßig großer Druckverlust nicht auf, wenn ein Gas, wie beispielsweise Luft, durch das Lösungsaufnahmeteil 319 strömt. Wenn der Porendurchmesser des dreidimensionalen porösen Elements groß ist, wie oben angegeben, kann weiter eine ausreichende Druckdifferenz zwischen dem oberen und unteren Teil des Nukleinsäureeinfangteils 310 erzeugt werden, wenn der Unterdruck vom oberen Auslass 307 angelegt wird.
  • Vorzugsweise steht der Strömungskanal, der das Lösungsaufnahmeteil 319 aufweist und mit dem oberen Auslass 307 in Verbindung steht, auch mit einem Zufuhranschluss 321 in Verbindung, der sich durch ein Druckeinstellungselement 320 nach außen zur Vorrichtung öffnet. In der Vorrichtung der 3 öffnet sich der Zufuhranschluss 321 nach außen in der Aufwärtsrichtung der Vorrichtung. In dem Fall, in dem der Zufuhranschluss 321 vorgesehen ist, wird, wenn der Unterdruck vom oberen Auslass 307 aus angelegt wird, das außen befindliche Gas vom Zufuhranschluss 321 durch das Druckeinstellungselement 320 eingelassen. Dies erzeugt einen Luftstrom 322, der bewirkt, dass die in den Lösungsaufnahmeteil 319 absorbierte Lösung abgeleitet wird. Mit der Konfiguration, die den Zufuhranschluss 321 aufweist, kann das Lösungsaufnahmeteil 319 die Lösung durch das Kapillarphänomen nur dann absorbieren, wenn ein Unterdruck vom oberen Auslass 307 aus angelegt wird. Das heißt, dass das Lösungsaufnahmeteil 319 die Lösung wieder durch das Kapillarphänomen nur für das Volumen der Lösung, das vom Lösungsaufnahmeteil 319 abgeleitet wurde, absorbieren kann. Weiter kann in der Konfiguration ohne den Zufuhranschluss 321 die Lösung nicht das Lösungsaufnahmeteil 319 nur dadurch erreichen, dass der obere Bereich 314 mit der Lösung gefüllt wird, so dass eine Absorption nicht beginnt; dagegen hört andererseits, wenn die Absorption beginnt, die Absorption nicht auf, bis das Lösungsaufnahmeteil 319 vollständig gefüllt ist, was bedeutet, dass die Steuerbarkeit unzureichend ist. In diesem Fall kann die Steuerbarkeit dadurch kompensiert werden, dass der Zufuhranschluss 321 vorgesehen wird. Es kann bevorzugt sein, weiter ein Luftventil in den Einlassanschluss 321 vorzusehen, wenn die Steuerbarkeit der Absorption der Lösung weiter verbessert wird.
  • Das Druckeinstellungselement 320 erzeugt vorzugsweise, wenn ein Gas hindurchgeleitet wird, einen Druckverlust, der größer als der Druckverlust ist, der erzeugt wird, wenn eine Lösung durch das Nukleinsäureeinfangteil 310 hindurchgeleitet wird. Durch das Vorsehen eines solchen Druckeinstellungselements 320 wird, wenn ein Unterdruck vom oberen Auslass 307 aus angelegt wird, der Unterdruck nicht nur an den Zufuhranschluss 321 sondern auch ausreichend an das Lösungsaufnahmeteil 319, das Nukleinsäureeinfangteil 310 und das Zelleinfangteil 302 angelegt. In Bezug auf das Druckeinstellelement 320 kann der Ausgleich vom Blickpunkt des Viskositätsunterschieds zwischen Luft und Wasser gut sein, falls ein Material verwendet wird, dessen Pore beispielsweise kleiner als die Pore des Nukleinsäureeinfangteils 310 ist, zum Beispiel ein Material mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von etwa 1/5 bis etwa 1/10, besonders bevorzugt etwa 1/7 bis etwa 1/9 und insbesondere etwa 1/8 der Pore des Nukleinsäureeinfangteils 310.
  • Es ist zu beachten, dass die vorliegenden Erfinder bereits eine internationale Patentanmeldung für eine Zellanalyseeinrichtung eingereicht haben, die mit einem dreidimensionalen porösen Element ausgestattet ist (PCT/JP2015/077849, eingereicht am 30. September 2015). Der in der Beschreibung, den Ansprüchen und Zeichnungen beschriebene Inhalt der Anmeldung wird hier durch Bezugnahme aufgenommen, und zwar so wie er ist.
  • 4 zeigt ein Fließdiagramm des Zellanalyseverfahrens mittels der Einrichtung der vorliegenden Erfindung. Die Zeitvorgabe, mit der das dreidimensionale poröse Element vom zweidimensionalen Array-Chip getrennt wird, wird mit Bezug auf das Diagramm erläutert.
  • Nachdem die Zellen auf dem Zelleneinfangteil 303 im ersten Schritt, wie oben angegeben, eingefangen wurden, werden dann im (Schritt 2) die Zellen durch einen Lysepuffer und dergleichen in einem Zustand, in dem ein Unterdruck vom oberen Auslass 307 aus angelegt wird, aufgebrochen und die aus den Zellen extrahierten Nukleinsäuren (zum Beispiel mRNA) werden von der Nukleinsäuresonde eingefangen, die auf dem Nukleinsäureeinfangteil 310 immobilisiert vorliegt. Im (Schritt 3) kann mittels der Nukleinsäuren, die auf der Oberfläche des Nukleinsäureeinfangteils 310 eingefangen werden, ein erster Strang des komplementären Strangs (zum Beispiel cDNA) der eingefangenen Nukleinsäure (zum Beispiel mRNA) synthetisiert werden, indem ein Reagens, das ein Enzym enthält, in das Nukleinsäureeinfangteil eingeführt wird. Im (Schritt 4) kann ein zweiter Strang synthetisiert werden, indem eine zweite DNA-Sonde in Übereinstimmung mit einem zu messenden Gen und ein Enzymreagens in das Nukleinsäureeinfangteil eingeführt werden. Bis zu diesem Punkt ist eine Reaktion an der Oberfläche aller Nukleinsäureeinfangteile aufgetreten und können notwendige Reaktionsprodukte auf der Oberfläche immobilisiert werden. In der anschließenden Amplifikationsreaktion (zum Beispiel PCR) wird das Amplifikationsprodukt von der Oberfläche freigesetzt und von der Einrichtung als Endprodukt gesammelt. Um zu verhindern, dass das Amplifikationsprodukt an die Innenwand des dreidimensionalen porösen Elements adsorbiert wird, wird die Ansaugkraft zu diesem Zeitpunkt abgeschaltet, nachdem das Reagens mit dem Enzym und das Substrat, das für die Amplifikationsreaktion notwendig ist, in das Nukleinsäureeinfangteil durch Ansaugen eingeführt werden, und Luft oder ein Trennlösungsmittel zum Trennen zwischen das dreidimensionale poröse Element und den zweidimensionalen Array-Chip von einem „Speichertank“ 323 durch Betätigen der Spritze 333 injiziert wird. Daher wird das Amplifikationsprodukt blockiert, so dass es nicht vom Inneren des zweidimensionalen Array-Chips zum dreidimensionalen porösen Element wandert und die Adsorption verhindert werden kann. Während der Amplifikation verteilt sich das Amplifikationsprodukt vom Inneren des zweidimensionalen Array-Chips, indem es in den Bereich 314 diffundiert.
  • Die Zeitwahl der Trennung durch das Einspritzen von Luft oder dem Trennlösungsmittel kann auch die Zeitwahl vor der Amplifikationsreaktion (zum Beispiel PCR-Zyklusreaktion) nach der Einführung des Reagens sein. Allerdings kann es besser sein, das dreidimensionale poröse Element und den zweidimensionalen Array-Chip nach dem Abschluss von mehreren Zyklen der Amplifikationsreaktion vor der Wanderung vom Nukleinsäureeinfangteil zum dreidimensionalen porösen Element durch Diffusion zu trennen. Der Einfluss der Wanderung der Lösung aufgrund einer Temperaturänderung kann auf ein Minimum gedrückt werden, indem die Trennung zu einer solchen Zeit durchgeführt wird.
  • Nach dem Abschließen des Amplifikationsschritts wird das Amplifikationsprodukt vom Probensammelanschluss 312 durch Ansaugen gesammelt. Zu dieser Zeit wird der Zelleinführungsanschluss 311 geöffnet und die Lösung wandert von 311 nach 312. DNA-Stränge (insbesondere kurze DNA-Stränge) mit Längen, die für eine Analyse nicht notwendig sind, sind in dem erhaltenen Amplifikationsprodukt enthalten, so dass in (Schritt 7) eine Reinigung durchgeführt wird, um diese DNA-Stränge zu entfernen, und die Sequenzanalyse im (Schritt 8) mit einem Sequenzer der nächsten Generation durchgeführt wird. Schließlich kann das Erhalten der Ergebnisse der Einzelzellanalyse durch Neuanordnung der Sequenzen, die in den Tag-Sequenzen erhalten werden, in Übereinstimmung mit den Zelleinfangpositionen (Schritt 9) ähnlich dem herkömmlichen Beispiel sein. Es ist zu beachten, dass die Amplifikation der Nukleinsäure vorzugsweise eine PCR-Amplifikation sein kann, es gibt aber keine Beschränkung darauf, und es ist möglich, andere Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise eine Rolling-Circle-Amplifikations- (RCA) Reaktion, ein NASBA-Verfahren und das LAMP-Verfahren zu verwenden. Diese anderen Amplifikationsverfahren sind auf dem technischen Gebiet hinreichend bekannt, so dass der Fachmann in geeigneter Weise eine zu verwendende Nukleinsäuresonde und ein zu verwendendes Reagens/Reagenzien auswählen konnte.
