JPH0751099A - 核酸配列検査方法及び検査装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 測定対象物である培養菌などを、前処理する
ことなく直接固相担体である膜に固定でき、そのまま試
薬を注入するだけで各工程処理を行うことができ、短時
間で多量の検体を高感度に検出できる核酸検査方法及び
検査装置を提供する。 【構成】 合成樹脂からなる筒状体の一方の開口部を閉
塞するように、少なくとも表面が親水性かつカチオン性
である多孔質膜を接着又は圧着して底部となしたウェル
型多孔質膜プレート１０を用い、その多孔質膜上に標的
核酸を固定した後、ハイブリダイゼーション法により試
料中の標的核酸を検出する。各工程でウェル１２に注入
した試薬は、真空吸引により多孔質膜を介して排出す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸ハイブリダイゼー
ション法により病原体や遺伝子を検出する方法及び装置
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子診断方法として、ＤＮＡプ
ローブを用いた核酸配列検査方法が提案されている。Ｄ
ＮＡプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション法
は、核酸の配列の相補性を利用した特異性の高い測定方
法であり、菌体中の核酸を抽出した後、ニトロセルロー
ス膜上に固定してハイブリダイゼーションを行うドット
ブロットハイブリダイゼーション法、核酸をそのまま又
は制限酵素で切断し電気泳動により分画し、ニトロセル
ロース膜などにトランスファーしてハイブリダイゼーシ
ョンを行うサザンブロット法などが知られている。

【０００３】しかし、このような核酸配列検査方法は、
検体から菌体を取り出した後、十分精製する必要があ
り、前処理段階でも操作が煩雑で長時間を要する。ま
た、膜上に固定した試料核酸とハイブリダイゼーション
を行う操作も膜の移し替えや試薬の交換など操作が煩雑
で、多検体を一度に処理する臨床検査には適していな
い。免疫検査によく使われるものとしてマイクロプレー
トがある。このマクロプレートの場合、操作性において
は優れているものの、試料中の高分子である核酸を直接
固定するには長時間を要する、膜に比べ固定できる核酸
量が少ないため検出感度が悪い、固定するためには必ず
検体の前処理が必要であるなどの問題があるため、迅速
で簡易な検査用には適していない。

【０００４】また、ウェル型診断用プレートとして特開
昭６３−１６７２６７号公報に示されたものがある。こ
のプレートは膜を親水性、半疎水性、疎水性膜で構成さ
れた三層構造にし、ウェル型多孔質膜プレートの形態と
することで、注入した溶液を長時間にわたって保持する
ことができる長所を有する。しかし、三層膜にすること
でコスト高になり、三層を構成する膜の材質の選択によ
っては発色用基質液と反応してしまいブランク値が高く
なる、あるいは多孔質膜プレートの形態にすると三層構
造故に前の液が完全には排出されないので常に共洗いを
する必要があるなどの短所もあった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の目的
は、測定対象物である培養菌などを、前処理することな
く直接固相担体である膜に固定でき、ハイブリダイゼー
ションやＢ／Ｆ分離工程においても膜を容器に移し替え
ることなく試薬を注入するだけで反応させうる専用容器
を用いて多検体を短時間で一度にハイブリダイゼーショ
ンし、高感度に検出できる核酸配列検査方法を提供する
ことである。本発明の第二の目的は、上記専用容器を設
置した後、各工程において試薬を注入するだけでハイブ
リダイゼーションなどが自動的に行われる検査装置を提
供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、親水性かつカチオ
ン性の多孔質膜を筒状体の一方の開口部の縁部に接着あ
るいは圧着して容器の形状に形成したウェル型多孔質膜
プレート、及びこのウェル型多孔質膜プレートの形状に
合った温度調整ユニット及び溶液排出手段を備える装置
を開発して、上記目的を達成することに成功し、本発明
を完成した。

【０００７】即ち、本発明の核酸配列検査方法は、酵素
などで標識したＤＮＡプローブ試薬でサンプル中の標的
核酸をハイブリダイゼーションせしめることにより、サ
ンプル中の標的核酸を測定する方法において、合成樹脂
からなる筒状体の一方の開口部を閉塞するように少なく
とも表面が親水性かつカチオン性である多孔質膜を開口
縁部に接着又は圧着して底部となしたウェル型多孔質膜
プレートを用い、その多孔質膜上に標的核酸を固定した
後、ハイブリダイゼーション法により試料中の標的核酸
を検出することを特徴とする。

