ES2350038T3 - Ensayos de ácidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE LA DETECCION DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS ESPECIFICAS, UTILIZANDO O NO UN PROCEDIMIENTO DE AMPLIFICACION DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS ESPECIFICAS. DE FORMA MAS CONCRETA, LA INVENCION DESCRIBE COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS MEJORADOS PARA REDUCIR EL RIESGO DE CONTAMINACION PROCEDENTE DE LA MANIPULACION DE LOS REACTIVOS, LOS CONTROLES INTERNOS PARA LA AMPLIFICACION, Y EL USO DE APARATOS AUTOMATICOS PARA LA DETECCION AUTOMATICA DE UNA O MAS DE LAS SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS AMPLIFICADAS.

Description

La presente invención se refiere a la detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas en una muestra de ensayo diana.

En particular, la presente invención se refiere a la detección automática de secuencias de ácidos nucleicos específicas que son secuencias de ácidos nucleicos no amplificadas o amplificadas (amplicones).

Además, la presente invención se refiere al uso de amplificaciones automáticas, procedimientos y composiciones para controlar una amplificación exitosa, procedimientos mejorados para reducir las posibilidades de contaminación y al uso de tampones de reacción unificados y alícuotas de dosis unitaria de componentes de reacción para la amplificación.

El desarrollo de técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, la amplificación de dichos ácidos nucleicos cuando sea necesario y la posterior detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos o amplicones ha generado ensayos específicos de secuencia de ácido nucleico y extremadamente sensibles para el diagnóstico de enfermedades y/o la identificación de organismos patógenos en una muestra de ensayo.

Cuando sea necesario, la amplificación enzimática de secuencias de ácidos nucleicos aumentará la capacidad de detectar dichas secuencias de ácidos nucleicos. Generalmente, los esquemas de amplificación conocidos actualmente se pueden agrupar ampliamente en dos clases basadas en si las reacciones de amplificación enzimática están dirigidas por ciclado continuo de la temperatura entre la temperatura de desnaturalización, la temperatura de hibridación de cebadores y la temperatura de síntesis del amplicón (producto de la amplificación enzimática de ácidos nucleicos), o si la temperatura se mantiene constante durante todo el procedimiento de amplificación enzimática (amplificación isotérmica). Son tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos por ciclado típicas (termociclado) la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR). Se analizan protocolos específicos para dichas reacciones en, por ejemplo, Short Protocols in Molecular Biology, 2ª Edición, A Compendium of Methods from Current protocols in Molecular Biology, (Ed. Ausubel y col., John Wiley & Sons, Nueva York, 1992) capítulo 15. Las reacciones que son isotérmicas incluyen: la amplificación mediada por transcripción (TMA), la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) y la amplificación con desplazamiento de cadena (SDA).

Los documentos de Patente de Estados Unidos que analizan la amplificación de ácidos nucleicos incluyen 4.683.195; 4.683.202; 5.130.238; 4.876.187; 5.030.557; 5.399.491; 5.409.818; 5.485.184; 5.409.818; 5.554.517; 5.437.990 y 5.554.516. Se sabe bien que procedimientos como los descritos en estas patentes permiten la amplificación y la detección de ácidos nucleicos sin necesidad de clonación y son responsables de los ensayos más sensibles para secuencias de ácidos nucleicos. Sin embargo, está igualmente bien reconocido que junto con la sensibilidad de detección posible con la amplificación de ácidos nucleicos, la facilidad de contaminación por cantidades mínimas de secuencias de ácidos nucleicos exógenas no deseadas es sumamente alta. La contaminación por ácidos nucleicos de ADN o ARN exógenos no deseados es igualmente probable. La utilidad de las reacciones de amplificación se aumentará mediante procedimientos para controlar la introducción de ácidos nucleicos exógenos no deseados y otros contaminantes.

Antes del descubrimiento de enzimas termoestables, los procedimientos que usaban el termociclado se hacían extremadamente difíciles debido a las necesidades de adición de enzima fresca después de cada etapa de desnaturalización, puesto que inicialmente las temperaturas elevadas necesarias para la desnaturalización también inactivaban las polimerasas. Una vez que se descubrieron las enzimas termoestables, la amplificación cíclica de ácidos nucleicos se convirtió en un procedimiento mucho más simplificado en el que la adición de enzima sólo era necesaria al principio de la reacción. Por tanto, los tubos de reacción no tenían que abrirse y no tenía que añadirse nueva enzima durante la reacción, lo que permitió una mejora en la eficacia y precisión ya que se redujo el riesgo de contaminación y se redujo también el coste de las enzimas. Un ejemplo de enzima termoestable es la polimerasa aislada del organismo Thermophilus aquaticus.

En general, la amplificación isotérmica puede requerir la actividad combinada de múltiples actividades enzimáticas para las que no se han descrito variantes termoestables óptimas. La etapa inicial de una reacción de amplificación requerirá normalmente la desnaturalización de la diana de ácido nucleico, por ejemplo en la reacción de TMA, la etapa de desnaturalización inicial es normalmente ≥65ºC, pero puede ser típicamente ≥95ºC, y se usa cuando es necesaria para eliminar la estructura secundaria del ácido nucleico diana.

La mezcla de reacción se enfría después a una temperatura menor que permite la hibridación de cebadores, y es la temperatura de reacción óptima para las actividades combinadas de las enzimas de amplificación. Por ejemplo, en la TMA las enzimas son generalmente una ARN polimerasa T7 y una transcriptasa inversa (que incluye actividad RNasa H endógena). La temperatura de la reacción se mantiene constante durante todo el ciclo de amplificación isotérmica posterior.

Debido a la ausencia de enzimas termoestables adecuadas, algunas amplificaciones isotérmicas requerirán generalmente la adición de enzimas a la mezcla de reacción después de la desnaturalización a alta temperatura y el enfriamiento a una temperatura más baja. Esta necesidad es poco práctica y requiere la apertura del tubo de reacción de amplificación, que

introduce una oportunidad clave para la contaminación.

Por tanto, sería más útil si dichas reacciones se pudieran realizar más fácilmente con un riesgo reducido de contaminación por procedimientos que permitirían una desnaturalización y amplificación integradas sin la necesidad de una transferencia manual de enzimas.

Los protocolos de reacción típicos requieren el uso de varios tampones diferentes, diseñados para optimizar la actividad de la enzima particular que se esté usando en determinadas etapas en la reacción, o para la resuspensión óptima de los componentes de reacción. Por ejemplo, aunque un tampón de amplificación de PCR 10x típico contendrá KCl 500 mM y Tris HCl 100 mM, pH 8,4, la concentración de MgCl2 dependerá de la secuencia diana de ácido nucleico y del conjunto de cebadores de interés. El tampón de transcripción inversa (5x) contiene típicamente Tris-Cl 400 mM, pH 8,2; KCl 400 mM y MgCl2 300 mM, mientras que el tampón de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia de Maloney murino (5x) contiene típicamente Tris-Cl 250 mM, pH 8,3; KCl 375 mM; DTT 50 mM (Ditiotreitol) y MgCl2 15 mM.

Aunque estos tampones de reacción se pueden preparar a granel a partir de productos químicos de soluciones madre, los productos de amplificación más disponibles en el mercado proporcionan tampones específicos y reactivos envasados a granel para su uso con el protocolo de amplificación. Por ejemplo, los ensayos de amplificación manuales disponibles en el mercado para la detección de patógenos clínicamente significativos (por ejemplo ensayos de detección de Chlamydia y Mycobacterium tuberculosis de GenProbe Inc.) requieren varias manipulaciones manuales para realizar el ensayo, incluyendo la dilución de la muestra ensayo en un tampón de dilución de muestras (SDB), la combinación de la muestra diluida con reactivos de reacción de amplificación tales como oligonucleótidos y cebadores/promotores oligonucleotídicos específicos que se han reconstituido en un tampón de reconstitución de amplificación (ARB) y, finalmente, la adición a esta mezcla de reacción de enzimas reconstituidas en un tampón de dilución de enzimas (EDB).

La preparación y uso de múltiples tampones que requiere múltiples adiciones manuales a la mezcla de reacción introduce una mayor posibilidad de contaminación. Sería más útil tener un tampón unificado único que se pudiera usar en todas las fases de un protocolo de amplificación. En particular, con los ensayos de TMA disponibles en el mercado descritos anteriormente, la necesidad de tres tampones complica mucho la automatización de dicho protocolo.

El envasado a granel de la enzima u otros componentes de reacción por los fabricantes puede requerir la reconstitución de los componentes en grandes cantidades y el uso de cantidades de soluciones madre de múltiples reactivos puede ser antieconómico cuando se van a realizar menos del número máximo de reacciones, ya que algunos de estos componentes pueden ser estables sólo durante un tiempo corto. Este procedimiento de reconstitución también requiere múltiples manipulaciones por el usuario de los reactivos de soluciones madre y la división en alícuotas de cantidades de reacción individuales de reactivos a partir de soluciones madre que genera una oportunidad clave de contaminación.

Se conocen procedimientos y composiciones para la preparación de cantidades a granel de proteínas conservadas, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.098.893; 4.762.857; 4.457.916; 4.891.319; 5.026.566 y las Publicaciones de Patente Internacional WO 89/06542; WO 93/00806; WO 95/33488 y WO 89/00012. Sin embargo, el uso de componentes reactivos previamente divididos en alícuotas y conservados en dosis/cantidades de reacción individuales es tanto muy útil como económico. Las alícuotas individuales de reactivos enzimáticos evitan el uso múltiple de reactivos a granel, reduciendo los residuos y reduciendo mucho las posibilidades de contaminación. Además, dichas alícuotas de reacción individuales son más adecuadas para la automatización del procedimiento de reacción.

La necesidad de muchos cambios de tampón y la adición múltiple de reactivos complica la automatización de dichas reacciones. Una unidad de dosis individual de mezcla de tampón de reacción y un tampón de combinación unificado, tanto simplificará la automatización del procedimiento como reducirá las posibilidades de contaminación.

Los ensayos de sonda de ácido nucleico y los ensayos de combinación de amplificación/sonda pueden ser rápidos, sensibles, altamente específicos y normalmente requieren una manipulación meticulosa para minimizar la contaminación con ácidos nucleicos inespecíficos y son, por tanto, candidatos principales para la automatización. Como con protocolos de detección de ácidos nucleicos convencionales, generalmente es necesario utilizar una secuencia oligonucleotídica de sonda de detección que está unida por algún medio a un componente de generación de una señal detectable. Un sistema de detección de sonda posible se describe en la Patente de Estados Unidos 4.581.333.

Además, la automatización de un sistema de detección de ácidos nucleicos que se dirige a ácidos nucleicos amplificados o no amplificados, o un sistema de detección/amplificación automático combinado, generalmente podrá adaptarse al uso de oligonucleótidos de captura de ácidos nucleicos que están unidos a alguna forma de sistema de soporte sólido. Se encuentran ejemplos de dicha unión y procedimientos para la unión de ácidos nucleicos a soportes sólidos en las Patentes de Estados Unidos 5.489.653 y 5.510.084.

La automatización de la amplificación, detección y una combinación de amplificación y detección es deseable para reducir la necesidad de múltiples interacciones del usuario con el ensayo. Los aparatos y procedimientos para el análisis óptico de los materiales de ensayo se describen por ejemplo en la Patente de Estados Unidos 5.122.284. Se cree generalmente que la automatización es más económica, eficaz, reproducible y precisa para el procesamiento de ensayos clínicos. Por tanto, con la sensibilidad y especificidad superior de los ensayos de detección de ácidos nucleicos, el uso de la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos y la automatización en una o más fases de un protocolo de ensayo pueden aumentar la utilidad del protocolo de ensayo y su utilidad en un entorno clínico.

La amplificación de ácidos nucleicos es altamente sensible a las condiciones de reacción y la no amplificación y/o detección de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos específicas en una muestra puede deberse tanto a un error en el procedimiento de amplificación tanto como deberse a la ausencia de secuencia diana deseada. Las reacciones de amplificación son notablemente sensibles a las condiciones de reacción y han requerido generalmente la inclusión de reacciones de control con dianas de ácidos nucleicos y cebadores conocidos en recipientes de reacción separados tratados al mismo tiempo. Sin embargo, las secuencias de control interno añadidas en la mezcla de reacción de ensayo controlarían realmente el éxito del procedimiento de amplificación en la mezcla de reacción de ensayo objeto y serían más útiles. La Patente de Estados Unidos 5.457.027 muestra determinadas secuencias de control interno que son útiles como un patrón oligonucleotídico interno en reacciones de amplificación isotérmicas para Mycobacterum tuberculosis.

Sin embargo, sería sumamente útil tener un procedimiento general de generación de secuencias de control interno, que serían útiles como controles internos de los diversos procedimientos de amplificación, que están específicamente diseñadas para no verse afectadas por la secuencias de ácidos nucleicos presentes en el organismo diana, el organismo huésped o los ácidos nucleicos presentes en la flora normal o en el entorno. Generalmente, dichas secuencias de control interno no deberían ser sustancialmente similares a ninguna secuencia de ácido nucleico presente en un entorno clínico, incluyendo seres humanos, organismos patógenos, organismos de la flora normal u organismos ambientales que podrían interferir con la amplificación y detección de las secuencias de control interno.

