JP4526609B2 - 改良された核酸アッセイ - Google Patents
改良された核酸アッセイ Download PDFInfo
- Publication number
- JP4526609B2 JP4526609B2 JP12356498A JP12356498A JP4526609B2 JP 4526609 B2 JP4526609 B2 JP 4526609B2 JP 12356498 A JP12356498 A JP 12356498A JP 12356498 A JP12356498 A JP 12356498A JP 4526609 B2 JP4526609 B2 JP 4526609B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- amplification
- reaction
- detection
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
- G01N35/026—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having blocks or racks of reaction cells or cuvettes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6846—Common amplification features
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的試験試料中の特定の核酸配列の検出に関する。特に、本発明は、増幅されていない、もしくは増幅されている核酸配列(アンプリコン)のいずれかである特定の核酸配列の自動化検出に関する。加えて、本発明は、自動化複製の使用、複製がうまくいくように監視するための方法および組成物、汚染の機会を減少させるための改良法、並びに増幅用の統合化された反応バッファ並びに反応成分の単位適用量のアリコートの使用に関するものである。
【0002】
最後に、本発明は、単一のアッセイにおける1つもしくは2つ以上の異なる核酸配列の従来の、もしくは自動化された検出のための独特な構築物、および方法にも関する。
【0003】
【従来の技術】
核酸を操作し、必要であればそのような核酸を増幅し、およびそれに続いて核酸もしくはアンプリコンの特定な配列を検出するための技術開発は、疾患の診断および/または試験試料中の病原性微生物を同定することに対して、非常に高感度であって、核酸配列に特異的なアッセイを生み出している。
【0004】
1.核酸の増幅
必要であれば、核酸配列の酵素的増幅がそのような核酸配列を検出する能力を高める。一般に、現在知られている増幅スキームは、その酵素的増幅反応が変性温度、プライマーアニーリング温度、およびアンプリコン(核酸の酵素的増幅の産物)合成温度との間の温度で、連続した循環によって進められるのか、またはその酵素的増幅プロセスを通じて温度が一定に保たれる(等温増幅、isothermal amplification)のかに基づいて、大まかに2つのクラスにグループ分けすることができる。典型的な循環核酸増幅技術(熱循環、thermocycling )はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびリガーゼ連鎖反応(LCR)である。これらの反応の具体的なプロトコルは、例えば、Short Protocols in Molecular Biology、第2版や、A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel ら編、John Wiley & Sons,New York、1992)の第15章で論じられている。等温(isothermal)である反応には、転写介在増幅(transcription-mediated amplification、TMA)、核酸配列に基づく増幅(nucleic acid sequence-based amplification 、NASBA)、および鎖置換増幅(strand displacement amplification 、SDA)が含まれる。
【0005】
核酸の増幅を論じている米国特許文献には、4,683,195号;4,683,202号;5,130,238号;4,876,187号;5,030,557号;5,399,491号;5,409,818号;5,485,184号;5,409,818号;5,554,517号;5,437,990号および5,554,516号(これらの各々は参照することによりそれら全体をここに引用する)が含まれる。これらの特許に記述されるもののような方法はクローン化を必要とすることなく核酸の増幅および検出を可能にし、核酸配列の最も感度の高いアッセイであることがよく知られている。しかしながら、核酸の増幅において高感度な検出が可能ではあるが、微量の望ましくない外来性の核酸配列による汚染が非常に簡単に起こりやすいことも同時によく認識されている。望ましくない外来性のDNAまたはRNAの核酸による汚染も同様である。増幅反応の有用性は、望ましくない外来性の核酸および他の汚染物質の混入を制御する方法によって高められる。
【0006】
熱安定性酵素が発見される以前は、変性に必要な最初の温度の上昇がポリメラーゼをも不活性化するため、変性工程が終了するたびに新鮮な酵素を添加することが必要であることから、熱循環を用いる方法は非常に困難であった。一度、熱安定性酵素が発見されると、循環核酸増幅は、酵素の添加が反応の開始時にのみに必要な、より簡潔な手順となった。したがって、反応容器が開放されている必要はなく、かつ反応の間に新たな酵素を添加する必要もなく、これにより汚染の危険性を低下させながら効率および正確性を改善することが可能となり、酵素のコストも低下した。熱安定性酵素の例は、微生物、サーモフィラス・アクアチクス(Thermophilus aquaticus)から単離されるポリメラーゼである。
【0007】
一般に、等温増幅では、酵素活性について最適の熱安定性変種が述べられていない複数の酵素活性を組み合わせてなる活性を必要とする。増幅反応の最初の工程は通常、核酸標的の変性を必要とし、例えば、TMA反応においては、最初の変性工程は通常≧65℃で、典型的には≧95℃であってもよいが、標的核酸の二次構造を取り除く必要がある場合に用いられる。
【0008】
次に、この反応混合物を、プライマーがアニーリングするのを可能にし、かつ増幅酵素の組み合わされた活性に対し最適の反応温度であるような、より低い温度に冷却する。例えば、TMAにおいては、この酵素は一般にはT7 RNAポリメラーゼと逆転写酵素(これは、エンドRNAアーゼH活性を有する)である。この反応温度は、次の等温増幅サイクルの間中一定に保たれる。
【0009】
適切な熱安定性酵素を欠くため、等温増幅では、一般に、高温で変性し、より低い温度に冷却した後に、反応混合物に酵素を添加することが必要となることがある。このような要求は不便なものであり、増幅用反応容器を開封することを必要とし、これにより汚染の機会が増大することになる。
【0010】
したがって、そのような反応が、マニュアル操作で酵素を移すような必要なしに、一体化された変性と増幅とを可能にする方法によって、汚染の危険性を低下させながらより容易に行うことができるようになれば最も有用となるであろう。
【0011】
2.増幅バッファ、および、試薬の単一反応用のアリコート
典型的な反応プロトコルは、その反応の特定の工程で用いられる特定の酵素の活性を最適化するようにあつらえられた、または反応成分の最適の再懸濁のための幾つかの異なるバッファを使用することを必要とする。例えば、典型的なPCR 10×増幅バッファは500mM KClと100mM トリスHCl、pH8.4とを含み、MgCl2 の濃度は核酸標的配列および対象となるプライマーの組に依存する。逆転写用バッファ(5×)は、典型的には400mM トリス−Cl、pH8.2;400mM KClおよび300mM MgCl2 を含むものであるが、一方、ネズミ・モロニー白血病ウイルス逆転写酵素用バッファ(5×)は典型的には250mM トリス−Cl、pH8.3;375mM KCl;50mM DTT(ジチオトレイトール)と15mM MgCl2 とを含んでいる。
【0012】
そのような反応バッファはストック化合物からバルクで調製することもできるが、ほとんどの市販の増幅用製品はその増幅プロトコルで用いられるパッケージ化された試薬および特定のバッファのバルクで提供される。例えば、臨床上重要な病原体を検出するための市販のマニュアル操作の増幅アッセイ(例えば、ジェン−プローブ社(Gen-Probe Inc.)、クラミジアおよび結核菌検出アッセイ)はそのアッセイを行うのに幾つかのマニュアル操作を必要とし、これには、サンプル希釈バッファ(sample dilution buffer、SDB)への試験試料の希釈や、希釈した試料と増幅反応試薬、例えば増幅再構成バッファ(amplification reconstitution buffer、ARB)中に再構成されているオリゴヌクレオチドや特定のオリゴヌクレオチドプロモーター/プライマーとの組み合わせや、また、最終的に、酵素希釈バッファ(enzyme dilution buffer、EDB)中で再構成された酵素の反応混合物への添加などが含まれる。
【0013】
反応混合物へのマニュアル操作での添加を必要とする複数のバッファの調製および使用は、汚染の大きな機会を持ち込むことになる。増幅プロトコルの全ての相で用いることができる単一の統合されたバッファであることが最も有用である。特に、上述の市販のTMAアッセイでは、3種類のバッファを必要とすることがそのプロトコルの自動化を非常に複雑にしている。
【0014】
製造者による酵素や他の反応成分のパッケージされているバルクは、それらの成分を多量に再構成することを必要とするであろうし、ストック量の複数の試薬の使用では、最大数を下回る数の反応が行われる場合には、これらの成分のうちの幾つかは短期間しか安定でないことがあり、不経済である可能性がある。また、この再構成の工程はユーザーによるストック試薬の複数回の操作と、原料試薬から個々の反応量の試薬に小分けすることとを必要とし、これが汚染の大きな機会を作り出す。
【0015】
バルク量の保存されたタンパク質を調製するための方法やその組成物は公知であり、例えば、米国特許5,098,893号;4,762,857号;4,457,916号;4,891,319号;5,026,566号並びに国際特許公開WO89/06542号;WO93/00806号;WO95/33488号およびWO89/00012号を参照のこと。これらの全ては参照することによりその全体がここに引用される。しかしながら、単一反応量/適用量の、予め小分けされ、かつ保存された試薬成分を使用することが非常に有用かつ経済的である。酵素試薬の単一のアリコートによりバルク試薬の使用が回避され、これにより無駄が減り、汚染の機会が非常に低くなる。さらに、そのような単一反応用のアリコートは反応プロセスの自動化に最も適切である。
【0016】
多くのバッファに変えることの必要性および試薬を複数回添加することの必要性は、このような反応の自動化を複雑にする。反応バッファ混合物の一回の適用量で、統合された組み合わせバッファはそのプロセスの自動化を単純化し、かつ汚染の機会を減らであろう。
【0017】
3.増幅を伴う、もしくは伴わない核酸検出の自動化
核酸プローブアッセイと増幅/プローブアッセイの組み合わせとは迅速で、高感度で、非常に特異的なものである。そして通常は、非特異的な核酸による汚染を最小にするために厳密な取り扱いを必要とするが、これらは自動化のための第1の候補となる。通常の核酸検出プロトコルを用いた場合には、一般に、特定の手段によって検出可能な信号生成成分と結合されている検出プローブオリゴヌクレオチド配列を使用することが必要である。可能性のあるプローブ検出系の1つが米国特許4,581,333号に記述されており、これは参照することによりその全体をここに引用する。
【0018】
加えて、増幅されていないもしくは増幅された核酸を標的とする核酸検出システムの自動化、もしくは組み合わせられた自動化増幅/検出システムは、一般には、特定の形態の固体担体系に結合している核酸キャプチャーオリゴヌクレオチドを使用するように適応させることができる。このような結合および固体担体への核酸の結合方法の例は米国特許5,489,653号および5,510,084号にあり、これらの両者を参照することによりここに引用する。
【0019】
増幅、検出、並びに増幅と検出とを組み合わせた自動化は、そのアッセイに関する複数のユーザー相互のやり取りを減らすためにも望ましい。試験材料を光学的に分析するための装置および方法が、例えば米国特許5,122,284号(これを参照することによりその全体をここに引用する)に記載されている。自動化は、一般に、臨床でのアッセイの処理に対してより経済的で、効率的で、再現性が高く、かつ正確であると信じられている。このように核酸検出の優れた感度および特異性を有することから、核酸配列の増幅を使用することおよびアッセイプロトコルの1以上のフェーズで自動化することは、そのアッセイプロトコルの有用性および臨床環境における有用性を高めることができる。
【0020】
4.内部対照配列(Internal Control Sequence )の利点
核酸の増幅は反応条件に対して非常に敏感であり、試料中のいかなる特定の核酸配列をも増幅および/または検出できないことは、所望の標的配列が存在しないことと同時に、増幅プロセスにおける過失によるものである可能性が高い。増幅反応が反応条件に対して敏感であることは周知であり、一般に、同時に処理される別の反応容器での既知の核酸標的とプライマーとの対照反応を含めることが必要となる。しかして、この試験反応混合物に添加される内部対照配列は、その対象となる試験反応混合物における増幅プロセスを成功に導くために正しく調節されるであろうし、これが最も有用なこととなる。米国特許5,457,027号(これを参照することによりその全体を引用する)は、結核菌についての等温増幅反応における内部オリゴヌクレオチド標準として有用な特定の内部対照配列を教示する。
【0021】
しかしながら、標的微生物、宿主微生物に存在する核酸配列、または正常なフローラ中もしくは環境中に存在する核酸配列の影響を受けないように特にあつらえられた、様々な増幅手順の内部対照として有用である内部対照配列を得る一般的な方法があれば極めて有用である。一般には、そのよう内部対照配列は、その内部対照配列の増幅および検出を妨げる、ヒト、病原微生物、正常なフローラ中の微生物、もしくは環境中の微生物を含む臨床的な環境中に存在するいかなる核酸配列とも実質的に類似するべきではない。
【0022】
5.1回のアッセイにおける2つ以上の核酸配列の検出
一般には、核酸配列を検出するための1回のアッセイ反応は1つの標的核酸配列の検出に限定される。この標的が1つという制限は、臨床診断アッセイおよび対照反応の検証を行うのに必要となるコストおよび時間を増大させる。1回のアッセイを用いて試料中の2つ以上の核酸配列の検出を行うことは試料分析の効率を大きく高め、コストを下げるものであって、例えば複数の臨床アッセイの必要性を減らすのを助け、非常に経済的にも有益なものとなる。
【0023】
1回のアッセイにおいて複数の分析物を検出することは、例えば国際特許公開WO89/00290号およびWO93/21346号(これらの両者を参照することによりその全体をここに引用する)におけるもののように分析物の抗体検出に適用されている。
【0024】
必要とされるコスト、時間を減少させることに加えて、1回のアッセイにおける2つ以上の核酸標的配列の検出は、間違った結果となる機会を低減させる。特に、多重検出は内部対照配列を用いることの有用性と利得とを大きく高め、陰性結果を迅速に立証することを可能にする。
【0025】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以上のべた従来技術の問題点を解決するためのものであり、以下に詳しく説明する。
【0026】
【課題を解決するための手段】
本発明は、試験しようとする試験試料中の特定の核酸配列の自動化等温増幅および検出方法であって、
a)試験しようとする試験試料を第1の反応容器中でバッファ、遊離ヌクレオチドの混合物、特定のオリゴヌクレオチドプライマー、および、必要により、熱安定性核酸重合酵素とを組み合わせ、かつ該反応容器を自動装置内に収容し、該自動装置では次のようにして増幅および検出を行う、;
b)自動装置は、必要であれば、第1の反応容器を、試験しようとする試料中の核酸を変性させるのに十分な温度に、かつ十分な時間加熱し;
c)自動装置は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸に特異的にアニールすることができるように第1の反応容器を冷却し;
d)自動装置は、反応混合物を第1の反応容器から第2の反応容器に移し、該反応混合物を熱不安定性核酸増幅酵素と接触させ;
e)自動装置は、第2の反応容器の温度を、核酸のプライマー介在増幅を可能にする温度に維持し;
f)自動装置は、第2の反応容器中の増幅した核酸を、試験しようとする核酸に特異的なキャプチャー核酸と接触させ、それらが特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体を形成するようにし;
g)自動装置は、必要により、特異的にキャプチャーされた増幅核酸を洗浄し、非特異的に結合した核酸が特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体から洗い落とされるようにし;