【０００８】より詳細には、本発明の核酸配列検査方法
は、親水性かつカチオン性の多孔質膜プレートに試料を
付着させる工程と、試料が付着した多孔質膜プレートに
界面活性剤を含んだ酸又はアルカリ溶液を注入し試料を
溶菌、変性させる工程と、酸又はアルカリ溶液を排出し
た後、ブロック溶液を注入して多孔質膜表面をブロック
するプレハイブリダイゼーション工程と、ブロック溶液
排出後酵素標識したプローブを注入して試料中の核酸と
酵素標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハ
イブリダイゼーション工程と、プローブ液排出後洗浄液
を注入してＢ／Ｆ分離を行うＢ／Ｆ分離工程と、洗浄液
を排出後基質液を注入することにより発色又は発光反応
を行ない発色又は発光量を検知する検出工程とを含む。
多孔質膜への試料の付着は、サンプルがコロニーの場合
は試料を直接塗り付けることによって行われ、液体培養
サンプルの場合には試料を直接滴下することによって行
われる。

【０００９】本発明の核酸配列検査方法には、合成樹脂
からなる筒状体の一方の開口部を閉塞するように、少な
くとも表面が親水性かつカチオン性である多孔質膜を前
記開口部の縁部に接着又は圧着した１ウェル型多孔質膜
プレート、１ウェル型多孔質膜プレートを筒状体の側壁
で結合して直線的に複数個連結したストリップ型多孔質
膜プレート、又は上下が開口した複数の貫通孔をマトリ
ックス状に配列して形成した板状樹脂部材の一方の表面
に、前記複数の貫通孔の開口部を夫々閉塞するように少
なくとも表面が親水性かつカチオン性である多孔質膜を
前記開口部の縁部に接着又は圧着して形成したウェル一
体型多孔質膜プレートを用いる。

【００１０】前記ウェル型多孔質膜プレートは、各々が
加熱手段を有し、少なくとも一方が隣接面に凹部を有す
る上部金属ブロックと下部金属ブロックとからなる温度
調整ユニットを有する本発明の核酸配列検査装置に収納
して使用される。この温度調整ユニットの下部金属ブロ
ックは、所定の領域を囲み、その上に載置されるウェル
型多孔質膜プレートの底面と下部金属ブロックとの間に
密閉空間を形成するシールパッキング部を上面に有する
と共に、前記シールパッキング部で囲まれた領域と下部
金属ブロックの外部空間とを連通させる連通孔を有し、
吸引手段で連通孔を介して密閉空間を排気することでウ
ェル型多孔質膜プレートのウェル内の溶液を吸引排出で
きる。

【００１１】核酸配列検査装置は、溶菌及び／又は変性
工程、プレハイブリダイゼーション工程、ハイブリダイ
ゼーション工程、Ｂ／Ｆ分離工程、及び検出工程ごとに
温度、工程時間、溶液の排出を制御できる制御手段を含
むのが好都合である。通常核酸は負に帯電しているた
め、固定のための支持体である多孔質膜は正に帯電され
た膜の方が多量の核酸を固定でき、その結果感度も高く
なる。親水性かつカチオン性の多孔質膜の材質としては
ニトロセルロース、ナイロン、ポリ塩化ビニル等を使用
することができる。多孔質膜のポアサイズは、小さい方
が表面積も広くなり注入した液も保持しやすいが、目詰
まりなどのトラブルも考えられるため、通常０. ２２〜
３μｍが望ましい。

【００１２】

【作 用】ウェル型膜プレートとして親水性かつカチオ
ン性の多孔質膜を使用したことにより、負に帯電してい
る核酸サンプルを滴下するだけで、核酸は膜上で静電的
に結合し固定される。また、多孔質膜であるため、広い
表面積が確保され、より多量の核酸を固定することがで
きる。その結果、核酸検出の感度も高くなる。膜表面が
親水性であるため、液状サンプルを滴下するだけでサン
プルは膜に馴染み、またウェルに注入した試薬溶液を多
孔質膜を通して吸引排出することができる。

【００１３】本発明の核酸配列検査方法及び検査装置に
よれば、親水性かつカチオン性の多孔質膜を使用したこ
とにより、培養したサンプルを前処理なしで直接滴下あ
るいは塗り付けるだけで核酸の高感度検出ができる。ま
た、ウェル型膜プレートを使用するため、操作性が飛躍
的に向上し、短時間で多量の検体を処理できる。