  • Wenn weiter das dreidimensionale poröse Element vom zweidimensionalen Array-Chip mit einem Aktuator getrennt wird, kann die Trennung auch zur gleichen Zeit, wie oben angegeben, durchgeführt werden.
  • Weiterhin kann beim Trennungsverfahren mittels der Ultrafiltrationsmembran oder der Gelmembran die Wanderung des Amplifikationsprodukts zum porösen Element zu jeder Zeit blockiert werden, und daher ist es nicht notwendig, die Zeitwahl der Trennung festzusetzen. Hier kann der Umfang der Wanderung der Nukleinsäure des Amplifikationsprodukts auf 1/10 oder weniger in einem Zustand reduziert werden, in dem es keine Unterdruckanlegung gibt, indem die Porengröße der Ultrafiltrationsmembran oder der Gelmembran auf 1 bis 10 nm, zum Beispiel 5 nm (30 kDa), eingestellt wird.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend ausführlicher unter Verwendung von Beispielen erläutert; allerdings ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • (Beispiel 1-1) Herstellung der Einrichtung
  • 5 ist eine Figur, die einen Überblick über die Konfiguration der im vorliegenden Beispiel hergestellten Einrichtung zeigt, wobei (a) eine Ansicht von unten (Draufsicht von unten aus gesehen) zeigt und (b) eine Querschnittsansicht im 5A-5A' Querschnitt zeigt. Die Einrichtung 500 weist eine Mehrzahl von Reaktionskammern 524 auf, die jede einen darauf angeordneten, zweidimensionalen Array-Chip 513 hat, wobei der zweidimensionale Array-Chip 513 Sätze der Mehrzahl von Zelleinfangteilen 503 und Nukleinsäureeinfangteilen 510 in Übereinstimmung mit den jeweiligen Zelleinfangteilen 503 aufweist. Eine Zelllösung wird durch einen gemeinsamen Strömungskanal 525 von einem Zelleinführungsanschluss 511 zu einem Probensammelanschluss 512 strömen gelassen und dann auf dem zweidimensionalen Array-Chip 513 bereitgestellt. Der Chip wird so mit der Zelllösung gefüllt. Separate Einlässe 527 können verwendet werden, wenn ein Reagens zu den Chips getrennt eingeführt wird, insbesondere zum Beispiel wenn ein Reagens eingeführt wird, das einen Primer mit einer Tag-Sequenz, die den Chip identifizieren soll, enthält.
  • Ein Kunststoff-Chip (quadratische Form, bei der eine Seite 1,125 mm beträgt) aus Dimethylpolysiloxan (PDMS), der durch Spritzgießen erhalten wurde, wurde zur Herstellung des zweidimensionalen Array-Chips 513 verwendet, und eine Durchgangsöffnung mit einem Durchmesser im Bereich von ungefähr 3 bis 10 µm, was kleiner als die Zellen ist, wurde gebildet, um das Zelleinfangteil 503 herzustellen. Es ist zu beachten, dass die Herstellung des zweidimensionalen Array-Chips mittels eines Kunststoff-Chips durchgeführt werden kann, der durch das Spitzgießen unter Verwendung eines anderen Kunststoffs (Polycarbonat, cyclisches Polyolefin, Polypropylen und dergleichen) erhalten wird, oder mittels einer Nanopräge-Technologie oder einem Halbleiterverfahren durchgeführt werden kann. Das bei der Herstellung des zweidimensionalen Array-Chips verwendete Material kann vorzugsweise ein hydrophobes Material sein, durch das die Adsorption von Zellen, Reagens und dergleichen auf dem Array-Chip reduziert werden können. Dadurch dass die Oberfläche des Substrats eines solchen zweidimensionalen Array-Chips einer Behandlung unterzogen wird, um die Adsorption von Zellen zu verhindern, ist es auch möglich, eine abstoßende Kraft auf die Zellen auszuüben (Bezugnahme auf die Beispiele 1-3).
  • Ein zylindrischer Raum mit einem Durchmesser von mehreren zehn µm (zum Beispiel 10 bis 50 µm) wird direkt unter dem Zelleinfangteil 503 vorgesehen, und dann wird der zylindrische Raum mit magnetischen Kügelchen gefüllt, auf denen eine Sonde zum Einfangen von Nukleinsäuren immobilisiert wird, um so das Nukleinsäureeinfangteil 510 zu bilden. Das Füllen mit den Magnetkügelchen kann separat unter Verwendung eines Tintenstrahldruckkopfs durchgeführt werden. Während der Chip vertikal umgekehrt ist, wird das Nukleinsäureeinfangteil 510 separat mit 2 nl einer Lösung der Kügelchen gefüllt, auf denen unterschiedliche Sequenzen gemäß jedem Bereich immobilisiert sind. Die Magnetkügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm können bei einer Zahldichte von 5 × 109/ml in der zum Füllen verwendeten Kügelchenlösung suspendiert sein. Streptavidin wird auf den Magnetkügelchen immobilisiert, und eine DNA-Sonde, die mit 5'-Biotin modifiziert ist, wird durch Streptavidin immobilisiert. Die Kügelchen sind so ausgebildet, dass sie einen Durchmesser von mehreren µm oder weniger (zum Beispiel 1 µm oder weniger) haben, um die Anzahl der einzufüllenden Magnetkügelchen zu erhöhen und dadurch die Nukleinsäureeinfangwirksamkeit zu verbessern. Eine Membran zum Verhindern eines Ausströmens 518 von Kügelchen (poröse Membran, die aus einem Kunststoff mit einer Porengröße von 0,8 µm hergestellt ist: Isopore-Membran, hergestellt von Millipore Corporation), die einen kleineren Porendurchmesser hat, als es der Kügelchendurchmesser ist, wird mit dem zweidimensionalen Array-Chip 513 in engen Kontakt gebracht, so dass die eingefüllten Magnetkügelchen nicht ausströmen.
  • Im vorliegenden Beispiel wird die Schwerkraft als abstoßende Kraft verwendet, und die Zellen werden daran gehindert, aufgrund eines Absetzens von Zellen durch die Schwerkraft mit den Bereichen in Kontakt zu gelangen und an diese zu adsorbieren, bei denen es sich nicht um das Zelleinfangteil auf dem zweidimensionalen Array-Chip handelt. Im vorliegenden Beispiel wirkt die Schwerkraft in der Richtung, die die Zellen vom zweidimensionalen Array-Chip trennt, so dass es notwendig ist, die Zellen anzusaugen, um die Schwerkraft zu überwinden. Allerdings wird das Nukleinsäureeinfangteil 510 des zweidimensionalen Array-Chips 513 mit magnetischen Mikrokügelchen gefüllt, so dass allein durch Anlegen einer Druckdifferenz an den oberen und unteren Teil des zweidimensionalen Array-Chips 513 mittels der Spritze die Zelllösung nicht mit einer ausreichenden Strömungsrate strömt und daher eine ausreichende Ansaugkraft nicht erhalten werden kann. Deshalb wird im vorliegenden Beispiel als bevorzugtere Ausführungsform das Ansaugverfahren nicht mittels der Spritze durchgeführt, sondern durch Verbinden der Membranpumpe mit dem oberen Auslass, wodurch der Druck im Bereich des oberen Strömungskanals 526 bei oder unter dem Sättigungsdampfdruck einer wässrigen Lösung gehalten wird, um so die Lösung, die die Rückseite des zweidimensionalen Array-Chips erreicht hat, zu verdampfen und schnell abzuleiten. Das Verdampfen der Lösung auf diese Weise fördert die Kapillarwirkung des Nukleinsäureeinfangteils, um dadurch eine Hochgeschwindigkeitsansaugung zu realisieren und die Zellen entgegen der Schwerkraft einzufangen.
  • (Beispiel 1-2) Einzelzellanalyseverfahren unter Verwendung der Einrichtung
  • 4 ist ein Fließdiagramm, das einen Überblick über das Einzelzellanalyseverfahren unter Verwendung der Einrichtung der vorliegenden Erfindung zeigt, die in Beispiel 1-1 hergestellt ist, wie in 5 gezeigt. Im vorliegenden Beispiel werden (Schritt 1) das Einfangen der Zellen, (Schritt 2) die Zelllyse (Aufreißen), (Schritt 3) die Komplementärstrang- (Erststrang-) Synthese (zum Beispiel cDNA-Synthese), (Schritt 4) der Abbau eingefangener Nukleinsäuren (zum Beispiel mRNA-Abbau), (Schritt 5) die Zweitstrangsynthese und (Schritt 6) die Amplifikationsreaktion in der Einrichtung durchgeführt. In der Reaktion kann bis (Schritt 5) das Reaktionsprodukt auf dem Nukleinsäureeinfangteil 510 immobilisiert sein, und die Reaktion ist eine Festphasenreaktion. Im (Schritt 6) diffundiert das Amplifikationsprodukt, das vom zweidimensionalen Array-Chip freigesetzt wird, in ein Reaktionsreagens in der Reaktionskammer 524. Nach dem Abschluss der Amplifikationsreaktion kann das Reagens, das das Amplifikationsprodukt enthält, aus dem Probensammelanschluss 512 durch Ansaugen gesammelt werden.
