DE60010058T2

DE60010058T2 - Biochemische reinigungsgeräte mit immobilisierten fangsonden und ihre anwendungen

Info

Publication number: DE60010058T2
Application number: DE60010058T
Authority: DE
Inventors: P. Christopher ADAMS; Christian T. BOLES; Lawrence Weir; K. Rahul DHANDA; J. Stephen KRON
Original assignee: Exact Sciences Corp
Current assignee: Exact Sciences Corp
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-25
Publication date: 2005-04-28
Anticipated expiration: 2020-02-26
Also published as: WO2000050870A1; US20020119480A1; EP1157264A1; ATE265040T1; WO2000050870A9; JP2002537781A; US20060088867A1; EP1157264B1; DE60010058D1; AU772213C; ES2221841T3; AU772213B2; DK1157264T3; AU3706300A; CA2369083A1

Description

GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG
Es besteht oftmals ein Bedarf an hoch gereinigter DNA in der molekularbiologischen Forschung und Anwendungen, zum Beispiel bei der DNA-Sequenzierung. Gegenwärtige Protokolle für die DNA-Sequenzierung erfordern eine wesentliche Reinigung der DNA vor der automatisierten Analyse. Typischerweise ist die DNA einem Replikationsprotokoll unter Einsatz eines Replikationsvektors, zum Beispiel eines M13 Phagen-Vektorsystems, wie auch von DNA-Polymerase, Desoxynukleotiden, Primern, Salzen und weiteren Replikationskomponenten unterzogen. Die Extensionsprodukte, die während dieses Replikationsschrittes gebildet werden, erfordern eine weitere Verarbeitung, um ein relativ gereinigtes Präparat zu erhalten, das nur die Replikationsprodukte selbst enthält. Eine häufig zur Reinigung der DNA-Extensionsprodukte angewandte Methodologie ist die Ethanolfällung. Die Ethanolfällung ist zur Entfernung von nicht eingebauten Nukleotiden und Salz aus dem Präparat, das die Extensionsprodukte enthält, relativ effektiv. Es ist ebenfalls erwünscht, jegliche Template-DNA und überschüssige Primer aus dem Präparat vor der Sequenzanalyse zu entfernen, die mit den Extensionsprodukten durchzuführen ist. Allerdings ist die Fällung zeitraubend und erfordert eine große Sorgfalt, um konsistente Produktausbeuten zu erreichen.
Es besteht ein Bedarf an einer Vorrichtung, die die Zeitfaktoren minimiert und eine Plattform bereitstellt, die hoch reproduzierbare Ergebnisse garantieren würde. Zusätzlich wäre es von Vorteil, eine Reinigungsvorrichtung zu besitzen, die die Produkte von mehrfach präparativen Sequenzierungsreaktionen sortieren könnten. Zusätzlich wäre es von Vorteil, eine Reinigungsvorrichtung zu besitzen, die die Produkte von mehrfach präparativen Sequenzierungsprodukten sortieren könnte.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen, umfassend mindestens eine Reinigungseinheit gemäß Anspruch 1, die zur Reinigung und/oder Konzentrierung eines in einer Untersuchungsprobe enthaltenen Target-Moleküls verwendet ist, und ein Verfahren gemäß Anspruch B. Typischerweise ist das Target-Molekül in einer Untersuchungsprobe eine Nukleinsäure. Diese gereinigten Nukleinsäuren können auf verschiedene Weisen verwendet sein, einschließlich einer Nukleotidsequenzanalyse unterzogen sein. Verfahren zur Anwendung der Vorrichtung und Kits, die die Vorrichtung enthalten, können ebenfalls bereitgestellt sein.
Die Reinigungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung enthält mindestens eine Reinigungseinheit. Alternativ kann die Vorrichtung mehrere Reinigungseinheiten enthalten, z.B. eine Mehreinheiten-Vorrichtung sein. Jede Reinigungseinheit umfasst eine Zone, die eine ein Target-Molekül umfassende Untersuchungsprobe aufnimmt, und eine zweite Zone zur Reinigung und/oder Konzentrierung des Target-Moleküls, falls dieses in der Untersuchungsprobe vorhanden ist. Typischerweise umfasst jede Reinigungseinheit drei Komponenten, die diskrete oder halbdiskrete Zonen der Reinigungseinheit sein können. Die Zonen können auch als Kammern bezeichnet sein. Typischerweise wandert die Untersuchungsprobe von der ersten Zone zu der zweiten Zone und dann zu der dritten Zone. Die erste Zone nimmt eine Untersuchungsprobe auf, die das Target-Molekül zusammen mit Nichttarget-Komponenten wie zum Beispiel kontaminierende Proteine oder Puffersalze umfasst. Die erste Zone ist als Aufnahmegefäß bezeichnet. Die Untersuchungsprobe wird in das Aufnahmegefäß eingeführt. Die zweite Zone wird zur Reinigung und/oder Konzentrierung des Target-Moleküls von den anderen in der Untersuchungsprobe enthaltenen kontaminierenden Molekülen eingesetzt. Spezifisch umfasst diese Trennzone eine Elektrophorese-Matrix zum Beispiel ein Polyacrylamid-Gel, das eine oder mehrere Arten oder Klassen an immobilisierten Fangsonden im Elektrophore-Medium besitzt. Die immobilisierte Fangsonde hybridisiert spezifisch mit dem Target-Molekül. Folglich wird das Target-Molekül in der Matrix in der Trennzone der Vorrichtung zurückgehalten, während Nichttarget-Komponenten zum Beispiel kontaminierende Komponenten der Probe die Trennzone passieren. Für Vorrichtungen mit Reinigungseinheiten, die dritte Zonen enthalten, trennt das Elektrophoresemedium das Aufnahmegefäß von der dritten Zone, die zum Aufnehmen von jedem oder allen Molekülen eingesetzt ist, die die zweite Zone der Vorrichtung passieren. Diese dritte Zone ist Sammelkammer genannt.
In einer alternativen Anwendungsform kann die Reinigungsvorrichtung mehrere Reinigungseinheiten umfassen. In einer bevorzugten Anwendungsform ist die Vorrichtung eine Mikrotiterplatte und jede Reinigungseinheit ist eine Mikrotiter-Vertiefung.
Die Reinigungsvorrichtung kann ebenfalls eine Vorreinigungseinheit umfassen, die ein Aufnahmegefäß, ein Elektrophoresemedium und eine Sammelkammer umfasst. Das Elektrophoresemedium trennt das Aufnahmegefäß von der Sammelkammer.
In den Anwendungsformen umfasst die Sammelkammer eine Auslassöffnung. In einer bevorzugten Anwendungsform enthält die Auslassöffnung eine semipermeable Membran.
Die Vorrichtung, die eine einzige Reinigungseinheit enthält, kann mehrere identische oder nahezu identische Fangsonden enthalten. Die Vorrichtung, die eine einzige Reinigungseinheit enthält, kann ebenfalls mehrere verschiedene Fangsonden enthalten. Die Vorrichtung kann ebenfalls mehrere Fangsonden enthalten, wobei ein Teil davon identisch oder nahezu identisch ist und ein Teil davon verschieden ist.
Die Vorrichtung, die mehrere Reinigungseinheiten enthält, kann mehrere identische oder nahezu identische Fangsonden enthalten. Die Vorrichtung, die mehrere Reinigungseinheiten enthält, kann ebenfalls mehrere verschiedene Fangsonden enthalten. Die Vorrichtung kann ebenfalls mehrere Fangsonden enthalten, wobei ein Teil davon identisch oder nahezu identisch ist und ein Teil davon verschieden ist.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einführung einer Untersuchungsprobe, enthaltend ein Target-Nukleinsäuremolekül, in ein Aufnahmegefäß einer Einheit einer Reinigungsvorrichtung, die ein Aufnahmegefäß und ein Elektrophoresemedium einschließlich mindestens einer immobilisierten Fangsonde, die ausgewählt ist, um an die Target-Nukleinsäure zu hybridisieren, umfasst, wobei das Elektrophoresemedium einem elektrischen Feld ausgesetzt ist, was zu einer Migration der Untersuchungsprobe durch das Medium führt, unter Bedingungen, die für eine Hybridisierung des Target-Moleküls mit der Fangsonde geeignet sind, wobei dadurch ein Target-Molekül/Fangsonde Komplex gebildet wird, und geeignet sind, ein Migrieren der verbleibenden Komponenten der Untersuchungsprobe durch das Medium und Eluieren aus dem Medium und Sammeln des Rückstandes der Untersuchungsprobe in der Sammelkammer zu erlauben.
In einer Anwendungsform umfasst das Verfahren außerdem den Schritt der Behandlung des Elektrophoresemediums, um das Target-Molekül freizusetzen. In bevorzugten Anwendungsformen kann das Target-Molekül aus dem Elektrophoresemedium freigesetzt sein durch Erhöhung der Temperatur des Elektrophoresemediums, die hinreichend ist, um den Target-Molekül/Fangsonde-Komplex zu denaturieren, Spalten der chemischen Bindung, die die Fangsonden in dem Elektrophoresemedium immobilisiert, oder Erhöhung der elektrischen Feldstärke auf einen Wert, der für eine Zerstörung des Target-Molekül/Fangsonde-Komplexes hinreichend ist. In einer Anwendungsform wird das Target-Molekül in ein Aufnahmegefäß freigesetzt.
Die im Verfahren eingesetzte Vorrichtung umfasst außerdem eine Sammelkammer, in der die Sammelkammer von dem Aufnahmegefäß durch ein Elektrophoresemedium getrennt ist.
In einer weiteren Anwendungsform umfasst das Verfahren außerdem den Schritt des Amplifizierens des Target-Moleküls.
In einer anderen Anwendungsform kann das Verfahren zu einer Konzentrationserhöhung des Target-Moleküls führen.
In einer alternativen Anwendungsform kann das Verfahren mit einer Reinigungsvorrichtung angewandt sein, die mehrere Reinigungseinheiten umfasst. In einer bevorzugten Anwendungsform sind mehrere Target-Moleküle gleichzeitig gereinigt, z.B. das Verfahren ist ein Mehrfachverfahren.
In einer bevorzugten Anwendungsform kann die Reinigung und Konzentrierung des Target-Moleküls in einem einzigen Prozess-Schritt erfolgen.