En general, una reacción de ensayo individual para la detección de secuencias de ácidos nucleicos se limita a la detección de una única secuencia de ácido nucleico diana. Esta limitación a una única diana aumenta los costes y el tiempo necesarios para realizar ensayos de diagnóstico clínico y reacciones de control de verificación. La detección de más de una secuencia de ácido nucleico en una muestra usando un único ensayo aumentaría mucho la eficacia del análisis de muestras y sería de un gran beneficio económico por la reducción de costes, por ejemplo, ayudando a reducir la necesidad de múltiples ensayos clínicos.

La detección de múltiples analitos en un único ensayo se ha aplicado a la detección de anticuerpos del analito como en por ejemplo las Publicaciones de Patentes Internacionales números WO 89/00290 y WO 93/21346.

Además de reducir los costes y el tiempo necesario, la detección de más de una secuencia diana de ácido nucleico en un único ensayo reduciría las posibilidades de resultados erróneos. En particular, una detección múltiple aumentaría mucho la utilidad y el beneficio usando secuencias de control interno y permitiría la validación rápida de resultados negativos.

También se puede hacer referencia al documento EP-A-0 622 464, que se refiere a un procedimiento de ensayo de ácidos nucleicos y al documento US-A-5.299.297, que se refiere a una cubeta de contención para PCR y a un procedimiento de uso.

La presente invención comprende procedimientos para la amplificación y detección isotérmica automática de un ácido nucleico específico en una muestra de ensayo a ensayar, que comprenden:

a) combinar una muestra de ensayo a ensayar con un tampón, una mezcla de nucleótidos libres, cebadores oligonucleotídicos específicos y, opcionalmente, una enzima de polimerización de ácidos nucleicos termoestable, en un primer recipiente de reacción y colocar el recipiente de reacción en un aparato automático de modo que; b) el aparato automático caliente el primer recipiente de reacción a una temperatura y durante un tiempo suficiente para desnaturalizar, si es necesario, el ácido nucleico en la muestra a ensayar; c) el aparato automático enfría el primer recipiente de reacción a una temperatura tal que los cebadores oligonucleotídicos pueden hibridar específicamente con el ácido nucleico diana; d) el aparato automático transfiere la mezcla de reacción del primer recipiente de reacción a un segundo recipiente de reacción y pone la mezcla de reacción en contacto con la enzima de amplificación de ácidos nucleicos termolábil; e) el aparato automático mantiene la temperatura del segundo recipiente de reacción a una temperatura que permite la amplificación mediada por cebador del ácido nucleico; f) el aparato automático pone en contacto el ácido nucleico amplificado en el segundo recipiente de reacción con un ácido nucleico de captura específico para el ácido nucleico a ensayar de modo que forman un complejo de sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente; g) el aparato automático opcionalmente lava el ácido nucleico amplificado capturado específicamente de modo que se elimina por lavado el ácido nucleico unido inespecíficamente del complejo de sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente; h) el aparato automático pone en contacto el complejo de sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente con una sonda de ácido nucleico marcada específica para el ácido nucleico amplificado de modo que se forma un complejo entre el ácido nucleico amplificado específicamente y la sonda de ácido nucleico marcada; i) el aparato automático lava el complejo de sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente de modo que se elimina por lavado el ácido nucleico de sonda marcado unido inespecíficamente del complejo unido específicamente; j) el aparato automático pone en contacto el complejo unido específicamente con una solución en la que una reacción de detección entre la sonda de ácido nucleico marcada se efectúa entre la solución y el marcador unido al ácido nucleico de modo que se genera una señal detectable a partir de la muestra en proporción a la cantidad de ácido nucleico amplificado unido específicamente en la muestra; en los que las etapas h, i y j pueden producirse secuencialmente o simultáneamente; k) el aparato automático detecta la señal y opcionalmente muestra un valor para la señal u opcionalmente registra un valor para la señal.

Como se usa en el presente documento, la expresión muestra de ensayo incluye muestras tomadas de pacientes vivos, pacientes no vivos, superficies, gas, atmósferas al vacío

o líquidos, tejidos, fluidos corporales, hisopos de superficies o cavidades corporales y cualquier fuente similar. El término tampón como se usa en el presente documento abarca formulaciones adecuadas de tampón que pueden servir de soporte a la actividad eficaz de un marcador, por ejemplo, una enzima localizada en dicho tampón cuando se trata a la temperatura adecuada para su actividad y dado el sustrato enzimático adecuado, y moldes según sea necesario. La expresión cebadores de ácidos nucleicos oligonucleotídicos específicos se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente complementaria a o hibridará/se apareará específicamente con un ácido nucleico diana de interés y puede contener opcionalmente una secuencia promotora reconocida por una ARN polimerasa. La expresión recipiente de reacción se refiere a un recipiente en el que se puede realizar una reacción química y, preferentemente, capaz de soportar cualquier temperatura de aproximadamente -80ºC a 100ºC.

La presente invención proporciona además el procedimiento descrito anteriormente, en el que el tampón de reacción es un tampón unificado y, como tal, es adecuado para la desnaturalización de ácidos nucleicos y la hibridación de ácidos nucleicos, y es capaz además de mantener la actividad enzimática de la enzima de amplificación y polimerización de ácidos nucleicos. La presente invención abarca además el procedimiento en el que la enzima de amplificación de ácidos nucleicos se administra en la segunda cámara de reacción como una cantidad de dosis de ensayo única en un sedimento liofilizado, y la cámara de reacción se sella antes de la etapa de amplificación.

Se describe un aparato para la detección automática de más de un amplicón o secuencia de ácido nucleico diana que comprende un receptáculo en fase sólida (dispositivo de tipo pipeta SPR®) revestido con al menos dos zonas distintas de un oligonucleótido de ácido nucleico de captura.

La solicitud muestra un procedimiento para la detección automática de más de una secuencia diana de ácido nucleico que comprende poner en contacto un receptáculo en fase sólida (dispositivo de tipo pipeta SPR®), revestido con al menos dos oligonucleótidos de ácidos nucleicos de captura distintos en una sola o en múltiples zonas, con una muestra a ensayar y detectar una señal o señales de la sonda unida específicamente. En una realización de la invención, el SPR está revestido con dos zonas distintas de oligonucleótidos de ácidos nucleicos de captura que son específicos para dianas de secuencias de ácidos nucleicos diferentes. En otra realización, el SPR está revestido con al menos una sonda de captura para una secuencia de ácido nucleico diana y una sonda de captura para una secuencia de ácido nucleico de control de amplificación que, cuando se detecta, confirma que tuvo lugar la amplificación.

La presente invención también comprende un ácido nucleico de control interno positivo de amplificación generado aleatoriamente que incluye la secuencia de ácido nucleico de RIC1 y un segundo ácido nucleico de control interno positivo de amplificación que tiene la secuencia de ácido nucleico de RIC2.

La solicitud también comprende ácidos nucleicos de control interno positivo de amplificación que tienen la secuencia de ácidos nucleicos de CRIC-2, GRIC, MRIC y HRIC, y además comprende un procedimiento para generar un ácido nucleico de control interno positivo de amplificación que consiste en:

generar secuencias de ácidos nucleicos aleatorias de al menos 10 nucleótidos de longitud,

explorar dichas secuencias de ácidos nucleicos aleatorias y seleccionar para una

funcionalidad específica, combinar en tándem varias de dichas secuencias de ácidos

nucleicos seleccionadas funcionalmente y explorar la secuencia de ácidos nucleicos

combinada y, opcionalmente, seleccionar frente a la formación de dímeros de ácidos

nucleicos intracatenarios, o la formación de estructuras de horquilla.

Las realizaciones preferidas actualmente de la invención se describirán junto con los dibujos adjuntos, en los que los mismos números de referencia se refieren a los mismos elementos en las diversas vistas, y en los que:

la Figura 1 es una gráfica que ilustra la estabilidad a temperatura de sedimento de reactivo

de dosis individual; la Figura 2 ilustra el protocolo general de TMA; la Figura 3A es una representación esquemática de un recipiente de reacción de doble cámara desechable y las etapas de calentamiento asociadas con el mismo para realizar una reacción de TMA de acuerdo con una posible realización de la invención; la Figura 3B es una representación esquemática de una forma alternativa de la invención en la que se combinan dos cámaras de reacción separadas para formar un recipiente de reacción de doble cámara; la Figura 3C es una representación esquemática de dos realizaciones alternativas de un recipiente de reacción de doble cámara que se encajan a presión en su lugar en una tira de ensayo para el procesamiento con un receptáculo en fase sólida y equipo óptico de acuerdo con una realización de preferencia de la invención; la Figura 4 es una representación esquemática de una realización alternativa de un recipiente de reacción de doble cámara formado a partir de dos cámaras separadas que se combinan de un modo que permite que se transfiera una muestra fluida de una cámara a la otra cámara, con el recipiente de doble cámara combinado situado en una tira de ensayo tal como se ilustra en la Figura 3C; la Figura 5 es una vista en perspectiva de una estación de procesamiento de amplificación autónoma para las tiras de ensayo que tiene los recipientes de reacción de doble cámara de acuerdo con una forma actualmente preferida de la invención; la Figura 6 es una vista en perspectiva de uno de los módulos de amplificación de la Figura 4 visto desde la parte posterior del módulo; la Figura 7 es una vista en perspectiva de la parte frontal del módulo de la Figura 5; la Figura 8 es otra vista en perspectiva del módulo de la Figura 7; la Figura 9 es una vista en perspectiva detallada de una parte del soporte de tira de ensayo y subsistemas de calentamiento Peltier a 95 °C del módulo de las Figuras 6-8; la Figura 10 es una vista en perspectiva aislada del soporte de tira de ensayo de la Figura 9, que muestra dos tiras de ensayo instaladas en el soporte de tira de ensayo; la Figura 11 es una vista en perspectiva detallada del soporte de tira de ensayo o bandeja de la Figura 7; la Figura 12 es un diagrama de bloques de la electrónica de la estación de procesamiento de la amplificación de la Figura 7; la Figura 13 es un diagrama del subsistema de vacío para la estación de procesamiento de la amplificación de la Figura 6; y la Figura 14 es una gráfica del ciclo térmico de la estación de la Figura 6; la Figura 15 ilustra un esquema del funcionamiento de la detección múltiple de VIDAS; la Figura 16 ilustra la producción de SPR con dos zonas de captura distintas; la Figura 17 ilustra la configuración de tira del aparato VIDAS para la detección múltiple; la Figura 18 ilustra y representa gráficamente los resultados de la verificación del protocolo múltiple de VIDAS que detecta sólo la diana Neisseria gonorrhoeae (NG); la Figura 19A es una gráfica que muestra los resultados de cuando se mezclaron 1 x 1012 dianas de Chlamydia trachomatis (CT) con 0, 1 x 109, 1 x 1010,1 x 1011 o 1 x 1012 dianas de NG y se detectaron con el instrumento VIDAS usando el protocolo múltiple y SPR revestidos con sondas de captura de CT en la zona inferior del SPR y sondas de captura de NG en la zona superior del SPR; la Figura 19B ilustra los resultados de cuando se mezclaron 1 x 1012 dianas de NG con 0, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011 o 1 x 1012 dianas de NG y se detectaron con el instrumento VIDAS usando el protocolo múltiple y SPR revestidos con sondas de captura de CT en la zona inferior del SPR y sondas de captura de NG en la zona superior del SPR; la Figura 20A es un diagrama que muestra la detección de ácido nucleico de Mtb mediante un aparato VIDAS después de la amplificación; la Figura 20B es un diagrama que muestra la detección de ácido nucleico de Mtb mediante un aparato VIDAS; la Figura 21 es un diagrama que muestra la detección de ácido nucleico de Mtb mediante un aparato VIDAS después de la amplificación; la Figura 22 es una gráfica que muestra la detección de ácido nucleico de Mtb mediante un aparato VIDAS después de la amplificación usando el protocolo de doble cámara/binario; la Figura 23 ilustra los resultados generados mediante el procedimiento descrito que muestra un grupo de hebras de secuencias de ácidos nucleicos y la exploración para determinar parámetros funcionales específicos; la Figura 24 muestra la secuencia de ácido nucleico de Control Interno Aleatorio 1 (RIC1) con las sondas/cebadores oligonucleotídicos posibles para la amplificación y detección de la secuencia de control; la Figura 25 muestra un análisis de los componentes estructurales secundarios posibles de la secuencia de RIC1; la Figura 26 muestra la secuencia de ácido nucleico de Control Interno Aleatorio 2 (RIC2) con las sondas/cebadores oligonucleotídicos posibles para la amplificación y detección de la secuencia de control; la Figura 27 muestra un análisis de los componentes estructurales secundarios posibles de la secuencia de RIC2; la Figura 28 ilustra los resultados de la detección de ADN de RIC1, en la que ran21 era la sonda de captura y ran33 era una sonda detectora ligada a enzima, y muestra que la amplificación y detección se produce en condiciones de ensayo convencionales; la Figura 29 muestra que el ARN de RIC1, amplificado por TMA, y la señal activada químicamente detectada en un instrumento VIDAS (BioMérieux Vitek, Inc.) usando el sistema de detección ligado a enzima, tiene un límite de sensibilidad de aproximadamente 1000 moléculas de ARN de RIC1 (sin optimización de las condiciones); la Figura 30 muestra la secuencia de ácido nucleico para oligonucleótidos de control interno diseñados para ensayos para detectar: Chlamydia trachomatis (CT), identificados como CRIC-2; para Neisseria gonorrhoeae (NG), identificados como GRIC; para Mycobacterium tuberculosis (MT), identificados como MRIC; y control interno para VIH identificado como HRIC.

Más particularmente, una realización de la presente invención proporciona un procedimiento para la detección de la presencia o ausencia de un primer ácido nucleico monocatenario o bicatenario en una muestra mediante amplificación isotérmica automática de dicho primer ácido nucleico en un recipiente de reacción de doble cámara, comprendiendo dicho recipiente de reacción de doble cámara dos cámaras de reacción, una primera y una segunda, que pueden ponerse en comunicación fluida entre sí, de modo que dicha comunicación fluida puede interrumpirse de manera controlable, caracterizado porque comprende:

(a)

combinar en dicha primera cámara de reacción: una muestra, conteniendo potencialmente dicha muestra dicho primer ácido nucleico, tampón de reacción, una mezcla de nucleótidos libres, un primer y un segundo cebador oligonucleotídico específico, y colocar dicho recipiente de reacción en un aparado automático de modo que;

(b)

el aparato automático calienta la primera cámara de reacción a una temperatura suficiente y durante un tiempo suficiente para convertir cualquier primer ácido nucleico bicatenario en la muestra a ensayar en un ácido nucleico monocatenario suficiente de modo que se puede formar un producto de hibridación, comprendiendo dicho producto de hibridación dicho primer ácido nucleico y al menos uno de dicho primer y segundo cebador oligonucleotídico;

(c)

el aparato automático enfría después la primera cámara de reacción a una temperatura suficiente, de modo que se forma dicho producto de hibridación, si dicho primer ácido nucleico está presente;

(d)

el aparato automático transfiere después la mezcla de reacción de la primera cámara de reacción a dicha segunda cámara de reacción mediante dicha comunicación fluida

controlable, de modo que la mezcla de reacción se pone en contacto con una enzima de polimerización de ácidos nucleicos;

(e)

el aparato automático mantiene la temperatura de la segunda cámara de reacción a una temperatura suficiente que permite la amplificación mediada por un cebador oligonucleotídico específico de dicho primer ácido nucleico, si está presente;

(f)

el aparato automático pone en contacto después cualquier producto de amplicón de dicho primer ácido nucleico en la segunda cámara de reacción con un ácido nucleico de captura específico para dicho amplicón de dicho primer ácido nucleico, de modo que puede formarse un complejo de hibridación de sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente;

(g)

el aparato automático opcionalmente lava la mezcla del complejo de hibridación de modo que se elimina por lavado el ácido nucleico unido inespecíficamente del complejo de sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente;

(h)

el aparato automático pone en contacto el complejo de sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente con una sonda de ácido nucleico marcada específica para dicho amplicón producida a partir de dicho primer ácido nucleico, de modo que puede formarse un complejo de sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente;

(i)

el aparato automático opcionalmente lava el complejo de sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente de modo que se elimina por lavado el ácido nucleico de sonda marcada unida inespecíficamente del complejo de sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente; y

(j)

el aparato automático detecta la presencia o ausencia de dicha señal generada y opcionalmente muestra un valor para la señal, y opcionalmente registra un valor para la señal, poniendo en contacto el aparato automático el complejo de sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente con una solución de modo que se genera una señal detectable si dicho amplicón y primer ácido nucleico están presentes, siendo la señal generada a partir de la muestra proporcional a la cantidad de dicho primer ácido nucleico en la muestra; realizándose cada una de (h), (i) y (j) secuencialmente o simultáneamente.

Otra de dichas realizaciones proporciona un dispositivo para la detección automática de al menos dos secuencias de ácidos nucleicos diana, caracterizado porque comprende un dispositivo de tipo pipeta que tiene una superficie interna y una externa y una cavidad interna definida por dicha superficie interna, estando dicha superficie interna revestida con al menos dos secuencias de ácidos nucleicos de captura que se unen a dichas secuencias de ácidos nucleicos diana para formar complejos de hibridación específicos, y detectándose dichos ácidos nucleicos diana por separado en dicho dispositivo.

Una realización adicional de este tipo proporciona un procedimiento para la detección automática de la presencia o ausencia de un primer ácido nucleico diana y un segundo ácido nucleico diana en una muestra, caracterizado porque comprende:

(a)

poner en contacto dicha muestra con dicho dispositivo, que está revestido con un primer ácido nucleico de captura y que puede formar un complejo de hibridación específica con dicho primer ácido nucleico, y un segundo ácido nucleico de captura que puede formar un complejo de hibridación específica con dicho segundo ácido nucleico.

(b)

permitir que se forme el complejo de hibridación específica si dicho ácido nucleico está presente;

(c)

poner en contacto dicho complejo de hibridación de receptáculo en fase sólida con un primer ácido nucleico de detección, que puede formar un complejo de detección de hibridación específica con dicho primer ácido nucleico, y está conjugado con un medio para generar una señal detectable seleccionada de enzimas, cromóforos, compuestos quimioluminiscentes, radioisótopos y fluoróforos.

(d)

permitir que se forme el complejo de detección específico y después generar dicha señal detectable;

(e)

detectar dicha señal si dicho primer ácido nucleico está en dicha muestra;

(f)

poner en contacto dicho complejo de hibridación de receptáculo en fase sólida con un segundo ácido nucleico de detección, que puede formar un complejo de detección de hibridación específica con dicho segundo ácido nucleico, y está conjugado con un medio para generar una señal detectable seleccionada de enzimas, cromóforos, compuestos quimioluminiscentes, radioisótopos y fluoróforos.

(g)

permitir que se forme el complejo de detección específico y después generar dicha señal detectable;

(h)

detectar dicha señal si dicho segundo ácido nucleico está en dicha muestra;

(i)

opcionalmente, entre operaciones, lavándose dicho complejo de hibridación para eliminar el exceso de ácido nucleico unido inespecíficamente, y

(j)

correlacionar la ausencia de una señal detectable con la ausencia de dicho ácido nucleico en dicha muestra.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor determinadas realizaciones de la presente invención.

Ejemplo 1 Reactivos de Dosis individual y Tampón Unificado

La ejecución de una reacción de TMA (véase la Patente de Estados Unidos 5.437.990) en línea en un VIDAS o fuera de línea en un instrumento separado (produciéndose la detección en un instrumento VIDAS) necesita la modificación de la química usada para realizar la reacción manualmente. Primero, los reactivos envasados a granel se han modificado en dosis de alícuotas individuales, y segundo, los componentes de tampón de la reacción se han alterado para formar una solución de tampón unificado polivalente completo única.

En la tecnología manual actual, los reactivos se preparan como “tortas” liofilizadas de múltiples cantidades de ensayo. La reactivos enzimáticos y de amplificación deben reconstituirse por tanto a granel y dividirse en alícuotas para ensayos individuales.

Por tanto, la forma automática de TMA en el sistema VIDAS mejora el procedimiento manual anterior utilizando sedimentos de dosis individuales de componentes de reacción liofilizados que pueden resuspenderse en un solo tampón unificado que servirá de soporte a la dilución de muestras, a la desnaturalización de ácidos nucleicos, a la hibridación de ácidos nucleicos y a la actividad enzimática deseada. A) Tampón Unificado y Reactivos de Dosis individual

Para ensayar la viabilidad de reactivos de amplificación de dosis individual, reactivos enzimáticos y de amplificación por TMA de Chlamydia convencionales (Gen-Probe Inc.), los reactivos a granel se reconstituyeron en 0,75 ml de agua. Se dividieron en alícuotas 12,5 µl del reactivo enzimático o de amplificación reconstituido en agua (es decir una alícuota de dosis individual) en tubos de microcentrífuga. Estos tubos se colocaron en una centrífuga al vacío con calor suave para eliminar el agua. El resultado final de este procedimiento era un tubo de microcentrífuga que contenía una torta seca pequeña de reactivo enzimático o de amplificación en el fondo del tubo.

El Tampón Unificado combinado usado en este ejemplo consiste en un Tampón de Dilución de Muestras (SDB) convencional de Gen-Probe Inc. disponible en el mercado, un Tampón de Reconstitución de Amplificación (ARB) y un Tampón de Dilución de Enzimas (EDB) en una proporción de 2:1:1. A cada tubo de microfuga de reactivo de amplificación seco se añadieron 100 µl del Tampón Unificado combinado y ácido nucleico de control positivo (+) y se cubrieron con 100 µl de aceite de silicona. El tubo se calentó después a 95ºC durante 10 minutos y después se enfrió a 42ºC durante 5 minutos. El volumen total de 200 µl se transfirió después a un tubo que contenía el reactivo enzimático seco. Después, esto se mezcló suavemente para resuspender el reactivo enzimático y la solución se calentó durante una hora a 42ºC.

Las reacciones de control se prepararon usando reactivos de Control de Gen-Probe

que se reconstituyeron en los 1,5 ml normales de ARB o EDB de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el kit de Gen-Probe. En cada reacción de control se combinaron 25 µl del reactivo de amplificación reconstituido con 50 µl del SDB con el ácido nucleico de control positivo (+). La mezcla también se calentó a 95ºC durante 10 minutos y después se enfrió a

5 42ºC durante 5 minutos. A esto se añadieron 25 µl del reactivo enzimático reconstituido y se incubaron a 42ºC durante una hora. El control negativo no tenía ácido nucleico.

Tanto las reacciones del Tampón Unificado de ensayo (Unificado) como las reacciones de Control patrón (Control) se sometieron después al protocolo de Ensayo de Protección de Hibridación (HPA) convencional de Gen-Probe Inc. En resumen, se añadieron 100 µl de una

10 sonda de ácido nucleico específica de Chlamydia trachomatis a cada tubo y se dejó que hibridara durante 15 minutos a 60ºC. Después, se añadieron 300 µl de Reactivo de Selección a cada tubo y se permitió que se produjera una hidrólisis diferencial de sonda hibridada y no hibridada durante 10 minutos. Los tubos se leyeron después en un luminómetro Leader 50 de Gen-Probe Inc. y los datos resultantes se registraron como Unidades Relativas de Luz (URL)

15 detectadas a partir del marcador, como se muestra en la Tabla 1 a continuación. Los datos se presentaron como URL, reacción de HPA/TMA de C. Trachomatis convencional.

TABLA 1 Alícuotas de dosis individuales unificadas de reactivos enzimáticos y de amplificación

Control (+)

Unificado (+) Control (-) Unificado (-)

2.264.426

2.245.495 6.734 3.993

2.156.498

2.062.483 3.484 3.765

1.958.742

2.418.531 5.439 5.836

2.451.872

2.286.773

2.346.131

1.834.198

20 Los datos de la Tabla 1 demuestran que se obtienen resultados comparables cuando se usan las alícuotas de dosis individual de reactivo enzimático y de amplificación seco. Además, los datos muestran que los resultados eran comparables usando tres tampones distintos (ARB, EDB y SDB) y un tampón combinado unificado (SDB, ARB y EDB combinados a una proporción de 2:1:1) para resuspender los reactivos y procesar las reacciones.

25 B) Sedimentación de Reactivos de Dosis Individual Para simplificar la división en alícuotas de dosis individual de reactivos, se usaron procedimientos que permitirán la sedimentación de estos reactivos en alícuotas de dosis individual. En resumen, se pueden preparar sedimentos de reactivos (o perlas) dividiendo en alícuotas una solución acuosa del reactivo de elección (que se ha combinado con un excipiente

adecuado, tal como D(+)Trehalosa (α-D-Glucopiranosil-α-D-glucopiranósido, adquirido en Pfanstiehl Laboratories, Inc., Waukegan, IL), en un fluido criogénico y después usando la sublimación para eliminar el agua del sedimento. Una vez que la mezcla de trehalosa/reactivo está dividida en alícuotas (gotas) en el fluido criogénico, forma un sedimento congelado esférico. Estos sedimentos se colocan después en un liofilizador en el que las moléculas de agua congeladas se subliman durante el ciclo de vacío. El resultado de este procedimiento son sedimentos de reactivo pequeños, estables, sin descamación que pueden dispensarse en el envase adecuado. Los sedimentos de reactivos de alícuotas de dosis individual que contenían RT, T7 y azúcar se sometieron a un amplio intervalo de temperaturas para examinar la estabilidad del sedimento. Después de someterse a una temperatura de ensayo durante 10 minutos, los sedimentos se usaron entonces para amplificación de CT. Los resultados se representan gráficamente en la Figura 1. Los resultados muestran que el sedimento de reactivo de dosis individual permanece estable incluso después de la exposición a altas temperaturas durante 10 minutos.

La extraordinaria estabilidad de las enzimas secas en trehalosa se ha descrito previamente (Colaco y col., 1992, Bio/Technology, 10, 1007), que ha reavivado el interés en la investigación sobre la estabilización a largo plazo de proteínas, que se ha convertido en un tema de interés (Franks, 1994, Bio/Technology, 12, 253). Los sedimentos resultantes del reactivo de amplificación y los reactivos enzimáticos se ensayaron mediante el uso en reacciones de HPA/TMA de C. trachomatis.