h)自動装置は、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体を、増幅した核酸に対して特異的な標識核酸プローブと接触させ、該特異的に増幅した核酸と該標識核酸プローブとの間に複合体を形成するようにし、;
i)自動装置は、該特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体を洗浄し、非特異的に結合した標識プローブ核酸が特異的に結合した複合体から洗い落とされるようにし;
j)自動装置は、該特異的に結合した複合体を信号を生じさせるものを含む溶液と接触させ、標識核酸プローブ間の検出反応が該溶液と核酸に結合した標識との間で生じ、検出可能な信号が試料中の特異的に結合した増幅核酸の量に比例して試料から生じるようにし、ここで、工程h、i、およびjは順次に、または同時に行ってもよいものであって;
k)自動装置は、該信号を検出し、必要により、該信号の値を表示するか、または必要により該信号の値を記録する、
こととを備える方法を含む。
【0027】
ここで用いられる、試験試料には、生存する患者から、生存してはいない患者から、表面、気体、真空吸引器もしくは液体から、体表面もしくは体腔に由来する組織、体液、スワブから、および類似のあらゆる源から採取される試料が含まれる。ここで用いられるバッファという用語は、標識(例えば、活性にとって適切な温度で処理し、必要に応じて適切な酵素基質および鋳型を加える際にそのようなバッファ中に加えられる酵素)の有効な活性をサポートすることができる適切な処方のバッファを包含する。特異的なオリゴヌクレオチド核酸プライマーという用語は、対象となる標的核酸に実質的に相補的であってそれに特異的にハイブリダイズ/アニールする核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであり、必要により、RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を有していてもよいオリゴヌクレオチドを意味する。反応容器という用語は、化学反応を行うことが可能であり、かつ、好ましくは、−80℃ないし100℃のいずれの温度にも耐えることが可能な容器を意味する。
【0028】
本発明では、さらに、反応バッファが統合バッファであってそれが核酸の変性および核酸のアニーリングに適するものであり、さらに核酸の重合酵素および増幅酵素の酵素活性を持続させることが可能である上述の方法をも提供する。さらに、核酸増幅酵素が第2の反応チャンバに凍結乾燥ペレットの形態の1回のアッセイ用の量で導入されており、かつその反応チャンバが増幅工程の前に密封されている方法が本発明に包含される。
【0029】
本発明は、2つ以上の核酸標的配列またはアンプリコンの自動検出のための装置であって、キャプチャー核酸オリゴヌクレオチドが少なくとも2つの異なる区域に被覆されている固相の受容部(SPR(登録商標)ピペット様装置)を備える装置を開示する。
【0030】
本発明は、2つ以上の核酸標的配列を自動検出するための方法であって、1つもしくは複数の区域で、少なくとも2種類の異なるキャプチャー核酸オリゴヌクレオチドが被覆されている固相の受容部(SPR(登録商標)ピペット様装置)と、試験しようとする試料とを接触させ、特異的に結合したプローブからの信号を検出することを包含する方法を教示する。本発明の一態様においては、SPR(登録商標)は、異なる核酸配列標的に対して特異的なキャプチャー核酸オリゴヌクレオチドが2つの異なる区域に被覆されている。本発明の別の態様においては、SPR(登録商標)は、標的核酸配列のための少なくとも1種のキャプチャープローブと、それが検出された場合には増幅が生じたことが確認される増幅対照核酸配列のためのキャプチャープローブとが被覆されている。
【0031】
また、本発明は、RIC1の核酸配列を含むランダムに生成された内部増幅陽性対照核酸と、RIC2の核酸配列を有する別の内部増幅陽性対照核酸とをも包含する。
【0032】
また、本発明は、CRIC−2、GRIC、MRIC、およびHRICの核酸配列を有する内部増幅陽性対照核酸をも包含する。
【0033】
さらに、本発明は次に示す内部増幅陽性対照核酸を生成する方法を含み、該内部増幅陽性対照核酸は、少なくとも10ヌクレオチドの長さのランダムな核酸配列を生成し、該ランダムな核酸配列をスクリーニングして特定の機能性について選択し、該機能的に選択された多数の核酸配列を直列に結合し、結合した核酸配列をスクリーニングし、必要により、鎖内核酸二量体の形成またはヘアピン構造の形成に対して選択して得られる。
【0034】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明の好ましい態様を添付の図面と連携させて説明する。これらの図面においては、同じ参照番号は様々な観点からの同じ要素を示す。
【0035】
以下の例は、本発明の範囲を限定しようとするものではなく、本発明の特定の態様をより十分に説明するために提供されるものである。
【0036】
例1.一回適用量の試薬および統合バッファ
VIDASとオンラインの状態での、もしくは別々の装置におけるオフラインの状態での(VIDAS装置で検出する)TMA反応を実施(参照することにより引用される米国特許5,437,990号を参照)するには、この反応をマニュアル操作で行うために用いられる化学薬品を改変する必要がある。第1にバルクのパッケージ化試薬を一回適用量のアリコートに変更しておかなければならず、第2に反応のバッファ成分は単一の包括的多機能性統合バッファ溶液を形成するように変更されていなければならない。
【0037】
現在のマニュアル操作の技術の下では、試薬は複数回のアッセイ量の凍結乾燥「ケーキ」として調製されている。したがって、増幅試薬および酵素試薬はバルクの形で再構成し、個々のアッセイ用に小分けしなければならない。
【0038】
したがって、VIDASシステムでのTMAの自動化は、試料を希釈すること、核酸を変性すること、核酸をアニーリングすること、および所望の酵素活性をサポートする単一の統合バッファ中に再懸濁することができる凍結乾燥した反応成分の一回適用量のペレットを用いることにより、上述のマニュアル操作による方法を改善することができる。
【0039】
A)統合バッファおよび一回適用量の試薬
一回適用量の増幅試薬の実現可能性を試験するため、バルク試薬である標準的なクラミジアTMA増幅試薬および酵素試薬(ジェン−プローブ社)を0.75mlの水で再構成した。水で再構成した増幅試薬もしくは酵素試薬のいずれか(すなわち、一回適用量のアリコート)12.5μlを微量遠心管に小分けした。これらの管を低温加熱しながら真空遠心して水を除去した。この手順で得られた最終結果は、管底部に酵素もしくは増幅試薬のいずれかの少量の乾燥ケーキを収容する微量遠心管となった。
【0040】
この例において用いられる組み合わせ統合バッファは、標準的な市販のジェン−プローブ社のサンプル希釈バッファ(SDB)、増幅再構成バッファ(ARB)、および酵素希釈バッファ(EDB)を2:1:1の比で組み合わせたものであった。乾燥した増幅試薬の微量遠心管の各々に、この組み合わせ統合バッファ100μlおよび陽性対照核酸(+)を添加し、100μlのシリコーン油で覆った。次に、この管を95℃で10分間加熱した後、42℃に5分間冷却した。次いで、合計容量200μlを乾燥酵素試薬を収容する管に移した。その後、これらを穏やかに混合して酵素試薬を再懸濁させ、その溶液を42℃で1時間加熱した。
【0041】
対照反応液を、ジェン−プローブキットに添付の指示に従って通常の1.5mlのARBもしくはEDBで再構成されたジェン−プローブ対照試薬を用いて調製した。対照反応液の各々において、25μlの再構成した増幅試薬を陽性対照核酸(+)を含むSDB 50μlと組み合わせた。この混合物も95℃に10分間加熱した後、42℃に5分間冷却した。これに25μlの再構成した酵素試薬を添加し、42℃で1時間インキュベートした。陰性対照には核酸を含めなかった。
【0042】
次に、試験統合バッファ反応液(統合)および標準対照反応液(対照)の両者をジェン−プローブ社の標準ハイブリダイゼーション保護アッセイ(Hybridization Protection Assay 、HPA)プロトコルに処した。簡単に述べると、100μlのトラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis )特異的核酸プローブを各管に添加し、60℃で15分間ハイブリダイズさせた。その後、300μlの選別試薬を各管に添加し、ハイブリダイズしたプローブおよびハイブリダイズしないプローブの差別的加水分解を10分間行った。次いで、これらの管をジェン−プローブ社のリーダー(Leader)50ルミノメータで読み取り、下記表1に示されるように、得られたデータを標識から検出される相対光単位(Relative Light Unit 、RLU)として記録した。データはRLU、トラコーマ病原体(C. Trachomatis)TMA/HPA反応として報告した。
【0043】
【表1】
【0044】
表1のデータは、乾燥した増幅試薬および酵素試薬の一回適用量アリコートを用いた場合に、比較に値する結果が得られることを示す。加えて、このデータは、試薬の再懸濁および反応を実行するために、3種類の別々のバッファ(ARB、EDBおよびSDB)と、単一の統合組み合わせバッファ(2:1:1の比率で組み合わされたSDB、ARBおよびEDB)とを用いて、それらの結果が比較に値するものであったことを示す。
【0045】
B)一回適用量の試薬のペレット化
試薬の一回適用量の小分けを簡素化するため、これらの試薬を一回適用量アリコートにペレット化することを可能にする方法を用いた。簡単に述べると、試薬ペレット(もしくはビーズ)は、選択した試薬の水溶液(D(+)トレハロース(α−D−グルコピラノシル−α−D−グルコピラノシド、ファンスティール・ラボラトリーズ社(Pfanstiehl Laboratories, Inc. )、ウォーケガン、ILから購入)のような適切な賦形剤と組み合わされている)を低温ストック液に小分けした後、昇華を用いてペレットから水を除去することにより作製することができる。試薬/トレハロース混合物を極低温の液(滴)に小分けすると、球状の凍結ペレットが形成される。次いで、これらのペレットを、真空サイクルの間に凍結水分子が昇華する凍結乾燥器に入れる。この手順の結果は少量の安定なフレーク状でない試薬ペレットが得られ、これは適切なパッケージに分配することができる。RT、T7および糖を含む試薬の一回適用量アリコートペレットを広範囲の温度に処してペレットの安定性を調べた。試験温度で10分間処した後、これらのペレットをCT増幅に用いた。それらの結果を図1にグラフとして表示する。これらの結果は、一回適用量試薬ペレットが高温に10分間晒した後であっても安定のままであることを示す。
【0046】
トレハロース中における乾燥した酵素の顕著な安定性は従来報告されており(Colacoら、1992、Bio/Technology,10,1007)、これには、関心の的になっているタンパク質の長期安定化に関する研究において再び関心が集まっている(Franks、1994、Bio/Technology,12,253 )。得られた増幅試薬および酵素試薬のペレットをトラコーマ病原体(C.Trachmomatis)TMA/HPA反応に用いることにより試験した。
【0047】
調製した増幅ペレットを管に入れ、これに陽性対照核酸を含むARBおよびSDBの混合物(1:2の比で混合)75μlを添加した。次いで、この試料を95℃で10分間加熱した後、42℃で5分間冷却した。これに、標準的なジェン−プローブ社の手順を用いて再構成した酵素試薬25μlを添加した。この混合物を42℃で1時間インキュベートした。次に、これらの反応物を上述のようにHPA法により分析した。この試験の結果を表2にRLUとして報告し、AMPペレット(+)と表示する。上記と同様に、陰性対照反応液は核酸なし(−)で実行する。
【0048】
調製した酵素ペレットを、陽性対照核酸を含むSDBと、EDBと、標準の再構成した増幅試薬とを(2:1:1の比率での)組み合わせたもの100μlを95℃で10分間加熱した後、42℃で5分間冷却することにより試験した。この反応混合物の総容量を、調製した酵素ペレットに添加した。ペレットを溶解した後、この反応物を42℃に1時間加熱し、次いで上述のようにHPA分析に処した。この試験の結果をRLUとして下記表2に報告し、酵素ペレット(+)と表示する。対照反応液は標準手順に従う標準的なジェン−プローブ社の試薬を用いて調製した。データを、RLU、標準のトラコーマ病原体(C. Trachomatis)TMA/HPA反応として報告する。
【0049】
【表2】
【0050】
表2のデータは、標準的なジェン−プローブ社の試薬、または乾燥し調製した一回適用量の増幅試薬ペレットもしくは酵素試薬ペレットを用いた際に、大きな相違がないことを示す。したがって、試薬の一回適用量のアリコートは、VIDASシステムを用いる自動化への適用に対して単一統合バッファと共に用いるのに適している。
【0051】
例2.熱不安定性酵素を用いる自動等温増幅
VIDAS装置(バイオメリュー ヴァイテック社)のような臨床アッセイ装置で用いられる等温増幅アッセイ反応を自動化するため、新規なデュアルチャンバ反応容器は、スタンドアロン型処理ステーションとの組み合わせで用いることができる試験試料の等温増幅アッセイにおいて、上述の統合バッファと一回反応アリコート試薬ペレットとを用いることができるように設計されている。
【0052】
A)デュアル反応チャンバ
2つのチャンバの使用は、熱安定性の試料/増幅試薬(特定のプライマーおよび核酸を含む)を熱不安定性の酵素性成分(すなわち、RNA逆転写酵素、RNAポリメラーゼ、RNAアーゼH)から分けておくことを容易にする。
【0053】
図3は、本発明の1つの可能な態様によるTMA反応を行うための使い捨てデュアルチャンバ反応容器10およびそれに関連する加熱工程を模式的に示すものである。チャンバAは増幅混合物、すなわち、ヌクレオチド、プライマー、MgCl2 、並びに他の塩やバッファ成分を収容する。チャンバBは増幅反応を触媒する増幅酵素、例えば、T7および/またはRTを収容する。標的(または患者の試料)をチャンバAに添加した後、チャンバAを加熱してDNA核酸標的を変性させ、および/またはRNAの二次構造を取り除く。次いで、チャンバAの温度を下げてプライマーをアニールさせる。続いて、チャンバAの溶液をチャンバBと接触させる。この時点で互いに液通にあるチャンバAおよびBを増幅反応に最適の温度、例えば42℃、に維持する。チャンバAをチャンバBから空間的に分離し、変性のためにチャンバAのみを加熱することにより、チャンバB内の熱不安定性の酵素は変性工程の間の不活性化から保護される。
【0054】
図4は本発明の代わりの形態を模式的に示すものであり、2つの別々の反応チャンバ12および14が組み合わされてデュアルチャンバ反応容器10を形成する。図3の態様と同様に、製造工程の間にチャンバAに増幅用混合物、すなわち、ヌクレオチド、プライマー、MgCl2 並びに他の塩やバッファ成分を前もって導入しておく。製造する間に、チャンバBに、増幅反応を触媒する増幅酵素、例えば、T7および/またはRTを前もって導入しておく。次に、液体試料をチャンバAに導入する。これらの標的を変性させるためにチャンバAは95℃に加熱される。チャンバAを42℃に冷却した後、チャンバA内の溶液をチャンバB内の酵素と接触させ、等温増幅反応を誘発する。
【0055】
チャンバAおよびBの内容物を接触させた後に、増幅チャンバが周囲の環境との間でいかなる物質の交換をも許容しないように反応容器が設計される場合、非相同の標的との増幅反応またはそれ以前の反応からの増幅産物で汚染される危険性を最小にする、閉じた系での増幅が実現される。
【0056】
図5は2つの代わりのデュアルチャンバ反応容器10および10′を模式的に示すものであり、これらは、本発明の好ましい態様に従って固相の受容部と光学機器とで処理するための試験ストリップ19にはめ込まれる。図3〜5の態様においては、一定方向の流動システムが導入される。まず、試料は変性温度に加熱するためにチャンバAに導入される。チャンバAは乾燥増幅試薬混合物16を収容している。冷却した後、その液体をペレットの形態の乾燥酵素18を収容するチャンバBに移す。液体試料をチャンバBに導入した後、チャンバBは42℃に維持される。チャンバBにおいて最適反応温度(例えば、42℃)で増幅反応が起こる。反応が完結してから、試験ストリップ19を、本発明の譲受人であるバイオメリュー ヴァイテック社から入手可能なVIDAS装置のような機器で処理する。当該技術分野における熟練者はVIDAS装置に習熟している。
【0057】
チャンバAの加熱および冷却工程は、デュアルチャンバ使い捨て反応容器10もしくは10′を試験ストリップ19に挿入する前に行うことが可能であり、あるいは、その代わりに、反応チャンバAを適切に温度制御するために試験ストリップ19の左手端部24に隣接して適切な加熱エレメントを配置することもできる。以下に説明される図6〜16のスタンドアロン型増幅処理ステーションには、反応容器10を適切に温度制御するために適切な加熱エレメントおよび制御システムが組み込まれている。
【0058】