  • Weiter kann nach dem Abschluss der Komplementärstrang- (Erststrang-) Synthese (zum Beispiel cDNA-Synthese) von (Schritt 4) der zweidimensionale Array-Chip aus der Einrichtung entfernt werden, und der Chip kann in das Rohr, dass das Reagens enthält, eingetaucht werden, so dass die Kügelchen in der Lösung gesammelt werden (Schritt 5). Danach können die anschließenden Reaktionen im Rohr (außerhalb der Einrichtung) durchgeführt werden.
  • (Schritt 7) ist ein Reinigungsschritt, der während der Amplifikation Nebenprodukte entfernt, die für die Nukleinsäuresequenzanalyse nicht notwendig sind. Weiterhin ist (Schritt 8) ein Sequenzanalyseschritt, der einen Sequenzer der nächsten Generation verwendet, und es kann jede Sequenzanalyseplattform verwendet werden, solange es sich dabei um einen Sequenzer mit hoher Parallelität handelt. Der abschließende Schritt (Schritt 9) ist der Datenanalyseschritt, bei dem es sich um einen Schritt zum Zusammenfassen der Sequenzanalyseergebnisse für die Zellidentifikations-Tags und Chip-Tags und zum Konstruieren der genetischen Analysedaten jeder einzelnen Zelle handelt.
  • Zuerst wird der Schritt zum Einfangen der Zellen in der Zelllösung durch Verwenden der Zelleinfangteile 503 auf dem zweidimensionalen Array-Chip 513 durchgeführt. Um den Schritt durchzuführen, wird der zweidimensionale Array-Chip 513 mit der Zelllösung gefüllt, indem die Zelllösung vom Zelleinführungsanschluss 511 eingeführt wird und die Zelllösung vom Probensammelanschluss 512 angesaugt wird. Als Nächstes wird durch Anlegen eines Unterdrucks an den unteren Auslass 507 die Zelllösung durch die Zelleinfangteile 503 und das Nukleinsäureeinfangteil 510 auf dem zweidimensionalen Array-Chip 513 hindurchgeleitet, und die Zellen werden auf den Zelleinfangteilen 503 eingefangen. 501 der 5(a) zeigt die Zellen, die auf dem Zelleinfangteil eingefangen werden. Zu dieser Zeit kann eine Hochgeschwindigkeitsansaugung durch kontinuierliches Absaugen mit der Membranpumpe und die Kapillarwirkung des Nukleinsäureeinfangteils durchgeführt werden, um dadurch ein Absetzen aufgrund der Schwerkraft zu überwinden. Die Ansaugzeit kann innerhalb 1 Minute bei 1 µl liegen. Zu dieser Zeit beträgt die Adsorption von Zellen auf dem zweidimensionalen Array-Chip aufgrund des Absetzens 10 % oder weniger.
  • Um die Zellen aufzubrechen, wird der zweidimensionale Array-Chip 513 mit einem Lysepuffer gefüllt, indem der Lysepuffer vom Zelleinführungsanschluss 511 eingeführt wird und der Lysepuffer vom Probensammelanschluss 512 angesaugt wird. Dann wird ein Unterdruck an den unteren Auslass 507 so angelegt, dass die notwendige Ansaugrate erhalten wird. Der angelegte Unterdruck wird dem Druck während der Zellansaugung angeglichen. Es ist zu beachten, dass, um die Zellansaugung abzuschließen, es effektiv sein kann, einen PBS-Puffer mit ungefähr 1 µl einzuführen, bevor der Lysepuffer eingeführt wird.
  • Als Nächstes wurde das Verfahren mit dem Schritt der Komplementärstrang- (Erststrang-) Synthese (zum Beispiel reverse Transkription, cDNA-Synthese) fortgesetzt. Um eine notwendige Einführungsrate mit einem Reagensgemisch für die Komplementärstrangsynthese (reverse Transkription) zu erzielen, wird die Stärke des Unterdrucks neu eingestellt. Nach dem Einstellen wird das Reagens vom Zelleinführungsanschluss 511 eingeführt, um den zweidimensionalen Array-Chip 513 mit dem Reagens zu füllen. Um mit der Komplementärstrangsynthesereaktion (reverse Transkriptionsreaktion) fortzufahren, wird dann die Temperatur der Einrichtung erhöht und nur für die Zeit beibehalten, die für die Reaktion notwendig ist. Weiterhin wird die Temperatur auf 85°C erhöht, um das Reagens (zum Beispiel die reverse Transkriptase) zu inaktivieren. Ein Waschpuffer wird vom Zelleinführungsanschluss 511 eingeführt, um die nicht notwendige Waschlösung auszuwaschen und abzuleiten, und der Unterdruck wird neu eingestellt, um den Waschpuffer in den Nukleinsäureeinfangteil einzuführen und abzuleiten. Der Abbau der eingefangenen Nukleinsäuren (mRNA-Abbau) und die Zweitstrangsynthese, die die nächsten Schritte bilden, sind fast dieselben wie der Schritt der Komplementärstrang-(Erststrang-) Synthese (reverse Transkription).
  • Der abschließende Schritt ist die Amplifikationsreaktion. Das Amplifikationsreaktionsreagensgemisch wird in den Zelleinführungsanschluss 511 eingeführt, und ein Unterdruck wird so eingestellt, dass das Reagensgemisch in das Nukleinsäureeinfangteil 510 mit der notwendigen Lösungsrate eingeführt wird. Der Temperaturzyklus wird begonnen, um die Amplifikationsreaktion (insbesondere PCR) durchzuführen, und die Druckeinstellung wird so geändert, dass die Spritze gleichzeitig betätigt wird, wenn die Anlegung des Unterdrucks in den ersten bis mehreren Zyklen angehalten wird. Danach wird der Temperaturzyklus wiederholt, bis die notwendige Konzentration des Amplifikationsprodukts erzielt wird. Dann wird ein Unterdruck an den unteren Auslass 507 angelegt, um das Amplifikationsprodukt anzusaugen und zu sammeln, und die gesammelte Amplifikationsproduktlösung wird im Rohr abgeleitet.
  • Als Nächstes wird das Herstellungsverfahren einer Probe zum Sequenzieren mittels des zweidimensionalen Array-Chips 513 ausführlich beschrieben. 6 zeigt, wie die Probe hergestellt wird, indem die Nukleinsäure (zum Beispiel mRNA), die durch das Nukleinsäureeinfangteil 510 der Einrichtung des vorliegenden Beispiels eingefangen wird, behandelt wird. Dieser Schritt kann in das Aufbrechen der Zellen nach dem Einfangen der Zellen (Schritt 1), das Einfangen der Nukleinsäure (mRNA) (Schritt 2), die Synthese eines komplementären Strangs (ersten Strangs) (zum Beispiel cDNA) (Schritt 3), den Abbau der eingefangenen Nukleinsäure (zum Beispiel mRNA) (Schritt 4) und die Nukleinsäureamplifikation (PCR) und Synthese von zweiten Strängen, in die bekannte terminale Sequenzen, die für die Sequenzierung notwendig sind, eingeführt wurden (Schritt 5), und weiter die Schritte der Nukleinsäureamplifikation (Schritt 6-1) und (Schritt 6-2) unterteilt werden.
  • Nach dem Waschen der Zellen mit 500 µl 1 × PBS-Puffer, ohne die Zellen zu beschädigen, werden 1000 Zellen, die in 10 µl 1 × PBS-Puffer, der auf 4°C gekühlt wurde, suspendiert werden, vom Zelleinführungsanschluss 511 eingeführt und vom oberen Auslass 512 so angesaugt, dass die Reaktionskammer 524 mit der Lösung gefüllt wird. Daher wird der zweidimensionale Array-Chip 513 mit Zellen enthaltendem PBS-Puffer gefüllt. Als Nächstes wird ein Unterdruck von 0,95 atm an den unteren Auslass 507 angelegt, indem zum Beispiel die Membranpumpe die Lösung so ansaugt, dass die Lösung durch das Zelleinfangteil 503 zum oberen Strömungskanal 526 strömt. Die Zellen wandern zusammen mit dem Strom der Lösung, um das Zelleinfangteil 503 zu erreichen. Da der Durchmesser der Öffnung des Zelleinfangteils 503 kleiner als der Durchmesser der Zellen ist, werden die Zellen darauf eingefangen. Die eingefangenen Zellen dienen als Pfropfen für den Lösungsstrom, so dass der Lösungsstrom sich zu einem Zelleinfangteil 503 bewegt, das noch Zellen einfangen muss. Daher wandern die übrigen Zellen zu den Einfangteilen, die noch Zellen einzufangen haben, und werden eingefangen.
  • Wenn eine gewünschte Anzahl von Zellen eingefangen wurde, werden überschüssige Zellen, die nicht eingefangen wurden, und der PBS-Puffer vom Probensammelanschluss 512 abgeleitet. Als Nächstes wird, nachdem der Lysepuffer (zum Beispiel ein Tensid wie beispielsweise Tween 20) vom Zelleinführungsanschluss 511 zum Probensammelanschluss 512 strömen gelassen und der zweidimensionale Array-Chip 513 mit dem Puffer gefüllt wird, die Lösung sofort durch Anlegen eines Unterdrucks an den unteren Auslass 507 angesaugt. Alle nachfolgend beschriebenen Lösungen werden auf diese Weise durch das Nukleinsäureeinfangteil 510 des zweidimensionalen Array-Chips 513 geleitet. Zu dieser Zeit dient als Membran zum Verhindern des Ausströmens 518 von Kügelchen ein Strömungskanal, der aus dem porösen Material mit einem Durchmesser von 0,8 µm gebildet ist und einen großen Druckverlust aufweist. Es kann daher für den Lysepuffer leicht sein, für etwa 5 Minuten durch das Zelleinfangteil 503 zum oberen Strömungskanal 526 kontinuierlich und langsam zu fließen, indem eine solche Membran zum Verhindern des Ausströmens 518 der Kügelchen verwendet wird.