In einer anderen Anwendungsform kann das Verfahren ebenfalls einen Prozess-Schritt der Vorreinigung umfassen. In einer noch weiteren Anwendungsform kann die Untersuchungsprobe aus der Sammelkammer einer Reinigungseinheit erhalten sein.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Entwicklung optimaler Bedingungen für Verfahren zur Reinigung von Target-Nukleinsäuren. In Anwendungsformen sind die Target-Nukleinsäuren mutierte Nukleinsäuren, von denen bekannt ist, dass sie für den Nachweis von Krankheiten aufschlussreich sind. In Anwendungsformen sind die Bedingungen, die eine Optimierung erfordern, Bedingungen, die das Einfangen von Target-Nukleinsäuren und die Elution der Target-Nukleinsäuren beeinflussen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Kit zur Präparation einer Target-Nukleinsäure in einer Untersuchungsprobe zur Verwendung bei Nukleinsäure-Sequenzierungsanwendungen, umfassend eine Vorrichtung zur Reinigung einer Target-Nukleinsäure aus einer Untersuchungsprobe und mindestens eine Reinigungseinheit enthaltend, wobei die Reinigungseinheit ein Aufnahmegefäß und ein Elektrophoresemedium umfasst, das mindestens eine immobilisierte Fangsonde, ausgewählt um an die Target-Nukleinsäure zu hybridisieren, enthält.
In einer Anwendungsform umfasst die Vorrichtung des Kits außerdem eine Reinigungseinheit einschließlich einer Sammelkammer, wo die Sammelkammer von dem Aufnahmegefäß durch ein Elektrophoresemedium getrennt ist.
In einer alternativen Anwendungsform kann das Kit eine Vorrichtung umfassen, enthaltend mehrere Reinigungseinheiten.
In einer Anwendungsform kann das Kit außerdem eine Vorreinigungseinheit umfassen, die ein Aufnahmegefäß, ein Elektrophoresemedium und eine Sammelkammer umfasst, wo das Elektrophoresemedium das Aufnahmegefäß von der Sammelkammer trennt.
In einer Anwendungsform ist die Target-Nukleinsäure eine mutierte Nukleinsäure, die zum Nachweis einer Humankrankheit zweckdienlich ist. In einer bevorzugten Anwendungsform ist die Humankrankheit Krebs.
Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung erlauben eine schnelle, hoch reproduzierbare Reinigung von Nukleinsäuren aus komplexen Molekül-Mischungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Reinigung einer Target-DNA für eine Verwendung zur weiteren Analyse, z.B. DNA-Sequenzierung, unter Verwendung von Reinigungseinheiten einer Vorrichtung, die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte sind.
2 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Reinigung einer Target-DNA für eine Verwendung zur weiteren Analyse, z.B. DNA-Sequenzierung, unter Verwendung einer Vorrichtung mit einer Reinigungseinheit, die eine Sammelkammer, enthaltend eine semipermeable Membran, enthält.
3A ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Oligonukleotid-Produkten von Mehrfachreaktion, das in einer Reinigungseinheit durchgeführt ist, in der ein Vorwärts-Primer, ein Rückwärts-Primer und ein Plasmid mit einem zu sequenzfierenden Oligonukleotid-Insert bereitgestellt sind. Die Multiplexprodukte der Amplifikationsreaktion sind unter Verwendung gestapelter Vorrichtungen gereinigt, die ein Elektrophoresemedium mit immobilisierten Fangsonden, z.B. Sonde-Gel-Spitze Vorrichtungen, enthalten, wobei die obere Vorrichtung eine Vorwärts-Fangsonde in dem Elektrophoresemedium besitzt und die untere Vorrichtung eine Rückwärts-Fangsonde in dem Elektrophoresemedium besitzt.
3B und 3C sind Fotografien der Reinigungsergebnisse, die unter Anwendung des in 3A dargestellten Verfahrens erhalten sind.
Vorwärts-Replikationsprodukte sind von Rückwärts-Replikationsprukten getrennt. 3C zeigt die reverse Sequenz.
3E zeigt die Sequenz, die in dem in 3A dargestellten Verfahren verwendet ist.
4A ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens unter Verwendung einer Vorrichtung, in der ein Elektrophoresemedium, das keine immobilisierten Fangsonden enthält, z.B. eine Gel-beladene Spitze Vorrichtung, gemeinsam mit einer Vorrichtung, die ein immobilisierte Fangsonden enthaltendes Elektrophoresemedium z.B. ein Sonde-Gel-Spitze Vorrichtung enthält, verwendet ist, um ein DNA-Target-Molekül, z.B. Produkte von DNA-Sequenzierungsreaktionen, zu reinigen und gegebenenfalls zu konzentrieren. Eine Temperaturänderung zur Denaturierung des Hybridisierungskomplexes und Freisetzung des DNA-Target-Moleküls ist verwendet.
4B ist eine Fotografie, die die Verteilung des Target-Moleküls in der Elektrophoresemedium Zone nach Elektrophorese und vor Elution zeigt.
5 ist eine Fotografie eines Elektrophorese-Gels, die die Komponenten der Proben zeigt, die 1) vor der Reinigung in einer Vorrichtung der Erfindung und 2) nach Hybridisierung und Entfernung aus der Vorrichtung aufgenommen wurden.
6 ist eine Fotografie eines senkrechten Blocks Elektrophoresemediums, in der ein immobilisierte Fangsonden enthaltendes Elektrophoresemedium, z.B. eine Sonde-Gel-Schicht als Sandwich zwischen einem oberen und unteren Elektrophoresemedium ohne immobilisierte Fangsonden, z.B. eine Gel-beladene Schicht, vorliegt. Die Sonde ist in der Sonde-Gel-Schicht gleichförmig verteilt. Ein Temperaturgradient von 24,7°C bis 53,4°C wurde von links nach rechts während der Elektrophorese eines Target-Oligonukleotids mit einer Farbmarkierung bereitgestellt.
7 ist eine Fotografie eines senkrechten Elektrophoresemediums mit mehreren Spuren. Jede Spur ist mit einem Temperaturgradienten von 23°C bis 45°C von oben nach unten versehen. Jede Spur hat eine Fangsonde verschiedener Größe. Die komplementäre Fangsonde in Spur 1 ist ein 13mer, Spur 2 ein 15mer, Spur 3 ein 17mer, Spur 4 ein 19mer und Spur 5 ein 21mer. Das gleiche Oligonukleotid mit einer Farbmarkierung ist in jeder Spur einer Elektrophorese unterzogen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen, umfassend mindestens eine Reinigungseinheit, die zur Reinigung und/oder Konzentrierung eines in einer Untersuchungsprobe enthaltenen Target-Moleküls eingesetzt ist. Der Begriff "Target-Molekül" und sein Plural "Target-Moleküle" ist im Wesentlichen in dieser Anmeldung austauschbar und umfasst beabsichtigterweise jedes geladene Molekül, das unter Verwendung der Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung weiter aufgereinigt oder aufkonzentriert werden kann.
Vorzugsweise ist das Target-Molekül eine Nukleinsäure. Der Begriff "Nukleinsäure" umfasst beabsichtigterweise Desoxyribonukleinsäure, nachstehend "DNA", oder Ribonukleinsäure, nachstehend "RNA". Derartige Nukleinsäuren umfassen zum Beispiel DNA-Extensionsprodukte, die mittels DNA-Sequenzierungsverfahren erzeugt sind. Diese Produkte können in ihrer Länge variieren und erfordern oftmals eine weitere Reinigung vor DNA-Sequenzierungen. Die gereinigten Target-Nukleinsäuren können auf verschiedenen Weisen verwendet sein, einschließlich einer weiteren Analyse z.B. Nukleotid-Sequenzanalyse unterzogen werden.
Die Target-Nukleinsäuren können in Untersuchungsproben enthalten sein, die eine Vielzahl an Komponenten enthalten. Darüber hinaus kann eine Untersuchungsprobe von zahlreichen Quellen stammen. Zum Beispiel kann eine Untersuchungsprobe entweder von einer Pflanze oder einem Tierorgan, Gewebe oder Zelle stammen. Eine Untersuchungsprobe kann von einem Zell-, Gewebe- oder Organkultursystem stammen. Eine Untersuchungsprobe kann von einer cDNA oder genomischen Bibliothek stammen.
In der Untersuchungsprobe verwendete DNA kann von einem Organismus, erhalten aus einer Körperprobe, wie beispielsweise Blut, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, Gewebematerial oder ähnliches mit Hilfe verschiedener Techniken extrahiert sein, wie beispielsweise Techniken, die von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., Seiten 280–281 (1982) beschrieben sind. Eine Untersuchungsprobe kann ebenfalls halb-gereinigt sein, zum Beispiel kann eine Überstandspräparation von einer Gewebeprobe als eine Untersuchungsprobe verwendet sein.
Die vorliegende Erfindung stellt Reinigungsvorrichtungen bereit, die zur Reinigung und Konzentrierung eines in einer Untersuchungsprobe enthaltenen Target-Moleküls zweckdienlich sind. Die Vorrichtungen der Erfindung umfassen mindestens eine Reinigungseinheit, die diskrete oder halb-diskrete Zonen enthalten. Typischerweise umfasst jede Reinigungseinheit mindestens drei Zonen, die hier als Kammern oder Komponenten bezeichnet sind.
Die erste Zone umfasst ein Aufnahmegefäß. Der Begriff "Aufnahmegefäß" umfasst beabsichtigterweise die Zone einer Reinigungseinheit, die eine Probe aufnehmen kann.
Die zweite Zone umfasst ein Elektrophoresemedium. Der Ausdruck "elektrophoretisches Medium" oder "Elektrophoresemedium" ist ein Technikterm und umfasst beabsichtigterweise alle bekannten Medien, die zur Reinigung und/oder Konzentrierung einer Target-Nukleinsäure in einer Untersuchungsprobe geeignet sind. Das Elektrophoresemedium der Vorrichtung kann zum Beispiel ein Polyacrylamid-Gel mit einer im Medium immobilisierten Fangsonde sein, zum Beispiel das im U.S. Patent, Nr. 5.932.711 , von Boles et al. beschriebene Elektrophoresemedium. Fangsonden können so gestaltet sein, dass sie spezifisch mit einem in der Untersuchungsprobe enthaltenen Target-Molekül interagieren und mit diesem hybridisieren. Der Begriff "Fangsonde" und sein Plural "Fangsonden" umfasst beabsichtigterweise diejenigen Sonden, die mit einem Target-Molekül, zum Beispiel einem Target-Nukleinsäuremolekül, hybridisieren können.