図6は、デュアルチャンバ反応容器10″の代替態様を、図5に上述されるもののような試験ストリップ19に配置される、組み合わせデュアルチャンバ容器10″と共に模式的に示すものであり、このデュアルチャンバ容器10″は、一方のチャンバの流体試料が他方に流動することを許容するような様式で組み合わせられている別々の2つの連結される容器10Aおよび10Bから形成されている。液体試料を、乾燥増幅試薬混合物16を収容するチャンバAに導入する。次に、容器Aを取り外した状態で95℃に加熱した後、42℃に冷却する。2つの容器AおよびBを、チャンバBの突起26とチャンバAの凹状溝との管の相補的かみ合わせ表面の間を通常するようにはめ込むことにより一体にする。矢印30で示されるようにこれらの2つのチャンバは互いに液的に連通するため、チャンバAからの試料溶液とチャンバBからの酵素との混合が起こる。その後、この組み合わせられたデュアルチャンバ使い捨て反応容器10″中において、取り外した状態で、またはこの組み合わせ使い捨て容器10″を改変したVIDASストリップにはめ込むことにより取り付けた状態で、試料を増幅させることができる。VIDAS装置は増幅反応の検出を既知の様式で行うことができる。
【0059】
B)増幅ステーション
図7は、本発明の現時点で好ましい形態に従うデュアルチャンバ反応容器を有する試験ストリップ19のためのスタンドアロン型増幅処理システム200の斜視図である。このシステム200は2つの等しい増幅ステーション202および204、電源モジュール206、制御回路モジュール208、真空タンク210および電源モジュール206へのコネクタ212からなる。タンク210は、第1のチャンバから第2のチャンバへの流体の移送を容易にするために上述の様式で増幅ステーション202および204、および最終的には複数の真空供給パイプ(ストリップ当たり1本)に真空を供給するホース320および324を有する。この真空サブシステムは図16に関連させて以下に説明する。
【0060】
増幅ステーション202および204は、各々、ストリップの少なくとも一つを受け入れ、また、ストリップの反応ウェルを適切な温度に加熱し、流体をデュアルチャンバ反応ウェルの第1のチャンバから第2のチャンバに移送し、およびシンブルバルブ(弁)もしくは、好ましくはボールバルブのようなバルブを始動させて流体通路を開放して2つのチャンバ間を流体が流動することを可能にするための関連する温度制御、真空およびバルブ始動サブシステムを有するトレイを有する。
【0061】
ステーション202および204は、患者の、もしくは臨床的試料が上述のデュアルチャンバ反応容器の第1のチャンバに添加された後に自動化された方式で増幅反応を行うためのスタンドアロン型増幅ステーションとして設計されている。SPRによる反応が完結した後のストリップの処理はVIDAS装置のような別の機械において行われる。具体的には、ストリップをステーション202および204に配置してそれらのステーションで反応を実行した後、ストリップをステーション202および204から取り外してVIDAS装置に入れ、既知の方法により続けて処理と分析を行う。
【0062】
システム200の全体は、増幅システムインターフェースボード(図7には示さず)によるマイクロプロセッサの制御下にある。この制御システムは図14にブロック図として示されており、後に説明する。
【0063】
図8を参照すると、増幅ステーション202の1つが斜視図で示されている。
他の増幅ステーションは同じ設計および構成のものである。図9は図8のモジュールの前面の斜視図である。
【0064】
これらの図を参照すると、このステーションは、真空供給パイプスライドモータ222および真空供給パイプスライドカムホイール246を備え、これらは、一組の真空供給パイプ244(図7に示される)を真空供給パイプスライド246に対してシンブルバルブを上下に摺動させて、シンブルバルブを開放し、真空を供給して流体が反応容器10の第1のチャンバから第2のチャンバに吸引されるように作動する。真空供給パイプ244は真空供給パイプスライド246に備えられる環状凹部内を往復運動する。トレイ上に装着された際に、試験ストリップにおいてピン構造および対応する構造を有する真空供給パイプ244の適切な組み合わせが必要であることが明らかである。
【0065】
ステーションは、ステーション202の枠を形作る側壁228および230を有する。トレイコントローラボード229はこの側壁228および230の間に載置される。ステーション202の電子モジュールはトレイコントローラボード229上に据え付けられる。
【0066】
一組のトレイ熱遮断カバー220は熱サブシステムの一部であり、1つ以上の試験ストリップを受け入れるトレイ240(図9)を覆うために提供される。熱遮断カバー220はトレイ240の温度を適切な温度に維持するのを助ける。熱サブシステムは42℃ペルチェヒートシンク242をも含み、その一部は試験ストリップ内のデュアルチャンバ反応容器の第2のチャンバに隣接して位置し、そのチャンバを酵素増幅反応に対して適正な温度を維持する。試験ストリップ内の反応ウェルの第1のチャンバを変性温度に維持するため、95℃ヒートシンク250がトレイ240の前面に設けられている。
【0067】
図10は図9のモジュールの別の斜視図であり、95℃ヒートシンク250および一組のフィン252を示す。95℃ヒートシンク250はトレイ240の前面かつ僅かに下方に位置することに注意されたい。42℃ヒートシンク242はヒートシンク250の背後に位置する。
【0068】
図11は、上記から理解される試験ストリップ(図示せず)を保持するトレイ240の一部の詳細な斜視図である。トレイ240は、基部254と、試験ストリップを受け入れるための凹状スロット258を備える複数の不連続で起立した平行なリッジ構造256とを有する前方部を含む。トレイ240の前方254の基部は95℃ヒートシンク250と接触する。位置256Aおよび256Bで平行に起立するリッジ256の側壁は、熱抵抗を減少させるため、図3の反応容器10の第1および第2チャンバのできる限り近くに配置される。トレイ240後方の基部は、図10において最もよく分かるように、42℃ペルチェヒートシンクに接触する。トレイ後方の位置256Bの起立したリッジはトレイ前方の位置256Aから物理的に分離されており、位置256Bは試験ストリップ内の反応容器の第2チャンバが適切な温度に保たれるように42℃ヒートシンクと接触している。
【0069】
さらに図11を参照すると、真空供給パイプ244はゴムガスケット260を有する。真空供給パイプ244が真空供給パイプモータ222(図8)によって下降すると、ガスケット260は、緊密に密封して真空系が第2チャンバ上に下降することが可能となるように、試験ストリップの上面でデュアルチャンバ反応容器内の真空ポートを取り巻くように配置されている。
【0070】
図12は、図11の試験ストリップホルダ、すなわちトレイ240を分離した斜視図であり、トレイ240に据え付けられた2つの試験ストリップを示している。トレイ240は、同時に処理するために6つまでの試験ストリップ19を受け入れる複数のレーンもしくはスロット241を有する。図12は、トレイ240およびリッジ256のそれぞれの部分を適切な温度に維持するためのヒートシンク242および250を示している。
【0071】
図13は、下記から理解される試験ストリップホルダ、すなわち240の詳細な斜視図である。トレイ240の後方部の下方の後部ヒートシンク242をよりよく説明するため、前方部254の下方に位置する95℃ペルチェヒートシンクが取り外されている。
【0072】
図14は、図7の増幅処理システムの電気系および制御システムのブロック図である。この制御システムは2つのボード310および311に分割され、この図の頂部の区画A310は増幅モジュール、すなわちステーション202に充てられており、他方のボード311(区画B)は他のモジュール204に充てられている。これらの2つのボード310および311は同一であり、頂部区画310のみについて説明する。これらの2つのボード310および311は増幅ステーションインターフェースボード300に接続されている。
【0073】
このインターフェースボード300は高速データバス302を介してスタンドアロン型パーソナルコンピュータ304と接続されている。パーソナルコンピュータ304は、ハードディスクドライブ、ビデオモニタ等を備える通常のIBM互換コンピュータである。好ましい態様において、ステーション202および204はこのインターフェースボード300による制御下にある。
【0074】
ステーション202用のボード310は、トレイ240の前方部254に組み込まれている2つのペルチェヒートシンクモジュール、一対のファンおよび温度センサによって95℃の温度に維持される前方トレイ240を制御する。トレイの後部は、2つのペルチェモジュールおよび温度センサによって42℃に維持される。真空供給パイプ244の移動は供給パイプモータ222によって制御される。真空供給パイプ244の位置に関してトレイコントローラボードに入力信号を付与するため、位置センサが備えられている。トレイコントローラボード310は、温度センサおよび位置センサからのデータを受信し、アクティブ構成要素、すなわちモータ、ファン、ペルチェモジュール等に命令を発する、システムのアクティブおよびパッシブ構成要素用の一組のドライバ312を含む。これらのドライバは増幅インターフェースボード300からのコマンドに応答する。また、このインターフェースボードは、図示されるように、真空サブシステムのための真空ポンプにも命令を発する。
【0075】
図15は、図7の増幅処理ステーション202および204のための真空サブシステム320の図である。このサブシステムは1リットルのプラスチック製真空タンク210を含んでおり、これはタンク210に真空を発生させるための真空ポンプ323へ吸引ライン320を介して接続している。真空供給ライン324は、一対のピンチソレノイドバルブ224(図8を参照)へ供給ライン324Aおよび324Bを介して真空を供給するために備えられている。これらの真空供給ライン324Aおよび324Bは、真空供給パイプ244に真空を分配する多分岐管226に真空を供給する。ストリップ19を覆うフィルムもしくは膜64を穿孔するための真空供給パイプ244の先細の先端245に注意されたい。また、真空システム320は、タンク210内の真空状態を監視するための示差圧変換器(Differential Pressure Transducer)321をも有する。この変換器321は圧力信号を図14のインターフェースボード300に供給する。
【0076】
図16は、図7のステーションの熱サイクルの概要を示すグラフである。線400に示されるように、1分未満の時間で持続する温度の最初の上昇402の後、第1の温度T1に到達し(例えば、変性温度)、これは所定の時間、例えば5−10分間維持され、その時に反応容器の第1チャンバ内で反応が生じる。その後、404で示されるように温度の下降が生じ、反応容器10の第1チャンバ内の反応溶液の温度が温度T2に冷却される。温度T2に冷却され、指定された時間の経過後、第1チャンバ内の溶液が第2チャンバに移され、流体の移動が生じる。対象である反応のための適切で充分な時間、例えば1時間T2の温度に維持される。時間406で、増幅反応を停止させるため、65℃の温度である温度T3に急速に上昇させる。TMA反応については、時間406から時間408への上昇時間が短いこと、すなわち2分未満、好ましくは1分未満であることが重要である。好ましくは、温度の上昇および下降の全ては1分未満である。
【0077】
反応容器および増幅ステーションの構成要素の他の態様も想起されるが、そのような代替態様は本願開示に包含される。
【0078】
例3 結核菌(Mycobacterium tuberculosis、M.tb)の非増幅検出および増幅検出のための自動化VIDAS試験
42℃に改変されたVIDAS装置(バイオメリュー ヴァイテック社)を用いて、我々は、試験試料中のM.tbの検出ための、短時間で完了させることが可能な臨床検査室向けのインラインの簡潔な迅速核酸増幅および検出アッセイを開発した。このアッセイ全体は単一の試験ストリップで行うことが指示されており、これにより標的またはアンプリコンの汚染の可能性を最小にすることができる。この増幅に基づくアッセイはM.tbの検出が可能であり、これは、ジェン−プローブの市販キットによって達成される感度と同様の僅か5個の細胞しか含まないような試料でも可能となる。
【0079】
この増幅に基づくアッセイは、rRNAの独特な配列を標的とする等温転写介在増幅(TMA)、続いてVIDAS装置でのハイブリダイゼーションと、核酸プローブ(アンプリコン)の酵素結合の蛍光検出とを用いる。
【0080】
この増幅/検出アッセイは、1試験当たり約1fgのM.tb rRNAすなわち1個以下のM.tb微生物を検出することが可能であり、M.tbの全てのメンバーに対して特異的である。M.tbを検出するための特異的プローブは、C.Mabilat,1994,J.Clin.Microbiol.,32,2707に記載がある。
【0081】
抗酸性の桿菌(バチルス)の標準スミアは診断ツールとして常に信頼できるものではなく、陽性の場合であってもM.tb以外のマイコバクテリアである可能性がある。現在、結核を診断するための標準的な方法は成長が遅い細菌の培養を必要とし、6週間、もしくはそれ以上かかることがある。この期間、患者は通常隔離される。当初の結果は、この自動化試験がこの培養法の臨床的感度と一致するか、もしくはこれを越えるもので、感染試料中のM.tbを迅速に(3時間未満で)検出する非常に高感度の方法を提供し、それにより迅速な診断、隔離および治療の助けとなるというものであった。
【0082】
A)試料調製
450μlの容量の検体をガラスビーズを収容する溶解管内のサンプル希釈バッファ50μlに添加し、室温で15分間超音波処理して微生物を溶解し、95℃で15分間加熱し不活性化する。必要であれば、標準キット試薬を用いるキットの指示に従い、市販のマニュアル操作アッセイキット(ジェン−プローブ社)の通りに等温増幅を行う。しかしながら、上述の例において説明したように、改変した成分を用いて同様のアッセイを行うことが可能である。
【0083】
B)検出
自動化検出アッセイを行うためには、検出システムは、固体担体(VIDASシステムにおいては「固相の受容部」SPR(登録商標)ピペット様装置と呼ばれる)および標識検出プローブ核酸(例えば、標識はアルカリホスファターゼ、化学発光シグナル化合物、もしくは結合したプローブの特異的な検出を可能にする他の試薬であり得る)に結合する特異的キャプチャー核酸に対する標的核酸またはアンプリコンのハイブリダイゼーションを必要とする。
【0084】
VIDASのような自動化システムにおいては、未結合のプローブを除去するための幾つかの洗浄工程の後、SPR(登録商標)がプローブ−標的ハイブリッドを酵素基質に移送し、それにより結合したプローブから検出可能な信号を誘発してアッセイ装置により検出する。一つの態様においては、検出プローブはアルカリホスファターゼに結合しており、一旦、基質、メチルウンベリフェリルホスフェート(MUMP)と接触すると、その基質はアルカリホスファターゼにより4−メチルウンベリフェロン(4−MU)に変換される。4−MUは蛍光を生じ、それが標準VIDAS装置によって検出されて相対蛍光単位(relative fluorescence unit、RFU)として記録される。標的核酸が存在しない場合、検出プローブは結合せず、かつ基質は変換されず、したがって蛍光が検出されることはない。
【0085】
C)分析感度:対照(Contol)
一般には、対照は、5fgのM.tb rRNAすなわち約1個のM.tb細胞と等価のrRNAを含む陽性対照をサンプル希釈バッファのマトリックス中に調製する。自動化プローブアッセイの感度は、溶解したM.tb細胞の希釈液を試験することにより決定することができる。細胞溶解物は、一般に、1μl白金耳の細胞を用いて調製することができる(従来の力価測定およびコロニー形成単位(CFU)実験に基づいて、1μl白金耳一杯当たり約1×109 CFUが存在すると仮定することができる)。その後、このM.tb溶解物の希釈液を自動化プローブアッセイを用いて試験することができる。
【0086】
図23は、ジェン−プローブキットによるM.tbアンプリコンの検出を示すグラフである。図24は、VIDAS装置による図23と同じ反応からのM.tbアンプリコンの検出を示すグラフである。
【0087】
図25は、改変VIDAS装置でのM.tb核酸の増幅および検出を示すグラフである。酵素は液体の形で用い、増幅はVIDASアッセイ装置とインラインの状態で行った。
【0088】
図26は、二元(バイナリー)/デュアルチャンバ使い捨て反応容器を用いる改変VIDAS装置でのM.tb核酸の増幅および検出を示すグラフである。変性工程はVIDAS装置とオフラインの状態で行い、増幅およびアンプリコン検出はVIDAS装置とインラインの状態で行った。
【0089】
例4 トラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis 、CT)の増幅検出のた めの自動化VIDAS試験
VIDAS装置(バイオメリュー ヴァイテック社)を用いて、我々は、試験試料からトラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis 、CT)を迅速に検出するための簡単で完全に自動化された非常に特異的なアッセイを開発している。この試験は、rRNAに特有の配列を標的とする等温TMA、次いでハイブリダイゼーションおよび酵素結合の蛍光検出を用いる。この自動化試験は、トラコーマ病原体(CT)の臨床上重要な血清型亜型(serovar )を泌尿生殖器の検体から、2時間未満で特異的に検出する。我々は、0.5fgのrRNA、すなわちトラコーマ病原体(CT)の基本小体(elementary body )の約1/10に等しい分析感度を得た。207例の臨床的子宮頸管内スワブおよび尿についての自動化試験とジェン−プローブの増幅CTとは完全な一致を示した。
【0090】
トラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis 、CT)感染は米国および欧州における性行為感染症の第1の原因である。米国においては、毎年約400万の新たなCT感染が生じているものと見積もられている。
【0091】
トラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis 、CT)は、女性および男性、成人および新生児の両者に感染を引き起こす小さな偏性細胞内寄生体である。CT感染の制御に対する最も大きな挑戦は、感染女性の75%および感染男性の50%もが無症候性であるというものである。これは、CT感染を伝染させることが可能な無自覚の感染個体が多数蓄積されることになる結果を生じる。CT感染の迅速かつ簡単な検出は感染個体の識別の大きな助けとなる。
【0092】
A)患者の検体および試料の調製
コード化された試料(n=207)はCT感染と一致する症状を呈する患者から得た。頸部の試料は、ジェン−プローブの搬送媒体を含有するジェン−プローブの試料収集キットを用いて集め、尿の試料は標準的な尿収集装置に集めた。全ての試料を4℃で保存した。
【0093】
頸部スワブを425×gで5分間遠心し、全ての液体を管の底部に沈めた。その後、スワブを40μlのジェン−プローブの検体調製試薬で処理し、60℃で10分間インキュベートした。次いで、処理した試料20μlをピペットで400μlのサンプル希釈バッファ(SDB)に移した。
【0094】
尿試料の各々の2mlを37℃に10分間加温し、12,000×gで5分間微量遠心した。上清を廃棄し、300μlのサンプル希釈バッファを各検体に添加した。15種の血清型亜型のCTの全てを包括的試料として用い、検体を定量し、各血清型亜型4×102 IFU/ml(ml当たりの封入形成単位、inclusion formation unit)を含む検体20μlを400μlのSDBに添加した。排他的泌尿生殖器微生物のパネルを得て定量し、2×109 /mlの微生物20μlをピペットで400μlのSDBに移した。0.5fgのrRNAすなわち0.1CT基本小体に等しい量を含む陽性対照をSDBで希釈した。
【0095】
B)試料増幅およびVIDAS検出
TMAプロトコルを用いて試料を増幅し、rRNA標的をAMVE共重合体に結合したオリゴマーおよびアルカリホスファターゼに結合したオリゴマーにハイブリダイズさせた。例えば、米国特許5,489,653号および5,510,084号を参照のこと。上述のように、固相反応の受容部(SPR(登録商標)ピペット様装置)は連続する洗浄工程を通してこの結合されたハイブリッドを保持し、最終的には基質4−MUPとなる。アルカリホスファターゼはこの基質を蛍光性の4−MUに変換し、これをVIDASアッセイ機で検出して相対蛍光単位として記録する。
【0096】
下記表3は、増幅に続くVIDAS自動化アッセイによるCTの検出を、CTrRNAの濃度に対するRFV(RFV=RFU−バックグランドのRFU)として示す。0ないし200分子のトラコーマ病原体(C. trachomatis)の精製rRNAの希釈液を増幅し(n=3)、VIDAS自動化プローブアッセイで検出した。検出限界は精製rRNA20分子である。
【0097】
【表3】
【0098】
C)分析特異性および結果
下記ATCC微生物の各々の存在下において増幅および検出を行い、下記表4にRFVとして報告される検出結果が得られた。
【0099】
【表4】
【0100】
RFVとして報告されるクラミジアの血清型亜型データに対する分析特異性を下記表5に示す。
【0101】
【表5】
【0102】
下記表6は、ジェン−プローブのマニュアル操作AMP−CTアッセイおよびVIDAS自動化プローブアッセイからの結果を比較する、CTについての臨床頸部スワブ検体試験の結果を示す。
【0103】
【表6】
【0104】
下記表7は、マニュアル操作AMP−CTアッセイおよびVIDAS自動化プローブアッセイの結果を比較する、臨床尿検体試験の結果を示す。
【0105】
【表7】
【0106】
このように、VIDAS装置を用いる自動プローブアッセイのアッセイとマニュアル操作のジェン−プローブAMP−CTアッセイとの結果は完全に一致した。
【0107】
例5 多重(複数配列)核酸検出
核酸プローブに基づく診断試験の価値は、複数の異なる核酸分子の検出および内部陽性対照の使用により実質的に高まり得る。少なくとも2つの異なる核酸配列を1回のアッセイ反応で別々に検出することが可能なVIDAS装置(バイオメリュー ヴァイテック社)を使用する、自動化方法が考案されており、これを多重プロトコルと呼ぶ。したがって、核酸増幅手順、もしくは処理された試験試料を同一のアッセイで2つ以上の増幅核酸分子についてスクリーニングすることができる。この方法は、VIDAS装置のSPRピペット様装置での、異なる標的核酸配列(アンプリコン)を特異的に捕捉することができる個別の核酸プローブを空間的に分離することに依存している。SPRは、アフィニティ捕捉(キャプチャー)のための固体担体として作用するとともに、流体の移動を可能にする使い捨てピペット様チップである。SPRによる多重捕捉(マルチプレックスキャプチャー)を、トラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis 、CT)および淋菌(Neisseria gonorrhoeae 、NG)に特異的なキャプチャープローブを用いて示した。
【0108】
図17は多重VIDAS検出の操作を模式的に示すものである。SPRチップは、アルカリホスファターゼ(AKP)で標識された対応する特異的レポータープローブ核酸または検出プローブ核酸を用いて相補体の核酸配列を特異的に捕捉するのに用いられる核酸配列(アンプリコン)のオリゴヌクレオチドにより2つの異なる区域に被覆されている。未結合レポータープローブを除去する洗浄の後、SPR(登録商標)の底部に局在するAKPを蛍光性基質4−MUPを用いて検出する。AKPは、NaOHや、核酸のハイブリッドの変性を促進するような試薬またはアルカリホスファターゼの活性を不活性化するような他の試薬を用いて、SPR(登録商標)の底部から除かれる。酵素反応ウェルを空にし、洗浄して新鮮な4−MUPを再充填する。SPR(登録商標)の底部からAKPが除去されていることを確認するために、新たな基質をSPR(登録商標)の底部に晒し、残留する蛍光を測定する。最後に、SPR(登録商標)の頂部に結合しているAKP−レポータープローブを、SPR(登録商標)を4−MUPに浸漬することにより検出し、第2のアンプリコンの存在を表示する。
【0109】
図18は、2つの異なるキャプチャー区域を有するSPR(登録商標)の製造を示す。SPR(登録商標)を、ラックに保持されるシリコンプラグに先端から挿入する。差動的圧力を用いて、AMVE共重合体に結合した約1μg/mlの特異的キャプチャープローブ溶液を均一に吸引して、全てのSPR(登録商標)に一度につける。各SPRに吸引される液体の量と、従って、区域の大きさとはシステムの圧力を調整することによりコントロールされる。SPR(登録商標)の表面への結合体の付着は室温で数時間受動的に吸着させることにより行われる。洗浄および乾燥の後、SPR(登録商標)を小さい接着性ディスクで蓋をし、新たなラックに先端を下にして挿入する。その後、SPR(登録商標)の低部を第2のキャプチャープローブ結合体で同様に被覆する。SPR(登録商標)は乾燥状態、4℃で保存した場合、安定である。
【0110】
図19は、多重検出のためのVIDAS装置のストリップの構成の好ましい態様を示す。このストリップは、ウェルX1にハイブリダイゼーションバッファ中のAKP−プローブ混合物200μl(各々約1×1012分子のプローブ)を、ウェルX3、X4、X5に600μlの洗浄バッファを、ウェルX6とX7に600μlの除去試薬を、およびX8に400μlのAKP基質を予め充填し、ホイルで密封してある。300μlの4−MUPを収容するホイルで密封した光学キュベット(XA)をこのストリップにはめ込み、これらのストリップを37℃でVIDAS装置に挿入する。次に、多重VIDASプロトコルを、異なる区域を2種類のキャプチャープローブで被覆したSPR(登録商標)を用いて実行した。
【0111】
VIDAS多重プロトコルは多くの工程を含むことができる。例えば、検証試験プロトコルは以下のように13個の基礎的な工程を含む。
【0112】
1.203μlの標的を、X0からX1内のAKP−プローブへ移送する、
2.SPR(登録商標)の全体に対するハイブリダイズおよび取り込み(キャプチャー)、
3.SPR(登録商標)をPBS/ツィーン(X3、X4)で2回洗浄(316μl)する、
4.4−MUP(89.6μl)をXA中でSPR(登録商標)底部に5.3分間導入した後、信号の読み取り、
5.4−MUP(89.6μl)をXA中でSPR(登録商標)底部に14.8分間導入した後、(必要に応じ)信号の読み取り、
6.使用した基質をXAからX2に移送(5×67.1μl)、
7.NaOH(X7)を用いてSPR(登録商標)底部からAKPを除去(112.6μl)、
8.新鮮なNaOHでXAを洗浄(3×112.6μl;X6→XA→X6)、
9.新鮮なPBS/ツィーンでXAを洗浄(3×112.6μl;X5→XA→X5)、
10.新鮮な4−MUPをX8からXAに移送(6×48μl)、
11.4−MUP(89.6μl)をXA中でSPR(登録商標)底部に10.7間分導入した後、信号の読み取り、
12.4−MUP(294μl)をXA中でSPR(登録商標)上部に5.5分間導入した後、信号の読み取り、
13.4−MUP(294μl)をXA中でSPR(登録商標)上部に15分間導入した後、(必要に応じ)信号の読み取り。
【0113】
ハイブリダイゼーション、基質、洗浄および除去の工程は、全て、それぞれの溶液のSPR(登録商標)へのピペッティングと、所定の時間の溶液の保持と、SPR(登録商標)からの溶液のピペッティングとの複数のサイクルを含む。ハイブリダイゼーションと、基質と、洗浄もしくは除去のための保持時間は、それぞれ、3.0、0.5および0.17分である。蛍光の信号はその装置により検出される。この研究プロトコルの合計アッセイ時間は約1.75時間であるが、約75分に減少させることが可能である。
【0114】
図20は上述の通りに実行されたVIDAS多重プロトコルの検証の結果を示すグラフであり、SPR(登録商標)は淋菌(Neisseria gonorrhoeae 、NG)に対する単一のキャプチャープローブだけで均一な被覆がされている。試験試料中のNGオリゴヌクレオチド標的の数は、試験試料中、0、1×1010、もしくは1×1011分子と変化させた。示されるデータは反復した試料の平均である。示されるグラフは2つの部分に分けられ、左および右半分は、それぞれ、SPR(登録商標)の下部および上部の区域からの2つの蛍光測定の結果を示す。下部領域から結合した核酸を除去し、新鮮な4−MUP基質に約11分晒した後に行なった底部区域の測定では、試験した全ての試料について約46RFUであり、これは測定されたバックグランドの蛍光に等しかった。この測定は、グラフの中央に0時点で示されている。したがって、このグラフは単一のSPR(登録商標)からの蛍光の測定の2つの連続する組を示し、測定の第1の組はSPR(登録商標)の下半分から得られたものであり(グラフの左半分)、測定の第2の組はSPR(登録商標)の上半分から得られたものである(グラフの右)。この実験では、多重プロトコルと区域ごとに被覆されたSPRの手法とが実質的に同一の結果を生じることが検証されており、このことはグラフの左側と右側とに示されている、SPRの上部区域および下部区域からの蛍光強度からわかる。
【0115】
図21〜22は、異なる投入量のCTおよびNGオリゴヌクレオチド標的の多重検出を示す。図21は、1×1012個のCT標的を、0、1×109 、1×1010、1×1011、または1×1012個のNG標的と混合し、SPR(登録商標)の底部区域をCTキャプチャープローブで被覆し、かつ頂部区域をNGキャプチャープローブで被覆したSPR(登録商標)を用い、多重プロトコルにより、VIDAS装置で検出した場合の結果を示すグラフである。図22は、1×1012個のNG標的を、0、1×109 、1×1010、1×1011、または1×1012個のCT標的と混合し、SPR(登録商標)の底部区域をCTキャプチャープローブで被覆し、かつ頂部区域をNGキャプチャープローブで被覆したSPR(登録商標)を用い、多重プロトコルにより、VIDAS装置で検出した場合の結果を示す。これらのデータは、上記と同様にグラフに表示されており、単一のSPR(登録商標)からの蛍光の測定の2つの連続する組を示し、測定の第1の組はSPR(登録商標)の下半分から得られたもの(グラフの左半分)であり、測定の第2の組はSPR(登録商標)の頂部から得られたものである(グラフの右)。また、グラフの中央部はSPRの除去についての検証を行ったものである。重要なことは、この実験がSPRの2つの区域がそれぞれ、多重プロトコルにおいて独立に機能するということを示すことであり、これは、2番目の区域から得られた信号が高い(1×1012)場合でも、低い(1×109 、検出されたもの)場合でも、もしくは陰性の場合であっても、1つの区域からの高い蛍光信号が2番目の区域から得られた信号を妨害しないからである。
【0116】
下記表8は、様々な標的レベルの試料におけるCTおよびNGの多重VIDAS検出により得られたもので、RFUで報告されたデータをまとめてある。
【0117】
【表8】
【0118】
このように、多重VIDASプロトコルは明らかに有効であり、試料中の2種類以上の異なる核酸を迅速に、かつ区別して検出することを可能にする。このプロトコルおよびSPR(登録商標)コーティングは、2またはそれ以上の検出区域の間に異なる大きさの間隙を有する異なる表面積のコーティング区域を提供する多くの様式で行うことができる。SPR(登録商標)は、検出する同じ核酸配列の異なる領域、例えば、トランケートされた遺伝子、異なる対立遺伝子もしくは交互にスプライスされた遺伝子を捕まえるように設計されている核酸により被覆することができる。SPR(登録商標)は、核酸増幅反応がうまくいったことを検出し、確認するのに用いる内部対照核酸分子からのアンプリコンを捕まえるように被覆することができる。このように、VIDAS多重プロトコルは、同じ試料中の2つ以上の核酸配列を単一のアッセイで検出するための柔軟な方法である。
【0119】
例6 内部対照配列および方法
増幅反応の内部陽性対照として用いられる、選択される機能的構築ブロックを含んでなる内部対照配列の核酸配列のランダムな生成による構築は、理想的には、その対照配列は、PCR、LCR、TMA、NASBAおよびSDAに限定されるものではないが、これらの様々な核酸の増幅プロトコルに用いられるように独自に設計されることを必要とする。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプロモーター−プライマーに特異的な適切な配列と組み合わせられている内部対照核酸配列は、増幅反応が成功裏に完了した場合、陽性増幅信号を生成する。
【0120】
理想的には、内部対照核酸は、標的微生物や宿主生物中に存在する核酸配列、または正常な微生物フローラもしくは環境中に存在する核酸の配列の存在に拘わらず有用である。一般には、内部対照配列は、その内部対照配列の増幅および検出を妨げる可能性のある、ヒト、病原性微生物、正常な微生物フローラ、または環境中の微生物を含む臨床環境に存在するいかなる核酸配列とも実質的に類似するべきではない。
【0121】
本発明の内部対照配列は、ランダムに生成させた核酸配列のリストから選択される配列の機能的ブロックからなる。この機能的ブロックは、増幅や、捕捉(キャプチャー)や、および増幅産物の検出を可能とするのに必要とされる特別な特性を備えるセグメントである。例えば、TMA反応においては、この機能的ブロックがその増幅プロトコルの特定の機能的要求、例えば、a)アンチセンス鎖のプライマー結合部位、b)捕捉(キャプチャー)部位、c)検出プローブ結合部位;d)センス鎖のプライマー結合部位を含むT7−プロモーター、のような機能的要求を含を満たす場合、その内部対照配列は最も有用となる。これらの機能的な要素の各々には、それら自身の特定の制約、例えば、長さ、G−C含有%、Tm、既知の配列に対する相同性の欠如、および二次構造の特徴が存在しない(すなわち、二量体の形成やヘアピン構造がない)などがあり、これらは適切な配列を選択するために用いることができる。このように、ランダムに生成した配列の機能的ブロックは、内部対照配列を構築する前に、所望の機能的特性についてスクリーニングすることができる。
【0122】
特定の数の機能的ブロックを含み、各々のブロック内で所望の制約を満たし、所望の特性を有する内部対照配列を構築するため、ランダムシーケンス生成器を用いて各々の数が0.000ないし4.000の範囲に限定されている数の列を生成させた。これらの列の長さは自由に変えることが可能であり、機能的ブロックの所望の長さに基づいて選択する。
【0123】
次に、この列の各々の数(すなわち、n1、n2、n3、n4、...nxであり、ここで、xはこの列の長さであるが)を次のようにして、対応するヌクレオチドに割り当てた:0<n≦1である場合にはグアノシン(G);1<n≦2である場合にはアデノシン(A);2<n≦3である場合にはチミジン(T);および3<n≦4である場合にはシトシン(C)。そのような列の大きな集合を作製し、機能的ブロックの各々の配列と構造的要件とを満たすものについてスクリーニングした。図27は説明される方法によって生じた結果を示すものであり、核酸配列の列の集合および特定の機能的パラメータについてのスクリーニングを示す。DNAでの用語体系を用いて示される配列は必要に応じて適切な核酸に容易に適合させることができるので、内部対照配列はDNA、RNA、修飾オリゴヌクレオチド、または核酸のいかなる組み合わせを含むことができる。