  • Die eingefangenen Zellen 501 werden durch den Lysepuffer aufgebrochen, und die Nukleinsäure 606 (zum Beispiel mRNA) verlässt die Zelle nach außen. Allerdings strömt die Zelllösung, die in der Umgebung des Zelleinfangteils 503 strömt, weiterhin so, dass sie in die Pore eingesaugt wird, die das Zelleinfangteil 503 bildet, so dass die Nukleinsäure 606 (zum Beispiel mRNA) das Nukleinsäureeinfangteil 510 durch das Zelleinfangteil 503 erreicht, ohne zur Peripherie zu diffundieren. Daher werden das Aufbrechen der Zellen und das Einfangen der Nukleinsäure 606 (zum Beispiel mRNA) durch eine erste DNA-Sonde 601, die auf dem Kügelchen des Nukleinsäureeinfangteils 510 immobilisiert ist, gleichzeitig durch Einführen des Lysepuffers durchgeführt. Der Zustand wird in Schritt 2 der 6 gezeigt.
  • Um in die Genanalysedaten die Positionsinformationen auf dem zweidimensionalen Array-Chip 513, in dem die Zellen eingefangen werden, d.h. die Positionskoordinaten des Zelleinfangteils 503, das in einer Gitterform angeordnet ist, wie in 5(a) gezeigt, einzubringen, wird hier eine erste DNA-Sonde 601, in der eine Zellerkennungssequenz 602 mit einer Sequenz, die sich in entsprechender Weise in Bezug auf die jeweiligen Zelleinfangteile 503 unterscheidet, auf der Kügelchenoberfläche des Nukleinsäureeinfangteils 510 immobilisiert. In 6 zeigen die schraffierten Teile am linken Ende des Diagramms von jedem Schritt eine zu immobilisierende Wandfläche, hier die Kügelchenoberfläche. Die erste DNA-Sonde 601 hat eine Sequenz (zum Beispiel beim Einfangen von mRNA eine poly (T) Sequenz), die komplementär zur in der 3'-terminalen Region einzufangenden Nukleinsäure ist, so dass die Nukleinsäure 606 (zum Beispiel mRNA) durch Hybridisieren der Sonde mit der Sequenz der einzufangenden Nukleinsäure (zum Beispiel durch Hybridisieren mit der poly-(A)-Sequenz am 3'-Terminal von mRNA) eingefangen werden kann. Weiter kann ein universeller Primer (604, revers) für die Amplifikationsreaktion auf der 5'-terminalen Seite vorgesehen sein.
  • Im vorliegenden Beispiel enthält die erste DNA-Sonde 601 vom S'-Terminal in der Reihenfolge eines universellen Primers (604, revers) für die Amplifikation mit ungefähr 30 Basen eine Zellerkennungssequenz (602) mit ungefähr 7 Basen und eine Oligo (dT) Sequenz mit ungefähr 18 Basen + eine VN-Sequenz mit 2 Basen. Im vorliegenden Beispiel wird eine poly-(T) Sequenz in einem Teil der DNA-Sonde 601 zum Einfangen verwendet, um die mRNA zu analysieren; allerdings kann ein Teil der Sequenz, die zur Sequenz der zu analysierenden Nukleinsäure komplementär ist oder eine willkürliche Sequenz anstelle der poly-(T) Sequenz verwendet werden, um eine microRNA- und Genomanalyse durchzuführen. Die Sequenz einer solchen Sonde zum Einfangen kann in geeigneter Weise von einem Fachmann auf der Grundlage herkömmlicher Techniken konstruiert werden.
  • Als Nächstes wird, wie in Schritt 3 der 6 gezeigt ist, die Nukleinsäure (mRNA) 606, die von der ersten DNA-Sonde 601 eingefangen wird, als Matrize verwendet, um den ersten Strang 607 zu synthetisieren. Im vorliegenden Beispiel werden zum Synthetisieren der ersten cDNA aus der mRNA als Reagens zum Synthetisieren des ersten Strangs 58,5 µl 10 mM Tris-Puffer (pH = 8,0) enthaltend 0,1 % Tween 20, 4 µl 10 mM dNTP, 225 µl 5xRT-Puffer (SuperScript III, Invitrogen Corporation), 4 µl 0,1 M DTT, 4 µl RNaseOUT (Invitrogen Corporation) und 4 µl Superscript III (reverse Transkriptase, Invitrogen Corporation) gemischt und vom Zelleinführungsanschluss 511 auf dieselbe Weise wie der vorherige Schritt eingeführt. Während des sehr langsamen Strömens der zuvor erwähnten Lösung von der Reaktionskammer 524 zum oberen Strömungskanal 526 in einem Zustand, in dem die Lücken zwischen den gepackten Kügelchen mit einer Lösung gefüllt waren, die ein Synthesereagens (zum Beispiel reverse Transkriptase) und ein Synthesesubstrat enthielt, wurde die Temperatur der Lösung langsam auf 50°C angehoben und die Komplementärstrangsynthesereaktion (Erststrang-Synthesereaktion) für etwa 50 Minuten durchgeführt. Im Ergebnis wird die Nukleinsäure (zum Beispiel cDNA), die auf der Oberfläche der Mehrzahl von Kügelchen für jede Zelle immobilisiert ist, als Bibliothek erhalten. Solche Bibliotheken sollten als Einzelzell-Nukleinsäure- (cDNA-) Bibliotheksanordnungen bezeichnet werden, die sich grundlegend von den herkömmlichen normierten Nukleinsäure- (cDNA-) Bibliotheken unterscheiden, die aus vielen Zellen erhalten werden.
  • Nachdem der erste Strang 607 synthetisiert wurde, wurde die gesamte Einrichtung für 1,5 Minuten bei 85°C gehalten, um das Synthesereagens (zum Beispiel reverse Transkriptase) zu inaktivieren. Nach dem Kühlen auf 4°C wurden 0,2 ml 10 mM Tris-Puffer (pH = 8,0), enthaltend z.B. RNase und 0,1 % Tween 20, vom oberen Einlass 511 injiziert und vom oberen Auslass 512 angesaugt, um die Reaktionskammer 524 mit der Lösung zu füllen. Danach wurde die Lösung vom unteren Auslass 507 abgeleitet, und der Puffer in der Reaktionskammer 524 wurde vom oberen Auslass 512 entfernt. Durch fünfmaliges Wiederholen dieses Schritts wurde die eingefangene Nukleinsäure (mRNA) abgebaut, und die Substanzen und die abgebauten Substanzen, die im Nukleinsäureeinfangteil verblieben, wurden entfernt und ausgewaschen. Weiterhin wurde fünfmal ein Waschen in einer ähnlichen Weise mit einer Flüssigkeit durchgeführt, die ein alkalisches Denaturierungsmittel und eine Waschflüssigkeit enthielt. Eine Nukleinsäure-Bibliotheksanordnung, die allen Zellen entspricht, zum Beispiel eine cDNA-Bibliotheksanordnung, kann durch das Verfahren bis zu diesem Punkt für jede der eingefangenen Zellen konstruiert werden, wie in Schritt 4 der 6 gezeigt ist.
  • Als Nächstes wurden 69 µl steriles Wasser, 10µl 10 × Ex Taq-Puffer (TaKaRa Bio Corporation), 100 µl 2,5 mM dNTP-Mix und 1 µl ExTaq Hot Start Version (TaKaRa Bio Corporation), dem 10 µm jeder der universellen Sequenzen für die Amplifikation (revers) 609 hinzugefügt wurde, gemischt, und dieses gemischte Reagens wurde vom oberen Einlass 511 zum Nukleinsäureeinfangteil 510 auf dieselbe Weise wie im vorherigen Schritt eingeführt. Das Verfahren zum getrennten Einführen einer zweiten DNA-Sonde 608 mit einem Chip-Identifikations-Tag 610 wird später beschrieben. Dann wurde nach dem Lösen der sekundären Struktur der Nukleinsäure bei 95°C für 3 Minuten die genspezifische Sequenz 611 des Primers mit dem ersten Strang als Matrize bei 44°C für 2 Minuten gebunden. Schritt 5 der 6 zeigt den Zustand, in dem die zweite DNA-Sonde 608 an den ersten Strang hybridisiert wird und der zweite Strang 612 synthetisiert wird. Die Komplementärstrangverlängerungsreaktion wird durch Erhöhen der Temperatur auf 72°C für 6 Minuten abgeschlossen.