Die dritte Zone umfasst eine Sammelkammer. Der Ausdruck "Sammelkammer" umfasst beabsichtigterweise eine Zone, die die Untersuchungsprobe aufnimmt, nachdem sie durch das Elektrophoresemedium migrierte. Diese Kammer kann physikalisch an die zweite Zone grenzen oder sie kann mit der zweiten Zone eine Phasengrenzfläche bilden, indem sie in unmittelbarer Nähe zur zweiten Zone liegt. Die dritte Zone kann von der zweiten Zone getrennt sein, was das Entleeren oder Befüllen der Sammelkammer und den Pufferaustausch gestattet.
Das Aufnahmegefäß und die Sammelkammer sind physikalisch durch das Elektrophoresemedium voneinander getrennt, das eine Barriere zwischen den beiden bildet.
Die Reinigungsvorrichtungen der Erfindung können aus vielen Materialien gebildet sein. Bevorzugte Materialien sind solche, die mit biologischen Molekülen wie beispielsweise DNA und RNA sehr verträglich sind. Materialien wie Kunststoff, Edelstahl, Messing, Keramik, Glas, Silika oder verschiedene Kombinationen dieser Materialien können zur Bildung der Reinigungsvorrichtungen verwendet sein. Während der tatsächliche geometrische Aufbau der Reinigungsvorrichtung für ihren Einsatz nicht entscheidend ist, können bestimmte Formen für besondere Anwendungen von Vorteil sein. Zum Beispiel ist es bei manchen Anwendungen für den Umfang der Reinigungseinheit bevorzugt, in den Bereichen zu differieren, die die verschiedenen Komponenten der Vorrichtung enthalten.
Vorzugsweise kann die Reinigungsvorrichtung mit einer elektrischen Stromquelle in Kontakt gebracht werden, so dass eine Spannungsdifferenz geschaffen werden kann, um die Migration der Moleküle durch das in der zweiten Zone enthaltene Elektrophoresemedium zu erleichtern. Die elektrische Stromquelle zur Reinigung kann von der eigentlichen Reinigungsvorrichtung getrennt und isoliert sein oder sie kann in den Aufbau der Reinigungsvorrichtung integriert sein. Ein wichtiges Merkmal der Vorrichtung ist, dass es möglich ist, die Reinigungsvorrichtung einer von einer Stromquelle gebildeten Spannungsdifferenz auszusetzen oder zu verbinden. Elektroden von der Stromquelle oder Steckdosen für Elektroden können ein integriertes Merkmal der Reinigungsvorrichtung sein.
Eine Untersuchungsprobe kann in die Reinigungsvorrichtung durch Verbringen in das Aufnahmegefäß eingeführt sein. Ein elektrisches Feld, das hinreichend ist, die Migration des Target-Moleküls und weiterer Probenkomponenten durch das auftrennende Elektrophoresemedium zu erlauben, z.B. 0,1 bis etwa 100–200 Volt/cm, kann angelegt sein, so dass geladene Moleküle in dem Aufnahmegefäß durch das Elektrophoresemedium zum geeigneten Pol migrieren können. Typischerweise besitzen die Target-Moleküle eine negative Ladung und migrieren deshalb zur Anode. Ein Target-Molekül kann die Migration durch das Medium fortsetzen, bis es mit einer immobilisierten Fangsonde in Kontakt kommt, die für dieses bestimmte Target-Molekül spezifisch ist, z.B. eine Fangsonde, mit der es hybridisiert. Es kann sich ein Hybridisierungskomplex aus der immobilisierten Fangsonde und dem Target-Molekül bilden. Bevorzugte Fangsonden sind mit 5'-Acrylamid-Gruppen modifizierte Oligonukleotide, die mit einem Elektrophorese-Gel, z.B. ein Polyacrylamid-Gel, copolymerisieren können. Target-Moleküle können an die in einer Fangsonde enthaltenen komplementären Sequenzen binden, falls eine wesentliche Komplementarität zwischen den beiden Molekülen besteht.
Der Begriff "wesentliche Komplementarität" umfasst beabsichtigterweise Nukleinsäuren der Fangsonde, die mit dem korrespondierenden Target-Molekül hybridisieren können. Derartige Sequenzen sind nicht erforderlich, um die exakte Nukleinsäure-Sequenz des Target-Moleküls wiederzugeben. Derartige Sequenzen müssen nur hinreichend ähnlich in der Sequenzidentität sein, um mit dem Target-Molekül unter bestimmten Bedingungen zu hybridisieren. Zum Beispiel können nicht komplementäre Basen oder zusätzliche Nukleotide in den Sequenzen eingestreut sein, vorausgesetzt die Sequenzen besitzen hinreichend komplementäre Basen, um damit zu hybridisieren. Spezifische Hybridisierungsbedingungen können empirisch vom Fachmann bestimmt werden.
Zum Beispiel sollten die Stringenz-Bedingungen so gewählt sein, dass nicht spezifische Hybridisierungsreaktionen signifikant abnehmen. Stringenz-Bedingungen für Hybridisierungen sind in verschiedenen Lehrbüchern, z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al., Vol. 1, Suppl. 28 (1991) erläutert, wobei deren Inhalte hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingefügt sind. Faktoren wie beispielsweise Sondenlänge, Basenzusammensetzung, Prozentsatz Basenfehlpaarung zwischen hybridisierenden Sequenzen, Temperatur und Ionenstärke beeinflussen die Stabilität der Nukleinsäure-Hybride. Stringenz-Bedingungen, z.B. geringe, moderate oder hohe Stringenz können empirisch bestimmt sein, was zum Teil von den Charakteristika der Fangsonde und dem Target-Molekül in der Untersuchungsprobe abhängt.
Der Hybridisierungskomplex verhindert eine weitere Migration des Target-Moleküls durch das Elektrophoresemedium, beeinflusst aber nicht die fortgesetzte Migration von Nichttarget-Molekülen, wobei dadurch die Reinigung des in der Untersuchungsprobe enthaltenen Target-Moleküls bewerkstelligt ist. Nichttarget-Moleküle können zum Beispiel Proteine, Peptide, Zucker, Salze und Nukleinsäuren umfassen.
Die in der Untersuchungsprobe enthaltenen Nichttarget-Moleküle können durch das Elektrophoresemedium weiter migrieren und werden effektiv von den Target-Molekülen getrennt. In der Probe enthaltene Nichttarget-Moleküle können das Gel und den in der Sammelkammer der Vorrichtung enthaltenen Elektrophorese-Puffer passieren. Der Puffer in der Sammelkammer kann durch frischen Elektrophorese-Puffer ersetzt werden. Das Target-Molekül kann anschließend von der Fangsonde und dem Elektrophoresemedium für eine anschließende Analyse eluiert werden.
Der Begriff "Elution" umfasst beabsichtigterweise Schmelzen des Hybrids und Bewegen des Targets in Richtung Elution. Schmelzen oder Dissoziieren des Targets von der Sonde kann durch Anwenden hoher Temperaturen auf die Vorrichtung, durch Änderung der Pufferbedingungen, z.B. pH-Erhöhung oder Zugabe von Lösemitteln wie beispielsweise Formamid oder durch hohe Spannung erreicht sein.
Zum Beispiel kann eine hohe Spannung angelegt werden, so dass der aus Target-Molekül und Fangsonde gebildete Hybridisierungskomplex denaturiert wird und das Target-Molekül freisetzt. Das elektrische Feld kann unter Einsatz der gleichen Polarität wie das ursprünglich angelegte Feld angelegt sein, wobei dadurch die kontinuierliche Migration des freigesetzten Target-Moleküls in die frischen Elektrophorese-Puffer enthaltende Sammelkammer erlaubt ist. Alternativ kann das elektrische Feld umgekehrt werden, um die Probe in die Proben-Vertiefung der Mikrotiterplatte wieder zurücklaufen zu lassen. Auf das gereinigte Target-Molekül kann nun zugegriffen werden und kann einer weiteren Analyse wie beispielsweise Nukleotid-Sequenzanalyse unterzogen werden. Alternativ kann das Target-Molekül einer Amplifizierungsreaktion zum Beispiel einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einer Ligation-Kettenreaktion, einer Nukleinsäure-Sequenz basierten Amplifikation oder anderen gleichwertigen Prozeduren zugeführt werden.
In einer Anwendungsform enthält die Vorrichtung eine einzige Reinigungseinheit und besitzt die Form eines Mikroröhrchens oder einer Einmalspitze z.B. Gilson oder Eppendorf-Spitzen. In einer anderen Anwendungsform enthält die Vorrichtung mehrere Reinigungseinheiten und besitzt die Form einer Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte kann viele Vertiefungen z.B. sechsundneunzig (96) Vertiefungen enthalten und jede Vertiefung bildet eine diskrete Reinigungseinheit. Diese Anwendungsform erleichtert die Reinigung multipler Proben. Falls die Vorrichtung aus einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen besteht, können 96 einzelne Untersuchungsproben zugegeben sein, z.B. auf die Vorrichtung geladen sein. Mikrotiterplatten, die mehr oder weniger als 96 Vertiefungen enthalten, liegen ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung. Die Vertiefung der Mikrotiterplatte kann drei Zonen enthalten. Die erste Zone der Vertiefung enthält ein Aufnahmegefäß, um die Probe aufzunehmen. Das Aufnahmegefäß kann vorzugsweise ein Volumen von etwa 5,0 μl bis etwa 1.000,0 μl fassen, obwohl größere Proben eingesetzt sein können. Das Aufnahmegefäß befindet sich zwischen der Oberseite der Vertiefung und der vom Elektrophoresemedium gebildeten Oberseitenrand. Das Elektrophoresemedium umfasst mindestens eine Art Fangsonden, z.B. eine Oligonukleotid-Sequenz, die im Medium immobilisiert ist. Alternativ können mehrere Arten Fangsonden, z.B. mehrere Oligonukleotid-Sequenzen, im Medium immobilisiert sein (siehe beispielsweise USSN 08/971.845 mit Titel "Electrophoretic Analysis of Molecules Using Immobilized Probes" von Boles et al., angemeldet am 8. August 1997, wobei der Inhalt hier durch Verweis eingefügt ist). In einer bevorzugten Anwendungsform ist die Sonde an das Elektrophoresemedium kovalent gebunden. Die zweite Zone befindet sich an der Unterseite des Aufnahmegefäßes an der Oberseite der Sammelkammer, wenn sie an die erste Zone angrenzt.
In einer anderen Anwendungsform kann eine Vorreinigungseinheit gemeinsam mit einer Reinigungseinheit der Erfindung verwendet sein. Das Elektrophoresemedium der Vorreinigungseinheit enthält keine immobilisierten Sonden, sondern soll eher für eine erste nicht spezifische Trennung der Untersuchungsprobe sorgen, woraus eine partiell gereinigte Probe resultiert. Die Untersuchungsprobe wird in das Aufnahmegefäß der Vorreinigungseinheit vorzugsweise in Elektrophoresepuffer verbracht. Bei Anlegen eines Spannungsgradienten wird die Probe durch Elektrophoresemedium z.B. Gel-beladene Zone schnell bewegt. Diese Trennzone entfernt in einer Probe, wo die meisten Moleküle die gleiche Ladung tragen, Komponenten primär aufgrund ihrer Größe. Typischerweise wird die Probe zur Anode gezogen, wobei die kleineren Moleküle dazu neigen, am schnellsten durch die Trennzone zu laufen. Folglich laufen die Extensionsprodukte schneller in eine Sammelkammer als das Template, das im Elektrophoresemedium zurückgehalten wird.
Die Inhalte der Sammelkammer von der Vorreinigungseinheit können in einer Reinigungseinheit einer Vorrichtung der Erfindung zweiter gereinigt werden. Die partiell gereinigte Probe wird mit der Oberseite der zweiten Zone in Kontakt gebracht, normalerweise durch Verbringen der partiell gereinigten Probe in das Aufnahmegefäß. Die dritte Zone kann an die zweite Zone angrenzen. Die Spitze der Mikrotiter-Vertiefung kann durch Abschneiden oder einem anderen gleichwertigen Verfahren entfernt sein. Die Öffnung, die durch Entfernen der unteren Spitze geschaffen ist, kann von einer semipermeablen Membran bedeckt sein. Die semipermeable Membran besitzt einen Molekulargewichts-Cutoff, der kontaminierenden Probenkomponenten ein Passieren der Membran erlaubt.
Die Mikrotiterplatte kann mit einer Stromquelle verbunden werden, so dass ein elektrisches Feld auf die Vertiefungen in den Mikrotiterplatten wirken kann. Das elektrische Feld kann bezogen auf die Vertiefungen eine beliebige Geometrie einnehmen. Vorzugsweise tritt das elektrische Feld, wenn es angelegt ist, entlang der Längsachse der Vertiefungen auf, so dass geladene Moleküle im Aufnahmegefäß in Längsrichtung durch das in der zweiten Zone enthaltene Elektrophoresemedium migrieren können. Sobald die Probe aufgetragen ist, kann ein elektrisches Feld auf die Reinigungsvorrichtung wirken, so dass geladene Moleküle unter Einfluss des elektrischen Feldes migrieren.
Jedes für eine Elektrophorese geeignetes Elektrophoresemedium oder Matrix kann in den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet sein. Geeignete Matrices umfassen Acrylamid und Agarose, es werden normalerweise beide für die Nukleinsäure-Elektrophorese eingesetzt. Allerdings könnten andere Materialien ebenso gut verwendet sein. Beispiele umfassen chemisch modifizierte Acrylamide, Stärke, Dextrane und auf Cellulose basierende Polymere. Weitere Beispiele umfassen modifizierte Acrylamide und Acrylatester (siehe Polysciences, Inc., Polymer & Monomer Catalog, 1996–1997, Warrington, PA), Stärke (siehe Smithies, Biochem. J., 71:585 (1959), und Produktnummer S5651, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Dextrane (siehe Polysciences, Inc., Polymer & Monomer Catalog, 1996–1997, Warrington, PA) und auf Cellulose basierende Polymere (siehe Quesada, Current Opin. In Biotechnology, 8: 82–93 (1997). Jedes der beschriebenen Polymere kann chemisch modifiziert sein, um ein spezifisches Binden der Fangsonden an das Elektrophoresemedium für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erlauben. Eine besonders bevorzugte Matrix ist Acrylamid.
Eine Reihe an Fangsonden können in den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet sein. Typischerweise umfasst die Fangsonde der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure mit einer Nukleotid-Sequenz mit einer wesentlichen Komplementarität zu einer Region einer Nukleotid-Sequenz, die im Target-Molekül enthalten ist, so dass das Target-Molekül mit der Fangsonde hybridisieren kann. Die Komplementarität der Nukleinsäure-Fangsonden ist nur erforderlich, um hinreichend spezifisch das Target-Molekül zu binden, und folglich die Reinigung des Target-Moleküls in einer Untersuchungsprobe zu bewerkstelligen. Für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Sonden umfassen Sonden, die aus Nukleinsäuren z.B. RNA, DNA, Nukleinsäure-Analoga, modifizierten Nukleinsäuren gebildet sind, und chimäre Sonden aus gemischten Klassen, die eine Nukleinsäure mit einer anderen organischen Komponente, z.B. Peptid-Nukleinsäuren, umfassen. Fangsonden können einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäuren sein. Bevorzugt beträgt die Länge der Fangsonden mindestens 5 Nukleotide, bevorzugter beträgt die Länge zwischen 5 und 50 Nukleotide, aber die Länge kann bis zu einigen Tausend Nukleotiden betragen.
Für Sonden der Erfindung zweckdienliche Nukleinsäuren umfassen Nukleinsäuren, die mit in der Technik bekannten Verfahren gewonnen sind. Diese Nukleinsäuren umfassen im Wesentlichen reine Nukleinsäuren, Nukleinsäuren, die mittels chemischer Synthese und mittels Kombinationen aus biologischen und chemischen Verfahren hergestellt sind, und rekombinante Nukleinsäuren. Sowohl DNA als auch RNA können verwendet sein.
Der Begriff "Nukleinsäure-Analogon" umfasst beabsichtigterweise Nukleinsäuren, die modifizierte Zuckergruppen, Phosphatgruppen oder modifizierte Basen enthalten. Beispiele für Nukleinsäuren mit modifizierten Basen umfassen zum Beispiel acetylierte, carboxylierte oder methylierte Basen z.B. 4-Acetylcytidin, 5-Carboxymethylaminomethyluridin, 1-Methylinosin, Norvalin oder allo-Isoleucin. Derartige Nukleinsäure-Analoga sind dem Fachmann bekannt. Ein Beispiel für ein zweckdienliches Nukleinsäure-Analogon ist Peptid-Nukleinsäure (PNA), in der Standard-DNA-Basen an ein modifiziertes Peptid-Rückgrat, bestehend aus wiederholenden N-(2-Aminoethyl)glycin-Einheiten, gebunden sind (Nielsen, et al., Science, 254: 1497–1500, (1991)). Das Peptid-Rückgrat ist in der Lage, die Basen in einem geeigneten Abstand für eine Basenpaarung mit Standard-DNA- und RNA-Einzelsträngen zu halten. PNA-DNA Hybridduplexe sind viel stärker als äquivalente DNA-DNA-Duplexe, möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass es keine negativ geladene Phosphodiester-Bindungen in dem PNA-Strang gibt. Zusätzlich sind PNAs wegen ihrer ungewöhnlichen Struktur sehr resistent gegen einen Nuklease-Abbau. Aus diesen Gründen sind PNA-Nukleinsäure-Analoga für Assays mit immobilisierten Sonden zweckdienlich. Es ist dem Fachmann klar, dass ähnliche Entwicklungsstrategien für die Konstruktion anderer Nukleinsäure-Analoga, die zweckdienliche Eigenschaften für Assays mit immobilisierten Sonden besitzen, angewandt sein können.
Sonden, die modifizierte Oligonukleotide enthalten, können ebenfalls zweckdienlich sein. Zum Beispiel Oligonukleotide, die Desazaguanin- und Uracil-Basen enthalten, können anstelle von Guanin und Thymin haltigen Oligonukleotiden verwendet sein, um die thermische Stabilität hybridisierter Sonden zu vermindern. Ähnlich kann 5-Methylcytosin Cytosin ersetzen, falls Hybride mit erhöhter thermischer Stabilität erwünscht sind (Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26: 227–2259 (1991)). Modifizierungen der Ribosezuckergruppe wie beispielsweise die Addition von 2'-O-Methylgruppen kann die Nuklease-Empfindlichkeit von immobilisierten RNA-Sonden verringern (Wagner, Nature, 372: 333–335, (1994). Modifikationen, die negative Ladung von dem Phosphodiester-Rückgrat entfernen, können die thermische Stabilität der Hybride erhöhen (Moody, et al., Nucleic Acids Res., 17: 4769–4782 (1989); Iyer, et al., J. Biol. Chem., 270: 14712–14717 (1995)).
Verfahren zum Binden von Nukleinsäuren, um immobilisierte Fangsonden enthaltende Elektrophoresemedien zu bilden, sind dem Fachmann bekannt und sind nicht Teil der Erfindung. Nukleinsäuren, modifizierte Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Analoga können an Agarose, Dextrane, Cellulose und Stärke-Polymere unter Verwendung von Cyanbromid oder Cyanurchlorid-Aktivierung gekoppelt sein. Carboxylgruppen enthaltende Polymere können an synthetische Fangsonden mit primären Amingruppen unter Verwendung der Carbodiimid-Kopplung gekoppelt sein. Primäre Amine tragende Polymere können an Amin haltige Sonden mit Glutaraldehyd oder Cyanurchlorid gekoppelt sein. Viele Polymere können mit Thiol reaktiven Gruppen modifiziert sein, die an Thiol haltige synthetische Sonden gekoppelt sind. Viele andere geeignete Verfahren lassen sich in der Literatur finden (zum Überblick siehe Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, FL (1993)).
Verfahren zum kovalenten Binden der Fangsonden an polymerisierbare chemische Gruppen sind ebenfalls entwickelt worden. Wenn die Matrices mit geeigneten Mischungen aus polymerisierbaren monomeren Verbindungen copolymerisiert werden, können Matrices mit hohen Konzentrationen an immobilisierten Nukleinsäuren hergestellt werden. Beispiele für bevorzugte Verfahren zum kovalenten Binden von Nukleinsäuren an polymerisierbare chemische Gruppen sind in Boles et al., United States Patent Nr. 5.932.711 mit Titel "Nucleic Acid-Containing Polymerizable Complex" und in Rehman, et al., Nucleic Acids Res., 27: 649–655 (1999) zu finden, wobei die Inhalte hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingefügt sind.
Für einige Anwendungsformen der Vorrichtung können Composite-Matrices, die eine Mischung aus zwei oder mehreren Matrix bildenden Materialien enthalten, z.B. das Composite Acrylamid-Agarose-Gel zweckdienlich sein. Diese Gele enthalten typischerweise etwa 2–5% Acrylamid und 0,5–1% Agarose. In diesen Gelen stellt das Acrylamid die hauptsächliche Siebfunktion bereit, aber ohne die Agarose fehlt derartigen gering konzentrierten Acrylamid-Gelen eine hinreichende mechanische Festigkeit für eine bequeme Handhabung. Die Zugabe von Agarose liefert eine mechanische Unterstützung ohne die Siebeigenschaften des Acrylamids signifikant zu verändern. In diesen Anwendungsformen können die Nukleinsäuren an die Komponente, die dem Gel die Siebfunktion verleiht, gebunden sein, da diese Komponente den innigsten Kontakt mit der Lösungsphase und dem Nukleinsäure-Target herstellt. Alternativ könnte ein verstärkendes Material oder Träger, auf dem die Gel-Matrix gebunden ist, bereitgestellt sein (siehe zum Beispiel Jones, et al., USSN 60/176.839; angemeldet am 19. Januar 2000, mit Titel "Method of Detecting Nucleic Acid Using a Thin Gel Support and An Apparatus Therefor", wobei die Inhalte hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingefügt sind).
Nukleinsäuren können an Partikel gebunden sein, die wiederum selbst in Elektrophoresemedien eingebaut sind. Die Partikel können makroskopischer, mikroskopischer oder kolloidaler Natur sein (siehe Polysciences, Inc., Polymer & Monomer Catalog, 1996–1997, Warrington, PA). Cantor et al. beschreibt im United States Patent Nr. 5.482.863 ein Verfahren zum Gießen von Elektrophorese-Gelen, die Partikel-Suspensionen enthalten. Die Partikel sind an die Nukleinsäuren unter Anwendung ähnlicher Verfahren, wie sie oben beschrieben sind, gebunden, mit den Gel bildenden Verbindungen gemischt und werden dann als eine Suspension in die gewünschte Matrix-Form gegossen.
Ein Überblick über die Figuren erleichtert das Verstehen der Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung. Unter Bezugnahme auf 1 ist ein Verfahren zur Anwendung der Vorrichtung der Erfindung dargestellt. In Schritt 1 ist eine Untersuchungsprobe 10, umfassend DNA-Target-Moleküle 15 gemeinsam mit DNA-Template, Salzen, Monomeren und Puffer in die erste Zone 110 einer Mikrotiter-Vertiefung 100 verbracht. Die Untersuchungsprobe ist in Kontakt mit Elektrophoresemedium, das sich in der zweiten Zone 120 befindet und mindestens eine Fangsonde 20 aufweist. In Schritt 2 wirkt ein elektrisches Feld auf die Inhalte der Mikrotiter-Vertiefung, folglich können negativ geladene Moleküle durch die Elektrophorese-Matrix in der zweiten Zone migrieren. Das DNA-Target 15 wird in der Elektrophorese-Matrix 120 von der Fangsonde 20 eingefangen. In Schritt 3 wird der Elektrophoresepuffer durch frischen Puffer (bevorzugt mit einem kleineren Volumen als das Volumen der DNA-Analysenprobe) in der ersten Kammer ersetzt. Strom wird angelegt, um den von der Fangsonde und dem DNA-Target gebildeten Komplex zu denaturieren, folglich wird das DNA-Analyt-Target 15 von Fangsonde freigesetzt. Ein umgekehrtes elektrisches Feld wird angelegt, um das DNA-Analyt in das Probenvolumen der ersten Zone der Reinigungseinheit zu eluieren. In Schritt 4 ist die Entfernung des DNA-Analyts aus der ersten Zone der Reinigungseinheit dargestellt. Das DNA-Analyt kann unter Verwendung einer Pipette 200 oder anderer Mittel entfernt werden und die DNA-Analyt Probe in Puffer ist dann für eine weitere Analyse wie zum Beispiel DNA-Sequenzierung bereit.
Unter Bezugnahme auf 2 ist ein Verfahren zur Herstellung einer Probe dargestellt, umfassend Primer-Extensionsprodukte zur Sequenzierung. In Schritt 1 wird eine Polymerase-Kettenreaktion in einem Puffer durchgeführt, um Extensionsprodukte 22 in einer Probenlösung bereitzustellen. Die Probenlösung enthält zusätzlich zu den Extensionsprodukten ebenfalls ddNTPs 24, Polymerase-Enzym 26, Salze und weitere Komponenten. In Schritt 2 wird die Probenlösung in das Aufnahmegefäß 110 über dem Elektrophoresemedium, das die immobilisierten Fangsonden 120 enthält, verbracht. Die Unterseite des Elektrophoresemediums steht in Kontakt mit einem Elektrophoresepuffer, der in der Sammelkammer 130 enthalten ist. Ein elektrisches Feld zwischen Aufnahmegefäß und der Sammelkammer 130 wird angelegt. Die ddNTPs 24, das Polymerase-Enzym 26 und die weiteren Nichttarget-Komponenten der Untersuchungsprobe passieren den Elektrophoresepuffer 30, während die Extensionsprodukte 22 mit den Fangsonden hybridisieren und einen Hybridisierungskomplex 222 bilden, der in der Gel-Matrix eingefangen wird. Der Elektrophoresepuffer wird entfernt und Denaturierungspuffer wird sowohl in das Aufnahmegefäß 110 als auch in die Sammelkammer 130 verbracht. In Schritt 3 besitzt die Sammelkammer eine semipermeable Membran 132 an der Öffnung an ihrer Basis 135. Die Vorrichtung wird Denaturierungsbedingungen ausgesetzt, um das Extensionsprodukt 22 von dem Hybridisierungskomplex 222 freizusetzen, was ihm den Eintritt in die Sammelkammer 130 erlaubt. Die semipermeable Membran verhindert, dass die Extensionsprodukte 22 in die untere Elektrodenkammer 140 eindringen, bis der überschüssige Puffer entfernt ist. Die Extensionsprodukte können dann auf einen automatischen Sequenzierer für eine DNA-Sequenzierung geladen werden.
In einer alternativen Anwendungsform zur Bereitstellung einer gereingten DNA-Probe zur Sequenzierung, die nicht in den Figuren dargestellt ist, wird die im Gel eingefangene DNA-Sequenz direkt in eine Kapillare oder einen automatisierten Sequenzierer geführt, was die Elution und oben beschriebene Wiederfindungsschritte vermeidet. Zum Beispiel können Acrydite-Kügelchen mittels Herstellen einer Hybrigel-Lösung (40% Acrylamid (29:1 Acrylamid-Monomer; Bis-Acrylamid) und 10 × TBE (90 mM Tris-Borat-EDTA Puffer, pH 8,3; Reagenzien wurden von Biorad Laboratories, Inc. Hercules, CA, erworben) hergestellt werden. Eine Fangsonde, die aus einem Acrylamid-Phosphoramidit-Derivat (Acrydite^TM Polymer, von Mosaic Technologies, Inc., Boston, MA, erhältlich) hergestellt ist, wird dann zugegeben. Polymerisierung wird durch Zugabe von 10% Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'-Tera-methyl-ethylendiamin (TEMED; BioRad, Hercules, CA) gestartet. Tröpfchen mit etwa 1,0 μl bis etwa 10,0 μl werden in Öl pipettiert und eine Polymerisierung kann bis zur vollständigen Bildung der Kügelchen ablaufen. Ein Kügelchen mit der erwünschten Fangsonden-Sequenz kann in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte, in eine Spitze oder in eine ähnliche nicht interferierende Träger-Vorrichtung verbracht werden. Eine zu reinigende und zu konzentrierende Probe wird auf die obere Seite des Kügelchens geführt. Dann wird ein Spannungsgradient durch das Kügelchen bei Vorhandensein eines Elektrophorese-Puffers unter Verwendung von Platinelektroden und einer Stromquelle angelegt. Die Probe wird im Kügelchen einer Elektrophorese unterzogen und es erfolgt das Einfangen der zur Fangsonden-Sequenz komplementären Sequenz. Das Kügelchen in kleinem Puffervolumen wird dann auf die Elektrode des Sequenzierers gegeben. Die zur Sequenzierung eingesetzten Hochspannungen sind hinreichend, den Target/Fangsonde Hybridisierungskomplex zu denaturieren und die DNA-Sequenz wandert aus dem Hybrigel-Kügelchen durch die Flüssigkeit in die Kapillare.
Unter Bezugnahme auf 3A ist ein Verfahren zur Reinigung der Produkte einer Mehrfachreaktion unter Anwendung einer Anwendungsform der Vorrichtung dargestellt. In einer Mehrfachreaktion werden beide Stränge eines doppelsträngigen Oligonukleotids im selben Gefäß unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Primer repliziert. Folglich wird eine Vielzahl an Oligonukleotid-Fragmenten synthetisiert. Ein Plasmid mit einem doppelsträngigen Insert, das repliziert werden soll, wird bereitgestellt. Der Vorwärts- und der Rückwärts-Primer replizieren jeweils ihre entsprechenden Templates. Jeder erzeugt eine Reihe an Oligonukleotid-Fragmenten mit verschiedener Länge. Typischerweise werden überlappende Sequenzen, wie in 3A dargestellt, hergestellt. Die vom Vorwärts-Primer erzeugten Oligonukleotid-Fragmente werden von den vom Rückwärts-Primer erzeugten Oligonukleotid-Fragmenten unter Verwendung einer Reinigungseinheit der Vorrichtung getrennt. Eine Vorwärts-Fangsonde-Spitze 40 wird auf eine Rückwärts-Fangsonde-Spitze 50 gesteckt und Elektrophoresepuffer wird zugegeben. Die Untersuchungsprobe von der Mehrfachreaktion wird auf das Aufnahmegefäß der Vorwärts-Fangsonde-Spitze 40 gegeben und durch beide Spitzen unter Einfluss des elektrischen Feldes gezogen. Oligonukleotid-Fragmente werden von ihren entsprechenden Fangsonden eingefangen, wie es mit den in 3B und 3C gezeigten Fotografien der Gele gezeigt ist. Alternativ kann die Probe vor Einführen der Probe auf den Sonde-Gel-Spitze-Stapel einer Elektrophorese unterzogen werden, z.B. durch eine Gel-beladene Spitze vorgereinigt werden, um von der Mehrfachreaktion zurückbleibende unerwünschte Komponenten zu entfernen.
Die Vorrichtungen der Erfindung sind zur selektiven Konzentrierung eine mutierten Nukleinsäure, von der bekannt ist, dass sie für eine Krankheitsnachweis aufschlussreich ist, besonders zweckdienlich. Zusätzlich finden gereinigte Target-Moleküle eine Anwendung bei Fingerabdruck-, Gewebetypisierungs- und forensischen Anwendungen, Mutterschafts- und Vaterschaftstests, fötaler Geschlechtsbestimmung wie auch bei der qualitativen Kontrolle in der Landwirtschaft, Nahrungsmittelindustrie und pharmazeutischer Industrie.
Durch Vergleich der DNA-Sequenz, die in einer unbekannten Probe gefunden ist, mit bekannten DNA-Sequenzen können Diagnoseverfahren entwickelt werden, die auf der Identifizierung von mutierten Sequenzen beruhen, die für eine Prädisposition für Krebs oder für das Potenzial der Entwicklung einer genetischen Erkrankung charakteristisch sind. Zum Beispiel kann in einem Krebs-Detektionsassay die mutierte Nukleinsäure, die für eine Krebszelle charakteristisch ist, in neoplastischem Gewebe, wo der Krebs seinen Ursprung hat, wie auch in anderen biologischen Proben in Abhängigkeit des Krebsstadiums, der Krebsart und des kanzerösen Gewebes gefunden werden.
Spezifischer, bestimmte Deletionsmuster oder Punktmutationen, z.B. Basenaustausch, in Gensequenzen sind für verschiedene Stadien des Colorektalkarzinoms charakteristisch. Stuhlproben sind verwendet worden, um colorektale Krebszellen durch Unterscheiden der mutierten DNA-Sequenzen, die für die Krankheit charakteristisch sind, nachzuweisen. Für ein Beispiel siehe Vogelstein et al., United States Patent, Nr. 5.380.645 , 5.580.729 und 5.910.407 . Wenn ein kanzeröses Gewebe metastasiert, können mutierte Nukleinsäure-Sequenzen im Blut und in den Lymphknoten gefunden werden. Verglichen mit der Menge an normaler Nukleinsäure-Sequenz, ist allerdings die mutierte Oligonukleotid-Sequenz in sehr geringen Mengen vorhanden, typischerweise in einer Menge geringer als 10% der vorliegenden Gesamtmenge. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Konzentrierung des mutierten Oligonukleotids bereit, um eine genaue Sequenzbestimmung für den Krankheitsnachweis zu erlauben.
Ein Verfahren zur Verwendung der erfundenen Vorrichtung umfasst die Gewinnen einer Blutprobe, Isolieren der Nukleinsäure, z.B. DNA, aus der Probe und Reinigen und gegebenenfalls Konzentrieren der Nukleinsäure. Dies kann erreicht werden durch Verbringen der Nukleinsäure-Untersuchungsprobe, die durch Extraktion des Bluts erhalten wird, in das Aufnahmegefäß einer Vorrichtung, die ein Elektrophoresemedium mit einer kovalent gebundenen Fangsonde enthält, die für die Target-Nukleinsäure-Sequenz spezifisch ist, um eine Hybridisierung mit der Fangsonde zu erlauben. Die Nukleinsäure kann von der Sonde entfernt und gegebenenfalls amplifiziert werden, um hinreichend Nukleinsäure für eine Sequenzierung zu liefern. Alternativ kann sie direkt sequenziert werden. Konzentrierung der Probe kann erreicht werden unter Verwendung einer kleinen Menge an Puffer, wenn die freigesetzte Target-Nukleinsäure-Sequenz vom Hybridisierungskomplex gesammelt wird.
Verfahren zur Entwicklung optimaler Bedingungen für Verfahren zur Reinigung von Target-Nukleinsäuren sind ebenfalls im Rahmen der Erfindung. Target-Nukleinsäuren, besonders mutierte Target-Nukleinsäuren, von denen bekannt ist, dass sie für einen Krankheitsnachweis aufschlussreich sind, können am effektivsten gereinigt werden, wenn die Bedingungen optimiert sind, die das Einfangen von Target-Nukleinsäuren und Elution der Target-Nukleinsäuren beeinflussen.
Kits, die Vorrichtungen der Erfindung enthalten, die für die Durchführung der beschriebenen Verfahren zweckdienlich sind, sind ebenfalls angedacht. Ein Kit zur schnellen Präparation von DNA-Sequenzprodukten für die Kapillarelektrophorese kann einen Behälter mit Gel-beladenen Spitzen und einen Behälter mit Sonden-Gel-Spitzen enthalten. Es kann ebenfalls Elektroden in der geeigneten Größe für die Spitzen und ein Behälter mit Elektrophorese-Puffer und/oder eine Stromquelle zum Anschließen an die Elektroden enthalten.
Ein Kit zur beschleunigten Multiplex-Reaktion kann einen Behälter mit Sonde 1-Gel-Spitzen (welche ein Vorwärts-Primer Sequenzkomplement sein kann) und einen Behälter mit Sonde 2-Gel-Spitzen (welche ein Rückwärts-Primer Sequenzkomplement sein kann) enthalten. Zusätzlich kann das Kit einen Behälter mit Gel-beladenen Spitzen, Elektroden, eine Stromquelle und Puffer oder eine beliebige Kombination dieser Komponenten enthalten.
Ein Kit zur Beschleunigung der Detektion von mutierter DNA, die für die mit kanzerösem Gewebe assoziierte DNA-Sequenz charakteristisch ist, ist ebenfalls angedacht. Ein derartiges Kit kann einen Behälter mit Sonde-Gel-Spitzen umfassen, wo die Sonden-Sequenz, die in den Elektrophoresemedien immobilisiert ist, zu einer mutierten DNA-Sequenz komplementär ist, von der bekannt ist, dass sie mit einer bestimmten Krebsart assoziiert ist.
Jedes der Kits kann so konfiguriert sein, dass es Vorrichtungen mit mehreren Reinigungseinheiten enthält.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Reinigung eines zu der M13mp18 Sequenz komplementären Einzel-DNA-Produkts
5 ist eine Fotografie eines Gels, das die Ergebnisse der Reinigung einer gewünschten Oligonukleotid-Sequenz aus einer DNA-Sequenzierungsreaktion zeigt, die Primer, Salze, nicht eingebaute Nukleotide und Dye-Terminatoren umfasst. Zuerst wurde die in der Sequenzierungsreaktion verwendete DNA, mit Hilfe einer Gel-beladenen Spitze gereinigt, um eine Rohprobe zu erhalten und dann wurde die Rohprobe mit Hilfe einer Fangsonde-Gel-Spitze gereinigt. Spur 1 zeigt das Muster vor der Reinigung. Spur 2 zeigt das Muster nach der Reinigung unter Verwendung einer Gel-beladenen Spitze. Die Entfernung des DNA-Templates ist dargestellt. Spur 3 zeigt das Muster, das nach Reinigung unter Verwendung einer Fangsonde-Gel-Spitze gesehen wird. Die Lokalisierung der gewünschten Sequenz in Abwesenheit eines DNA-Templates ist gezeigt worden.
A. Herstellung einer Trennvorrichtung mit (Sonde-Gel-Spitze) und ohne (Gel-beladene Spitze) immobilisierter Fangsonde.
Die Herstellung der Sonde-Gel-Spitze, einer Reinigungsvorrichtung, die Acrydite^TM Oligonukleotid-Gel enthält, wurde folgendermaßen durchgeführt:
Eine Hybrigel-Lösung wurde aus Stammlösungen von 40% Acrylamid (29:1 Acrylamid-Monomer:Bis-Acrylamid) und 10 × TBE (90 mM Tris-Borat-EDTA Puffer pH 8,3; die Reagenzien wurden von Biorad Laboratories, Inc.; Hercules, CA bezogen) hergestellt. Das Acrydite^TM Oligonukleotid für die Fangsonde wurde unter Verwendung von Oligonukleotiden (erhalten von Operon Technologies, Inc.; Alameda, CA) und Acrylamid-Phosphoramidit (Acrydite^TM Polymer erhältlich bei Mosaic Technologies, Inc.; Waltham, MA) gemäß dem United States Patent Nr.: 5.641.658 und dem Artikel von Kenney, Ray und Boles, BioTechniques 25, 516–521 (1998) synthetisiert. Das Hybrigel enthält 5% Acrylamid (29:1), 1 × TBE und 10 μM Acrydite^TM Oligonukleotid-Fangsonde mit der folgenden Sequenz:
5'-Acrylamid GCT GAG ATC TCC TAG GG 3' (Sonde 1) (SEQ ID NR.: 1).
Die für dieses Beispiel ausgewählte Sonde hat eine Sequenz, die zu einem Teil des Polylinkers des Vektors M13mp18 komplementär ist, welcher das Target-Molekül liefert, ein Produkt einer DNA Sequenzierungsreaktion, wobei aber die Fangsonde kein Teil der Primer-Sequenz umfasst. Wenn 10% Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'-Tera-methylethylendiamin (TEMED; BioRad, Hercules, CA) zu der Hybrigel-Lösung gegeben wurde, erfolgte die Polymerisation schnell (innerhalb 2 Minuten).
Um die Sonde-Gel-Spitze herzustellen, wurden 1 μl 10% Ammoniumpersulfat und 0,5 μl TEMED zu 200 μl Hybrigel-Lösung gegeben. 10 μl der polymerisierenden Oligonukleotid haltigen Hybrigel-Lösung wurden schnell in eine 200 μl Spitze (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA) pipettiert und polymerisieren gelassen. Die Sonde-Gel-Spitzen wurden zu 8 oder zu 12 auf einmal mit Hilfe einer Multipipettiervorrichtung hergestellt (200 μl Einmal-Pipettenspitzen und Multipipettiervorrichtungen sind bei Gilson, Middleton, WI erhältlich). Zur Lagerung wurden die Sonde-Gel-Spitzen in Mikroröhrchen Spitzen verbracht, die annähernd 0,3 ml 1 × TBE enthielten. Dies muss mit Vorsicht durchgeführt werden, um das Gel nicht aus der Spitze zu drücken. Dann wurden die Sonde-Gel-Spitzen mit 150 μl 1 × TBE überschichtet.
Die Gel-beladenen Spitzen wurden verwendet, um Template-DNA zu entfernen. Gel-beladene Spitzen wurden hergestellt, die nur Acrylamid (29:1) enthalten (d.h. ohne Acrydite^TM Fangsonden). Die Gel-beladenen Spitzen wurden, wie oben beschrieben, unter Verwendung einer Lösung, die 5% Acrylamid (29:1), 1 × TBE enthält, hergestellt aus Stammlösungen von 40% Acrylamid (29:1 Monomer:Bis) und 10 × TBE. 10% Ammoniumpersulfat und TEMED wurden zu der Lösung gegeben und 200 μl der fertigen Lösung wurde in jede Spitze pipettiert. Gel-beladene Spitzen können ebenfalls, wie oben beschrieben, gelagert werden.
B. Herstellung eines DNA-Sequenz-Produkts und Fangsonden
PE-Applied Biosystems Sequenzierungsprodukte wurden nach dem Protokoll von PE Applied Biosystems BigDye Primer Cycle Sequencing Kit (erhältlich bei PE-Applied Biosystems, Wellesley, MA) mit dem –21 M13 Vorwärts-Primer in einem GeneAmp 2400 unter Verwendung der von PE Applied Biosystems empfohlenen Zyklus-Bedingungen hergestellt. Vektor M13mp18 wurde verwendet. Ein DNA-Abschnitt mit einer bekannten Sequenz war nach der Primerstelle inseriert. Extensionsprodukte wurden hergestellt. Fangsonden für die Region zwischen dem Primer und der inserierten DNA wurden hergestellt. Fangsonden, die in der Lage sind, an Extensionsprodukte des Vorwärts-Primers zu hybridisieren, wurden ausgewählt. Die Fangsonden umfassen ein Oligonukleotid mit an dem 5' Ende synthetisierten Acrydite^TM.
Alternativ kann das DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit von Amersham-Pharmacia verwendet werden.
C. Einfangen des DNA-Sequenz-Extensionsprodukts
Elektrophoretisches Einfangen und Trennen eines gewählten Extensionsprodukts (Target in Untersuchungsprobe) wurde folgendermaßen durchgeführt: 10 μl Sequenzierungsreaktionslösung (d.h. ½ einer Reaktion), die Primer, Salz, nicht eingebaute Nukleotide, Dye-Terminatoren, Template-DNA und die von der Template-DNA synthetisierten Target-DNA Extensionsprodukte wurden zu 1 μl 10 × Ficoll Ladepuffer (35% Ficoll 400, 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylolcyanol, 100 mM EDTA) gegeben, um eine Probenlösung zu erhalten. Ein Volumen von annähernd 200 μl Elektrophoresepuffer wurde auf die Oberfläche des Gels in der Gel-beladenen Spitze geschichtet, wohingegen ein geringeres Volumen, das hinreichend ist, um die Oberfläche feucht zu halten und einen elektrischen Kontakt zu liefern, auf die Oberfläche der Sonde-Gel-Spitze geschichtet wurde. Die Probelösung wurde auf die Oberfläche des Gels geschichtet, das in einer Gel-beladene Spitze ist (d.h. ohne Acrydite^TM Fangsonde), um Template-DNA zu entfernen. Diese Spitze wurde auf eine Sonde-Gel-Spitze, eine Hybrigel haltigen Spitze, gesteckt, wie es in 4A gezeigt ist. Ein geringes Volumen an Elektrophoresepuffer wurde auf die Geloberfläche in der Sonde-Gel-Spitze geschichtet und die Gel-beladene Spitze wurde mit dem Elektrophoresepuffer in Kontakt gebracht. Folglich wurde eine flüssige Verbindung zwischen den beiden Gelen gebildet, was eine elektrische Verbindung ermöglichte, wenn die Elektroden und Spannungsquelle angeschlossen waren.
Nachdem die Probenlösung auf die Geloberfläche der Gel-beladenen Spitze geladen war, wurden beide Spitzen in Mikroröhrchen (1,5 ml), die 1 × TBE, Elektrophoresepuffer enthalten, verbracht. Platin-Elektroden wurden oben und unten in den Elektrophoresepuffer gestapelten Gel-Spitzen gesteckt und eine Spannung von 100 V wurde für 10 Minuten angelegt. Die obere Elektrode wird mit dem negativen Pol der Stromquelle verbunden, während die untere Elektrode mit dem positiven Pol der Stromquelle verbunden wurde. Die Gel-beladene Spitze liefert folglich eine partiell gereinigte Probenlösung zur Einführung in die Sonde-Gel-Spitze. (An dieser Stelle kann die Gel-beladene Spitze verworfen werden.) Die kleineren DNA-Fragmente wandern wesentlich schneller in den Puffer und dann in die Sonde-Gel-Spitze als die Template-DNA und die Farbstoffe, die in der Gel-beladenen Spitze verblieben sind.
Der auf der Sonde-Gel-Spitze verbliebene Elektrophoresepuffer wird entfernt. Der Elektrophoresepuffer wurde durch 4 μl Formamid-Ladepuffer (5:1 deionisiertes Formamid, 25 mg/ml Dextranblau, 25 mM EDTA) ersetzt. Die Temperatur im Gel in der Sonde-Gel-Spitze wurde auf 55°C erhöht, indem die Mikroröhrchen-Spitzen, die das untere Puffer-Reservoir enthalten, in ein Trockenbad (VWR) verbracht wurden, um das Ablösen der Target-Oligonukleotid-Sequenz von der Fangsonde zu erleichtern. Eine saubere zweite Gel-beladene Spitze mit einem 30% Acrylamid-Gel, das 5% Acrylsäure enthält, wurde in den Formamid-Farbladepuffer gesenkt. Eine Platin-Elektrode wurde in die obere Gel-beladene Spitze platziert. Die Stromrichtung wurde umgekehrt, um die vom Hybridisierungskomplex freigesetzten Oligonukleotide nach oben migrieren zu lassen. Eine (1) Minute bei 40 V war hinreichend, um die Oligonukleotide aus der Sonde-Gel-Spitze und in den Formamid-Farbladepuffer migrieren zu lassen. Eine 4 μl Probe wurde mit Hilfe einer Pipette entfernt und für eine Sequenzanalyse zurückgehalten. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in der Sonde-Gel-Spitze unter Verwendung eines Molecular Dynamics Fluorimager 595 visualisiert. Die in 4B dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Einfangen in der oberen Oberfläche des Gels in der Sonde-Gel-Spitze stattfindet.
D. Sequenz-Reinigungsanalyse mittels Hybrigel-Assay
Glasplatten wurden für ein vertikales Polyacrylamid-Minigel (10 × 10 cm, 0,75 mm Abstandshalter) zusammengebaut und das Sandwich wurde mit 20% Acrylamid (29:1; BioRad), 1 × TBE (90 mM Tris-Boratpuffer, pH 8,3; 2 mM EDTA) annähernd zur Hälfte gefüllt. Die Polymerisation wurde durch Zugabe von 10% wässrigem Ammoniumpersulfat (APS) und TEMED 1/100 beziehungsweise 1/1000 Gelvolumen gestartet. Für Gele, die eine Fangschicht enthalten, wurde 600 μl Gellösung (20% Polyacrylamid, 1 × TBE, 4 μl 10% APS und 4 μl TEMED), die Acydite^TM-markierte Oligonukleotide mit einer Endkonzentration von 10 μM enthält, polymerisiert. Nach der Polymerisation der Fangschicht wurde der verbliebene Raum in dem Plattensandwich mit einem 5% Gel gefüllt. Dieses zusammengesetzte Gel wurde in eine Minigel-Apparatur eingebaut, die 1 × TBE enthält, und einer Elektrophorese bei 100–150 V für ~ 45 Min. unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Hilfe eines Molecular Dynamics Fluorimager 595 visualisiert. Die Ergebnisse bestätigen, dass die mittels Hybrigel-Sonde eingefangene Sequenz das Komplement der Template-DNA ist.
E. Automatisierte Sequenzierung des eingefangenen Oligonukleotids
Nach Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens und Analyse der Sequenz der mittels der erfundenen Vorrichtung gereinigten Oligonukleotide mit einem automatisierten Sequenzierer haben mit Standard-Vektoren wiederholte Experimente gezeigt, dass die Genauigkeit der Sequenzierung der ersten 500 Nukleotide 100% erreicht. Die lesbare Sequenz umfasste mindestens 750 Nukleotide.
BEISPIEL 2
Gleichzeitige Trennung multipler DNA-Sequenzprodukte
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfundene Vorrichtung und das Verfahren für eine Sequenzierung eines in einem Plasmid replizierten Oligonukleotid-Inserts zweckdienlich ist. Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärts-Primer werden, wie in 3A dargestellt, verwendet. Ein Plasmid mit einem langen Insert wurde unter Verwendung zweier Primer in einem Reaktionsgefäß gleichzeitig sequenziert. Zwei Sonde-Gel-Spitzen, wobei jede eine unterschiedliche Fangsonde enthält, wurden hintereinander arrangiert. Die Sonden-Sequenzen wurden basierend auf den verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Primer gestaltet. Mit dem in 5 dargestellten Gel wurde die Reinigung der zwei Oligonukleotid-Targets in der Untersuchungsprobe im Vergleich zu dem Rohprodukt dargestellt. Es ist hervorzuheben, dass die Sequenz des Rückwärts-Produkts (rechts) keinerlei Kontamination mit der Vorwärts-Sequenz zeigt. Ebenfalls ist hervorzuheben, dass eine DNA-Template Kontamination entfernt wird.