【００１４】

【実施例】以下に、本発明による核酸配列検査方法及び
検査装置の一実施例を図面に基づいて詳細に説明する。
図１は、本発明で使用するウェル型多孔質膜プレートの
一例の外観図である。図１のウェル型多孔質膜プレート
１０はマイクロプレート状で、各ウェル１２の底面は多
孔質膜で形成されている。合成樹脂からなるマイクロプ
レート状容器の底面への多孔質膜の接着は、超音波接着
や熱融着などの方法で行われる。ウェルの容積は２００
〜４００μｌ程度、底面積は０．２〜０．８ｃｍ²程度
とするのが好ましい。

【００１５】親水性かつカチオン性の多孔質膜として
は、例えば市販のナイロンメンブレンを使用し、好まし
くは、ポール社製バイオダインＢやアマシャム製ハイボ
ンドＮ＋を用いる。多孔質膜の膜厚は１０〜５０μｍ程
度が好ましい。マイクロプレート状容器の本体は、ポリ
スチレン、６６ナイロン、ＰＶＣなどの合成樹脂から成
形される。

【００１６】ウェル型多孔質膜プレートの形状は、図１
に示すような９６ウェル一体型のものの他にも、図２に
示すような８ウェル毎のストリップ型、あるいは１個ず
つ分離した１ウェル型とすることもできる。どのタイプ
においても、ウェルの底面は各ウェルの底部開口円周に
接着させた多孔質膜で形成する。図３は、本発明の一実
施例による核酸配列検査装置に図１に示すウェル型多孔
質膜プレート１０を設置した状態を示す図である。この
核酸配列検査装置は、ウェル型多孔質膜プレート１０を
インキュベートするための温度調整ユニット２０、温度
調整ユニットを制御するためのコントローラ及びハイブ
リダイゼーションなどの各工程を開始するためのスイッ
チなどが設置された制御部５０を有する。温度調整ユニ
ット２０は、フック２１と孔２２の係合によって閉じた
状態を維持され、装置前面のレバー２３を押すと、フッ
ク２１と孔２２の係合が外れて、図３に示すように開い
た状態となる。

【００１７】図４は、温度調整ユニット２０の断面図で
ある。温度調整ユニット２０は、ウェル型多孔質膜プレ
ート１０中に注入された溶液を効率よく温度調整するた
めに、ウェル型多孔質膜プレート１０を熱伝導性の良い
上下の金属ブロック２４，２５で完全に囲う構造となっ
ている。熱伝導性金属ブロック材質としては、通常アル
ミニウムを用いる。上下の金属ブロックには、平面状ヒ
ーター２６が取り付けられ、ヒーターを制御するための
温度センサー２７が金属ブロックに組み込まれている。
それぞれのブロックのヒーター近辺には、金属ブロック
を冷却するためのファン２８が取り付けられている。ウ
ェル型多孔質膜プレート１０を下部金属ブロック２５に
設けられたシリコン等からなるシールパッキング部３２
上に設置後、カバー状の上部金属ブロック２４を閉める
ことにより、上部金属ブロック２４がウェル型多孔質膜
プレート１０の上面に接触し、熱伝導を効率よく行える
ように工夫されている。

【００１８】下部金属ブロック２５は、シールパッキン
グ部３２上に多孔質膜プレート１０を設置したとき、下
部金属ブロック２５と多孔質膜プレート１０の間に、ウ
ェル型多孔質膜プレート内の溶液を排出するための空間
２９が形成されるように構成されており、下部金属ブロ
ック２５には廃液をブロックより排出するための排出孔
３０が設けられている。排出孔３０の出口は、液を排出
するためのポンプと接続されている。下部金属ブロック
２５に設けられるシールパッキング部３２等のシール機
構はウェル型多孔質膜プレートの形状に応じて、即ちウ
ェル型多孔質膜プレート１０が９６ウェル一体型である
か、ストリップ型又は１ウェル型であるかによって異な
る。

【００１９】図５は、ウェル一体型多孔質膜プレートを
使用する場合のシール機構の例を示す断面図である。下
部金属ブロック２５には、ウェル一体型多孔質膜プレー
ト１０の外形寸法とほぼ同じ大きさのシールパッキング
部３２が設置されている。シールパッキング部３２で多
孔質膜プレート１０の外周をシールし、上部金属ブロッ
ク２４でカバーをすることで多孔質膜プレート内の溶液
部分と多孔質膜プレート下の廃液用空間２９がシールさ
れる。この状態で排出孔３０に接続したポンプによって
廃液用空間２９のエアーを吸引すると、空間２９が負圧
状態となって多孔質膜プレートのウェル１２内の溶液１
８がウェル底面の多孔質膜１１を通して排出される。