  • Das Einführen der zweiten DNA-Sonde 608 in die Reaktionskammer 524 wird wie folgt durchgeführt. Zuerst wird Mineralöl vom Zelleinführungsanschluss 511 eingeführt und vom oberen Auslass 512 abgeleitet. Als Nächstes strömt die Pufferlösung, die das Reagens enthält, durch den oberen Strömungskanal 526 zu den separaten Einlässen 527, und überschüssiges Mineralöl in der Reaktionskammer wird von den separaten Einlässen 527 abgeleitet. Auf diese Weise werden die Bereiche, die mit der Pufferlösung gefüllt sind, in der Reaktionskammer 524 am unteren Abschnitt des zweidimensionalen Array-Chips 513 durch das Mineralöl getrennt. Eine solche Trennung tritt auf, weil die Innenwand der Reaktionskammer 524 hydrophil ist, während demgegenüber eine Oberflächenbehandlung so durchgeführt wird, dass der Bereich 528 zwischen den Reaktionskammern hydrophob ist. Weiter ist es bevorzugt, dass der erste Strang fest an die Kügelchen (zum Beispiel durch Biotin-Avidin-Bindung) immobilisiert ist, um eine hohe Reaktionswirksamkeit aufrechtzuerhalten. Nach dem Abschluss der Trennung der Reaktionskammer 524 wird eine Pufferlösung, die die zweite DNA-Sonde mit den jeweiligen unterschiedlichen Chipidentifikationssequenzen enthält, vom separaten Einlass 527 eingeführt, und die Pufferlösung wird vom oberen Auslass 512 durch den oberen Strömungskanal 526 abgeleitet. Die Umgebung des Nukleinsäureeinfangteils 510 wird dadurch mit einer unterschiedlichen zweiten DNA-Sonde in jeder Reaktionskammer 524 gefüllt und diese Sonde hybridisiert an den ersten Strang. Nach dem Abschluss der Synthese des zweiten Strangs, strömt eine große Menge der Pufferlösung vom Zelleinführungsanschluss 511 zum Probensammelanschluss 512 und wird das Mineralöl im Bereich 528 weggewaschen. Da die Strömungskanäle nur verbunden werden müssen, kann etwas Mineralöl im Bereich 528 zurückbleiben.
  • Der abschließende Schritt ist die Amplifikationsreaktion durch den universellen Primer, wie in Schritt 6-1 und Schritt 6-2 der 6 gezeigt. Im vorliegenden Beispiel wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt und 49 µl steriles Wasser, 10 µl 10 × High Fidelity PCR-Puffer (Invitrogen Corporation), 10 µl 2,5 mM dNTP-Mix, 4 µl 50 mM MgSO4, 10 µl 10 µm universeller Primer für die PCR-Amplifikation (vorwärts), 10 µl 10 µm PCR der universellen Primersequenz für die Amplifikation (rückwärts) und 1,5 µl Platinum Taq-Polymerase High Fidelity (Invitrogen Corporation) wurden gemischt, um das Reagens herzustellen. Dann wurde das Reagens vom Zelleinführungsanschluss 511 auf dieselbe Weise wie im vorherigen Schritt eingeführt. Anschließend wurde die gesamte Einrichtung für 30 Sekunden bei 94°C gehalten, und es wurde ein 3-Schritt-Verfahren für 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 68°C 40-mal wiederholt. Danach wurde am Ende die gesamte Einrichtung für 3 Minuten bei 68°C gehalten. Anschließend wurde die gesamte Einrichtung auf 4°C gekühlt, um den Amplifikationsschritt durchzuführen. Diese Reaktion ist eine universelle Reaktion, die es möglich macht, eine gleichmäßige Amplifikationswirksamkeit zwischen den Chip sicherzustellen, indem die Amplifikationsreaktion unter den universellen Bedingungen für alle Chips durchgeführt wird. Zum Beispiel wird ein PCR-Reinigungskit (QIAGEN Inc.) für die Reinigung verwendet, um die Amplifikationsproduktlösung zu sammeln, die sich in der Lösung angesammelt hat, und die übrigen, in der Lösung enthaltenen Reagenzien, wie beispielsweise freie universelle Primersequenzen für die Amplifikation (vorwärts/rückwärts) und Enzyme zu entfernen.
  • Bei dem erhaltenen Amplifikationsprodukt 615 handelt es sich um eine Sequenz, für die eine Sequenzanalyse möglich ist und die als Sequenzierungsbibliothek bezeichnet wird. Selbst wenn eine Amplifikationsneigung zwischen den Genen oder Molekülen in diesem Schritt auftritt, kann die Amplifikationsneigung unter Verwendung des Zellerkennungs-Tags nach dem Erwerben der Sequenzierungsdaten korrigiert werden, so dass hochgenaue Quantifizierungsdaten erhalten werden können. Die Genexpressionsniveaus für die Zellidentifizierungssequenzen und die Chipidentifizierungssequenzen können erhalten werden, indem eine Sequenzanalyse dieser Sequenzierungsbibliothek durchgeführt wird. Und zwar ist die gleichzeitige Analyse im Hinblick auf eine Anzahl von Zellen, die geringer oder gleich der Anzahl der Arten von Zellidentifikationssequenzen ist, die gleichzeitig in die Einrichtung eingeführt werden, multipliziert mit der Art der Chipidentifizierungssequenzen, möglich. Die Analyse der Anzahl von Zellen, die signifikant höher ist als die Anzahl der Zellidentifizierungssequenzen, die vorher in den zweidimensionalen Array-Chip eingeführt werden, ist dadurch möglich.
  • Es ist zu beachten, dass die vorliegenden Erfinder bereits eine internationale Patentanmeldung für ein Zellanalyseverfahren eingereicht haben, das die gleichzeitige Durchführung der genetischen Analyse einer einzelnen Zelle und die umfassende genetische Analyse einer Zellpopulation, die die Zelle enthält, ermöglicht ( PCT/JP2014/073753 , eingereicht am 9. September 2014). Der in der Beschreibung, den Ansprüchen und Zeichnungen der Anmeldung beschriebene Inhalt wird hier durch Bezugnahme, aufgenommen und zwar so wie er ist.
  • (Beispiel 1-3) Anwendungsverfahren einer abstoßenden Kraft, bei der es sich nicht um die Schwerkraft handelt (Oberflächenbehandlung)
  • Der zweidimensionale Array-Chip kann mittels eines PDMS-Kunststoffs hergestellt werden. Die Oberfläche des zweidimensionalen Array-Chips (Substrat), der aus einem PDMS-Kunststoff hergestellt wurde, wird vor dem Injizieren der Kügelchen, die den Nukleinsäureeinfangteil bilden, überzogen. Daher wirkt eine abstoßende Kraft auf die Zellen in einer Richtung, die die Zellen vom zweidimensionalen Array-Chip (Substrat) in der Umgebung der zweidimensionalen Array-Chip-Oberfläche trennt, und es ist möglich, die Adsorption der Zellen an der Chipoberfläche zu verhindern. Im vorliegenden Beispiel kann durch Überziehen eines MPC (2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin)polymers (Lipidure (eingetragene Marke) CM5206, hergestellt von NOF Corporation), die Absorptionsrate der Zellen auf 1/10 oder weniger verringert werden. Als Überzugsverfahren wurde eine 0,5 gewichtsprozentige Ethanollösung hergestellt, 2 µl pro Chip wurde auf eine PDMS-Kunststoffmembran getropft, der Chip wurde mit der Lösung bedeckt, für 5 Minuten stehen gelassen und der Chip wurde gesammelt. Der Aufbau der Einrichtung ist der gleiche wie in 5, und die Zellen wurden kaum adsorbiert und 95 % oder mehr der Zellen wurden in allen Chips gesammelt. Anders als das MPC-Polymer kann ein Überzugsmittel auf Basis von PEG (Polyethylenglycol) (Blockmaster, hergestellt von JSR Life Sciences Corporation) und dergleichen als Überzugsmittel verwendet werden, und es kann jedes Überzugsmittel verwendet werden.
  • (Beispiel 1-4) Anwendungsverfahren von abstoßenden Kräften, bei denen es sich nicht um die Schwerkraft handelt (Konfiguration unter Verwendung der Dielektrophorese)
  • 7 zeigt die Konfiguration mittels Dielektrophorese, um eine abstoßende Kraft auf die Zellen auszuüben, so dass die Adsorption der Zellen auf den zweidimensionalen Array-Chip verringert wird. Die Unterschiede von der grundlegenden Konfiguration, die in 5 gezeigt ist, bestehen darin, dass eine Elektrode für die Dielektrophorese vertikal angeordnet wird, dass die Kügelchen des Nukleinsäureeinfangteils durch metallische Gold-Mikropartikel anstatt Magnetkügelchen konfiguriert werden und dass eine hochfrequente Stromzufuhr erfolgt.
  • Die Elektrodenkonfiguration zum Verhindern der Adsorption von Zellen ist wie folgt. Eine obere Elektrode 729 befindet sich in einem oberen Strömungskanal 726 und ist ein flaches Substrat, das aus Platin hergestellt ist. Eine 1,1 mm quadratische Elektrode, die sich direkt über dem zweidimensionalen Array-Chip befindet und ungefähr die gleiche Größe wie der zweidimensionale Array-Chip hat, ist in derselben Anzahl wie die Anzahl der Chips in Reihe geschaltet. Weiter wird die Dicke der Elektrode auf 0,1 mm eingestellt. Da die angelegte Spannung im Verwendungsverfahren des vorliegenden Beispiels gering ist, ist die Möglichkeit einer Korrosion gering und kann das Material ein Metall sein, bei dem es sich nicht um Platin handelt. Weiter befindet sich in einer unteren Elektrode 730 ein Draht mit einem Durchmesser von 0,1 mm in einer Gitterform und ein Elektrodenaufbau wird durch Ultraschallschweißen geformt. Weiterhin ist, wie in 7(a) gezeigt ist, der Draht so angeordnet, dass er zwischen den Zelleinfangteilen positioniert ist. Außerdem wird das Nukleinsäureeinfangteil 731 mit Gold-Mikropartikeln mit einem Durchmesser von 400 nm gepackt und es verwendet eine Thiolgruppe auf der Oberfläche, um die DNA-Sonde zu immobilisieren. Durch das Herstellen des Nukleinsäureeinfangteils aus Gold-Mikropartikeln (Goldkolloid) wirkt eine Ansaugkraft in Richtung auf das Zelleinfangteil durch dielektrische Kopplung. Es ist zu beachten, dass die Wechselspannung, die an beide Elektroden von einer hochfrequenten Stromzufuhr 732 angelegt wird, eine Sinuswelle von 10 Vpp mit mehreren kHz ist und eine Frequenz hat, die niedriger als die Frequenz ist, die sich von einer dielektrischen Anziehungskraft zu einer dielektrischen abstoßenden Kraft umdreht. Es versteht sich von selbst, dass die Frequenz höher als mehrere MHz sein kann (die Frequenz ist unterschiedlich abhängig von der Größe der Zellen und der Dielektrizitätskonstante), um die dielektrische Kraft als eine abstoßende Kraft zu erhalten und antagonistisch mit der Ansaugkraft zu verwenden.