【0124】
次に、これらの(ランダムに選択された)機能的ブロックを適切な順序で組み立てることにより、有用な内部対照(IC)を構築する。最後に、組み立てた内部対照配列は、全体の配列および構造的制約が維持されていることを確かめるために試験される。例えば、TMA反応においては、内部対照配列が、2つのプライマーの結合部位の間で大きな塩基対形成潜在能力を有するべきではなく、また、安定な3′二量体構造を形成するべきではない。次いで、これらのスクリーニングを通った内部対照配列をオーバーラップするオリゴヌクレオチドを用いて物理的に作製し、実際の増幅/検出アッセイにおける性能について試験した。
【0125】
機能的なブロックのいずれもが臨床環境に存在する配列といくらかの相同性を有することはあり得るが(4e12の配列、すなわち約4×1012の配列ごとに1つのランダムな頻度で21のヌクレオチドブロックの完全な一致が考えられる;生成した配列をジーンバンク(GenBank )のデータベースに対してスクリーニングした)、全ての機能的配列が実質的な相同性を有することが見出されることはほとんど考えられない。内部対照核酸配列は直列に配置された機能的ブロックの群で構成されるため、天然の核酸配列が同じ直列構造をとる同一の核酸配列ブロックの列を有する可能性は非常に少ない。
【0126】
上述の方法を用いて2種類の特異的内部対照配列が構築されている。ランダム内部対照1(Random Internal Control 1 、RIC1)が、この対照配列の増幅および検出のための可能性のあるオリゴヌクレオチドプライマー/プローブと共に図28に示されている。図29はRIC1分子の可能性のある二次構造の分析を示す。RIC1は、ランダムに生成した列ran16、ran19、ran21およびran33を用いて構築した。プライマーの結合を必要とする機能的ブロックはran16およびran19によって満たされ、捕捉(キャプチャー)部位はran21によって満たされ、検出プローブ結合部位はran33によって満たされた。キャプチャープローブまたは検出プローブ配列の指定の選択は、適切なリンカー分子が適切なプローブに結合し、ここでレポータープローブオリゴヌクレオチドが検出可能な信号を生成する手段に結合し、かつキャプチャープローブオリゴヌクレオチドがそのキャプチャープローブを適切な担体に付着させる手段に結合する限り、入れ替えることが可能である。これらのプローブおよびオリゴ体は、二本鎖DNAの場合には、相補鎖が標的であってもよく、あるいは、適切である限り、検出用の鎖として用いるために変換されていてもよいと理解されている。したがって、適切な状況において、当該技術分野における熟練者が、ここに説明されるものと均等な様式で用いるのに適切な代替プローブおよびプライマーが生成するように開示されている配列を修正することが可能である。
【0127】
ランダム内部対照2(Random Internal Control 2 、RIC2)が、この対照配列の増幅および検出のための可能性のあるオリゴヌクレオチドプライマー/プローブと共に図30に示されている。図31はRIC2配列の可能な二次構造の分析を示す。RIC1と同様に、RIC2はランダムに生成した列ran27、ran32、ran39およびran51を用いて構築した。したがって、プライマー結合、キャプチャープローブ結合、検出プローブ結合を必要とする機能的ブロックが上述の方法によって生成される他のランダム配列によって満たされ得ることもあり得ることが示される。
【0128】
図32は、ran21がキャプチャープローブであり、かつran33が酵素結合検出プローブであるRIC1 DNAの検出の結果を示すものであり、標準アッセイ条件下において予期される蛍光強度で検出がなされることを示す。図33は、TMAによって増幅され、酵素結合検出系を用いるVIDAS装置(バイオメリュー ヴァイテック社)で検出されたRIC1 RNAは、(条件を最適化することなしには)RIC1 RNA約1000分子の感度の限界を有することを示す。RIC2配列の類似の分析を行い、RIC1と類似することが見出された。内部対照の増幅および検出系が、選択された標的に最適化された条件下において有効に機能することは重要である。
【0129】
内部対照(IC)を用いる多重検出のための代替アプローチとして、SPR(登録商標)の1個のSPR(登録商標)の全ての区域を異なるキャプチャー核酸配列の混合物で均一な被覆をすることが可能である。例えば、2種類のキャプチャー核酸配列、すなわち1つは標的試験配列に特異的なもの、もう1つは内部対照配列に特異的なものを1つの区域内に組み合わせることができる。標的アンプリコンが存在する場合には、標的アンプリコンと内部対照アンプリコンとは、標的アンプリコン試験核酸配列に特異的な標識プローブ配列の存在下において、同時にSPR(登録商標)にハイブリダイズされる。洗浄の後、最初の信号の読み取りを行い、SPR(登録商標)上の標識の存在もしくは不存在を決定して試験標的の存在もしくは不存在を確認する。次いで、内部対照に対して特異的な検出標識プローブを用いて、SPR(登録商標)に対して第2のハイブリダイゼーションを行う(順次ハイブリダイゼーション)。SPR(登録商標)を洗浄して過剰の未結合検出プローブを除去し、第2の標識を測定して内部対照の存在もしくは不存在を示す。第1の信号が陰性である場合、ICからの第2の読み取りからの陽性信号は増幅/検出系の機能性を裏付ける。もし、第1および第2の標識が同じであれば、陽性の第1の読み取りおよび陽性の第2のICの読み取りからの付加された信号が生じる。第1の信号が陰性であり、かつ第2のIC信号も陰性である場合には、その増幅/検出は機能性を欠き、これは、例えば、試料の妨害または機械的な失敗のためであり得る。この場合、試験結果は無効である(偽陰性)と報告され、再試験が推奨される。もし、標識が異なっているのであれば、順次起こるハイブリダイゼーションも検出ステップのいずれも必要とはならないであろう。
【0130】
内部対照の使用には大きな関心があり、その根底をなす根拠は「その試料が内部対照の増幅をサポートしない場合、標的核酸配列の増幅をサポートするものとは考えられない。」というものである(NCCLS Document MM3-A,Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases;Approved Guideline,p.55,March 1995)。
【0131】
複数の検出プローブを用いる順次ハイブリダイゼーションアプローチを用いて、第1の読み取り信号(すなわち、純粋なCT信号)および付加的に「混合された」第2の読み取り信号(すなわち、付加されたCTおよびIC信号;下記表9を参照)の別々の検出を許容するプロトコルを設計することが可能となっている。このプロトコルは「除去すること」を必要としない。例えば、表9は、CTとICとの合成標的の異なる混合物がまず均一に被覆されたSPR(登録商標)(CTおよびICキャプチャープローブ)で捕捉され、CT検出プローブと最初にハイブリダイズする場合の結果を示す。第1の読み取りの後、IC検出プローブとのハイブリダイゼーションを行い、次いで第2の読み取り(同じ基質)を行った。
【0132】
この型のプロトコルは、スクリーニングアプローチが許容されている(第1の読み取りの際にGCおよび/またはCT陽性の間に区別がない)場合、組み合わせGC/CT/内部対照アッセイに用いることもできる。GCおよびCT特異的信号は、陽性試料(罹患率に応じて症例の5−10%)のスクリーニングに関して、CTおよびGC特異的アッセイを実行することにより分離しなければならない。SPR(登録商標)は3種類のキャプチャープローブ(CT/GC/内部対照)で均一な被覆をする。その代わりに、ICをCTもしくはGCのキャプチャープローブのいずれかとすることもできる。
【0133】
【表9】
【0134】
このように、上述の内部対照配列は、被覆SPR(登録商標)を備えたVIDAS装置への適用に有効であり、また、核酸の組み合わせアッセイ検出ならびに反応を成功させるための対照のモニタリングを行う多重システムでの使用に有効となる。
【0135】
例7 内部対照配列
ランダムに生成した内部対照配列の精製は、そのような内部対照配列を特異的なアッセイシステムに対して最適化することを可能にする。上述の方法に続いて、CRIC−2として認識されるトラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis 、CT)アッセイ用の内部対照;GRICとして認識される淋菌(Neisseria gonorrhoeae 、NG)アッセイ用の内部対照;およびMRICとして認識される結核菌(Mycobacterium tuberculosis、MT)用の内部対照を含む内部対照核酸配列が様々な増幅および検出システムにおいて用いるために設計され、検証されている。HRICとして認識されるHIVアッセイ用の内部対照を生成した。この内部対照においては、キャプチャープローブ配列およびレポータープローブ配列の両者はランダム配列から誘導されたものである。この内部対照の配列および対応する標的配列を図34に示す。これらの内部対照配列の各々においては、前に説明されるようにレポーター分子に適切に結合されるならば、ランダム配列プローブ#1082をレポータープローブとして用いることができる。HIV内部対照においては、キャプチャーオリゴヌクレオチドランダム配列プローブ#1081は、この対照配列の捕捉において、標的アンプリコンとICアンプリコンとの間で従来のキャプチャープローブに対して競合して排除することにより改良された定量分析が可能なものとして用いることができるように設計されている。
【0136】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】一回適用量の試薬ペレットの温度安定性を示すグラフである。
【図2】一般的なTMAプロトコルを示す図である。
【図3】本発明の可能な態様の1つに従って、TMA反応を行うための使い捨てデュアルチャンバ反応容器およびそれに関連する加熱工程を模式的に示す図である。
【図4】2つの別々の反応チャンバを組み合わせてデュアルチャンバ反応容器を形成する本発明の代わりの形態について模式的に示す図である。
【図5】本発明の好ましい態様に従って2つの固相の受容部および光学機器で処理するために試験ストリップの所定の位置にはめ込まれるデュアルチャンバ反応容器の別の態様を模式的に示す図である。
【図6】一方のチャンバ内の流体試料を他方のチャンバに移すことが可能であるような様式で組み合わされた2つの別のチャンバから形成されたデュアルチャンバ反応容器の別の態様を、図5に示されるような試験ストリップに配置させたものと併せて模式的に示す図である。
【図7】本発明の現時点で好ましい形態に従うデュアルチャンバ反応容器を有する試験ストリップのためのスタンドアロン型増幅処理ステーションの斜視図である。
【図8】図7の増幅モジュールの1つを、このモジュールの後方から見た斜視図である。
【図9】図8のモジュールの前面の斜視図である。
【図10】図9のモジュールの別の斜視図である。
【図11】図8〜10のモジュールの試験ストリップホルダの一部および95℃ペルチェ加熱サブシステムの詳細な斜視図である。
【図12】図11の試験ストリップホルダの分離斜視図であって、2つの試験ストリップがこの試験ストリップホルダに装着されている様子を示す。
【図13】図9の試験ストリップホルダもしくはトレイの詳細な斜視図である。
【図14】図9の増幅処理ステーションの電気系のブロック図である。
【図15】図8の増幅処理ステーションの真空サブシステムの図である。
【図16】図8のステーションの熱サイクルを示すグラフである。
【図17】多重VIDAS検出の操作を模式的に示す図である。
【図18】2つの異なるキャプチャー(捕捉)区域を有するSPR(登録商標)の作製を示す図である。
【図19】多重検出のためのVIDAS装置のストリップの構成を示す図である。
【図20】淋菌(Neisseria gonorrhoeae 、NG)標的のみを検出するVIDAS多重プロトコルの検証の結果を示すグラフである。
【図21】1×1012のトラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis 、CT)標的を、0、1×109 、1×1010、1×1011、もしくは1×1012のNG標的と混合し、SPR(登録商標)の底部区域がCTキャプチャープローブで被覆され、かつ上部区域がNGキャプチャープローブで被覆されているSPR(登録商標)を用い、多重プロトコルによりVIDAS機器を用いて検出した場合の結果を示すグラフである。
【図22】1×1012のNG標的を、0、1×109 、1×1010、1×1011、もしくは1×1012のCT標的と混合し、SPR(登録商標)の底部区域がCTキャプチャープローブで被覆され、かつ上部区域がNGキャプチャープローブで被覆されているSPR(登録商標)を用い、多重プロトコルによりVIDAS機器を用いて検出した場合の結果を示すグラフである。
【図23】増幅後のVIDAS装置によるM.tb核酸の検出を示す図である。
【図24】VIDAS装置によるM.tb核酸の検出を示す図である。
【図25】増幅後のVIDAS装置によるM.tb核酸の検出を示す図である。
【図26】二元/デュアルチャンバプロトコルを用いる増幅の後のVIDAS装置によるM.tb核酸の検出を示すグラフである。
【図27】説明した方法によって得られた結果を示す図であり、核酸配列を示す列の収集および特定の機能的パラメータに関するスクリーニングについて示すものである。
【図28】ランダム内部対照1(RIC1)の核酸配列を、この対照配列の増幅および検出のための可能なオリゴヌクレオチドプライマー/プローブとして示す図である。
【図29】RIC1配列の可能性のある二次構造のおける成分の検討結果を示す図である。
【図30】ランダム内部対照2(RIC2)の核酸配列を、この対照配列の増幅および検出のための可能なオリゴヌクレオチドプライマー/プローブとして示す図である。
【図31】RIC2配列の可能性のある二次構造における成分の検討結果を示す図である。
【図32】RIC1 DNAの検出から得られる結果を示す図であって、ran21はキャプチャープローブ、ran33は酵素結合検出プローブであり、かつ標準アッセイ条件下で増幅および検出できることを示す。
【図33】TMAによって増幅されたRIC1 RNAおよび酵素結合検出システムを用いるVIDAS装置(バイオメリュー ヴァイテック社)で検出された化学的に活性化された信号の感度の限界が約1000分子のRIC1 RNAである(条件の最適化なし)ことを示す図である。
【図34】CRIC−2として識別されるトラコーマ病原体(Chlamydia trachomatis 、CT);GRICとして識別される淋菌(Neisseria gonorrhoeae 、NG);MRICとして識別される結核菌(mycobacterium tuberculosis、MT)を検出するアッセイ用に設計された内部対照オリゴヌクレオチドの核酸配列、およびHRICとして識別されるHIV用の内部対照の核酸配列を示す図である。
【符号の説明】
10 デュアルチャンバ反応容器
19 試験ストリップ
200 スタンドアロン型増幅処理システム
202、204 増幅ステーション
240 トレイ
244 真空供給パイプ
Claims (7)
- 試料中の一本鎖もしくは二本鎖の第1の核酸の存在または不存在を、デュアルチャンバ反応容器内での該第1の核酸の自動化等温増幅によって検出する方法であって、該デュアルチャンバ反応容器は第1および第2の2つの反応チャンバを具備し、該反応チャンバは互いに液通が可能なように配置されており、それにより該液通を制御可能に遮断することが可能となっており、
該検出は、
a)該第1の反応チャンバ内で、潜在的に該第1の核酸を含む試料と、反応バッファと、遊離ヌクレオチドの混合物と、第1および第2の特異的オリゴヌクレオチドプライマーとを組み合わせ、かつ該反応容器を自動装置内に収容し、該自動装置は次のように
b)自動装置は、第1の反応チャンバを、試験しようとする試料中のいかなる二本鎖の第1の核酸でもハイブリダイゼーション産物の形成が可能となるのに十分な一本鎖の核酸となるような十分な温度で、かつ十分な時間加熱する一方、該ハイブリダイゼーション産物は該第1の核酸および少なくとも1つの該第1および第2のオリゴヌクレオチドプライマーとからなるものであり;
c)自動装置は、該第1核酸が存在する場合に該ハイブリダイゼーション産物が形成するのに十分な温度に第1の反応チャンバを冷却し;
d)自動装置は、反応混合物を該制御可能な液通により第1の反応チャンバから該第2の反応チャンバに、該反応混合物が核酸重合酵素と接触するように移送し;
e)自動装置は、第2の反応チャンバの温度を、該第1の核酸が存在する場合、該第1の核酸の特異的オリゴヌクレオチドプライマー介在増幅を可能とするのに十分な温度に維持し;
f)自動装置は、特異的に結合する核酸−キャプチャープローブハイブリダイゼーション複合体の形成が可能となるように、第2の反応チャンバ内にある第1の核酸からのあらゆるアンプリコン産物と、該第1の核酸からの該アンプリコンに対して特異的なキャプチャー核酸とを接触させ;
g)自動装置は、必要により、ハイブリダイゼーション複合体混合物を、非特異的に結合した核酸が特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体から洗い落とされるように洗浄し;