A. Herstellung einer Trennvorrichtung mit und ohne immobilisierter Fangsonde
Gel-beladene Spitzen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
Sonden-Gel-Spitzen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, außer dass eine mit einem Vorwärts-Primer (Sonde 2) und die andere mit einem Rückwärts-Primer (Sonde 3), wie in 3A gezeigt, versehen war. Folglich wurden zwei getrennte Hybrigel Sonde-Gel-Spitzen hergestellt, eine mit Acrydite-Oligonukleotid 6269-17ac (Seq ID NR.: 2) und die andere mit Acrydite-Oligonukleotid 6231-19ac (Seq ID NR.: 3). Plasmid pB98, welches Plasmid Vektor pGEM3Zf(–) (Promega Biotech, WI) mit einem 3,8 kb Insert in der XbaI-Stelle des Polylinkers ist, wurde verwendet. Die zwei Sonden stammen von Sequenzen von jeder Seite der XbaI-Stelle innerhalb des Polylinkers ab. Sonde 6269-17ac ist komplementär und deshalb in der Lage, Sequenzprodukte, die mit Hilfe des Rückwärts-Primers hergestellt wurden, einzufangen. Ähnlicherweise kann Sonde 8231-19ac Sequenzen vom Vorwärts-Primer einfangen.
Folglich ist an jede Oligonukleotid-Primersonde am 5'-Ende Acrydite synthetisiert und in der Lage, an ein Extensionsprodukt zu binden. Jede Fangsonden-Sequenz ist sowohl zu einer Extensionsprodukt-Sequenz als auch zu dem Primer komplementär. Jede Fangsonden-Sequenz ist für einen bestimmten Vektor spezifisch, der von der Region zwischen Primer-Stelle und Insert-DNA abgeleitet ist.
B. Reinigung von Produkten aus multiplen Reaktionen
Eine Sonde2-Gel-Spitze wurde tandemartig (gestapelt) in eine Sonde3-Gel-Spitze, wie in 3A dargestellt, verbracht. Elektrophorese-Laufpuffer wurde auf die Oberseite der Sonde3-Gel-Spitze gegeben, um einen elektrischen Kontakt herzustellen und ein Austrocknen zu verhindern. Die Untersuchungsprobe aus einer Mutiplex Sequenzierungsreaktion wurde einer Elektrophorese sowohl durch die Sonde2-Gel-Spitze als auch durch die Sonde3-Gel-Spitze unterzogen. 3B zeigt das Einfangen in den zwei getrennten Spitzen durch die beiden unterschiedlichen Sonden.
BEISPIEL 3
Elution des Targets von der Fangsonde unter Verwendung eines Temperaturgradienten
Das folgende Verfahren kann angewandt werden, um die optimale Temperatur zum Einfangen und für die Elution zu bestimmen.
Die Stabilität des Hybridisierungskomplexes ist von der Temperatur abhängig. Ein vertikales Gel, das eine Schicht an Acrydite^TM Fangsonde enthält, die sandwichartig zwischen Gelschichten ohne Fangsonden liegt, wurde hergestellt. Das Gel für die obere und untere Schicht war auch für die Gel-beladene Spitze verwendet. Die Acrydite-Sondenschicht wurde, wie in Beispiel 1 für die Sonden-Gel-Spitze beschrieben, unter Verwendung der Fangsonden-Sequenz 6249-17ac (Seq ID NR.: 4) hergestellt. Die Probe war in diesem Fall ein fluoreszierendes Oligonukleotid mit einer zu 6249-17ac komplementären Sequenz. In jede Vertiefung wurde die gleiche Probe geladen. Das gesamte Gel wurde einem Temperaturgradienten mit Hilfe einer Aluminiumrückplatte und zweier Wasserbäder ausgesetzt. Die Geltemperatur links beträgt 23°C. Die Temperatur stieg über die Gelfläche bis auf 53°C auf der rechten Seite an. Bei geringen Temperaturen wurde das Target effizient im oberen Bereich der Fangschicht eingefangen. Wenn die Temperatur erhöht war, war das Einfangen des Targets gehemmt bis die Probe rechts durch die Schicht läuft. Die Transitionstemperatur, d.h. die Temperatur bei der das Target aufhört eingefangen zu werden, ist in Beziehung zu T_m. Temperaturen unter dieser Transitionstemperatur sind für das Einfangen zweckdienlich, während jene oberhalb dieser Transitionstemperatur zweckdienlich für die Elution sind.
BEISPIEL 4
Abhängigkeit der Elution der Sequenz von Temperatur und Größe der Fangsonde
Um die Temperaturbedingungen für das Einfangen und die Elution von Sequenzierprodukten zu definieren, wurde das in 7 gezeigte Experiment durchgeführt. Dieses Experiment zeigt, dass die Elutionstemperatur von der Größe der Fangsonde beeinflusst ist. Von der Elutionstemperatur wurde gezeigt, dass sie von der Größe der Fangsonde beeinflusst ist. Die fünf in 7 gezeigten Panels zeigen den gleichen vertikalen Gel-Lauf bei fünf unterschiedlichen Temperaturen beginnend mit 23°C, worin fünf unterschiedliche Fangsonden verwendet wurden. Die Anzahl an Basen in jeder Sondensequenz beträgt 13, 15, 17, 19 und 21 Nukleotide, wie in 7 (von links nach rechts) angegeben. Eine M13 Sequenzierungsreaktion (Dynamic^TM ET) wurde in jede Spur geladen. Das 13mer fing bei 23°C nicht gut, während die anderen alle einfingen. Bei 30°C setzte das 15mer die Sequenz frei, während das 17mer bei 35°C freisetzte, und so weiter, bis bei 50°C alle Target-Sequenzen freigesetzt wurden. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Temperaturbedingungen zum Einfangen und Eluieren von Sequenzprodukten.
Die 17mer Acrydite^TM Sonde wurde als Fangsonde in den Standardverfahren mit einer bei 45°C stattfindenden Elution gewählt.
Während diese Erfindung mit Bezug auf die bevorzugten Anwendungsformen besonders gezeigt und beschrieben worden ist, versteht der Fachmann, dass verschiedene Änderungen in Form und Details hier gemacht werden können, ohne den Rahmen der Erfindung, der von den anhängigen Ansprüchen umfasst ist, zu verlassen.

Claims

Gerät zur Reinigung eines Target-Nukleinsäuremoleküls aus einer Untersuchungsprobe, umfassend mindestens eine Reinigungseinheit, wobei die Reinigungseinheit einen Kanal einschließt, umfassend: (a) eine erste Zone, die ein Gefäß zum Aufnehmen einer Probe einschließt; (b) eine zweite Zone, die ein Elektrophoresemedium mit mindestens einer immobilisierten Fangsonde, ausgewählt, um an die Target-Nukleinsäure zu hybridisieren, wobei die Fangsonde an das Elektrophoresemedium copolymerisiert ist, einschließt; und (c) eine dritte Zone, die eine Sammelkammer zum Aufnehmen der Untersuchungsprobe, die die zweite Zone durchläuft, wobei die zweite Zone die erste Zone von der dritten Zone trennt, einschließt.
Gerät gemäß Anspruch 1, weiter umfassend eine Mehrzahl von Reinigungseinheiten.
Gerät gemäß Anspruch 2, wobei das Gerät eine Mikrotiter-Platte und jede Reinigungseinheit ein Mikrotiter-Well ist.
Gerät gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 3, wobei die Sammelkammer eine Austrittsöffnung hat.
Gerät gemäß Anspruch 4, wobei die Austrittsöffnung eine semipermeable Membran umfasst.
Gerät gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 3, umfassend eine Mehrzahl identischer Fangsonden.
Gerät gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 3, umfassend eine Mehrzahl unterschiedlicher Fangsonden.
Verfahren zur Reinigung eines Target-Nukleinsäuremoleküls aus einer Untersuchungsprobe, umfassend die Schritte: (a) Einbringen einer Untersuchungsprobe, die das Target-Nukleinsäuremolekül enthält, in das Gefäß eines Reinigungsgerätes, umfassend (1) eine erste Zone, die ein Gefäß zum Aufnehmen einer Probe einschließt; (2) eine zweite Zone, die ein Elektrophoresemedium mit mindestens einer immobilisierten Fangsonde, ausgewählt, um an die Target-Nukleinsäure zu hybridisieren, wobei die Fangsonde an das Elektrophoresemedium copolymerisiert ist, einschließt; und (3) eine dritte Zone, die eine Sammelkammer zum Aufnehmen der Untersuchungsprobe, die die zweite Zone durchläuft, wobei die zweite Zone die erste Zone von der dritten Zone trennt, einschließt; und (b) Aussetzen des Elektrophoremediums einem elektrischen Feld, was zur Migration der Untersuchungsprobe durch das Medium führt, unter Bedingungen, die geeignet sind für das Target-Molekül in der Untersuchungsprobe, um an die Fangsonde zu hybridisieren, wodurch ein Target-Molekül/Fangsonden-Komplex gebildet wird, und für die restlichen Komponenten der Untersuchungsprobe, um hindurchzuwandern und vom Medium zu eluieren.
Verfahren gemäß Anspruch 8, weiter umfassend die Behandlung des Elektrophoresemediums zum Freisetzen des Target-Moleküls.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Target-Molekül aus dem Elektrophoresemedium freigesetzt wird durch eine Behandlung, ausgewählt aus Erhöhung der Temperatur des Elektrophoresemediums auf eine Temperatur, die genügt, um den Target-Molekül/Fangsonden-Komplex zu denaturieren, Aufspalten der chemischen Bindung, wodurch die Fangsonden im Elektrophoresemedium immobilisiert werden, und Erhöhung der elektrophoretischen Feldstärke auf einen Wert, der genügt, um den Target-Molekül/Fangsonden-Komplex zu spalten.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Target-Molekül in das Gefäß freigesetzt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8, 9 und 10, weiter umfassend das Verstärken des Target-Moleküls.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Probe eine Stuhlprobe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, weiter umfassend das Analysieren der Target-Nukleinsäuremoleküle, um das Vorhandensein von kolorektalem Karzinom festzustellen.
Verwendung einer Target-Nukleinsäure, gereinigt durch ein Gerät gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Target-Nukleinsäure eine mutierte Nukleinsäure ist, zur Feststellung einer Erkrankung beim Menschen.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei (a) die Erkrankung Krebs ist; oder (b) die Erkrankung kolorektales Karzinom ist.