  • Beispiel 2
  • 8 ist eine Figur, die einen Überblick über die Konfiguration der Einrichtung gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung zeigt; (a) zeigt eine Ansicht von oben und (b) zeigt die Konfiguration zur Zeit der Zelllösungsansaugung in einer Querschnittsansicht am 8A-8A' Querschnitt. Weiter zeigt die 8(c) eine Querschnittsansicht, wenn das dreidimensionale poröse Element und der zweidimensionale Array-Chip während der Amplifikationsreaktion getrennt werden. Die Einrichtung des vorliegenden Beispiels ist eine Konfiguration, die die Schwerkraft und die Ansaugkraft nicht in der entgegengesetzten Richtung wie im Beispiel 1 anordnet (kann in die entgegengesetzte Richtung gesetzt werden), die Ansaugkraft durch die Verwendung des dreidimensionalen porösen Elements erhöht und den Einfluss des Absetzens aufgrund der Schwerkraft auf ein Minimum reduziert. Es wird nun der Einrichtungsaufbau und das Arbeitsverfahren beschrieben, die mit einem Mittel zum Trennen des dreidimensionalen porösen Elements vom zweidimensionalen Array-Chip vorgesehen sind, um die Adsorption des Amplifikationsprodukts in das Innere des dreidimensionalen porösen Elements zu verhindern, das sich in einem Lösungsaufnahmeteil 819 befindet, was das zu lösende Problem ist, wobei der Fokus auf den Unterscheidungspunkten des Beispiels 1 liegt.
  • 8(b) ist eine Querschnittsansicht der Einrichtung, während das Einfangen der Zellen durchgeführt wird. Der zweidimensionale Array-Chip 813 besteht aus einem PDMS-Kunststoff mit Elastizität und verwendet eine poröse Membran, die aus einem Kunststoff mit einer Porengröße von 0,8 µm (Isopore-Membran, hergestellt von Millipore Corporation) als Membran verwendet wird, um ein Ausströmen 818 von Kügelchen zum Verhindern des Ausströmens der Kügelchen zu verhindern, die ein Nukleinsäureeinfangteil 810 bilden.
  • Die Einrichtung 800 weist eine Mehrzahl von Reaktionskammern 824 auf, die jeweils einen zweidimensionalen Array-Chip 813 umfassen, der sich darauf befindet, wobei der zweidimensionale Array-Chip 813 eine Mehrzahl von Zelleinfangteilen 803 und Nukleinsäureeinfangteilen 810 in Übereinstimmung mit den jeweiligen Zelleinfangteilen 803 hat. Eine Zelllösung wird durch einen gemeinsamen Strömungskanal 825 von einem Zelleinführungsanschluss 811 zu einem Probensammelanschluss 812 strömen gelassen und dann dem zweidimensionalen Array-Chip 813 zugeführt. Der Chip wird so mit der Zelllösung gefüllt. Separate Einlässe 827 werden verwendet, wenn separate Reagenzien in die Chips eingeführt werden sollen, insbesondere zum Beispiel wenn ein Reagens, das einen Primer mit einer Tag-Sequenz zum Identifizieren eines Chips und dergleichen enthält, eingeführt wird.
  • Ein poröses mit Shirasu gesintertes Element (Shirasu-poröses Glas: SPG-Membran, hergestellt von SPG Technology Co., Ltd), das ein dreidimensionales poröses Element ist, befindet sich in einem unteren Strömungskanal 837 des Nukleinsäureeinfangteils 810 und ist als Lösungsaufnahmeteil 819 ausgebildet. Durch die Verwendung dieses dreidimensionalen porösen Elements ist ein Ansaugen mit hoher Geschwindigkeit möglich, und der Einfluss des Absetzens aufgrund der Schwerkraft kann ausgeschaltet werden. Der untere Strömungskanal 837 ist mit einem unteren Auslass 838 und einem Zufuhranschluss 835 verbunden, der die Luft einlässt und mit einem Druckeinstellfilter 836 (im vorliegenden Beispiel wird die poröse Membran aus Kunststoff (Isopore-Membran, hergestellt von Millipore Corporation) mit einem Porendurchmesser von 0,1 µm in Anbetracht des Unterschieds hinsichtlich der Viskosität zwischen Wasser und Luft verwendet) und einem Luftventil 834 in der Umgebung der Zufuhranschluss 835 ausgestattet. Wenn die Zelle im Zelleinfangteil 803 eingefangen wird, wird der zweidimensionale Array-Chip 813 mit der Zelllösung gefüllt, und dann wird ein Unterdruck durch die Spritzenpumpe angelegt, die mit dem unteren Auslass 838 verbunden ist, wobei das Luftventil 834 offen ist. Eine andere Pumpe, wie beispielsweise eine Membranpumpe, kann anstelle der Spritzenpumpe verwendet werden.
  • Der zweidimensionale Array-Chip wird gebogen, indem ein Unterdruck an den unteren Auslass 838 angelegt wird, und die Membran zum Verhindern des Ausströmens 818 der Kügelchen und das dreidimensionale poröse Element 819 befinden sich in engem Kontakt miteinander. Daher kann der Kapillareffekt des dreidimensionalen porösen Elements verwendet werden, um die Zelllösung mit hoher Geschwindigkeit anzusaugen.
  • Ein Hochgeschwindigkeits-Ansaugverfahren, das den Kapillareffekt verwendet, wird nachstehend beschrieben. In der in 8 gezeigten Einrichtung kann, wenn die Druckverhältnisse in Position A (dem oberen Teil des zweidimensionalen Array-Chips 813), Position B (dem unteren Strömungskanal 837 zwischen dem Lösungsaufnahmeteil 819 und dem Druckeinstellfilter 836), Position C (zwischen dem zweidimensionalen Array-Chip 813 und dem Lösungsaufnahmeteil 819) und Position D (dem unteren Strömungskanal 837, der näher am unteren Auslass 838 als das Lösungsaufnahmeteil 819 ist), wie in der Figur gezeigt, so eingestellt werden, dass sie die Größenbeziehung A>>B>C>D erfüllen, das Nukleinsäureufnahmeteil 810 mit der Lösung gefüllt werden, und weiterhin kann die Lösung mit dem Lösungsaufnahmeteil 819 in Kontakt kommen und das Kapillarphänomen wird im dreidimensionalen porösen Element erzeugt, das das Lösungsaufnahmeteil 819 bildet, um eine große Ansaugkraft zu erzeugen. In dem Fall, in dem die Porengröße des dreidimensionalen porösen Elements beispielsweise 10 µm ist, kann berechnet werden, dass die Ansaugkraft aufgrund dieses Kapillarphänomens eine Ansaugkraft von etwa 100 kPa im Zelleinfangteil 803 (es wird von einer kreisförmigen Form mit einem Durchesser von 5 µm ausgegangen) in der Konfiguration des vorliegenden Beispiels erzeugt. Daher können die Zellen weitgehend ohne einen Einfluss auf das Absetzen aufgrund der Schwerkraft angesaugt werden.
  • Die Luft, die vom Zufuhranschluss 835 zugeführt wird, strömt durch das Lösungsaufnahmeteil 819 aufgrund der Druckdifferenz zwischen der Position B, der Position C und der Position D, und eine wässrige Lösung, die mittels des Lösungsaufnahmeteils 819 absorbiert wird, wird dadurch zur Position D abgeleitet. Die Ansaugkraft aufgrund des Kapillarphänomens des Lösungsaufnahmeteils 819 wird durch diese Ableitung wiedergewonnen, so dass solange das Ansaugen vom unteren Auslass 838 andauert, die Ansaugkraft des Lösungsaufnahmeteils 819 aufrechterhalten wird. Wenn einerseits das Ansaugen vom unteren Auslass 838 gestoppt wird, wird die Innenwand der Pore des dreidimensionalen porösen Elements, das das Lösungsaufnahmeteil 819 bildet, schnell mit der wässrigen Lösung gefüllt, und die Ansaugkraft kann verloren gehen.