Los sedimentos de amplificación preparados se introdujeron en un tubo al que se añadieron 75 µl de una mezcla de ARB y SDB (mezclados en una proporción de 1:2) con ácido nucleico de control positivo. Esta muestra se calentó después a 95ºC durante 10 minutos y después se enfrió a 42ºC durante 5 minutos. A esto se añadieron 25 µl de reactivo enzimático, que se había reconstituido usando un procedimiento convencional de Gen-Probe Inc. Se dejó incubar esta mezcla durante una hora a 42ºC. Se analizaron después las reacciones por el procedimiento HPA, como se ha descrito anteriormente. Los resultados de este ensayo se presentan como URL en la Tabla 2 y sedimentos de AMP marcados (+). Como anteriormente, las reacciones de control negativo se procesaron sin ácido nucleico (-).

Los sedimentos enzimáticos preparados se ensayaron por calentamiento de 100 µl de una combinación de SDB con ácido nucleico de control positivo, EDB, y el reactivo de amplificación reconstituido patrón (en una proporción de 2:1:1) a 95ºC durante 10 minutos y después se enfriaron a 42ºC durante 5 minutos. El volumen total de la mezcla de reacción se añadió al sedimento enzimático preparado. Después se disolvió el sedimento, la reacción se calentó a 42ºC durante una hora y después se sometió a análisis HPA como anteriormente.

Los resultados de este ensayo se representan como URL en la Tabla 2 a continuación, sedimento enzimáticos marcados (+). Las reacciones de control se prepararon usando reactivos de Gen-Probe Inc. convencionales siguiendo un procedimiento convencional. Los datos se presentaron como URL, reacción de HPA/TMA de C. Trachomatis convencional.

TABLA 2 Alícuotas de dosis individuales de reactivos enzimáticos y de amplificación sedimentados

Control (+)

Sedimentos de Amp (+) Sedimentos de Amp (-) Sedimentos Enzimáticos (+) Sedimentos Enzimáticos (-)

2.363.342

2.451.387 2.619 2.240.989 3.418

2.350.028

2.215.235 2.358 3.383.195 1.865

2.168.393

2.136.645 3.421 2.596.041 2.649

2.412.876

2.375.541 2.247 2.342.288 1.653

Los datos de la Tabla 2 demuestran que no había diferencias significativas cuando se

10 usaban los reactivos de Gen-Probe Inc. convencionales o el sedimento de reactivo de amplificación de dosis individual preparado seco o el sedimento de reactivo enzimático. Por tanto, las alícuotas de dosis individuales de los reactivos son adecuadas para su uso con un solo tampón unificado para su aplicación a la automatización usando un sistema VIDAS. Ejemplo 2 Amplificación Isotérmica Automática Usando Enzimas Termolábiles

15 Para automatizar la reacción de ensayo de amplificación isotérmica para su uso con aparatos de ensayo clínico, tal como un instrumento VIDAS (bioMérieux Vitek, Inc.), se ha diseñado un nuevo recipiente de reacción de doble cámara para aplicar el uso del tampón unificado y los sedimentos de reactivo de alícuotas de reacción individuales descritos anteriormente en el ensayo de amplificación isotérmica de muestras de ensayo que pueden

20 usarse adicionalmente en combinación con una estación de procesamiento autónoma. A) Cámaras de reacción dobles El uso de dos cámaras facilitará el mantener separada la muestra/reactivo de amplificación (que contiene los cebadores y nucleótidos específicos) termoestable de los componentes enzimáticos termolábiles (es decir, transcriptasa inversa del ARN, ARN

25 polimerasa RNasa H). La Figura 3A es una representación esquemática de un recipiente de reacción de doble cámara desechable 10 y de las etapas de calentamiento asociadas con el mismo para realizar una reacción de TMA de acuerdo con una posible realización de la invención. La cámara A contiene la mezcla de amplificación, en concreto nucleótidos, cebadores, MgCl2 y otras sales y

componentes de tampón. La cámara B contiene la enzima de amplificación que cataliza la reacción de amplificación, por ejemplo, T7 y/o RT. Después de la adición de las dianas (o de muestra de paciente) en la cámara A, se aplica calor a la cámara A para desnaturalizar las dianas de ácido nucleico de ADN y/o eliminar la estructura secundaria del ARN. La temperatura de la cámara A se enfría después para permitir la hibridación de cebadores. Posteriormente, la solución de la cámara A se pone en contacto con la cámara B. Las cámaras A y B, ahora en comunicación fluida entre sí, se mantienen entonces a la temperatura óptima para la reacción de amplificación, por ejemplo, 42ºC. Mediante la separación espacial de la cámara A de la cámara B y la aplicación del calor para la desnaturalización sólo a la cámara A, las enzimas termolábiles de la cámara B están protegidas de la inactivación durante la etapa de desnaturalización.

La Figura 3B es una representación esquemática de una forma alternativa de la presente invención en la que dos cámaras de reacción separadas 12 y 14 se combinan para formar un recipiente de reacción de doble cámara 10. Como la realización de la Figura 3A, la cámara A se precarga durante una etapa de fabricación con una mezcla de amplificación, en concreto nucleótidos, cebadores, MgCl2 y otras sales y componentes de tampón. La cámara B se precarga durante la fabricación con la enzima de amplificación que cataliza la reacción de amplificación, por ejemplo, T7 y/o RT. La muestra fluida se introduce después en la cámara A. Las dianas se calientan para su desnaturalización a 95ºC en la cámara A. Después del enfriamiento de la cámara A a 42ºC, la solución de la cámara A se pone en contacto con las enzimas de la cámara B para desencadenar la reacción de amplificación isotérmica.

Si el recipiente de reacción se diseña de modo que, después de haber puesto en contacto el contenido de las cámaras A y B, la cámara de amplificación no permita ningún intercambio de materiales con el entorno, se realiza una amplificación en un sistema cerrado que minimiza el riesgo de contaminación de la reacción de amplificación con dianas heterólogas o productos de amplificación de reacciones anteriores.

La Figura 3C es una representación esquemática de dos recipientes de reacción de doble cámara alternativos 10 y 10’ que se encajan a presión en su lugar en una tira de ensayo 19 para su procesamiento con un receptáculo de fase sólida y equipo óptico de acuerdo con una realización preferida de la invención. En las realizaciones de la Figura 3, se proporciona un sistema de flujo unidireccional. La muestra se introduce primero en la cámara A para su calentamiento a la temperatura de desnaturalización. La cámara A contiene la mezcla de reactivo de amplificación seco 16. Después del enfriamiento, el fluido se transfiere a la cámara B, que contiene la enzima seca 18 en forma de un sedimento. La cámara B se mantiene a 42ºC después de que la muestra fluida se introduzca en la cámara B. La reacción de amplificación tiene lugar en la cámara B a la temperatura de reacción óptima (por ejemplo, 42ºC). Después de que se complete la reacción, la tira de ensayo 19 se procesa entonces en una máquina tal como el instrumento VIDAS disponible en bioMérieux Vitek, Inc., el cesionario de la presente invención. Los expertos en la materia están familiarizados con el instrumento VIDAS.

Las etapas de calentamiento y enfriamiento de la cámara A se podrían realizar antes de la inserción del recipiente de reacción desechable de doble cámara 10 ó 10’ en la tira de ensayo 19 o, como alternativa, elementos de calentamiento adecuados podrían localizarse adyacentes al extremo izquierdo 24 de la tira de ensayo 19 para proporcionar el control de temperatura adecuado de la cámara de reacción A. La estación de procesamiento de amplificación autónoma de las Figuras 4-14, que se describe a continuación, incorpora elementos de calentamiento adecuados y sistemas de control para proporcionar el control de temperatura adecuado para el recipiente de reacción 10.

La Figura 4 es una representación esquemática de una realización alternativa de un recipiente de reacción de doble cámara 10’’ formado a partir de dos recipientes interconectados distintos 10A y 10B que se combinan de un modo que permita que una muestra fluida de una cámara fluya a la otra, situándose el recipiente de doble cámara combinado 10’’ en una tira de ensayo 19 tal como se ha descrito anteriormente en la Figura 3C. La muestra fluida se introduce en la cámara A, que contiene la mezcla de reactivo de amplificación seco 16. El recipiente A se calienta después fuera de línea a 95ºC, después se enfría a 42ºC. Los dos recipientes A y B se unen por medio de un cierre a presión convencional entre superficies de cierre complementarias en la protuberancia de tubo 26 de la cámara B y el conducto empotrado 28 de la cámara A. La mezcla de la solución de muestra de la cámara A con la enzima de la cámara B se produce ya que las dos cámaras están en comunicación fluida entre sí, como se indica mediante la flecha 30. Después, la muestra puede amplificarse en el recipiente de reacción desechable de doble cámara combinado 10’’, fuera de línea o en línea, encajando a presión el recipiente desechable combinado 10’’ en una tira de VIDAS modificada. El instrumento VIDAS podría realizar la detección de la reacción de amplificación de un modo conocido. B) Estación de Amplificación

La Figura 5 es una vista en perspectiva de un sistema de procesamiento de amplificación autónomo 200 para las tiras de ensayo 19 que tienen los recipientes de reacción de doble cámara de acuerdo con una forma actualmente preferida de la invención. El sistema 200 consiste en dos estaciones de amplificación idénticas 202 y 204, un módulo de suministro de energía 206, un módulo de circuitos de control 208, un tanque de vacío 210 y conectores 212 para el módulo de suministro de energía 206. El tanque 210 tiene tubos flexibles 320 y 324 para proporcionar vacío a las estaciones de amplificación 202 y 204 y, finalmente, a una pluralidad de sondas de vacío (una por tira) del modo descrito anteriormente para facilitar la transferencia de fluido de la primera cámara a la segunda cámara. El subsistema de vacío se describe a continuación junto con la Figura 14.

Las estaciones de amplificación 202 y 204 tienen cada una una bandeja para recibir al menos una de las tiras y subsistemas de control de temperatura, vacío y activación de válvulas asociados para calentar los pocillos de reacción de la tira a las temperaturas adecuadas, transferir fluido de la primera cámara de los pocillos de reacción de doble cámara a la segunda cámara y activar una válvula tal como una válvula de manguito o, preferentemente, una válvula de bola para abrir el canal de fluido para permitir que el fluido fluya entre las dos cámaras.

Las estaciones 202 y 204 están diseñadas como estaciones de amplificación autónomas para realizar la reacción de amplificación de un modo automático después de que la muestra de paciente o clínica se haya añadido a la primera cámara del recipiente de reacción de doble cámara descrito anteriormente. El procesamiento de las tiras después de que se complete la reacción con un SPR tiene lugar en una máquina separada, tal como el instrumento VIDAS. Específicamente, después de que las tiras se hayan colocado en las estaciones 202 y 204 y se procese la reacción en las estaciones, las tiras se retiran de las estaciones 202 y 204 y se colocan en un instrumento VIDAS para su procesamiento y análisis posterior de un modo conocido.

El sistema completo 200 está bajo el control de un microprocesador mediante una placa de interfaz de sistema de amplificación (no mostrada en la Figura 5). El sistema de control se muestra en forma de diagrama de bloques en la Figura 12 y se describirá posteriormente.

Haciendo referencia ahora a la Figura 6, una de las estaciones de amplificación 202 se muestra en una vista en perspectiva. La otra estación de amplificación es de construcción y diseño idénticos. La Figura 7 es una vista en perspectiva de la parte frontal del módulo de la Figura 6.

En referencia a estas figuras, la estación incluye un motor de deslizamiento de sondas de vacío 222 y una rueda excéntrica de deslizamiento de sondas de vacío que funciona deslizando un conjunto de sondas de vacío 244 (mostrado en la Figura 7) para las válvulas de manguito hacia arriba y hacia abajo respecto al carro de sondas de vacío 246 para abrir las válvulas de manguito y aplicar vacío para extraer el fluido de la primera cámara del recipiente de reacción 10 hacia la segunda cámara. Las sondas de vacío 244 se corresponden con entrantes anulares proporcionados en el carro de sondas de vacío 246. Obviamente, debe observarse un registro adecuado de la estructura de clavijas y las sondas de vacío 244 con la

estructura correspondiente en la tira de ensayo según se instala en la bandeja.

La estación incluye paredes laterales 228 y 230 que proporcionan un armazón para la estación 202. La placa de controlador de bandeja 229 se monta entre las paredes laterales 228 y 230. El módulo electrónico para la estación 202 se instala en la placa de controlador de bandeja 229.

Un conjunto de cubiertas de aislamiento térmico de bandeja 220 son parte de un subsistema térmico y se proporcionan para envolver una bandeja 240 (Figura 7) que recibe una o más de las tiras de ensayo. Las cubiertas de aislamiento 220 ayudan a mantener la temperatura de la bandeja 240 a las temperaturas adecuadas. El subsistema térmico también incluye un disipador de calor Peltier de 42ºC 242, estando una parte del mismo situada adyacente a la segunda cámara en el recipiente de reacción de doble cámara en la tira de ensayo para mantener esa cámara a la temperatura adecuada para la reacción de amplificación enzimática. Se proporciona un disipador de calor de 95ºC 250 para la parte frontal de la bandeja 240 para mantener la primera cámara del pocillo de reacción en la tira de ensayo a la temperatura de desnaturalización. La Figura 8 es otra vista en perspectiva del módulo de la Figura 7, que muestra el disipador de calor de 95ºC 250 y un conjunto de aletas

252. Obsérvese que el disipador de calor de 95ºC 250 está localizado hacia la parte frontal de y ligeramente por debajo de la bandeja 240. El disipador de calor de 42ºC 242 está situado detrás del disipador de calor 250.

La Figura 9 es una vista en perspectiva detallada de una parte de la bandeja 240 que sostiene las tiras de ensayo (no se muestran) como se observa de lo anterior. La bandeja 240 incluye una parte frontal que tiene una base 254, una pluralidad de estructuras de crestas paralelas elevadas discontinuas con ranuras entrantes 258 para recibir las tiras de ensayo. La base de la parte frontal 250 de la bandeja 240 está en contacto con el disipador de calor de 95ºC 250. Las paredes laterales de las crestas elevadas paralelas 256 en las posiciones 256A y 256B se sitúan tan cerca como sea posible de la primera y segunda cámaras del recipiente de reacción 10 de la Figura 3A para reducir la resistencia térmica. La base de la parte posterior de la bandeja 240 está en contacto con un disipador de calor Peltier de 42ºC, como se observa mejor en la Figura 8. La parte 256B de la cresta elevada para la parte posterior de la bandeja está aislada físicamente de la parte 256A para la parte frontal de la bandeja, y la parte 256B está en contacto con el disipador de calor de 42ºC para mantener la segunda cámara del recipiente de reacción en la tira de ensayo a la temperatura adecuada.

En referencia todavía a la Figura 9, las sondas de vacío 244 incluyen una junta de goma 260. Cuando las sondas de vacío 244 se descienden por el motor de sondas de vacío 222 (Figura 6), las juntas 260 están situadas en la superficie superior de la tira de ensayo rodeando la toma de vacío en el recipiente de reacción de doble cámara para generar un cierre hermético y permitir que se extraiga el vacío en la segunda cámara.

La Figura 10 es una vista en perspectiva aislada del soporte o bandeja de tira de ensayo 240 de la Figura 9, que muestra dos tiras de ensayo instaladas en la bandeja 240. La bandeja 240 tiene una pluralidad de carriles o ranuras 241 que reciben hasta seis tiras de ensayo 19 para su procesamiento simultáneo. La Figura 10 muestra los disipadores de calor 242 y 250 para mantener las partes respectivas de la bandeja 240 y las crestas 256 a la temperatura adecuada.

La Figura 11 es una vista en perspectiva detallada del soporte o bandeja de tira de ensayo 240 como se observa desde abajo. El disipador de calor Peltier de 95ºC que estaría debajo de la parte frontal 254 se ha eliminado para ilustrar mejor el disipador de calor posterior 242 debajo de la parte posterior de la bandeja 240.

La Figura 12 es un diagrama de bloques de la electrónica y del sistema de control del sistema de procesamiento de amplificación de la Figura 5. El sistema de control se divide en dos placas 310 y 311, la sección A 310 en la parte superior del diagrama dedicada a la estación o módulo de amplificación 202 y la otra placa 311 (sección B) dedicada al otro módulo

204. Las dos placas 310 y 311 son idénticas y sólo se analizará la sección superior 310. Las dos placas 310 y 311 están conectadas a una placa de interfaz de estación de amplificación

300.

La placa de interfaz 300 se comunica con un ordenador personal autónomo 304 mediante un bus de datos de alta velocidad 302. El ordenador personal 304 es un ordenador compatible IBM convencional con disco duro, monitor de vídeo, etc. En una realización preferida, las estaciones 202 y 204 están bajo el control de la placa de interfaz 300.

La placa 310 para la estación 202 controla la bandeja frontal 240 que se mantiene a una temperatura de 95ºC mediante dos módulos disipadores de calor Peltier, un par de ventiladores y un sensor de temperatura incorporado en la parte frontal 254 de la bandeja 240. La parte trasera de la bandeja se mantiene a una temperatura de 42ºC mediante dos módulos Peltier y un sensor de temperatura. El movimiento de las sondas de vacío 244 está controlado por el motor de sondas 220. Se proporcionan sensores de posición para proporcionar señales de entrada a la placa de controlador de bandeja en cuanto a la posición de las sondas de vacío

244. La placa de controlador de bandeja 310 incluye un conjunto de controladores 312 para los componentes activos y pasivos del sistema, que reciben datos de los sensores de temperatura y posición y emiten órdenes a los componentes activos, es decir, motores, ventiladores, módulos Peltier, etc. Los controladores reaccionan a órdenes de la placa de interfaz de amplificación 300. La placa de interfaz también emite órdenes a la bomba de vacío para el

subsistema de vacío, como se muestra.

La Figura 13 es un diagrama del subsistema de vacío 320 para las estaciones de procesamiento de amplificación 202 y 204 de la Figura 5. El subsistema incluye un tanque de vacío de plástico de 1 litro 210 que está conectado mediante una tubería de entrada 322 a una bomba de vacío 323 para generar vacío en el tanque 210. Se proporciona una tubería de suministro de vacío 324 para proporcionar vacío a un par de válvulas de pinza de solenoide 224 (véase Figura 6) mediante tuberías de suministro 324A y 324B. Estas tuberías de suministro de vacío 324A y 324B suministran vacío a un colector 226 que distribuye el vacío a las sondas de vacío 244. Obsérvense las puntas afiladas 245 de las sondas de vacío 244 para perforar la película o membrana 64 que cubre la tira 19. El sistema de vacío 320 también incluye un transductor de presión diferencial 321 para controlar la presencia de vacío en el tanque 210. El transductor 321 suministra señales de presión a la placa de interfaz 300 de la Figura 12.

La Figura 14 es una gráfica representativa del perfil de ciclo térmico de la estación de la Figura 5. Como se indica en la línea 400, después de un aumento gradual inicial 402 en la temperatura que dura menos de un minuto, se alcanza una primera temperatura T1 (por ejemplo, una temperatura de desnaturalización) que se mantiene durante un periodo de tiempo predeterminado, tal como 5-10 minutos, momento en el que se produce una reacción en la primera cámara del recipiente de reacción. Después de eso, se produce un descenso gradual de la temperatura como se indica en la 404, y la temperatura de la solución de reacción en la primera cámara del recipiente de reacción 10 se enfría a la temperatura T2. Después de una cantidad de tiempo designada después del enfriamiento a la temperatura T2, se produce una transferencia de fluido en la que la solución de la primera cámara se transporta a la segunda cámara. La temperatura T2 se mantiene durante una cantidad de tiempo adecuada para la reacción de interés, tal como una hora. Al tiempo 406, la temperatura se aumenta rápidamente a una temperatura T3 de 65ºC para detener la reacción de amplificación. Para una reacción de TMA, es importante que el tiempo de aumento gradual del tiempo 406 al tiempo 408 sea breve, es decir, menos de 2 minutos y, preferentemente, menos de un minuto. Preferentemente, todos los aumentos y descensos graduales de la temperatura se producen en menos de un minuto.

También se prevén otras realizaciones de recipientes de reacción y componentes de estación de amplificación, y dichas realizaciones alternativas están incluidas en la presente divulgación.

Ejemplo 3 Ensayo VIDAS Automático para la Detección No-amplificada y Amplificada de Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

Usando el instrumento VIDAS (bioMérieux Vitek, Inc.), modificado a 42ºC, los presentes inventores han desarrollado un ensayo de detección y amplificación de ácidos nucleicos rápido simple en línea para el laboratorio clínico para que la detección de Mtb en muestras de ensayo pueda completarse en un tiempo corto. Todo el ensayo está diseñado para que tenga lugar en una sola tira de ensayo, minimizando la posibilidad de contaminación de diana o amplicón. El ensayo basado en amplificación es capaz de detectar Mtb cuando la muestra contiene sólo 5 células, lo que es similar a la sensibilidad conseguida por el kit comercial de Gen-Probe.

El ensayo basado en amplificación utiliza amplificación mediada por transcripción (TMA) isotérmica que se dirige a secuencias únicas de ARNr, seguida de hibridación y detección de fluorescencia ligada a enzimas de la sonda de ácido nucleico (amplicón) en el instrumento VIDAS.

El ensayo de amplificación/detección puede detectar aproximadamente 1 fg de ARNr de Mtb, o menos de un organismo de Mtb por ensayo, y es específico para todos los miembros del complejo de Mtb. Se pueden encontrar sondas específicas para la detección de Mtb en C. Mabilat, 1994, J. Clin. Microbiol. 32, 2707.

Los frotis convencionales para bacilos acidorresistentes no son siempre fiables como herramienta de diagnóstico e incluso cuando son positivos puede tratarse de una micobateria distinta de Mtb. Actualmente, los procedimientos convencionales para el diagnóstico de tuberculosis requieren el cultivo de bacterias de crecimiento lento y pueden llevar hasta 6 semanas o más. Durante este tiempo, el paciente normalmente está aislado. Los resultados iniciales son que este ensayo automático iguala o supera la sensibilidad clínica del procedimiento de cultivo y ofrece un procedimiento altamente sensible para detectar rápidamente Mtb (en menos de tres horas) en muestras infectadas, contribuyendo de ese modo a un diagnóstico, aislamiento y tratamiento rápido. A) Preparación de Muestras

Se añadió un volumen de 450 µl de muestra a 50 µl de tampón de dilución de muestras en un tubo de lisis que contiene perlas de vidrio, se sonicó durante 15 minutos a temperatura ambiente para lisar los organismos, y se inactivó por calor durante 15 minutos a 95ºC. Se realizó una amplificación isotérmica donde fuera necesario conforme a un kit de ensayo manual disponible en el mercado (Gen-Probe Inc.) siguiendo las instrucciones del kit usando reactivos de kit convencionales. Sin embargo, se pueden realizar ensayos similares usando los componentes modificados como se han descrito en los Ejemplos anteriormente.

B) Detección

Para que funcione el ensayo de detección automática, el sistema de detección requiere la hibridación del ácido nucleico diana o amplicón con un ácido nucleico de captura específico unido a un soporte sólido, (en el sistema VIDAS denominado un dispositivo de tipo pipeta de “receptáculo en fase sólida” SPR) y con un ácido nucleico de sonda de detección marcada (por ejemplo, en el que el marcador puede ser fosfatasa alcalina, un compuesto de señal quimioluminiscente u otro reactivo que permitirá la detección específica de sonda unida).

En un sistema automático tal como el VIDAS, después de varias etapas de lavado para eliminar la sonda no unida, el SPR transfiere el híbrido de sonda-diana a un sustrato enzimático, por lo que se desencadena la señal detectable a partir de la sonda unida y se detecta mediante el instrumento de ensayo. En una realización, la sonda de detección se conjuga con fosfatasa alcalina, y una vez que se pone en contacto con sustrato de metil umbeliferil fosfato (MUMP), el sustrato se convierte en 4-metil umbeliferona (4-MU) mediante la fosfatasa alcalina. La 4-MU produce fluorescencia que se mide y se registra mediante el instrumento VIDAS convencional como unidades relativas de fluorescencia (URF). Cuando el ácido nucleico diana no está presente, ninguna sonda de detección está unida y no se convierte ningún sustrato, por lo tanto, no se detecta fluorescencia. C) Sensibilidad Analítica; Controles

Generalmente se preparan controles en una matriz de tampón de dilución de muestras con controles positivos que contienen 5 fg de ARNr de Mtb o el ARNr equivalente a aproximadamente 1 célula de M. tb. La sensibilidad del ensayo de sonda automático puede determinarse mediante el ensayo de diluciones de células de M. tb lisadas. Los lisados celulares pueden prepararse generalmente con un asa de siembra de 1 µl de células (asumiéndose que hay aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias (UFC) por un asa de siembra de 1 µl llena, basándose en los experimentos de UFC y titulación previos). Después pueden ensayarse diluciones de los lisados de Mtb con el ensayo de sonda automático.

La Figura 20A es una gráfica que muestra la detección de amplicones de Mtb de acuerdo con el kit de Gen-Probe. La Figura 20B es una gráfica que muestra la detección de amplicones de Mtb de las mismas reacciones que en la Figura 20A por el instrumento VIDAS.

La Figura 21 es una gráfica que muestra la amplificación y detección de ácidos nucleicos de Mtb en el aparato VIDAS modificado. Se usó enzima en forma líquida y se realizó la amplificación en línea con el instrumento de ensayo VIDAS.

La Figura 22 es una gráfica que muestra la amplificación y la detección de ácidos nucleicos de Mtb en el aparato VIDAS modificado usando el recipiente de reacción desechable de doble cámara/binario. La etapa de desnaturalización se realizó fuera de línea del instrumento VIDAS, la amplificación y la detección de amplicón se realizaron en línea con el instrumento VIDAS. Ejemplo 4 Ensayo VIDAS Automático para la Detección Amplificada de Chlamydia trachomatis (CT)

Usando el instrumento VIDAS (bioMérieux Vitek, Inc.), los presentes inventores han desarrollado un ensayo simple altamente específico, completamente automático, para la detección rápida de Chlamydia trachomatis (CT) a partir de muestras de ensayo. El ensayo utiliza TMA isotérmica que se dirige a secuencias únicas del ARNr, seguida de hibridación y detección de fluorescencia ligada a enzimas. El ensayo automático detecta específicamente todas las serovariedades clínicamente importantes de Chlamydia trachomatis (CT) de muestras urogenitales en menos de dos horas. Se obtuvo una sensibilidad analítica de 0,5 fg de ARNr, o el equivalente a aproximadamente 1/10 de un cuerpo elemental de Chlamydia trachomatis (CT). La concordancia entre el ensayo automático y el ensayo de CT amplificada de Gen-Probe para doscientos siete (207) orinas e hisopos endocervicales clínicos mostró una concordancia total.