【００２０】図６は、ストリップ型又は１ウェル型の多
孔質膜プレートを使用する場合のシール機構の例を示
す。図６（ａ）はストリップ型又は１ウェル型の多孔質
膜プレートを下部金属ブロック上に設置した状態での断
面図であり、図６（ｂ）はストリップ型又は１ウェル型
タイプ多孔質膜プレートを固定するためのアダプタ４０
の上面図である。

【００２１】ストリップ型又は１ウェル型の場合のシー
ル機構は、ウェルを固定するためのアダプタ４０を含ん
でいる。アダプタ４０は、ポリプロピレン、ポリエチレ
ン、塩化ビニール、ポリスチレン等の合成樹脂製で、好
ましくは成形品であり、複数個の筒状ガイド４２を有す
る。各筒状ガイド４２の底面４４はガイド部に比較して
薄く成形され、かつウェルを押し込んだとき穴が開くよ
うに切れ目が入れられている。

【００２２】ストリップ型多孔質膜プレート１５又は１
ウェル型多孔質膜プレートを本発明の核酸配列検査装置
の温度調製ユニット２０中に設置するには、まずアダプ
タ４０の筒状ガイド４２にウェル型多孔質膜プレートを
押し込んで固定し、その後そのアダプタ４０を下部金属
ブロック２５のシールパッキング部３２の上に載置す
る。

【００２３】各ウェル型多孔質膜プレートは、その筒状
体の側面が筒状ガイド４２の内面と密着シールされ、か
つ筒状ガイド４２に押し込むことによりガイドの底面に
直径１ｍｍ以下の穴４６が開く。一方、ウェル型多孔質
膜プレートを設置しないガイド４２の底面は閉塞された
状態のままである。このようにして、廃液用空間２９が
ウェル型多孔質膜膜プレート内の各溶液部分とシールさ
れる。なお、アダプタ４０の下部金属ブロック２５との
接触部分にシール部材を取り付けることにより、核酸配
列検査装置本体のシールパッキング部３２を省略するこ
ともできる。

【００２４】図７は、核酸検出装置全体の構成図で、温
度調整ユニット２０の一部である下部金属ブロック２５
に設けられた排出孔３０とポンプ６０はチューブ６２で
接続され、ポンプ６０で吸引された廃液は装置外の廃液
タンク６４へ排出される。装置には、その他にも温度調
整用コントローラ５５、工程制御用コントローラ５６、
タイマーなどが内蔵されている。

【００２５】次に、前記核酸検出装置を用いた本発明に
よる核酸の検査方法について説明する。例えば、試料を
液体培地で培養した場合、培養サンプルをピペットで２
〜３μｌ採取し、多孔質膜プレートの各ウェルのまん中
に滴下後、前記装置に設置し、以下の操作で核酸の検出
を行う。試薬の注入は、手動で行う。 （１）溶菌及び／又は、一本鎖工程 サンプルを添加した多孔質膜プレート内に界面活性剤を
含んだＮａＯＨ、ＫＯＨ等のアルカリ溶液を一定量注入
後、カバーを閉じて溶菌、一本鎖工程を開始する。液温
は設定した温度（例えば５０℃）に温度コントローラで
温度調整され、タイマーで設定した時間がくれば自動的
にポンプが稼働し、多孔質膜プレートのウェル内の液は
排出される。サンプル中の核酸は、本工程で菌体から溶
出し、１本鎖の状態で多孔質膜に固定される。

【００２６】（２）プレハイブリダイゼーション工程 多孔質膜上で核酸が固定されたスポット以外をブロック
溶液で覆うため、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイ
ン等を含むブロック溶液を一定量注入後、カバーを閉じ
てプレハイブリダイゼーション工程を開始する。液温、
及び時間は前記工程と同様に設定値で制御され、設定さ
れた時間が経過すれば、自動的にポンプが稼働し、ウェ
ル内の液は排出される。本工程により多孔質膜上の核酸
が固定されたスポット以外はブロック溶液で覆われ、サ
ンプルも中和される。