  • Als Nächstes wird das Trennverfahren des dreidimensionalen porösen Elements vom zweidimensionalen Array-Chip beschrieben. Nach dem Füllen der Reaktionskammer 824 mit dem Reagens für die Amplifikationsreaktion (PCR-Reaktion) auf dieselbe Weise wie im Beispiel 1 wird das Amplifikationsreagens (PCR-Reagens) in das Nukleinsäureeinfangteil eingeführt, indem ein Unterdruck an den unteren Auslass 838 angelegt wird. Dann wird die Spritze 833 betätigt, und das Mineralöl, das sich im „Speichertank“ 823 gesammelt hat, wird langsam für ungefähr 10 Sekunden zwischen die Membran zum Verhindern eines Ausströmens 818 der Kügelchen und das dreidimensionale poröse Element injiziert. Zu dieser Zeit, wenn das dreidimensionale poröse Element stark hydrophil ist, gelangt das meiste Mineralöl, bei dem es sich um ein unpolares Lösungsmittel handelt, nicht in das poröse Element. Auf diese Weise, wie in 8(c) gezeigt, kann die Amplifikationsreagens- (PCR-Reagens-) Lösung, die im dreidimensionalen porösen Element geblieben ist, vom Amplifikationsreagens (PCR-Reagens) im Nukleinsäureeinfangteil im zweidimensionalen Array-Chip getrennt werden. Wenn Luft anstelle von Mineralöl verwendet wird, gelangt die Luft in das dreidimensionale poröse Element, und die Amplifikationsreagens- (PCR-Reagens-) Lösung kann vom zweidimensionalen Array-Chip auf dieselbe Weise getrennt werden.
  • (Beispiel 2-2) Trennung aufgrund des Bewegungsmechanismus des dreidimensionalen porösen Elements
  • Im Beispiel 2-1 wird ein unpolares Lösungsmittel oder Öl zum Trennen injiziert; allerdings ist es im vorliegenden Beispiel auch möglich, die Lösung zu trennen, indem der Abstand zwischen dem dreidimensionalen porösen Element und dem zweidimensionalen Array-Chip mit einer geeigneten Zeitwahl erfolgt. Insbesondere kann ein Bewegungsmechanismus direkt unter das dreidimensionale poröse Element eingeführt werden. Das vorliegende Beispiel zeigt ein Beispiel, das einen Luftdruck verwendet; allerdings kann auch ein Bewegungsmechanismus, wie beispielsweise ein Servomechanismus, verwendet werden.
  • Die Konfiguration zum Trennen des zweidimensionalen Array-Chips vom dreidimensionalen porösen Element durch den Luftdruck ist in 9 gezeigt. 939 ist ein Luftbeutel aus Polyethylen-Kunststoff. Der Luftbeutel hat eine Größe von ungefähr 1 × 1 mm, ähnlich dem zweidimensionalen Array-Chip, und ist so gestaltet, dass die Dicke des Luftbeutels sich auf etwa 0,1 bis 0,3 mm durch Injizieren von Luft in den Luftbeutel unter Verwendung einer Pumpe, wie beispielsweise einer Spritze 940, ändert. Wenn die Spritze 940 betätigt wird, um Luft zu injizieren, befinden sich der zweidimensionale Array-Chip und das dreidimensionale poröse Element miteinander in engem Kontakt, und das Ansaugen der Lösung aufgrund des Kapillareffekts wird möglich. Das dreidimensionale poröse Element wird vom zweidimensionalen Array-Chip unter Ausnutzung der Tatsache getrennt, dass der Innendruck des Luftbeutels 939 sinkt und seine Dicke durch das Ziehen der Spritze 940 abnimmt.
  • Es kann möglich sein, die Adsorption des Amplifikationsprodukts an die Innenwand des dreidimensionalen porösen Elements zu verhindern, indem der Innendruck des Luftbeutels vor der Einführung des Amplifikationsreagens (PCR-Reagens) zunimmt und indem der Innendruck des Luftbeutels nach dem Beginn der Amplifikationsreaktion (zum Beispiel ein PCR-Zyklus) abnimmt.
  • Weiter kann es auch möglich sein, die Adsorption des Amplifikationsprodukts an das dreidimensionale poröse Element zu verhindern, ohne die Trennung mit einem bewegenden Teil durchzuführen. Eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Porengröße von ungefähr 5 nm kann als Membran zum Verhindern eines Ausströmens 918 der Kügelchen anstelle von ISOPORE mit einer Porengröße von 0,8 µm verwendet werden. In diesem Fall bleiben der zweidimensionale Array-Chip und das dreidimensionale poröse Element während aller Schritte in engem Kontakt miteinander; allerdings wird das Anlegen eines Unterdrucks zur Zeit der Amplifikationsreaktion ausgesetzt. Daher ist die Geschwindigkeit, mit der das Amplifikationsprodukt durch die Ultrafiltrationsmembran hindurchströmt, stark reduziert. Es ist dadurch möglich, die Adsorption des Amplifikationsprodukts an das dreidimensionale poröse Element zu verhindern.
  • Beispiel 3
  • Das vorliegende Beispiel beschreibt den Vorrichtungsaufbau, der ein Fluoreszenzmikroskop zur Beobachtung der eingefangenen Zellen mit dem Einrichtungsaufbau von Beispiel 1 kombiniert.
  • Eine Ansicht des Aufbaus ist in 10 gezeigt. Die Konfiguration einer Einrichtung 1001 beruht auf der grundlegenden Konfiguration des Beispiels 1. Es ist zu beachten, dass die Konfiguration der Einrichtung 1001 die dreidimensionalen porösen Elemente 319, 819 und 919 für ein Hochgeschwindigkeitsansaugen aufweist. Und zwar wird die Schwerkraftrichtung 217 in die Richtung eingestellt, die entgegengesetzt zur Zellansaugrichtung 216 verläuft. Der zweidimensionale Array-Chip 513 zeigt in der Figur den Zustand während des Ansaugens der Zelllösung und befindet sich in engem Kontakt mit den dreidimensionalen porösen Elementen 319, 819 und 919. 501 ist eine eingefangene Zelle.
  • Weiter wird eine Membranpumpe 1002 zur Anlegung des Unterdrucks verwendet. Die im Puffer in einem Rohr 1003 suspendierten Zellen für die Zelllösung werden in die Reaktionskammer durch den Zelleinführungsanschluss 511 durch Ansaugen mit einer Spritze 1004 eingeführt. Die überschüssige Zelllösung und das Reagens werden in ein Rohr 1006 für unbrauchbare Flüssigkeit durch den Probenableitanschluss 512 und einen Dreiwegehahn 1005 abgeleitet. Die Membranpumpe 1002 wird in einem Zustand betrieben, in dem die Zelllösung in die Reaktionskammer eingeführt wird, um die Zellen einzufangen. Um den Zustand zu dieser Zeit mit dem Fluoreszenzmikroskop zu beobachten, werden eine Objektivlinse 1007, eine Laserlichtquelle 1008 mit einer Anregungswellenlänge, die für ein Fluorophor geeignet ist, das die Zellen gefärbt hat, ein dichroitischer Spiegel 1009 zum Trennen des Anregungslichts und der Fluoreszenz aus den Zellen und eine CCD-Kamera 1010 als Bildkamera vorgesehen, wie in 10 gezeigt. 1011 ist eine XYZ-Bühne für die Fokuseinstellung und Änderung der Bildregion. Wenn Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden, ist es notwendig, die Zellen einer Fluoreszenzfärbung zu unterziehen. Hier wird ein Färbeverfahren zum Färben der Zellmembran verwendet. Um das Fluoreszenzbild über das Mikroskopbeobachtungsfenster 1012 auf der Einrichtung 1001 zu erhalten, verwendet das Material der Einrichtung mit dem Fenster Acryl (PMMA). Es versteht sich von selbst, dass es auch möglich ist, andere transparente Kunststoffmaterialien (Polycarbonat, Cycloolefin und dergleichen) zu verwenden.