h)自動装置は、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体と、該第1の核酸からの該アンプリコン産物に対して特異的な標識核酸プローブとを接触させ、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体の形成が可能となるようにし;
i)自動装置は、必要により、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体を洗浄し、非特異的に結合した標識プローブ核酸が特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体から洗い落とされるようにし;および
j)自動装置は、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体を、該アンプリコンおよび第1の核酸が存在する場合には、検出可能な信号を発生させるものが含まれている溶液と接触させ、該試料から試料中の該第1の核酸の量に比例する量の信号を生成し、該生成した信号の存在もしくは不存在を検出し、必要により該信号の値を表示し、かつ必要により該信号の値を記録することを備えるものであって、ここで、工程h、i、およびjの各々は順次行っても同時に行ってもよいものである検出方法。 - 前記核酸増幅酵素が前記第2の反応チャンバ内に凍結乾燥ペレットの形態で一回のアッセイ用の量として配置され、かつ該反応チャンバが使用前には密封されている請求項1に記載の検出方法。
- 核酸増幅酵素が熱安定性酵素である請求項1に記載の検出方法。
- 熱安定性の核酸増幅酵素が第1の反応チャンバ内に配置されている請求項3に記載の検出方法。
- 内部対照分子がさらに組み込まれている請求項1に記載の検出方法。
- 標的核酸配列の増幅および検出をさらに包含する請求項1に記載の検出方法。
- プライマー対照配列の検出をさらに包含する請求項1に記載の検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US85017197A | 1997-05-02 | 1997-05-02 | |
US08/850,171 | 1997-05-02 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10304890A JPH10304890A (ja) | 1998-11-17 |
JP4526609B2 true JP4526609B2 (ja) | 2010-08-18 |
Family
ID=25307435
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP12356498A Expired - Lifetime JP4526609B2 (ja) | 1997-05-02 | 1998-05-06 | 改良された核酸アッセイ |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US6558901B1 (ja) |
EP (1) | EP0875584B1 (ja) |
JP (1) | JP4526609B2 (ja) |
KR (1) | KR19980086701A (ja) |
BR (1) | BR9801572A (ja) |
CA (1) | CA2230967C (ja) |
DE (1) | DE69841895D1 (ja) |
ES (1) | ES2350038T3 (ja) |
Families Citing this family (74)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6444444B1 (en) * | 1996-07-10 | 2002-09-03 | Aventis Pasteur Limited | Genes encoding mycobacterial proteins associated with cell binding and cell entry and uses thereof |
US6558901B1 (en) * | 1997-05-02 | 2003-05-06 | Biomerieux Vitek | Nucleic acid assays |
IL124275A (en) * | 1997-05-02 | 2002-03-10 | Bio Merieux Vitek Inc | A method to produce sequences of nucleic acids |
US6849400B1 (en) * | 1997-07-23 | 2005-02-01 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detecting and measuring spliced nucleic acids |
US6582962B1 (en) * | 1998-02-27 | 2003-06-24 | Ventana Medical Systems, Inc. | Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters |
US8337753B2 (en) | 1998-05-01 | 2012-12-25 | Gen-Probe Incorporated | Temperature-controlled incubator having a receptacle mixing mechanism |
DE1075328T1 (de) | 1998-05-01 | 2001-10-11 | Ammann Kelly G | Automatische diagnostische analysevorrichtung und -verfahren |
US6235479B1 (en) * | 1999-04-13 | 2001-05-22 | Bio Merieux, Inc. | Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample |
DE19952723C2 (de) * | 1999-10-26 | 2002-10-31 | Epigenomics Ag | Vorrichtung und Verfahren zur Hybridisierung doppelsträngiger DNA-Proben an Oligomer-Arrays |
GB2368809B (en) * | 2000-09-15 | 2004-09-29 | Norchip As | Microfabricated reaction chamber system |
WO2004083806A2 (en) | 2003-01-22 | 2004-09-30 | University Of South Florida | Autonomous genosensor apparatus and methods for use |
BRPI0408967B8 (pt) | 2003-03-31 | 2021-07-27 | Hoffmann La Roche | kit e métodos para detecção de um ácido nucléico de vários membros do sorogrupo do vírus da encefalite japonesa em uma amostra biológica sob condições de hibridização rigorosas |
FR2854695B1 (fr) * | 2003-05-07 | 2006-01-21 | Biomerieux Sa | Module de reaction pour l analyse biologique |
US20070172886A1 (en) * | 2003-05-07 | 2007-07-26 | Bruno Colin | Reaction module for biological analysis |
EP1625232B1 (en) * | 2003-05-16 | 2013-09-04 | GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Internal control nucleic acid molecule for nucleic acid amplification systems |
GB0317335D0 (en) * | 2003-07-24 | 2003-08-27 | Sec Dep For The Home Departmen | Improvements in and relating to interpretation |
US7090803B1 (en) * | 2003-10-28 | 2006-08-15 | American Bio Medica Corporation | Lateral flow immunoassay device |
US20050164204A1 (en) * | 2004-01-27 | 2005-07-28 | Reed Thomas D. | Single use lyophilized rnase reagents, and kits and methods for using same |
WO2005072456A2 (en) * | 2004-01-28 | 2005-08-11 | Gerard Biotech, Llc | Single use lyophilized enzymatic reagents, and kits and methods for using same |
US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
FI20040768A0 (fi) * | 2004-06-04 | 2004-06-04 | Teemu Korpimaeki | Menetelmä määritysreagenssien stabiloimiseksi, stabilisoituja määritysreagensseja sisältävä reagenssisäiliö ja sen käyttö |
EP1781810A1 (en) * | 2004-06-29 | 2007-05-09 | Wallac Oy | Integrated non-homogeneous nucleic acid amplification and detection |
US20060068398A1 (en) * | 2004-09-24 | 2006-03-30 | Cepheid | Universal and target specific reagent beads for nucleic acid amplification |
JP2008000002A (ja) * | 2004-09-30 | 2008-01-10 | Sysmex Corp | リブロース2リン酸カルボキシラーゼスモールチェーン1A(RBCS−1A)遺伝子及び/又は該遺伝子のmRNAを検出するための核酸増幅用プライマ、及び内部標準として該遺伝子及び/又は該遺伝子のmRNAを用いた検査方法。 |
CA2582661C (en) * | 2004-11-09 | 2015-08-11 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting group a streptococci |
CA2842232C (en) | 2005-03-10 | 2015-01-27 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples |
CN101365781A (zh) * | 2005-11-21 | 2009-02-11 | 阿普尔拉公司 | 用于核酸处理的便携式制备、分析和检测设备 |
US9839909B2 (en) | 2006-07-28 | 2017-12-12 | Diagnostics For The Real World, Ltd. | Device, system and method for processing a sample |
CN1888902B (zh) * | 2006-08-11 | 2011-05-18 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置 |
US20080261216A1 (en) * | 2006-09-08 | 2008-10-23 | The Regents Of The University Of Michigan | HERV Group II Viruses In Lymphoma And Cancer |
GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
US8835157B2 (en) * | 2007-04-25 | 2014-09-16 | 3M Innovative Properties Company | Supported reagents, methods, and devices |
CA2683990A1 (en) * | 2007-04-25 | 2008-11-06 | 3M Innovative Properties Company | Chemical component and processing device assembly |
CA2691451C (en) | 2007-06-21 | 2015-03-24 | Sara H. Fan | Instrument and receptacles for performing processes |
US20090011422A1 (en) * | 2007-06-28 | 2009-01-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Methods for cloning small rna species |
PT2557517T (pt) * | 2007-07-23 | 2023-01-04 | Univ Hong Kong Chinese | Determinação de um desequilíbrio de sequências de ácido nucleico |
WO2009024773A1 (en) | 2007-08-17 | 2009-02-26 | Diagnostics For The Real World, Ltd | Device, system and method for processing a sample |
US7644610B2 (en) * | 2007-08-24 | 2010-01-12 | Baker Hughes Incorporated | Automated formation fluid clean-up to sampling switchover |
US20100209927A1 (en) * | 2007-11-06 | 2010-08-19 | Menon Vinod P | Processing device tablet |
EP2287331A4 (en) * | 2008-05-12 | 2012-01-25 | Olympus Corp | PROCESS FOR PROCESSING EXCREMENTS AND CONTAINERS FOR PROCESSING EXCREMENTS |
KR101796906B1 (ko) | 2009-03-24 | 2017-11-10 | 유니버시티 오브 시카고 | 반응을 수행하기 위한 방법 |
US9464319B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-10-11 | California Institute Of Technology | Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes |
US9447461B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-09-20 | California Institute Of Technology | Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes |
US10196700B2 (en) | 2009-03-24 | 2019-02-05 | University Of Chicago | Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes |
WO2011099855A1 (en) * | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, | Method for combined monitoring of detection of at least two molecular targets and to a kit therefore |
WO2012003289A1 (en) * | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Method and apparatus for identifying analyte-containing samples using single-read determination of analyte and process control signals |
CN103540518B (zh) | 2010-07-23 | 2015-07-08 | 贝克曼考尔特公司 | 化验盒 |