La infección por Chlamydia trachomatis (CT) es la causa principal de enfermedad de transmisión sexual en los Estados Unidos y Europa. Se estima actualmente que cada año se producen aproximadamente cuatro millones de nuevas infecciones por CT en los Estados Unidos.

Chlamydia trachomatis (CT) es un parásito intracelular pequeño que causa infecciones tanto en hombres como en mujeres, adultos y recién nacidos. El mayor desafío para el control de la infección por CT es que tantas como el 75% de las mujeres infectadas y el 50% de los hombres infectados son asintomáticos. Esto da como resultado un gran reservorio de individuos infectados no reconocidos que pueden transmitir la infección por CT. La detección rápida y simple de la infección por CT ayudaría mucho a la identificación de individuos infectados. A) Especímenes de pacientes y preparación de muestras

Se obtuvieron muestras codificadas (n = 207) a partir de pacientes con síntomas que concordaban con una infección por CT. Las muestras cervicales se recogieron con un kit de recogida de muestras de Gen-Probe que contenía medio de transporte de Gen-Probe; las muestras de orina se recogieron en dispositivos de recogida de orina convencionales. Todas las muestras se almacenaron a 4ºC.

Los hisopos cervicales se centrifugaron a 425 x g durante 5 minutos para llevar todo el líquido al fondo del tubo. Después, se trataron los hisopos con 40 µl de Reactivo de

Preparación de Muestras de Gen-Probe y se incubaron a 60ºC durante 10 minutos. Después, se pipetearon 20 µl de la muestra tratada en 400 µl de tampón de dilución de muestras (SDB). Dos ml de cada muestra de orina se calentaron a 37ºC durante 10 minutos y se centrifugaron en una microfuga a 12.000 x g durante 5 minutos. Se desechó el sobrenadante y

5 se añadieron 300 µl de tampón de dilución de muestras a cada espécimen. Las 15 serovariedades de CT se usaron para muestras de inclusividad, los especímenes se cuantificaron y 20 µl de especímenes que contenían 4 x 102 UFI/ml (unidades formadoras de inclusiones por ml) de cada serovariedad se añadieron a 400 µl de SDB. Se obtuvo un panel de microorganismos urogenitales exclusivos y se cuantificó, y se pipetearon 20 µl de 2 x 109/ml

10 de microorganismos en 400 µl de SDB. El control positivo que contenía 0,5 fg de ARNr, o el equivalente a 0,1 cuerpos elementales de CT, se diluyó en SDB. B) Amplificación de muestras y detección VIDAS

Se amplificaron muestras usando el protocolo de TMA y las dianas de ARNr se hibridaron con oligómeros conjugados con copolímero AMVE y un oligómero conjugado con 15 fosfatasa alcalina. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.489.653 y

5.510.084. Como se ha descrito anteriormente, el receptáculo en fase sólida (dispositivo de tipo pipeta SPR) porta los híbridos unidos a través de etapas de lavado sucesivas y finalmente en el sustrato 4-MUP. La fosfatasa alcalina convierte el sustrato en 4-MU fluorescente, que se detecta mediante la máquina de ensayo VIDAS y se registra como unidades relativas de

20 fluorescencia. La Tabla 2B a continuación ilustra la detección de CT mediante el ensayo automático VIDAS, seguida de la amplificación como VRF (VRF = URF -URF de fondo) frente a la concentración de ARNr de CT. Se amplificaron diluciones de ARNr purificado de C. trachomatis de 0 a 200 moléculas (n = 3) y se detectaron en el ensayo de sonda automático VIDAS. El

25 límite de detección es de 20 moléculas de ARNr purificado.

TABLA 2B: Detección de CT por VIDAS

Moléculas de aportación de ARNr

VRF VIDAS

0

1

2

121

20

3260

200

8487

C) Especificidad analítica y Resultados

Se realizaron amplificaciones y detección en presencia de cada uno de los siguientes organismos de la ATCC, con detecciones presentadas como VRF en la Tabla 3 a continuación.

TABLA 3 Panel de exclusividad para CT

Bacillus subtilis 33

Branhamella catarrhalis 15 Candida albicans 26 Chlamydia pneumoniae 39 Chlamydia psittaci 11

Escherichia coli 11

Klebsiella pneumoniae 13 Lactobacillus acidophilus 27 Neisseria elongata 44 Neisseria lactamica 18

Neisseria meningitidis-D 61

Neisseria meningitidis-Y 52 Propionibacterium acnes 14 Pseudomona aeruginosa 13 Staphylococcus aureus 13

Streptococcus agalactiae 16

Streptococcus bovis 45 Streptococcus pneumoniae 34 Yersinia enterolitica 11 Chlamydia trachomatis 10673

Control Negativo 12

La especificidad analítica para datos de serovariedades de Chlamydia presentados como VRF se muestra en la Tabla 4 a continuación.

TABLA 4 Panel de Inclusividad para CT

Serovariedad A 5421

Serovariedad B 7247 Serovariedad Ba 9626 Serovariedad C 8066 Serovariedad D 10849

Serovariedad E 4608

Serovariedad F 9916 Serovariedad G 10082 Serovariedad H 7769 Serovariedad I 9733

Serovariedad J 9209

Serovariedad K 2423 Serovariedad L1 10786 Serovariedad L2 1812 Serovariedad L3 5883

Control positivo 3775

Control negativo 9

La Tabla 5 a continuación ilustra los resultados del ensayo de especímenes de hisopos 10 cervicales clínicos para CT que comparan los resultados del ensayo de CT por AMP manual de Gen-Probe y el ensayo de sonda automático VIDAS.

TABLA 5 Detección de CT en Espécimen Cervical Clínico Amplificado

Ensayo de CT por AMP manual de Gen-Probe Ensayo de sonda +

automático fuera de +

línea VIDAS

35

0

0

85

5

10

15

20

25

30

29

La Tabla 6 a continuación ilustra los resultados del ensayo de especímenes de orina clínicos que comparan los resultados del ensayo de CT por AMP manual y el ensayo de sonda automático VIDAS.

TABLA 6

Detección de CT en Espécimen de Orina Clínico Amplificada

Ensayo de CT por AMP manual de Gen-Probe

Ensayo de sonda

+ -

automático fuera de + línea VIDAS

25

0

0

62

Por tanto, había una concordancia perfecta en los resultados de ensayo entre el ensayo de sonda automático usando el instrumento VIDAS y el ensayo de CT por AMP manual de Gen-Probe. Ejemplo 5 Detección de Ácidos Nucleicos Múltiple (Secuencia Múltiple)

El valor de ensayos de diagnóstico basados en sondas de ácido nucleico puede aumentarse sustancialmente a través de la detección de múltiples moléculas de ácidos nucleicos diferentes y el uso de controles positivos internos. Se ha ideado un procedimiento automático para su uso con el instrumento VIDAS (bioMérieux Vitek, Inc.), que puede detectar por separado al menos dos secuencias de ácidos nucleicos diferentes en una reacción de ensayo, y se denomina protocolo Múltiple. Por tanto, un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos o una muestra de ensayo procesada puede explorarse para más de una molécula de ácido nucleico amplificada en el mismo ensayo. Este procedimiento se basa en la separación espacial de sondas de ácidos nucleicos diferentes que pueden capturar específicamente secuencias de ácidos nucleicos diana (amplicones) diferentes en el dispositivo de tipo pipeta SPR en el instrumento VIDAS. El SPR es una punta de tipo pipeta desechable que permite los movimientos de fluido, además de actuar como soporte sólido para la captura por afinidad. La captura múltiple mediante SPR se demuestra usando sondas de captura específicas para Chlamydia trachomatis (CT) y Neisseria gonorrhoeae (NG).

La Figura 15 ilustra un esquema del funcionamiento de la detección VIDAS múltiple. Las puntas SPR están revestidas en dos zonas distintas con secuencias oligonucleotídicas de ácidos nucleicos que se usan para capturar específicamente secuencias de ácidos nucleicos complementarias (amplicones) con sus ácidos nucleicos de sonda detectora o indicadora específicos correspondientes marcados con fosfatasa alcalina (AKP). Después de lavados para eliminar las sondas indicadoras no unidas, se detecta la AKP localizada en la parte inferior del SPR con el sustrato fluorescente 4-MUP. Se separa la AKP de la parte inferior del SPR con NaOH u otros reactivos que promueven la desnaturalización de híbridos de ácidos nucleicos o inactivan la actividad fosfatasa alcalina. El pocillo de reacción enzimática se vacía, se lava y se rellena con 4-MUP fresca. Para confirmar la eliminación de la AKP de la parte inferior del SPR, el nuevo sustrato se expone a la parte inferior del SPR y se mide cualquier fluorescencia residual. Finalmente, la sonda indicadora-AKP unida a la parte superior del SPR se detecta sumergiendo el SPR en la 4-MUP y representando la presencia de los segundos amplicones.

La Figura 16 ilustra la producción de SPR con dos zonas de captura distintas. El SPR se inserta por la punta en un tapón de silicona, que se sujeta en una gradilla. Se usa presión diferencial para extraer uniformemente una solución de una sonda de captura específica a aproximadamente 1 µg/ml, conjugada con copolímero AMVE, en todos los SPR a la vez. La cantidad de fluido extraído en cada SPR y, por tanto, el tamaño de la zona, se controla regulando la cantidad de presión en el sistema. La unión del conjugado a la superficie del SPR se consigue por adsorción pasiva durante varias horas a temperatura ambiente. Después del lavado y secado, los SPR se tapan con un disco adhesivo pequeño y se insertan en nuevas gradillas en una nueva orientación con la punta hacia abajo. La porción inferior del SPR se reviste después de manera similar con un segundo conjugado de sonda de captura. Los SPR son estables cuando se almacenan secos a 4ºC.

La Figura 17 ilustra una realización preferida de la configuración de tiras del aparato VIDAS para la detección múltiple. La tira puede precargarse con 200 µl de mezcla de sondas-AKP (aproximadamente 1 x 1012 moléculas de cada sonda) en tampón de hibridación en el pocillo X1, 600 µl de tampón de lavado en los pocillos X3, X4, X5, 600 µl de reactivo de separación en los pocillos X6 y X7 y 400 µl de sustrato de AKP en X8 y sellarse con papel de aluminio. Una cubeta óptica sellada con papel de aluminio (XA) que contiene 300 µl de 4-MUP se encaja a presión en la tira y las tiras se insertan en el instrumento VIDAS a 37ºC. El protocolo de VIDAS múltiple se ejecuta después usando SPR revestidos con dos sondas de captura en zonas distintas.

El protocolo múltiple de VIDAS puede implicar muchas etapas. Por ejemplo, el protocolo de ensayo de validación contenía trece (13) etapas básicas de la siguiente manera:

1.

Transferencia de 203 µl de diana de X0 a sondas-AKP en X1.

2.

Hibridación y captura en todo el SPR.

3.

Lavar el SPR (316 µl) dos veces con PBS/Tween (X3, X4).

4.

4-MUP en la parte inferior del SPR (89,6 µl) en XA durante 5,3 minutos, y después leer la señal.

5.

4-MUP en la parte inferior del SPR (89,6 µl) en XA durante 14,8 minutos, y después leer la señal (opcional).

6.

Transferir el sustrato usado de XA a X2 (5 x 67,1 µl).

7.

Separar la AKP de la parte inferior del SPR (112,6 µl) con NaOH (X7).

8.

Lavar el XA con NaOH recién preparado (3 x 112,6 µl; X6 a XA a X6).

9.

Lavar el XA con PBS/Tween (3 x 112,6 µl; X5 a XA a X5).

10.

Transferir 4-MUP recién preparado de X8 a XA (6 x 48 µl).

11.

4-MUP a la parte inferior del SPR (89,6 µl) en XA durante 10,7 minutos, y después leer la señal.

12.

4-MUP a la parte superior del SPR (294 µl) en XA durante 5,5 minutos, y después leer la señal.

13.

4-MUP a la parte superior de SPR (294 µl) en XA durante 15 minutos, y después leer la señal (opcional).

Las etapas de hibridación, adición de sustrato, lavado y separación implican múltiples ciclos de pipeteo de la solución respectiva en el SPR, mantener la solución durante un periodo de tiempo definido y sacar con pipeta la solución del SPR. Los tiempos de mantenimiento para la hibridación, adición de sustrato y lavado o separación son de 3,0, 0,5 y 0,17 minutos, respectivamente. La señal de fluorescencia se detecta por el aparato. El tiempo de ensayo total para el protocolo de investigación era de aproximadamente 1,75 horas, pero se puede reducir a aproximadamente 75 minutos.

La Figura 18 ilustra y representa gráficamente los resultados de la verificación del protocolo múltiple de VIDAS ejecutado como se ha descrito anteriormente, excepto por que el SPR se revistió homogéneamente con sólo una única sonda de captura para Neisseria gonorrhoeae (NG). El número de dianas oligonucleotídicas de NG en la muestra de ensayo variaba de 0, 1 x 1010 ó 1 x 1011 moléculas en la muestra de ensayo. Los datos que se muestran son promedios de muestras repetidas. La gráfica, como se ilustra, se divide en dos partes; las mitades izquierda y derecha muestran los resultados de dos mediciones fluorescentes de las zonas inferior y superior del SPR, respectivamente. Las medidas tomadas de la zona inferior después de la separación del área inferior de ácido nucleico unido y de la exposición durante aproximadamente 11 minutos en sustrato 4-MUP recién preparado eran de aproximadamente 46 URF para todas las muestras ensayadas y eran equivalentes a la fluorescencia de fondo medida. Esta medición se muestra por el punto temporal 0 en el centro de la gráfica. Por tanto, la gráfica ilustra dos conjuntos secuenciales de mediciones de fluorescencia a partir de un único SPR, tomándose el primer conjunto de mediciones a partir de la mitad inferior del SPR (mitad izquierda de la gráfica) y tomándose un segundo conjunto de mediciones de la parte superior del SPR (la parte derecha de la gráfica). Este experimento valida que el protocolo Múltiple y el procedimiento de SPR revestido por zonas produce resultados esencialmente idénticos, como se indica por las intensidades de fluorescencia en las partes izquierda y derecha de la gráfica, a partir de las porciones superior e inferior del SPR.

La Figura 19 ilustra la detección Múltiple de dianas oligonucleotídicas de CT y NG a

5 diferentes cantidades de aportación. La Figura 19A es una gráfica que muestra los resultados de cuando 1 x 1012 dianas de CT se mezclaron con 0, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011 ó 1 x 1012 dianas de NG y se detectaron con el instrumento VIDAS usando el protocolo múltiple y SPR revestidos con sondas de captura de CT en la zona inferior del SPR y sondas de captura de NG en la zona superior del SPR. La Figura 19B ilustra los resultados de cuando 1 x 1012 dianas

10 de NG se mezclaron con 0, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011 ó 1 x 1012 dianas de CT y se detectaron con el instrumento VIDAS usando el protocolo múltiple y SPR revestidos con sondas de captura de CT en la zona inferior del SPR y sondas de captura de NG en la zona superior del SPR. Los datos se representan gráficamente, como anteriormente, donde la gráfica ilustra dos conjuntos secuenciales de mediciones de fluorescencia a partir de un único SPR, tomándose el

15 primer conjunto de mediciones a partir de la mitad inferior del SPR (parte izquierda de la gráfica) y tomándose un segundo conjunto de mediciones de la parte superior del SPR (la derecha de la gráfica) con verificación de la separación del SPR en el centro de la gráfica. De forma importante, este experimento muestra que las dos zonas del SPR actúan independientemente en el protocolo Múltiple, puesto que las señales de fluorescencia alta de

20 una zona no interfieren con las señales producidas a partir de la segunda zona, independientemente de si estas últimas señales son altas (1 x 1012) o bajas (1 x 109, simplemente detectables) o negativas. La Tabla 7 a continuación resume los datos obtenidos mediante detección VIDAS Múltiple de CT y NG en una muestra a diversos niveles diana, presentados en URF.

25

TABLA 7 Detección de dianas de CT y NG en muestras

URFA

ningunaB 1 x 109 1 x 1010 1 x 1011 1 x 1012 1 x 1013

ningunaC

43D/40B 43/116 46/693 62/7116 174/11817 273/12136

1 x 109

189/41 246/118 169/773 220/5750 422/11817 399/11401

1 x 1010

1736/41 2258/125 1937/734 1931/6639 2128/12390 237/11180

1 x 1011

10339/48 9815/145 9858/760 9369/4571 9784/11825 10252/10312

1 x 1012

12149/49 13520/148 12940/796 13593/4397 11239/11786 10158/9900

1 x 1013

11545/57 11713/121 10804/815 12805/5404 12305/12326 11416/10490

5

10

15

20

25

33

A Los datos se presentan en URF, después de una exposición de 5 minutos de 4-MUP a sonda-AKP unida. B Las columnas son los datos para ese número de dianas de NG en la muestra. C Las filas son los datos para ese número de dianas de CT en la muestra. D El primer valor presentado son las URF detectadas a partir de la parte de ensayo de CT. E El segundo valor presentado son las URF detectadas a partir de la parte de ensayo de NG.

Por tanto, el protocolo VIDAS múltiple es claramente operativo y permite la detección rápida y separada de más de un ácido nucleico diferente en una muestra. Este protocolo, y el revestimiento de SPR, se pueden manipular en muchos formatos para presentar zonas de revestimiento de diferente área superficial con huecos de diferentes tamaños entre dos o más zonas de detección. El SPR puede revestirse con ácidos nucleicos que estén diseñados para capturar diferentes regiones de la misma secuencia de ácido nucleico para detectar, por ejemplo, expresión génica truncada, alelos diferentes o genes cortados y empalmados de manera alternativa. El SPR se puede revestir para capturar amplicones a partir de moléculas de ácido nucleico de control interno que se pueden usar para detectar y confirmar reacciones de amplificación de ácidos nucleicos exitosas. Por tanto, el protocolo Múltiple de VIDAS es un procedimiento flexible para la detección de más de una secuencia de ácido nucleico en la misma muestra, en un único ensayo. EJEMPLO 6 Secuencia de Control Interno y Procedimiento

La construcción de secuencias de control interno compuestas por componentes básicos funcionales de secuencias elegidas por generación aleatoria de secuencias de ácidos nucleicos para su uso como controles positivos internos de la reacción de amplificación idealmente requiere que las secuencias de control se diseñen específicamente para usarse para los diversos protocolos de amplificación de ácidos nucleicos incluyendo, pero sin limitación, PCR, RCL, TMA, NASBA y SDA. La secuencia de ácido nucleico de control interno, en combinación con promotores-cebadores o cebadores oligonucleotídicos específicos de secuencia apropiados generará una señal de amplificación positiva si la reacción de amplificación se completó con éxito.

Idealmente, el ácido nucleico de control interno es útil independientemente de las secuencias de ácidos nucleicos presentes en el organismo diana, el organismo huésped o los ácidos nucleicos presentes en la flora normal o en el entorno. Generalmente, las secuencias de control interno no deberían ser sustancialmente similares a ninguna de las secuencias de ácidos nucleicos presentes en un entorno clínico, incluyendo seres humanos, organismos patógenos, organismos de la flora normal u organismos del entorno, que podrían interferir con

la amplificación y detección de las secuencias de control interno.

Las secuencias de control interno de la presente invención están compuestas por componentes básicos funcionales de secuencias seleccionadas de una lista de secuencias de ácidos nucleicos generadas aleatoriamente. Los componentes básicos funcionales son segmentos que proporcionan una propiedad especial necesaria para permitir la amplificación, captura y detección del producto de amplificación. Por ejemplo, en una reacción de TMA, las secuencias de control interno son más útiles cuando los componentes básicos funcionales cumplen determinados requisitos funcionales del protocolo de amplificación, tales como: a) un sitio de unión de cebador en la cadena antisentido; b) un sitio de captura; c) un sitio de unión de sonda detectora; d) un promotor T7 que contiene un sitio de unión de cebador en la cadena con sentido. Cada uno de estos elementos funcionales tiene sus propias limitaciones particulares, tales como longitud, contenido de G-C en %, Tm, falta de homología con secuencias conocidas y ausencia de características estructurales secundarias (es decir, sin formación de dímeros o estructuras de horquilla) que se pueden usar para seleccionar la secuencia adecuada. Por tanto, los componentes básicos funcionales de secuencias generadas aleatoriamente se pueden explorar para las propiedades funcionales deseadas antes de su uso en la construcción de secuencias de control interno.

Para construir secuencias de control interno que tengan las propiedades deseadas que comprendan un número especificado de componentes básicos funcionales y que satisfagan las limitaciones deseadas dentro de cada componente básico, se usó un generador de secuencias aleatorias para generar hebras de números; estando cada número limitado al intervalo de 0,000 a 4,000. La longitud de las hebras es flexible y se selecciona basándose en las longitudes deseadas de los componentes básicos funcionales.

A cada número en la hebra (es decir, n1, n2, n3, n4 ... nx, en los que x es la longitud de la serie) se le asignó después un nucleótido correspondiente de la siguiente manera: guanosina (G) si 0 < n ≤ 1; adenosina (A) si 1 < n ≤ 2; timidina (T) si 2 < n ≤ 3; y citosina (C) si 3<n ≤ 4. Se produjo un gran grupo de dichas hebras y se exploró para determinar las que cumplían los requisitos de secuencia y estructurales de cada componente básico funcional. La Figura 23 ilustra los resultados generados por el procedimiento descrito mostrando un grupo de hebras de secuencias de ácidos nucleicos y explorándolo para determinar parámetros funcionales específicos. La secuencia de control interno puede incluir ADN, ARN, oligonucleótidos modificados o cualquier combinación de ácidos nucleicos, de modo que las secuencias ilustradas usando la nomenclatura del ADN pueden adaptarse fácilmente como se desee al ácido nucleico adecuado.

Después se construyeron secuencias de control interno (CI) potenciales mediante

ensamblaje de los componentes básicos funcionales (seleccionados aleatoriamente) en el orden adecuado. Finalmente, las secuencias de control interno ensambladas se examinaron después para asegurar que se mantuviera la secuencia global y las limitaciones estructurales. Por ejemplo, en una reacción de TMA, la secuencia de control interno no debería tener un potencial de emparejamiento de bases significativo entre los dos sitios de unión de cebador o a partir de estructuras de dímeros 3’ estables. Las secuencias de control interno que pasan a través de estas capas de exploración se produjeron después físicamente usando oligonucleótidos solapantes y se ensayaron para determinar su comportamiento en ensayos de amplificación/detección reales.

Aunque un componente básico funcional cualquiera puede tener cierta homología con secuencias presentes en un entorno clínico (se espera un emparejamiento perfecto de un componente básico de 21 nucleótidos a una frecuencia aleatoria de 1 en 4e12 secuencias o aproximadamente 4 x 1012; las secuencias generadas se exploraron frente a la base de datos GeneBank) es muy poco probable que se encuentre que todos los componentes básicos funcionales tienen una homología sustancial. Puesto que las secuencias de ácidos nucleicos de control interno se construyen de un grupo de componentes básicos funcionales situados en tándem, la posibilidad fortuita de que una secuencia de ácido nucleico natural tenga una hebra de componentes básicos de secuencia de ácido nucleico idéntica en la misma organización en tándem es remota.

Se han construido dos secuencias de control interno específicas usando el procedimiento descrito anteriormente. El Control Interno Aleatorio 1 (RIC1) se muestra en la Figura 24 con las sondas/cebadores oligonucleotídicos posibles para la amplificación y detección de la secuencia de control. La Figura 25 muestra un análisis de la posible estructura secundaria de la molécula de RIC1. Se construyó un RIC1 usando las hebras generadas aleatoriamente ran16, ran19, ran21 y ran33. Los componentes básicos funcionales que requerían la unión de cebador se satisficieron con ran16 y ran19, mientras que el sitio de captura se satisfizo con ran21 y el sitio de unión de sonda detectora se satisfizo con ran33. La elección de la designación de secuencia de sonda de detección o de sonda de captura puede intercambiarse, siempre que la molécula de engarce adecuada se una a la sonda adecuada, en la que un oligonucleótido de la sonda indicadora está unido a un medio para generar una señal detectable y el oligonucleótido de sonda de captura está unido a un medio para adherir la sonda de captura a un soporte adecuado. Las sondas y oligonucleótidos se describen con el entendimiento de que en el caso de ADN bicatenario, la cadena complementaria puede ser la diana o, según sea apropiado, se puede convertir para su uso como la cadena para la detección. Por tanto, en la circunstancia adecuada, un experto en la materia será capaz de modificar las secuencias como se desvelan para generar sondas y cebadores alternativos que sean útiles para su uso de un modo equivalente al que se describe en el presente documento.

En la Figura 26 se muestra el Control Interno Aleatorio 2 (RIC2) con las sondas/cebadores oligonucleotídicos posibles para la amplificación y detección de la secuencia de control. La Figura 27 muestra un análisis de la estructura secundaria posible de la secuencia de RIC2. De manera similar a RIC1, RIC2 se construyó usando las hebras generadas aleatoriamente ran27, ran32, ran39 y ran51. Por tanto, ilustra que también es posible que los componentes básicos funcionales que requieren la unión de cebador, unión de sonda de captura, unión de sonda detectora puedan satisfacerse con secuencias aleatorias alternativas generadas por el procedimiento descrito anteriormente. La Figura 28 ilustra los resultados de la detección de ADN de RIC1, en la que ran21 era la sonda de captura y ran33 era una sonda detectora ligada a enzima y muestra que la detección se produce en condiciones de ensayo convencionales con intensidades de fluorescencia esperadas. La Figura 29 muestra que el ARN de RIC1, amplificado mediante TMA y detectado en un instrumento VIDAS (bioMérieux Vitek, Inc.) usando el sistema de detección ligado a enzima, tiene un límite de sensibilidad de aproximadamente 1000 moléculas de ARN de RIC1 (sin la optimización de las condiciones). Se realizó un análisis similar de secuencias de RIC2 y se descubrió que eran similares a RIC1. Es significativo que el sistema de amplificación y detección del control interno funcionó de manera eficaz en las condiciones optimizadas para la diana seleccionada.

Como una estrategia alternativa para la detección Múltiple usando controles internos (CI), se pueden revestir SPR homogéneamente con una mezcla de secuencias de ácidos nucleicos de captura diferentes en una única zona completa de SPR. Por ejemplo, dos secuencias de ácidos nucleicos de captura se pueden combinar en una zona, una específica para una secuencia de ensayo diana, y una específica para una secuencia de ensayo diana y una específica para una secuencia de control interno. Los amplicones diana, si están presentes, y los amplicones de control interno hibridan simultáneamente con el SPR en presencia de secuencias de sonda marcadas específicas para los amplicones diana. Después del lavado, se realiza una primera lectura de señal para que se determine la presencia o ausencia de marcador en el SPR para establecer la presencia o ausencia de la diana de ensayo. Después, se realiza una segunda hibridación (hibridación secuencial) con el SPR usando una sonda marcada de detección específica para el control interno. Se lava el SPR para eliminar el exceso de sonda de detección no unida y el segundo marcador se mide para indicar la presencia o ausencia del control interno. Si la primera señal es negativa, una señal positiva de la segunda lectura de CI confirma la funcionalidad del sistema de amplificación/detección. Si el primer y segundo marcador son el mismo, se obtendrá una señal aditiva como resultado de la primera lectura positiva y de la segunda lectura de CI positiva. Si tanto la primera señal es negativa como la segunda señal de CI es también negativa, entonces falla la funcionalidad de amplificación/detección, lo que podría deberse, por ejemplo, a interferencia de muestra o fallo mecánico. En este caso, el resultado de ensayo se describe

5 como inválido (falso negativo) y se recomienda ensayar de nuevo. Si los marcadores son diferentes, entonces no serían necesarias ni las hibridaciones secuenciales ni las etapas de detección secuencial.

Hay un gran interés en el uso de controles internos, siendo la lógica subyacente que “…si la muestra no soportará la amplificación del control interno, es poco probable que soporte

10 la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana”. (NCCLS Document MM3-A, Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Aproved Guideline, pág. 55, marzo 1995).

Usando una estrategia de hibridación secuencial con múltiples sondas detectoras, ha sido posible diseñar protocolos que permitan la detección separada de la primera lectura de 15 señal (es decir, señal de CT pura) y una segunda lectura de señal “mixta” aditiva (es decir, señales de CI y CT aditivas; véase la Tabla 7A a continuación). Este protocolo no requerirá separación. Por ejemplo, la Tabla 7A muestra los resultados cuando diferentes mezclas de dianas sintéticas de CI y CT se capturaron primero con SPR revestidos homogéneamente y se hibridaron primero con la sonda detectora de CT. Después de la primera lectura, se realizó la

20 hibridación con la sonda detectora de CI, seguida por una segunda lectura (mismo sustrato). Este tipo de protocolo también se puede usar para un ensayo de GC/CT/control interno combinado, si se permite una estrategia de exploración (sin discriminación entre positivos de GC y/o CT durante la primera lectura). Las señales específicas de GC y CT tienen que resolverse por procesamiento de los ensayos específicos de GC y CT en muestras de

25 exploración positivas (5-10% de casos, dependiendo de la prevalencia). Los SPR se revestirían homogéneamente con 3 sondas de captura (CT/GC/control interno). Como alternativa, el CI podría compartir una sonda de captura con CT o GC.

TABLA 7A: Detección de Señales Múltiples en SPR Revestido Homogéneamente

Diana

1ª Lectura de CT 2ª Lectura de CI URF de fondo

1010 CT

7077 8608 58

1010 CI

58 4110 56

1010 CI/CT

5594 8273 57

1010 CI/CT

5712 8317 57

sin diana

66 89 57

Por tanto, las secuencias de control interno descritas anteriormente son útiles para su aplicación con el aparato VIDAS con SPR revestido y el uso del sistema Múltiple para proporcionar la detección de ensayo combinada de un ácido nucleico y el seguimiento del control para una reacción exitosa. EJEMPLO 7 Secuencia de Control Interno

El perfeccionamiento de las secuencias de control interno generadas aleatoriamente permitirá la optimización de dichas secuencias de control interno para sistemas de ensayo específicos. Siguiendo los procedimientos descritos anteriormente, se han diseñado y validado secuencias de ácido nucleico de control interno para su uso en diversos sistemas de amplificación y detección incluyendo un control interno para el ensayo de Chlamydia trachomatis (CT) identificado como CRIC-2; para un ensayo de Neisseria gonorrhoeae (NG) identificado como GRIC; y para Mycobacterium tuberculosis (MT) identificado como MRIC. Se generó un control interno para ensayos de VIH identificado como HRIC, en el que tanto la secuencia de la sonda de captura como la secuencia de la sonda indicadora procedían de secuencias aleatorias. La secuencia del control interno y la secuencia diana correspondiente se muestran en la Figura 30. En cada una de estas secuencias de control interno, la Sonda de Secuencia Aleatoria Nº 1082 se puede usar como la sonda indicadora, cuando está convenientemente conjugada con una molécula indicadora como se ha descrito anteriormente. En el control interno de VIH, se ha diseñado una Sonda de Secuencia Aleatoria oligonucleotídica de captura Nº 1081 para su uso en la captura de la secuencia de control, para una cuantificación mejorada por eliminación de la competición entre los amplicones diana y los amplicones de CI para una sonda de captura común.

LISTA DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: Catanzrariti, Luigi Kluttz, Bryan W Vera-Garcia, Marcela Burg, J.L Moe, James G. McKinley, Geoff A.

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Ensayos de Ácidos Nucleicos Mejorados

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

(A)

DESTINATARIO: McDonnell Boehnen Hulbert & Berghoff

(B)

CALLE: 300 S. Wacker Dr., Suite 3200

(C)

CIUDAD: Chicago

(D)

ESTADO: IL

(E)

PAÍS: Estados Unidos

(F)

CÓDIGO POSTAL: 60606

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: Patentln Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/850.171

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 02-MAYO-1997

(viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

(A)

NOMBRE: Chao, Mark

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 37.293

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 97.195

(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

(A)

TELÉFONO: 312-913-0001

(B)

TELEFAX: 312-913-0002

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 87 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “control interno aleatorio 1”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 4..24

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “cebador de TMA RAN16”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 46..66

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “sonda-AMVE RAN21, enlace amino en extremo 5’”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 25..45

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “sonda-AKP RAN33, enlace amino en el extremo 5’”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..87

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “diana de RICI”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

imagen1

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 48 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “oligonucleótido de detección de control interno aleatorio 1”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

CAATACGCCT GACATCAGCC CTTACAGAAA GACTTGCTCA CCCATGAG 48

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 56 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “oligonucleótido de parte superior de RIC1”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..22

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “Promotor T3”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

GCAATTAACC CTCACTAAAG GGAGCGAATG TTAGGGCACA TCATGGGTGA GCAGTC 56

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 64 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “oligonucleótido de parte inferior de RIC1”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 48 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “promotor T7/cebador RAN19”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 28..48

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “cebador RAN19”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

imagen1

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGATCT GGTCGTCATG CTTGTCAA 48

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “Control Interno Aleatorio 2”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..96

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “diana de RIC2”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..26

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “cebador de TMA RAN51”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 28..48

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “sonda-AMVE RAN27, enlace amino en extremo 5’”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 49..69

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “sonda-AKP RAN32, enlace amino en extremo 5’”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencillo

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “oligonucleótido de detección de RIC2”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

imagen1

AAGTATTCGC CGTGCTGAGT CGTTCCGTAC ACTGGCTTCT GTTATAC 47

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 67 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencillo

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “oligonucleótido de parte superior de RIC2”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 3..22

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “promotor T3”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 66 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencillo

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “oligonucleótido de parte inferior de RIC2”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 52 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencillo

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “promotor T7/cebador RAN39”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 28..52

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “cebador RAN39”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

imagen1

imagen1

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAACG CACTCCTCTA GGTCTGGTAG CA 52

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 111 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “diana de control interno de CT”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 111 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “control interno de CT”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 34..54

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “Sonda de Secuencia Aleatoria Nº 1082 (Indicadora)”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 110 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “diana de control interno de NG”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 110 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: ambas

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “control interno de NG”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 29..49

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “Sonda de Secuencia Aleatoria Nº 1082 (Indicadora)”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 125 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “diana de control interno de MT”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen2

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases 15 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico 20 (A) DESCRIPCIÓN: /desc = “control interno de MT”

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 54..74

25 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= “Sonda de Secuencia Aleatoria Nº 1082 (Indicadora)”

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

imagen3

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 109 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “diana de control interno de VIH”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 90 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: /desc = “control interno de VIH”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 20..40

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “Sonda de Secuencia Aleatoria Nº 1082 (Indicadora)”

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

(B)

LOCALIZACIÓN: 41..61

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= “Sonda de Secuencia Aleatoria Nº 1081 (Captura)”

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

imagen1

imagen1

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la detección de la presencia o ausencia de un primer ácido nucleico monocatenario o bicatenario en una muestra por amplificación isotérmica automática de dicho primer ácido nucleico en un recipiente de reacción de doble cámara, comprendiendo dicho recipiente de reacción de doble cámara dos cámaras de reacción, una primera y una segunda, que pueden situarse en comunicación fluida entre sí, de modo que dicha comunicación fluida puede interrumpirse de forma controlable, caracterizado porque comprende:

   (a)

   combinar en dicha primera cámara de reacción: una muestra, conteniendo potencialmente dicha muestra dicho primer ácido nucleico, tampón de reacción, una mezcla de nucleótidos libres, un primer y un segundo cebador oligonucleotídico específico, y colocar dicho recipiente de reacción en un aparato automático de modo que;

   (b)

   la primera cámara de reacción se calienta automáticamente a una temperatura suficiente y durante un tiempo suficiente para convertir cualquier primer ácido nucleico bicatenario en la muestra a ensayar en ácido nucleico monocatenario suficiente de modo que se puede formar un producto de hibridación, comprendiendo dicho producto de hibridación dicho primer ácido nucleico y al menos uno de dichos primer y segundo cebadores oligonucleotídicos;

   (c)

   la primera cámara de reacción se enfría después automáticamente a una temperatura suficiente de modo que se forme dicho producto de hibridación, si dicho primer ácido nucleico está presente;

   (d)

   la mezcla de reacción se transfiere después automáticamente de la primera cámara de reacción a dicha segunda cámara de reacción mediante dicha comunicación fluida controlable, de modo que la mezcla de reacción se pone en contacto con una enzima de polimerización de ácidos nucleicos;

   (e)

   manteniéndose automáticamente la temperatura de la segunda cámara de reacción a una temperatura suficiente que permita la amplificación mediada por un cebador oligonucleotídico específico de dicho primer ácido nucleico, si está presente;

   (f)

   cualquier producto de amplicón de dicho primer ácido nucleico en la segunda cámara de reacción se pone en contacto después automáticamente con un ácido nucleico de captura específico para dicho amplicón de dicho primer ácido nucleico, de modo que pueda formarse un complejo de hibridación de sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente;

   (g)

   opcionalmente, la mezcla del complejo de hibridación se lava automáticamente de modo que el ácido nucleico unido inespecíficamente se elimine por lavado del complejo sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente;

   (h)

   el complejo de sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente se pone en contacto automáticamente con una sonda de ácido nucleico marcada específica para dicho amplicón producida a partir de dicho primer ácido nucleico de modo que pueda formarse un complejo de sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente;

   (i)

   opcionalmente, el complejo sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente se lava automáticamente de modo que el ácido nucleico de sonda marcada unido inespecíficamente se elimine por lavado del complejo de sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente;

   (j)

   la presencia o ausencia de dicha señal generada se detecta automáticamente y se presenta opcionalmente como un valor para la señal y, opcionalmente, se registra como un valor para la señal, el complejo de sonda marcada-sonda de captura-ácido nucleico unido específicamente se pone en contacto automáticamente con una solución de modo que se genera una señal detectable si dicho amplicón y primer ácido nucleico están presentes, siendo la señal generada a partir de la muestra proporcional a la cantidad de dicho primer ácido nucleico en la muestra; realizándose cada uno de (h), (i) y (j) secuencialmente o simultáneamente.

2. 2.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enzima de amplificación de ácidos nucleicos se pone en dicha segunda cámara de reacción como una cantidad de dosis de ensayo individual en un sedimento liofilizado y dicha cámara de reacción se sella antes de su uso.

3. 3.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enzima de amplificación de ácidos nucleicos es una enzima termoestable.

4. 4.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha enzima de amplificación de ácidos nucleicos termoestable se pone en la primera cámara de reacción.

5. 5.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que incorpora además moléculas de control interno.

6. 6.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye además la amplificación y detección de una segunda secuencia de ácido nucleico.

7. 7.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye además la detección de secuencias de control de cebadores.