【００２７】（３）ハイブリダイゼーション工程 酵素や蛍光物質で標識したＤＮＡプローブを用い、上記
サンプル中の核酸とハイブリダイゼーションを行わせる
ため、標識ＤＮＡプローブ試薬を一定量注入後、カバー
を閉じてハイブリダイゼーション工程を開始する。液
温、及び反応時間は前記工程と同様に設定値で制御さ
れ、設定された時間が経過すれば、自動的にポンプが稼
働し、ウェル内の液は排出される。本工程によりハイブ
リダイゼーションが行われる。

【００２８】（４）Ｂ／Ｆ分離工程 ハイブリダイゼーション後のＢ／Ｆ分離を行うため、洗
浄液を一定量注入し、カバーを閉じた後Ｂ／Ｆ分離工程
を開始する。以下、上記と同様にしてＢ／Ｆ分離工程が
行われる。 （５）検出工程 発色による検出の場合はニトロブルーテトラゾリウム
（ＮＢＴ）、５−ブロモ−クロロ−３−インドリルリン
酸溶液（ＢＣＩＰ）等の発色基質液を準備し、各ウェル
に発色基質液を一定量注入後、カバーを閉じて発色工程
を開始する。通常発色工程での液温は３７℃であり、ハ
イブリダイゼーション工程での液温より低いため、発色
工程開始と同時にファンを稼働し、温調温度を急速に下
げる。前記工程と同様に設定時間が経過すれば、自動的
にポンプが稼働し、プレート内の液は排出される。

【００２９】各ウェルで、サンプルを添加したスポット
の発色強度を目視、色差計、市販プレートリーダなどで
読み取る。読み取り終了後の多孔質膜プレートは、乾燥
状態で保存する。色差計での読み取りについては、特開
平２−２２７０９９号公報に記載されている。検出方法
として化学発光法を採用する場合、化学発光基質液とし
て、ルミノール、アクリジニウムエステル、安定化ジオ
キセタン、過シュウ酸エステルなどを用いる。本検出方
式の場合、検出工程で市販ルミノメータを用いれば定量
的に検出できる。

【００３０】前記一連の工程で、各工程の終了をブザー
で知らせるようにすると、操作者はそれを合図にして装
置のカバーを開け、次の工程の実行にかかることができ
るので便利である。次に、より具体的な実施例により、
本発明の検査方法を説明する。

【００３１】〔実施例１〕９６ウェル型多孔質膜プレー
トを用いて、腸炎ビブリオ菌体の核酸検出を行った。９
６ウェル型多孔質膜プレートは、ポリスチレンからなる
ウェル本体の底面に親水性かつカチオン性の多孔質膜で
あるナイロン膜を熱融着によって接着して形成した。各
ウェルの容積は約０．４ｃｃ、底面積は約０．３ｃｍ²
とした。

【００３２】サンプルは、ＴＤＨ産生腸炎症ビブリオ菌
株を液体培地で一晩培養した。液体培地よりサンプルを
２μｌ取り、前処理を行わずに直接多孔質膜プレートの
各ウェルに添加し、サンプルを多孔質膜に固定した。変
性、１本鎖工程では、ＮａＯＨを含むアルカリ溶液を１
０μｌ注入し、５０℃で１０分間処理した。陰性検体と
して、ヒト胎児盤由来ＤＮＡ（シグマ社）１μｇ／μｌ
を１μｇ、多孔質膜ウェルに添加し同様に変性した。

【００３３】変性後、アルカリ溶液をポンプで自動的に
排出し、プレハイブリダイゼーション工程を行う。各ウ
ェルにブロック溶液を２００μｌ注入し、５０℃で１５
分間プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブ
リダイゼーション工程の後、ブロック溶液をポンプで自
動的に排出し、ハイブリダイゼーション工程を行う。ア
ルカリホスファターゼ標識プローブ溶液を１００μｌ注
入し、５０℃で１５分間ハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００３４】Ｂ／Ｆ分離工程では、洗浄液１（２×ＳＳ
Ｃ，１％ＳＤＳ）、洗浄液２（１×ＳＳＣ，０. ５％ト
リトンＸ−１００）を準備する。洗浄液１を注入後５０
℃で１５分間Ｂ／Ｆ分離を行った後、洗浄液２を加えウ
ェル型多孔質膜プレートの各ウェル内の洗浄を行う。溶
液は各工程終了後、ポンプで自動的に排出される。各ウ
ェルに発色用基質液（ニトロブルーテトラゾリウム，５
−ブロモ−クロロ−３−インドリルリン酸溶液）を１０
０μｌ加え３７℃で４０分反応させた。発色工程終了後
イオン交換水を注入／排出を繰り返すことで、発色用基
質液を十分洗い流した。検出は、標準色彩サンプルと比
較し目視にて陽性、陰性の判定をした。

【００３５】〔比較例〕比較例として、従来技術である
ドットブロット法を採用し、多孔質膜ウェルの代わりに
ナイロン膜（ハイボンドＮ＋；アマシャム社）を使用し
た。培養後のサンプルを酵素、フェノール等で前処理す
ることにより取り出した核酸を、ドットブロッター（Ｂ
ＲＬ社）に固定した膜上に２μｌずつ滴下した。核酸を
膜上に固定した後、膜を取り出し、ハイブリダイゼーシ
ョン専用パック（ハイブリパック）に移し変え、実施例
１と同様に酵素標識プローブを入れ、完全にシールした
後、恒温水槽中に浸漬し、ハイブリダイゼーション反応
を行わせた。反応終了後、別に用意したハイブリパック
に移し変え、洗浄液を入れ、実施例１と同様に完全にシ
ールした後、恒温水槽中に浸漬し、Ｂ／Ｆ分離を行っ
た。以下、発色液の添加も実施例１と同様な操作で行
い、発色反応を行った。

【００３６】前記実施例１の方法でＴＤＨ産生腸炎症ビ
ブリオ菌株５０株、陰性検体としてその他の腸内細菌１
８株の検出結果を、従来のドットブロット法と比較した
結果を表１に示す。表１から明らかなように、本実施例
のウェル型多孔質膜プレートを用いた場合、比較例と同
様の特異性が確認された。

【００３７】

【表１】

【００３８】〔実施例２〕ＴＤＨ産生腸炎症ビブリオ菌
株を３％ＮａＣｌブレインハートインヒュージョン培地
に接種し、３７℃で一晩培養した。生育したコロニーを
白金耳でかきとり、実施例１で用いたのと同様の９６ウ
ェル型多孔質膜プレートの底面の膜に塗り付けた。以
下、前記実施例１と同様な操作を行った。本実施例の方
法でＴＤＨ産生腸炎症ビブリオ菌株５０株、陰性検体と
してその他の腸内細菌１８株の検出結果を、従来のドッ
トブロット法と比較したところ、前記表１と同じ結果が
得られた。

【００３９】〔実施例３〕ＴＤＨ産生腸炎症ビブリオ菌
株を含む便検体をかきとり、希釈緩衝液（０．１Ｍリン
酸バッファ）３００μｌに懸濁した。さらに、その中に
プロテナーゼＫ０．６ｍｇ、溶菌液（８Ｍ尿素、５０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）６００μｌを加えて撹拌し、６０℃で３
０分間インキュベートした。得られた溶菌液をフェノー
ルで２回、クロロホルムで１回抽出後、エタノール沈澱
し、核酸を得た。次に、ＰＣＲ用試薬に上記の方法で精
製した核酸サンプルを１μｌ加え、核酸の増幅を行っ
た。実施例１で用いたのと同様の９６ウェル型多孔質膜
プレートを用いて、増幅後のサンプルを２ｍｌずつ膜プ
レート内に添加し、サンプルを膜に固定した。以下、前
記実施例１と同様な操作を行った。本実施例の方法でＴ
ＤＨ産生腸炎症ビブリオ菌株５０株、陰性検体としてそ
の他の腸内細菌１８株の検出結果を、従来のドットブロ
ット法と比較したところ、前記表１と同じ結果が得られ
た。

【００４０】

【発明の効果】本発明の検査方法及び検検査置による
と、培養検体でも前処理の必要がなく、従来６時間以上
かかっていた検出も２時間以内で可能となり、操作の簡
便化及び検出時間の短縮を図ることができる。コロニー
培地を用いた場合も、コロニーを多孔質膜プレート底面
の多孔質膜に塗り付けるだけでよく、又ＰＣＲで増幅し
たサンプルを検出したい場合も、液体培養サンプルと同
様、２〜３μｌサンプルを滴下するだけでよい。

【図面の簡単な説明】

【図１】９６ウェル一体型多孔質膜プレートの外観図。

【図２】ストリップ型多孔質膜プレートの外観図。

【図３】核酸配列検査装置に多孔質膜プレートを設置し
た状態図。

【図４】温度調整ユニットの断面図。

【図５】一体型多孔質膜プレートに対するシール機構及
びシールパッキング部の説明図。

【図６】ストリップ型またはウェル型多孔質膜プレート
に対するシール機構及びアダプタの説明図。

【図７】核酸配列検査装置の構成図。

【符号の説明】

１０…多孔質膜プレート、１１…多孔質膜、１２…ウェ
ル、２０…温度調整ユニット、２４…上部金属ブロッ
ク、２５…下部金属ブロック、２６…平面ヒーター、２
７…温度センサー、２８…金属ブロック冷却用ファン、
２９…廃液用空間、３０…排出孔、３２…シールパッキ
ング部、４０…ストリップ型及び１ウェル型多孔質膜プ
レート用アダプタ、４２…筒状ガイド、５０…制御部、
５５…温度調整用コントローラ、５６…工程制御用コン
トローラ、６０…ポンプ、６４…廃液タンク

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 合成樹脂からなる筒状体の一方の開口部
   を閉塞するように、少なくとも表面が親水性かつカチオ
   ン性である多孔質膜を前記開口部の縁部に接着又は圧着
   したことを特徴とするウェル型多孔質膜プレート。
2. 【請求項２】 複数個の筒状体が側壁の少なくとも一部
   で結合して直線的に連結していることを特徴とする請求
   項１記載のウェル型多孔質膜プレート。
3. 【請求項３】 上下が開口した複数の貫通孔をマトリッ
   クス状に配列して形成した板状合成樹脂部材の一方の表
   面に、前記複数の貫通孔の開口部を夫々閉塞するように
   少なくとも表面が親水性かつカチオン性である多孔質膜
   を接着又は圧着したことを特徴とするウェル型多孔質膜
   プレート。
4. 【請求項４】 各々が加熱手段を有する上部金属ブロッ
   クと下部金属ブロックとからなり、少なくとも一方の金
   属ブロックが隣接面に凹部を有して、該凹部に請求項
   １、２又は３記載のウェル型多孔質膜プレートを収納で
   きる温度調整ユニットと、溶液排出手段と、制御手段と
   を含み、 前記温度調整ユニットの下部金属ブロックは、所定の領
   域を囲み、その上に載置されるウェル型多孔質膜プレー
   トの底面と下部金属ブロックとの間に密閉空間を形成す
   るシールパッキング部を上面に有すると共に、前記シー
   ルパッキング部で囲まれた領域と下部金属ブロックの外
   部空間とを連通させる連通孔を有し、前記溶液排出手段
   は前記下部金属ブロックに設けられた連通孔を介して前
   記密閉空間を排気することにより、ウェル型多孔質膜プ
   レートのウェル内の溶液を吸引排出可能に構成されてい
   ることを特徴とする核酸配列検査装置。
5. 【請求項５】 前記制御手段は、ウェル型多孔質膜プレ
   ート内での試料の溶菌及び／又は変性工程、ウェル型多
   孔質膜プレートへの標的核酸の固定化工程、多孔質膜上
   で核酸が固定されたスポット以外をブロック溶液で覆う
   プレハイブリダイゼーション工程、標識核酸と標的プロ
   ーブとのハイブリダイゼーション工程、Ｂ／Ｆ分離工
   程、及び標識の検出工程ごとに調整温度、工程時間、及
   び溶液の排出を制御するものであることを特徴とする請
   求項４記載の核酸配列検査装置。
6. 【請求項６】 請求項１、２又は３記載のウェル型多孔
   質膜プレート上に試料中の標的核酸を固定した後、標識
   プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法により試
   料中の標的核酸を検出することを特徴とする核酸配列検
   査方法。
7. 【請求項７】 請求項１、２又は３記載のウェル型多孔
   質膜プレート内に試料を付着させる工程と、前記多孔質
   膜プレート内で試料を溶菌及び／又は変性する工程と、
   前記ウェル型多孔質膜プレートの多孔質膜に標的核酸を
   固定する工程と、多孔質膜上で核酸が固定されたスポッ
   ト以外をブロック溶液で覆うプレハイブリダイゼーショ
   ン工程と、標的核酸と標識プローブとのハイブリダイゼ
   ーション工程と、Ｂ／Ｆ分離工程と、標識を検出する工
   程とを含むことを特徴とする核酸配列検査方法。