US9046507B2 (en) | 2010-07-29 | 2015-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Method, system and apparatus for incorporating capacitive proximity sensing in an automated fluid transfer procedure |
CN103403533B (zh) | 2011-02-24 | 2017-02-15 | 简.探针公司 | 用于分辨光信号检测器中不同调制频率的光信号的系统和方法 |
WO2013070754A1 (en) | 2011-11-07 | 2013-05-16 | Beckman Coulter, Inc. | Robotic arm |
BR112014011046A2 (pt) | 2011-11-07 | 2017-06-13 | Beckman Coulter, Inc. | fluxo de trabalho e sistema de centrífuga |
KR20140091033A (ko) | 2011-11-07 | 2014-07-18 | 베크만 컬터, 인코포레이티드 | 검체 컨테이너 검출 |
CN104053997B (zh) | 2011-11-07 | 2016-12-21 | 贝克曼考尔特公司 | 用于处理样本的系统和方法 |
US8973736B2 (en) | 2011-11-07 | 2015-03-10 | Beckman Coulter, Inc. | Magnetic damping for specimen transport system |
WO2013070740A1 (en) | 2011-11-07 | 2013-05-16 | Beckman Coulter, Inc. | Aliquotter system and workflow |
GB201122121D0 (en) * | 2011-12-22 | 2012-02-01 | Animal Health Trust | Diagnostic test for bacterial pathogens |
US20130280696A1 (en) | 2012-04-23 | 2013-10-24 | Elliott Millenson | Devices and methods for detecting analyte in bodily fluid |
MX2014014356A (es) | 2012-05-24 | 2015-07-06 | Fundació Inst D Investigació Biomédica De Bellvitge Idibell | Metodo para la identificacion del origen de un cancer de origen primario desconocido. |
CN105745546B (zh) | 2013-03-15 | 2017-10-13 | 雅培制药有限公司 | 具有后面可进入轨道系统的自动化诊断分析仪及相关方法 |
ES2934684T3 (es) | 2013-03-15 | 2023-02-24 | Abbott Lab | Analizadores de diagnóstico automatizados que tienen carruseles dispuestos verticalmente y métodos relacionados |
EP2972402B1 (en) | 2013-03-15 | 2023-12-20 | Abbott Laboratories | Diagnostic analyzers with pretreatment carousels and related methods |
US9984201B2 (en) | 2015-01-18 | 2018-05-29 | Youhealth Biotech, Limited | Method and system for determining cancer status |
GB201510723D0 (en) * | 2015-06-18 | 2015-08-05 | Alere Switzerland Gmbh | High throughput isothermal nucleic acid amplification |
US10202650B2 (en) | 2016-05-31 | 2019-02-12 | Youhealth Biotech, Limited | Methods for monitoring ELOVL2, KLF14 and PENK gene expression following treatment with vitamin C |
WO2018009703A1 (en) | 2016-07-06 | 2018-01-11 | Youhealth Biotech, Limited | Breast and ovarian cancer methylation markers and uses thereof |
US10093986B2 (en) | 2016-07-06 | 2018-10-09 | Youhealth Biotech, Limited | Leukemia methylation markers and uses thereof |
CN107847515B (zh) | 2016-07-06 | 2021-01-29 | 优美佳生物技术有限公司 | 实体瘤甲基化标志物及其用途 |
US10427162B2 (en) | 2016-12-21 | 2019-10-01 | Quandx Inc. | Systems and methods for molecular diagnostics |
US10513739B2 (en) | 2017-03-02 | 2019-12-24 | Youhealth Oncotech, Limited | Methylation markers for diagnosing hepatocellular carcinoma and lung cancer |
JP7050757B2 (ja) * | 2017-03-29 | 2022-04-08 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 検体処理測定システム |
CN107460108A (zh) * | 2017-07-23 | 2017-12-12 | 新疆昆泰锐生物技术有限公司 | 一种连续进样的pcr反应体系配制及进样装置及pcr仪 |
WO2022006468A1 (en) | 2020-07-02 | 2022-01-06 | Ultima Genomics, Inc. | Methods and systems for nucleic acid analysis |
CN114480098B (zh) * | 2022-02-15 | 2023-10-03 | 吉林正业生物制品股份有限公司 | 一种便携式鸡滑液囊支原体检测装置及其方法 |
WO2024069939A1 (ja) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | 株式会社Mirai Genomics | 核酸増幅用カートリッジ及び核酸増幅方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996024664A1 (en) * | 1995-02-10 | 1996-08-15 | Gen-Probe Incorporated | Stabilized enzyme compositions for nucleic acid amplification |
Family Cites Families (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4087248A (en) | 1976-07-26 | 1978-05-02 | Miles Laughton E | Multiple assay machine and method |
FR2422956A1 (fr) | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
US4457916A (en) | 1982-08-31 | 1984-07-03 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for stabilizing Tumor Necrosis Factor and a stable aqueous solution or powder containing the same |
WO1987000196A1 (en) | 1985-07-09 | 1987-01-15 | Quadrant Bioresources Limited | Protection of proteins and the like |
US4762857A (en) | 1986-05-30 | 1988-08-09 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Trehalose as stabilizer and tableting excipient |
US5541308A (en) | 1986-11-24 | 1996-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
US5202231A (en) * | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
GB8715238D0 (en) | 1987-06-29 | 1987-08-05 | Quadrant Bioresources Ltd | Food process |
JPH02504188A (ja) | 1987-07-02 | 1990-11-29 | イン・ヴィトロ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド | 複数分析の免疫検定用毛細管装置 |
CA1340843C (en) | 1987-07-31 | 1999-12-07 | J. Lawrence Burg | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
GB8801338D0 (en) | 1988-01-21 | 1988-02-17 | Quadrant Bioresources Ltd | Preservation of viruses |
US4983523A (en) * | 1988-04-08 | 1991-01-08 | Gene-Trak Systems | Methods for preparing sample nucleic acids for hybridization |
US5229297A (en) | 1989-02-03 | 1993-07-20 | Eastman Kodak Company | Containment cuvette for PCR and method of use |
GB8903593D0 (en) | 1989-02-16 | 1989-04-05 | Pafra Ltd | Storage of materials |
WO1990010716A1 (en) * | 1989-03-10 | 1990-09-20 | Gene-Trak Systems | Immobilized oligonucleotide probes and uses therefor |
US5217862A (en) | 1989-05-24 | 1993-06-08 | Amoco Corporation | Method for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
DE69027910T2 (de) | 1989-05-31 | 1997-02-20 | Amoco Corp | Nukleinsäuresonden zum Nachweis von Chlamydia trachomatis und Chlamydia psittaci |
US5143854A (en) * | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5766849A (en) | 1989-07-11 | 1998-06-16 | Gen-Probe Incorporated | Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence |
US5856088A (en) | 1989-07-11 | 1999-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
US5219727A (en) | 1989-08-21 | 1993-06-15 | Hoffmann-Laroche Inc. | Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction |
US5122284A (en) | 1990-06-04 | 1992-06-16 | Abaxis, Inc. | Apparatus and method for optically analyzing biological fluids |
US5395521A (en) * | 1991-05-31 | 1995-03-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Automated column equilibration, column loading, column washing and column elution |
GB9114202D0 (en) | 1991-07-01 | 1991-08-21 | Quadrant Holdings Cambridge | Blood products |
FR2679255B1 (fr) | 1991-07-17 | 1993-10-22 | Bio Merieux | Procede d'immobilisation d'un fragment nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation. |
US5521300A (en) | 1991-08-13 | 1996-05-28 | Norval B. Galloway | Oligonucleotides complementary to mycobacterial nucleic acids |
FR2688788B1 (fr) | 1992-03-17 | 1994-05-13 | Bio Merieux | Composes hydrosolubles derives d'un homopolymere ou copolymere de l'anhydride maleique, et applications desdits composes au support de molecules biologiques. |
JP2001504572A (ja) | 1992-04-09 | 2001-04-03 | アボツト・ラボラトリーズ | Hiv抗原及びhiv抗体を検出するためのアッセイ |
US5587128A (en) | 1992-05-01 | 1996-12-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale polynucleotide amplification devices |
US5498392A (en) | 1992-05-01 | 1996-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale polynucleotide amplification device and method |
CA2135073C (en) | 1992-05-06 | 2002-11-19 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
US5715385A (en) * | 1992-07-10 | 1998-02-03 | Lsi Logic Corporation | Apparatus for 2-D affine transformation of images |
US5849544A (en) * | 1992-07-24 | 1998-12-15 | University Of Australia | Amplification and detection process |
FR2694754B1 (fr) | 1992-08-12 | 1994-09-16 | Bio Merieux | Fragments d'ADN de mycobactéries, amorces d'amplification, sondes d'hybridation, réactifs et procédé de détection de détection de mycobactéries. |
WO1994005812A1 (en) * | 1992-09-02 | 1994-03-17 | The Scripps Research Institute | Coupled isothermal polynucleotide amplification and translation system |