  • Alle hier angegebenen Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden hier durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
  • Beschreibung der Bezugszeichen
    • 101, 201, 301
    Zelle
    102
    poröse Membran
    103, 203, 303
    Zelleinfangteil
    104, 204, 304
    oberer Bereich
    105
    unterer Bereich
    106
    Einlass
    107, 207, 307
    oberer Auslass
    108
    unterer Auslass
    109
    Zelle
    210, 310
    Nukleinsäureeinfangteil
    211, 311
    Zelleinführungsanschluss
    212, 312
    Probensammelanschluss
    213, 313
    zweidimensionaler Array-Chip
    214, 314
    unterer Bereich zur Aufnahme der Zelllösung vor dem Ansaugen
    215, 315
    oberer Bereich
    216
    Zettansaug- (Kraft-) Richtung
    217
    Richtung der Schwerkraft
    318
    Membran zum Verhindern des Ausströmens von Kügelchen (hydrophile poröse Membran)
    319
    Lösungsaufnahmeteil (dreidimensionales poröses Element)
    320
    Druckeinstellelement
    321
    Zufuhranschluss
    322
    Luftstrom
    323
    Speichertank
    333
    Spritze
    500, 700, 800, 900
    Einrichtung
    501, 701, 801, 901
    Zelle
    503, 703, 803, 903
    Zelleinfangteil
    507, 707
    unterer Auslass
    510, 810, 910
    Nukleinsäureeinfangteil
    511, 711, 811, 911
    Zelleinführungsanschluss (oberer Einlass)
    512, 712, 812, 912
    Probensammelanschluss (oberer Auslass)
    513, 713, 813, 913
    zweidimensionaler Array-Chip
    518, 718, 818
    Membran zum Verhindern des Ausströmens von Kügelchen
    524, 724, 824, 924
    Reaktionskammer
    525, 725, 825, 925
    gemeinsamer Strömungskanal
    526, 726, 826, 926
    oberer Strömungskanal
    527, 727, 827, 927
    separater Einlass
    528, 728, 828, 928
    Bereich zwischen Reaktionskammern
    601
    erste DNA-Sonde
    602
    Zellerkennungssequenzen
    604
    universeller Primer
    606
    Nukleinsäure (mRNA)
    607
    erster Strang
    608
    zweite DNA-Sonde
    609
    universelle Sequenz zur Amplifikation (revers)
    610
    Chipidentifikations-Tag
    611
    genspezifische Sequenz
    612
    zweiter Strang
    613
    universeller Primer
    614
    universelle Sequenz zur Amplifikation (vorwärts)
    615
    Amplifikationsprodukt
    729
    obere Elektrode
    730
    untere Elektrode
    731
    Gold-Mikropartikel Nukleinsäureeinfangteil
    732
    Hochfrequenz-Stromzufuhr
    819, 919
    Lösungsaufnahmeteil (dreidimensionales poröses Element)
    823
    Speichertank
    833
    Spritze
    834, 934
    Luftventil
    835, 935
    Zufuhranschluss
    836, 936
    Druckeinstellfilter
    837, 937
    unterer Strömungskanal
    838, 938
    unterer Auslass
    939
    Luftbeutel
    940
    Spritze
    1001
    Einrichtung (Gehäuse)
    1002
    Membranpumpe
    1003
    Rohr für die Zelllösung
    1004
    Spritze
    1005
    Dreiwegehahn
    1006
    Rohr für die Abfalllösung
    1007
    objektive Linse
    1008
    Laserlichtquelle
    1009
    dichroitischer Spiegel
    1010
    CCD-Kamera
    1011
    XYZ-Bühne
    1012
    Mikroskopbeobachtungsfenster

Claims (15)

  1. Zellanalyseeinrichtung umfassend: einen Lösungseinführungskanal zum Einführen einer Zellen enthaltenden Lösung; ein Substrat mit einer Mehrzahl von Sätzen aus einem Zelleinfangteil und einem Nukleinsäureeinfangteil, wobei das Zelleinfangteil mit dem Lösungseinführungskanal in Kontakt ist und eine Konkavität aufweist, die in der Lage ist, eine einzelne Zelle einzufangen, und das Nukleinsäureeinfangteil in entsprechender Weise im Hinblick auf die Konkavität des Zelleinfangteils vorgesehen ist und eine Nukleinsäure einfängt, die aus der mittels des Zelleinfangteils eingefangenen Zelle extrahiert wurde; einen Ableitkanal, der benachbart dem Nukleinsäureeinfangteil des Substrats vorgesehen ist und eine Lösung des Nukleinsäureeinfangteils ableitet; und ein Drucksteuermittel, das in dem Ableitkanal vorgesehen ist, wobei das Substrat eine abstoßende Kraft in einer Richtung aufweist, die die Zellen vom Substrat trennt, und das Drucksteuermittel eine Steuerung derart vornimmt, dass, wenn die Zelle vom Zelleinfangteil eingefangen wird, eine Kraft in der Richtung vom Zelleinfangteil zum Nukleinsäureeinfangteil als erster Druck dient, der höher als die abstoßende Kraft ist.
  2. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 1, wobei das Drucksteuermittel eine Steuerung derart vornimmt, dass, wenn die Nukleinsäurereaktion im Nukleinsäureeinfangteil durchgeführt wird, die Kraft in der Richtung vom Zelleinfangteil zum Nukleinsäureeinfangteil größer als die Schwerkraft und kleiner als der erste Druck ist.
  3. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 1, wobei ein Bereich, der sich auf dem Substrat befindet, bei dem es sich nicht um die Konkavität handelt und der mit der die Zellen enthaltenden Lösung in Kontakt ist, ein Bereich ist, der eine abstoßende Kraft auf die Zellen ausübt.
  4. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 1, wobei die abstoßende Kraft eine abstoßende Kraft ist, die dadurch bewirkt wird, dass das Substrat derart angeordnet wird, dass das Zelleinfangteil die Zelle in der Richtung entgegengesetzt zur Schwerkraft einfängt.
  5. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 1, wobei die abstoßende Kraft eine abstoßende Kraft ist, die dadurch bewirkt wird, dass die Oberfläche des Substrats einer Behandlung unterzogen wurde, die die Adsorption von Zellen verhindert.
  6. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 1, weiter umfassend ein Elektrodenpaar, das so vorgesehen ist, dass das Substrat dazwischen eingelegt wird, wobei das Nukleinsäureeinfangteil Mikropartikel aus Metall umfasst und die abstoßende Kraft eine abstoßende Kraft ist, die hervorgerufen wird durch eine Spannung, die an das Elektrodenpaar angelegt wird, und eine dielektrische Kopplung durch die Mikropartikel aus Metall.
  7. Zellanalyseeinrichtung, umfassend: einen Lösungseinführungskanal zum Einführen einer Zellen enthaltenden Lösung, einen zweidimensionalen Array-Chip mit einer Mehrzahl von Zelleinfangteilen und Nukleinsäureeinfangteilen, wobei die Zelleinfangteile benachbart dem Lösungseinführungskanal vorgesehen und jeweils in der Lage sind, eine einzelne Zelle einzufangen, und wobei jedes der vorgesehenen Nukleinsäureeinfangteile mit jedem Zelleinfangteil aus der Mehrzahl der Zelleinfangteile übereinstimmt und eine Nukleinsäure einfängt, die aus der Zelle extrahiert wird, die vom Zelleinfangteil eingefangen wurde, einen Ableitkanal mit einem dreidimensionalen porösen Element, das eine Lösung absorbiert, die im Nukleinsäureeinfangteil zurückgehalten wird, und zum Ableiten der Lösung dient, und ein Trennsteuerteil zum Steuern der Trennung zwischen dem Nukleinsäureeinfangteil und dem Ableitkanal, wobei das Trennsteuerteil eine Trennsteuerung so durchführt, dass, nachdem die Nukleinsäure vom Nukleinsäureeinfangteil eingefangen wurde, ein Produkt, das aus der eingefangenen Nukleinsäure amplifiziert wird, nicht in den Ableitkanal eingeleitet wird.
  8. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 7, wobei das Trennsteuerteil ein Ansaugdruckanwendungsmittel ist, das im Ableitkanal vorgesehen ist.
  9. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 7, wobei eine Ultrafiltrationsmembran oder eine Gelmembran zum Verhindern des Durchlassens von Molekülen mit der Molekülgröße des amplifizierten Produkts zwischen dem zweidimensionalen Array-Chip und dem dreidimensionalen porösen Körper angeordnet ist.
  10. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 7, wobei das Trennsteuerteil ein Mittel zum Einführen eines Trennlösungsmittels oder von Luft zwischen das Nukleinsäureeinfangteil und den Ableitkanal ist.
  11. Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 1 oder 7, wobei das Nukleinsäureeinfangteil eine Nukleinsäuresonde zum Einfangen einer Nukleinsäure umfasst, und die Nukleinsäuresonde eine Nukleinsäureeinfangsequenz, die mit der aus der Zelle extrahierten Nukleinsäure hybridisiert, und eine Zellerkennungssequenz umfasst, die sich entsprechend dem jeweiligen Zelleinfangteil unterscheidet.
  12. Zellanalyseverfahren, das die Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 1 verwendet, umfassend die folgenden Schritte: Füllen des Substrats mit einer Zellen enthaltenden Lösung; und Anlegen eines Unterdrucks an das Zelleinfangteil, Ansaugen der Lösung, die die Zellen enthält, in Richtung des Substrats und Einfangen einer einzelnen Zelle auf dem Zelleinfangteil.
  13. Zellanalyseverfahren nach Anspruch 12, weiter umfassend die Schritte des Aufreißens der einzelnen Zelle, die auf dem Zelleinfangteil eingefangen wurde, in einem Zustand, in dem ein Unterdruck an das Zelleinfangteil angelegt wird, und Einfangen der aus der Zelle extrahierten Nukleinsäure mittels des Nukleinsäureeinfangteils.
  14. Analyseverfahren nach Anspruch 13, weiter umfassend einen Schritt des Zuführens zum Nukleinsäureeinfangteil einer zweiten Nukleinsäuresonde, die eine Sequenz hat, die mit der vom Nukleinsäureeinfangteil eingefangenen Nukleinsäure hybridisiert, und eines Enzyms und eines Substrats für die komplementäre Strangsynthese, die die eingefangene Nukleinsäure als Matrize verwendet, um eine komplementäre Strangsynthese durchzuführen.
  15. Zellanalyseverfahren unter Verwendung der Zellanalyseeinrichtung nach Anspruch 7, umfassend die folgenden Schritte: Füllen einer Lösung, die Zellen enthält, auf den zweidimensionalen Array-Chip; und Anlegen eines Unterdrucks an das Zelleinfangteil, Ansaugen der die Zellen enthaltenden Lösung vom Ableitkanal, der mit dem dreidimensionalen porösen Element ausgestattet ist, und Einführen eines Reagens für die Nukleinsäureamplifikation in das Nukleinsäureeinfangteil durch Ansaugen in der gleichen Weise wie die die Zellen enthaltende Lösung und dann Trennen des Nukleinsärueeinfangteils oder des zweidimensionalen Array-Chips vom dreidimensionalen porösen Element bis vor den Beginn der Amplifikationsreaktion oder nach dem Beginn und bis vor dem Ende der Amplifikationsreaktion.
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