US5780273A (en) | 1993-04-09 | 1998-07-14 | Amoco Corporation | Insertion elements and amplifiable nucleic acids |
CA2119701A1 (en) | 1993-04-16 | 1994-10-17 | Colleen M. Nycz | Nucleic acid assay procedure |
US5457027A (en) | 1993-05-05 | 1995-10-10 | Becton, Dickinson And Company | Internal controls for isothermal nucleic acid amplification reactions |
US6709813B1 (en) * | 1993-05-14 | 2004-03-23 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of human CMV DNA using primers having matched melting temperatures |
US5837832A (en) * | 1993-06-25 | 1998-11-17 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
FR2709310B1 (fr) | 1993-07-23 | 1995-09-29 | Bio Merieux | Fragment nucléotidique de l'ARN ribosomique 23S de mycobactéries, sondes et amorces dérivées, réactif et procédé de détection. |
US6136529A (en) | 1993-09-03 | 2000-10-24 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes to Mycobacterium avium complex |
FR2710075B1 (fr) * | 1993-09-15 | 1995-10-27 | Bio Merieux | Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal. |
US5645801A (en) | 1993-10-21 | 1997-07-08 | Abbott Laboratories | Device and method for amplifying and detecting target nucleic acids |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
WO1995024499A1 (en) | 1994-03-10 | 1995-09-14 | Gen-Probe Incorporated | Method for suppressing inhibition of enzyme-mediated reactions by ionic detergents |
CN1188171C (zh) | 1994-06-02 | 2005-02-09 | 廓德伦特控股剑桥有限公司 | 防止各种特质在再水化或熔化时聚集的方法以及由此获得的组合物 |
US6060288A (en) * | 1994-08-03 | 2000-05-09 | Mosaic Technologies | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
US5646801A (en) * | 1994-08-30 | 1997-07-08 | International Business Machines Corporation | Direct access storage device with improved reliability flex cable mounting |
US5589336A (en) | 1994-11-10 | 1996-12-31 | New York Blood Center | Diagnostic method and kit for determining Kell blood group genotype |
DE19503685C2 (de) | 1995-01-30 | 2000-05-31 | Invitek Gmbh | Verfahren zur Herstellung komplexer multienzymatischer lagerstabiler Reaktionsgemische und deren Verwendung |
FR2730545B1 (fr) * | 1995-02-13 | 1997-03-28 | Bio Merieux | Vanne statique a congelation, et enceinte de traitement controlee par au moins une vanne |
US5710029A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-20 | Gen-Probe Incorporated | Methods for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product |
US5747252A (en) | 1995-06-07 | 1998-05-05 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species |
US5856174A (en) * | 1995-06-29 | 1999-01-05 | Affymetrix, Inc. | Integrated nucleic acid diagnostic device |
US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
US5697409A (en) * | 1996-02-21 | 1997-12-16 | Biomerieux Vitek, Inc. | Diluting and pipetting stations for sample testing machine |
US5762873A (en) * | 1996-02-21 | 1998-06-09 | Biomerieux Vitek, Inc. | Automatic sample testing machine |
CA2199213C (en) * | 1996-03-11 | 2007-04-17 | John Wesley Backus | Amplifying and detecting target nucleic acids using a post amplification incubation step |
US5804384A (en) * | 1996-12-06 | 1998-09-08 | Vysis, Inc. | Devices and methods for detecting multiple analytes in samples |
US6558901B1 (en) * | 1997-05-02 | 2003-05-06 | Biomerieux Vitek | Nucleic acid assays |
IL124275A (en) * | 1997-05-02 | 2002-03-10 | Bio Merieux Vitek Inc | A method to produce sequences of nucleic acids |
US5786182A (en) * | 1997-05-02 | 1998-07-28 | Biomerieux Vitek, Inc. | Dual chamber disposable reaction vessel for amplification reactions, reaction processing station therefor, and methods of use |
-
1998
- 1998-04-24 US US09/065,914 patent/US6558901B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 ES ES98303458T patent/ES2350038T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 KR KR1019980015754A patent/KR19980086701A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-05-01 DE DE69841895T patent/DE69841895D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 EP EP98303458A patent/EP0875584B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 CA CA002230967A patent/CA2230967C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-04 BR BR9801572A patent/BR9801572A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-05-06 JP JP12356498A patent/JP4526609B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-02-05 US US09/245,939 patent/US6300068B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-05 US US09/245,940 patent/US6586234B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-05-31 US US09/586,546 patent/US6528632B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-07-09 US US09/901,181 patent/US7309588B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-07-19 US US11/780,164 patent/US20080240985A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996024664A1 (en) * | 1995-02-10 | 1996-08-15 | Gen-Probe Incorporated | Stabilized enzyme compositions for nucleic acid amplification |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6300068B1 (en) | 2001-10-09 |
US20040248087A1 (en) | 2004-12-09 |
US20080240985A1 (en) | 2008-10-02 |
EP0875584A2 (en) | 1998-11-04 |
ES2350038T3 (es) | 2011-01-17 |
US6528632B1 (en) | 2003-03-04 |
BR9801572A (pt) | 1999-06-29 |
CA2230967A1 (en) | 1998-11-02 |
US7309588B2 (en) | 2007-12-18 |
EP0875584B1 (en) | 2010-09-15 |
DE69841895D1 (de) | 2010-10-28 |
JPH10304890A (ja) | 1998-11-17 |
CA2230967C (en) | 2009-10-27 |
US6586234B1 (en) | 2003-07-01 |
EP0875584A3 (en) | 2001-12-05 |
KR19980086701A (ko) | 1998-12-05 |
US6558901B1 (en) | 2003-05-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4526609B2 (ja) | 改良された核酸アッセイ | |
EP2271767B1 (en) | Amplicon rescue multiplex polymerase chain reaction for amplificaton of multiple targets | |
Fredricks et al. | Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases | |
Farrell et al. | Rapid-cycle PCR method to detect Bordetella pertussis that fulfills all consensus recommendations for use of PCR in diagnosis of pertussis | |
CA2673958C (en) | Methods for detecting methicillin-resistant s. aureus as well as primers, probes and kits for the same | |
US10538805B2 (en) | Quantitative multiplexed identification of nucleic acid targets | |
Jannes et al. | A review of current and future molecular diagnostic tests for use in the microbiology laboratory | |
US7262008B2 (en) | Nucleic acid assays | |
Diggle et al. | Automation of fluorescence-based PCR for confirmation of meningococcal disease | |
Lampel et al. | Polymerase chain reaction detection of invasive Shigella and Salmonella enterica in food | |
AU769852B2 (en) | Improved nucleic acid assays | |
Hirvonen | Utility and Impact of Detecting Clinically Important Bacteria with Small-Scale and Automated Nucleic-Acid Amplification Assays | |
MXPA98003500A (en) | Best nucleic acid experiments | |
EP3066210B1 (en) | Detection of streptococcus pneumoniae | |
Mitchell et al. | Current trends in molecular microbiology | |
JP5089222B2 (ja) | プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法 | |
JP5089220B2 (ja) | プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法 | |
JP5089223B2 (ja) | プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法 | |
JP5089221B2 (ja) | プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法 | |
JP5094181B2 (ja) | プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050421 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080826 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081125 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081128 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090224 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100511 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100602 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130611 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |