JP5089223B2 - プローブセット、プローブ固定担体及び検査方法 - Google Patents
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[菌名]
Clostridium difficile (クロストリディウム ディフィシル)
そこで、本発明の第1の目的は、対象菌の遺伝子を正確に同定することのできるプローブセットを提供することを目的とする。
(1)AATATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGGA(配列番号43)で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ、
(2)CCGTAGTAAGCTCTTGAAACTGGGAGAC(配列番号44)で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ、
(3)TCCCAATGACATCTCCTTAATCGGAGAG(配列番号45)で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ。
(ii)前記プローブ固定担体上のプローブと前記検体中の核酸との反応の有無、またはその反応強度を検出する工程と、
を有することを特徴とするクロストリディウム ディフィシルのDNAの検出方法である。
そして、同定されたそれら全ての配列を比較しながら、Clostridium difficile菌におけるプローブ配列について詳細な分析を行い、本発明のClostridium difficile菌を同定することのできるプローブを見出した。
敗血症起炎菌
(1)Staphylococcus aureus (ATCC12600)
(2)Staphylococcus epidermidis (ATCC14990)
(3)Escherichia coli (ATCC11775)
(4)Klebsiella pneumoniae (ATCC13883)
(5)Pseudomonas aeruginosa (ATCC10145)
(6)Serratia marcescens (ATCC13380)
(7)Streptococcus pneumoniae (ATCC33400)
(8)Haemophilus influenzae (ATCC33391)
(9)Enterobacter cloacae (ATCC13047)
(10)Enterococcus faecalis (ATCC19433)
(11)Staphylococcus haemolyticus (ATCC29970)
(12)Staphylococcus hominis (ATCC27844)
(13)Staphylococcus saprophyticus (ATCC15305)
(14)Streptococcus agalactiae (ATCC13813)
(15)Streptococcus mutans (ATCC25175)
(16)Streptococcus pyogenes (ATCC12344)
(17)Streptococcus sanguinis (ATCC10556)
(18)Enterococcus avium (JCM 8722)
(19)Enterococcus faecium (ATCC19434)
(20)Pseudomonas fluorescens (ATCC13525)
(21)Pseudomonas putida (ATCC12633)
(22)Burkholderia cepacia (JCM5964)
(23)Stenotrophomonas maltophilia (ATCC13637)
(24)Acinetobacter baumannii (ATCC19606)
(25)Acinetobacter calcoaceticus (ATCC23055)
(26)Achromobacter xylosoxidans (ATCC27061)
(27)Vibrio vulnificus (ATCC27562)
(28)Salmonella choleraesuis (JCM 1651)
(29)Citrobacter freundii (ATCC8090)
(30)Klebsiella oxytoca (ATCC13182)
(31)Enterobacter aerogenes (ATCC13048)
(32)Hafnia alvei (ATCC13337)
(33)Serratia liquefaciens (ATCC27592)
(34)Proteus mirabilis (ATCC29906)
(35)Proteus vulgaris (ATCC33420)
(36)Morganella morganii (ATCC25830)
(37)Providencia rettgeri (JCM 1675)
(38)Aeromonas hydrophila (JCM1027)
(39)Aeromonas sobria (ATCC43979)
(40)Gardnerella vaginalis (ATCC14018)
(41)Corynebacterium diphtheriae (ATCC2701)
(42)Legionella pneumophila (ATCC33152)
(43)Bacillus cereus (ATCC14579)
(44)Bacillus Subtilis (ATCC6051)
(45)Mycobacterium kansasii (ATCC12478)
(46)Mycobacterium intracellulare (ATCC13950)
(47)Mycobacterium chelonae (ATCC35752)
(48)Nocardia asteroids (ATCC19247)
(49)Bacteroides fragilis (JCM11019)
(50)Bacteroides thetaiotaomicron (JCM5827)
(51)Clostridium difficile (ATCC51695)
(52)Clostridium perfrigens (JCM1290)
(53)Eggerthella lenta (JCM10763)
(54)Fusobacterium necrophorum (JCM3718)
(55)Fusobacterium nucleatum (ATCC25586)
(56)Lactobacillus acidophilus (ATCC4356)
(57)Anaerococcus prevotii (JCM6490)
(58)Peptoniphilus asaccharolyticus (JCM8143)
(59)Porphyromonas asaccharolytica (JCM6326)
(60)Porphyromonas gingivalis (JCM8525)
(61)Prevotella denticola (ATCC38184)
(62)Propionibacterium acnes (JCM6473)
(右の括弧内は、入手した菌種の寄託番号を示す。)
本発明により、感染症の起炎菌同定の為のオリゴヌクレオチドプローブ(以下単にプローブという)及びその3以上の組み合わせからなるプローブセットが提供される。このプローブセットを用いることで感染により炎症を引き起こす以下の菌の検出が可能である。
[菌名]
Clostridium difficile
上記の菌の遺伝子のうち16S rRNA遺伝子領域のDNA配列を検出し得るプローブには、以下の各塩基配列からなるものが含まれる。
(A)AATATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGGA(配列番号43)で表される塩基配列からなるプローブ、
(B)CCGTAGTAAGCTCTTGAAACTGGGAGAC(配列番号44)で表される塩基配列からなるプローブ、
(C)TCCCAATGACATCTCCTTAATCGGAGAG(配列番号45)で表される塩基配列からなるプローブ、
(D)配列番号43の塩基配列の相補配列からなるプローブ、
(E)配列番号44の塩基配列の相補配列からなるプローブ、
(F)配列番号45の塩基配列の相補配列からなるプローブ、
(G)配列番号43の塩基配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
(H)配列番号44の塩基配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
(I)配列番号45の塩基配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
(J)配列番号43の塩基配列の相補配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
(K)配列番号44の塩基配列の相補配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、及び
(L)配列番号45の塩基配列の相補配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ。
(a)16S rRNA遺伝子検出用に設計されたPCR反応用プライマーを用いて調整された増幅検体。
(b)PCR増幅物を元にさらにPCR反応等を行なって調整された検体。
(c)PCR以外の増幅方法により調整された検体。
(d)可視化のために各種標識方法により標識された検体。
(i)本発明にかかる固定担体と検体とを反応させる工程。
(ii)前記プローブ固定担体上のプローブと前記検体中の核酸との反応の有無、またはその反応強度を検出する工程。
(A)本発明にかかるプローブを固定したプローブ固定担体と検体とを反応させる工程。
(B)プローブ固定担体上のプローブと検体中の核酸との反応の有無を検出する工程。
(C)プローブと検体中の核酸の反応が検出される場合に、検体中の核酸と反応したプローブを特定し、プローブの塩基配列に基づいて検体中に含まれる感染症起炎菌DNAを特定する工程。
(1)5' gcggcgtgcctaatacatgcaag 3'(配列番号1)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(2)5' gcggcaggcctaacacatgcaag 3'(配列番号2)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(3)5' gcggcaggcttaacacatgcaag 3'(配列番号3)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(4)5' gcggtaggcctaacacatgcaag 3'(配列番号4)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(5)5' gcggcgtgcttaacacatgcaag 3'(配列番号5)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(6)5' gcgggatgccttacacatgcaag 3'(配列番号6)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(7)5' gcggcatgccttacacatgcaag 3'(配列番号7)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(8)5' gcggcatgcttaacacatgcaag 3'(配列番号8)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(9)5' gcggcgtgcttaatacatgcaag 3'(配列番号9)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(10)5' gcggcaggcctaatacatgcaag 3'(配列番号10)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(11)5' gcgggatgctttacacatgcaag 3'(配列番号11)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(12)5' gcggcgtgcctaacacatgcaag 3'(配列番号12)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(13)5' gcggcgtgcataacacatgcaag 3'(配列番号13)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(14)5' gcggcatgcctaacacatgcaag 3'(配列番号14)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(15)5' gcggcgcgcctaacacatgcaag 3'(配列番号15)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(16)5' gcggcgcgcttaacacatgcaag 3'(配列番号16)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(17)5' gcgtcatgcctaacacatgcaag 3'(配列番号17)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(18)5' gcgataggcttaacacatgcaag 3'(配列番号18)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(19)5' gcgacaggcttaacacatgcaag 3'(配列番号19)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(20)5' gctacaggcttaacacatgcaag 3'(配列番号20)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(21)5' acagaatgcttaacacatgcaag 3'(配列番号21)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(22)5' atccagccgcaccttccgatac 3'(配列番号22)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(23)5' atccaaccgcaggttcccctac 3'(配列番号23)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(24)5' atccagccgcaggttcccctac 3'(配列番号24)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(25)5' atccagccgcaccttccggtac 3'(配列番号25)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(26)5' atccagcgccaggttcccctag 3'(配列番号26)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(27)5' atccagccgcaggttctcctac 3'(配列番号27)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(28)5' atccagccgcacgttcccgtac 3'(配列番号28)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(12)5' gcggcgtgcctaacacatgcaag 3'(配列番号12)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(22)5' atccagccgcaccttccgatac 3'(配列番号22)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(25)5' atccagccgcaccttccggtac 3'(配列番号25)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
但し、(22)と(25)は少なくとも一方でよい。
(12)5' gcggcgtgcctaacacatgcaag 3'(配列番号12)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(22)5' atccagccgcaccttccgatac 3'(配列番号22)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(25)5' atccagccgcaccttccggtac 3'(配列番号25)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
配列番号68
CTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAACACATGCAAGTTGAGCGATTTACTTCGGTAA
AGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTACCCTGTACACACGGATAACATAC
CGAAAGGTATGCTAATACGGGATAATATATTTGAGAGGCATCTCTTGAATATCAAAGGTG
AGCCAGTACAGGATGGACCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAG
GCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGAACTGAGACACGGTCC
AAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGC
AACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAACTCTGTCCTCAAGGAAGATAAT
GACGGTACTTGAGGAGGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG
GGGGCTAGCGTTATCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGTCTTTCAAGTCA
GGAGTGAAAGGCTACGGCTCAACCGTAGTAAGCTCTTGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAG
GAGAGGAGAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCA
GTTGCGAAGGCGGCTCTCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAA
ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTACTAGGTGTCGGGGGTT
ACCCCCYTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTACTCCGCCTGGGAAGTACGCTCGCAAG
AGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGTAGCGGAGCATGTGGTTTAATTC
GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAAGCTTGACATCCCAATGACATCTCCTTAATCGGAG
AGTTCCCTTCGGGGACATTGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCATTAAGTT
GGGCACTCTAGAGAGACTGCCAGGGATAACCTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCA
TCATGCCCCTTATGCTTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGGTAGTACAGAGGGTTGCCA
AGCCGTAAGGTGGAGCTAATCCCTTAAAGCTACTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACT
CGCCTACATGAAGCTGGAGTTACTAGTAATCGCAGATCAGAATGCTGCGGTGAATGCGTT
CCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTGGAGACGCCCGAAGCCGATT
ATCTAACCTTTTGGAAGAAGTCGTCGAAGGTGGAATCAATAACTGGGGTGAAGTCGTAAC
AAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGG
Bacteroides thetaiotaomicron菌DNAを検出する目的においては、少なくとも上記(22)及び(25)に挙げるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド、並びに、上記(12)に挙げるオリゴヌクレオチドのみを有していれば良い。
(実施例1)
以下の実施例では、2 Step PCR法を用いた微生物の検出について説明する。
[1.プローブDNAの準備]
Clostridium difficile菌検出用プローブの塩基配列として、表1に示す核酸配列を設計した。具体的には、Clostridium difficile菌の16S rRNA遺伝子をコーディングしているゲノム部分より、これらの塩基配列を選択した。これらのプローブ塩基配列群は、当該菌に対して非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列でばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。なお、プローブとしては、表1に示す塩基配列からなるプローブの他に、各塩基配列を含む20から30程度の塩基長を有するプローブも利用可能である。この場合、表1で規定される塩基配列以外の部分については検出精度に影響のない塩基配列を有していることが必要である。
[2−1.検体増幅用PCRプライマーの準備]
起炎菌検出用の為の16s rRNA遺伝子(標的遺伝子)増幅用PCRプライマーとして以下の表2に示す核酸配列を設計した。具体的には、16s rRNAをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約1500塩基長の16s rRNAコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えるよう設計されたプライマーを使用した。なお、先に(1)〜(62)にあげた複数の異なる菌種や、変異株や、ゲノム上に複数存在する16s rRNA遺伝子も同時に増幅できるように複数種類のプライマーが設計されている。なお、起炎菌の16s rRNA遺伝子に対して共通にほぼ全長を増幅できるプライマーセットであれば、下記の表2に挙げたプライマーセットに限定する必要はないのは言うまでもない。
[2−2.標識用PCRプライマーの準備]
上述の検体増幅用のプライマーと同様に、以下の表3に示す配列を持つオリゴヌクレオチドを標識用のプライマーとして使用した。
[3−1.微生物の培養 & Genome DNAの抽出]
まず、Clostridium difficile菌(ATCC 51695)を、定法に従って培養した。この微生物培養液から、核酸精製キット(FastPrep FP100A・FastDNA Kit:フナコシ株式会社製)を用いて、Genome DNAの抽出と精製を行なった。
[3−2.回収したGenome DNAの検査]
回収された微生物(Clostridium difficile菌)のGenome DNAは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行い、その品質(低分子核酸の混入量、分解の程度)と回収量を検定した。本実施例では、約10μgのGenome DNA が回収され、Genome DNAのデグラデーションやrRNAの混入は認められなかった。回収したGenome DNAは、最終濃度50ng/μlとなるようにTE緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。
[4−1.ガラス基板の洗浄]
合成石英のガラス基板(サイズ:25mm×75mm×1mm、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリ のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄をおこなった。次に80℃に加熱した1N水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、DNAチップ用の石英ガラス基板を用意した。
[4−2.表面処理]
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、1重量(wt)%の濃度となるように純水中に溶解させ、2時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで、N−マレイミドカプロイロキシスクシイミド(以下EMCSと略す)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合(容量比)溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したEMCS溶液を用意した。EMCSは、同仁化学研究所社製のN−マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)である。
[4−3.プローブDNA]
実施例1の[1.プローブDNAの準備]で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度(インク溶解時)10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
[4−4.BJプリンタによるDNA吐出、および基板への結合]
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した2種類のプローブ(表1)の夫々を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたDNA溶液をインクジェットプリンタ(商品名:BJF-850 キヤノン社製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
[4−5.洗浄]
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により表面に残ったDNA溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖DNAが固定したDNAチップを得た。
[5.検体の増幅と標識化]
[5−1.検体の増幅:1st PCR]
検体となる微生物遺伝子の増幅(1st PCR)、および、標識化(2nd PCR)反応を以下の表4に示す。
[5−2.標識化反応:2nd PCR]
表5の組成の反応液を図2に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行なった。
上述の[4.DNAチップの作成]で作成したDNAチップと[5.検体の増幅と標識化]で作成した標識化検体を用いて、検出反応を行なった。
[6−1.DNAチップのブロッキング]
BSA(牛血清アルブミンFraction V:Sigma社製)を1wt%となるように100mM NaCl/10mM Phosphate Bufferに溶解した。次に、この溶液に[4.DNAチップの作製]で作製したDNAチップを室温で2時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、以下の洗浄液で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
洗浄液:
0.1wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む2×SSC溶液(NaCl 300mM 、Sodium Citrate(trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30mM、p.H.7.0)
[6−2.ハイブリダイゼーション]
水切りしたDNAチップをハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc. Hybridization Station)にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
[6−3.ハイブリダイゼーション溶液]
6xSSPE / 10% Formamide / Target(2nd PCR Products 全量)/ 0.05wt% SDS
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 50mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
[6−4.ハイブリダイゼーション条件]
65℃ 3min → 55℃ 4hr → Wash 2xSSC / 0.1% SDS at 50℃ → Wash 2xSSC at 20℃ → (Rinse with H2O : Manual) → Spin dry
[7.微生物Genomeの検出(蛍光測定)]
上記ハイブリダイゼーション反応終了後のDNAチップをDNAチップ用蛍光検出装置(Axon社製、GenePix 4000B)を用いで蛍光測定を行った。その結果、再現性良く、十分なシグナルでClostridium difficile菌を検出することができた。
以下の表6に、Clostridium difficile菌の蛍光測定結果を示す。
表1に示すプローブセットが、Clostridium difficile菌のみに特異的にハイブリッド体を形成することを証明するため、Clostridium perfringens(JCM 1290)とのハイブリダイゼーション反応を行なった結果を、次の表7に示す。
以上に説明したように、上記実施例によれば、Clostridium difficile菌のみを特異的に検出可能なプローブセットを固定したDNAチップを作成することができた。更に、このDNAチップを用いて、感染症起炎菌を同定することが可能になり、微生物由来のDNAプローブの問題を解決した。すなわち、オリゴヌクレオチドプローブは化学的に大量合成が可能であり、精製や濃度のコントロールが可能である。また、微生物の種による分類を目的に、同じ種の菌種は一括検出が可能で、しかも、他の種の菌は区別して検出できるようなプローブセットが提供できた。
また、上記実施例によれば、感染症起炎菌の16S rRNAのDNA配列を過不足なく検出することにより、該感染症起炎菌の存在を効率良く、また高い精度で判定することができる。
実施例1の[1.プローブDNAの準備]と同様に、以下の表8に示す塩基配列のプローブを準備した。
実施例2で作成したDNAチップを用いて、検体中に複数の菌種が存在する場合の検出を試みた。Clostridium difficile菌およびClostridium perfringens菌がともに培養されている培養液を用意し、これを実施例1と同様に処理し、DNAチップと反応させた。この結果、配列番号43、44、45、46、47、48のみのプローブのスポットが高い蛍光輝度を示し、これらの菌が共に存在していることが同時に確認できた。
Claims (13)
- 感染症起炎菌であるクロストリディウム ディフィシルのDNAを特異的に検出するためのプローブセットであって、
下記の(1)から選択される少なくとも1つのプローブと、下記の(2)から選択される少なくとも1つのプローブと、下記の(3)から選択される少なくとも1つのプローブとを含み、該少なくとも3つのプローブのそれぞれとの反応を示すシグナルを検出するために用いられることを特徴とするプローブセット。
(1)AATATCAAAGGTGAGCCAGTACAGGATGGA(配列番号43)で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ、
(2)CCGTAGTAAGCTCTTGAAACTGGGAGAC(配列番号44)で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ、
(3)TCCCAATGACATCTCCTTAATCGGAGAG(配列番号45)で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ。 - 請求項1に記載のプローブセットを構成する複数のプローブの各々が固相担体上に配置されていることを特徴とするプローブ固定担体。
- 前記プローブと離間した位置に、配列番号35から42及び配列番号46から67の塩基配列、並びにそれらの相補配列のいずれかの塩基配列からなるプローブからなる群から選択された少なくとも1種が固定されている請求項2に記載のプローブ固定担体。
- 請求項1に記載のプローブセットを構成する複数のプローブの各々と、標的核酸との反応を検出するための試薬と、を有することを特徴とするクロストリディウム ディフィシルDNA検出用のキット。
- 前記試薬は、クロストリディウム ディフィシルのDNAを増幅するプライマーを含み、
該プライマーは、以下の(12)の塩基配列のオリゴヌクレオチドと、以下の(22)及び(25)の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなる請求項4に記載のキット。
(12)5' gcggcgtgcctaacacatgcaag 3'(配列番号12)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(22)5' atccagccgcaccttccgatac 3'(配列番号22)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(25)5' atccagccgcaccttccggtac 3'(配列番号25)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 前記プローブが固相担体に固定された状態で提供される請求項4または5に記載のキット。
- 請求項2または3に記載のプローブ固定担体と、プローブと標的核酸との反応を検出するための試薬と、を有するDNA検出用のキットであって、
前記試薬は、感染症起炎菌DNAを増幅するプライマーを含み、
該プライマーとして、以下の(1)乃至(21)から選ばれる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと、以下の(22)乃至(28)から選ばれる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと、を含むことを特徴とするDNA検出用キット。
(1)5' gcggcgtgcctaatacatgcaag 3'(配列番号1)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(2)5' gcggcaggcctaacacatgcaag 3'(配列番号2)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(3)5' gcggcaggcttaacacatgcaag 3'(配列番号3)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(4)5' gcggtaggcctaacacatgcaag 3'(配列番号4)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(5)5' gcggcgtgcttaacacatgcaag 3'(配列番号5)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(6)5' gcgggatgccttacacatgcaag 3'(配列番号6)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(7)5' gcggcatgccttacacatgcaag 3'(配列番号7)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(8)5' gcggcatgcttaacacatgcaag 3'(配列番号8)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(9)5' gcggcgtgcttaatacatgcaag 3'(配列番号9)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(10)5' gcggcaggcctaatacatgcaag 3'(配列番号10)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(11)5' gcgggatgctttacacatgcaag 3'(配列番号11)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(12)5' gcggcgtgcctaacacatgcaag 3'(配列番号12)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(13)5' gcggcgtgcataacacatgcaag 3'(配列番号13)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(14)5' gcggcatgcctaacacatgcaag 3'(配列番号14)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(15)5' gcggcgcgcctaacacatgcaag 3'(配列番号15)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(16)5' gcggcgcgcttaacacatgcaag 3'(配列番号16)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(17)5' gcgtcatgcctaacacatgcaag 3'(配列番号17)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(18)5' gcgataggcttaacacatgcaag 3'(配列番号18)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(19)5' gcgacaggcttaacacatgcaag 3'(配列番号19)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(20)5' gctacaggcttaacacatgcaag 3'(配列番号20)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(21)5' acagaatgcttaacacatgcaag 3'(配列番号21)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(22)5' atccagccgcaccttccgatac 3'(配列番号22)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(23)5' atccaaccgcaggttcccctac 3'(配列番号23)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(24)5' atccagccgcaggttcccctac 3'(配列番号24)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(25)5' atccagccgcaccttccggtac 3'(配列番号25)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(26)5' atccagcgccaggttcccctag 3'(配列番号26)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(27)5' atccagccgcaggttctcctac 3'(配列番号27)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(28)5' atccagccgcacgttcccgtac 3'(配列番号28)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 前記感染症起炎菌DNAを増幅するプライマーが、前記(1)乃至(28)の全てのオリゴヌクレオチドの混合物である請求項7に記載のキット。
- 該試薬として、増幅された感染症起炎菌DNAの標識化のためのプライマーである以下の(29)〜(34)の標識化されたオリゴヌクレオチドを更に含む請求項4乃至8のいずれか1項に記載のキット。
(29)5’TACCTTGTTACGACTTCACCCCA 3’(配列番号29)
(30)5’TACCTTGTTACGACTTCGTCCCA 3’(配列番号30)
(31)5’TACCTTGTTACGACTTAGTCCCA 3’(配列番号31)
(32)5’TACCTTGTTACGACTTAGCCCCA 3’(配列番号32)
(33)5’TACCTTGTTACGACTTAGTCCTA 3’(配列番号33)
(34)5’TACCTTGTTACGACTTAGCCCTA 3’(配列番号34) - プローブ固定担体を用いた検体中でのクロストリディウム ディフィシルのDNAの検出方法において、
(i)請求項2に記載のプローブ固定担体と検体とを反応させる工程と、
(ii)前記プローブ固定担体上のプローブと前記検体中の核酸との反応の有無、またはその反応強度を検出する工程と、
を有することを特徴とするクロストリディウム ディフィシルのDNAの検出方法。 - 前記検体中の標的核酸を、以下の(12)の塩基配列のオリゴヌクレオチドと、以下の(22)及び(25)の少なくとも一方とをプライマーとして用いて、PCR増幅する工程を更に有する請求項10に記載の検出方法。
(12)5' gcggcgtgcctaacacatgcaag 3'(配列番号12)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(22)5' atccagccgcaccttccgatac 3'(配列番号22)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(25)5' atccagccgcaccttccggtac 3'(配列番号25)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 前記検体中の標的核酸を、以下の(1)乃至(28)の全てのオリゴヌクレオチドの混合物プライマーとして用いて、PCR増幅する工程を更に有する請求項10に記載の検出方法。
(1)5’ gcggcgtgcctaatacatgcaag 3’(配列番号1)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(2)5’ gcggcaggcctaacacatgcaag 3’(配列番号2)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(3)5’ gcggcaggcttaacacatgcaag 3’(配列番号3)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(4)5’ gcggtaggcctaacacatgcaag 3’(配列番号4)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(5)5' gcggcgtgcttaacacatgcaag 3'(配列番号5)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(6)5' gcgggatgccttacacatgcaag 3'(配列番号6)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(7)5’ gcggcatgccttacacatgcaag 3’(配列番号7)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(8)5’ gcggcatgcttaacacatgcaag 3’(配列番号8)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(9)5’ gcggcgtgcttaatacatgcaag 3’(配列番号9)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(10)5’ gcggcaggcctaatacatgcaag 3’(配列番号10)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(11)5’ gcgggatgctttacacatgcaag 3’(配列番号11)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(12)5' gcggcgtgcctaacacatgcaag 3'(配列番号12)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(13)5' gcggcgtgcataacacatgcaag 3'(配列番号13)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(14)5' gcggcatgcctaacacatgcaag 3'(配列番号14)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(15)5’ gcggcgcgcctaacacatgcaag 3’(配列番号15)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(16)5’ gcggcgcgcttaacacatgcaag 3’(配列番号16)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(17)5’ gcgtcatgcctaacacatgcaag 3’(配列番号17)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(18)5’ gcgataggcttaacacatgcaag 3’(配列番号18)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(19)5’ gcgacaggcttaacacatgcaag 3’(配列番号19)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(20)5’ gctacaggcttaacacatgcaag 3’(配列番号20)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(21)5’ acagaatgcttaacacatgcaag 3’(配列番号21)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(22)5’ atccagccgcaccttccgatac 3’(配列番号22)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
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(25)5’ atccagccgcaccttccggtac 3’(配列番号25)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(26)5’ atccagcgccaggttcccctag 3’(配列番号26)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(27)5’ atccagccgcaggttctcctac 3’(配列番号27)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
(28)5’ atccagccgcacgttcccgtac 3’(配列番号28)の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 増幅された標的核酸を、標識化のためのプライマーである以下の(29)〜(34)を用いるPCR増幅により標識化する工程を更に含む請求項11または12に記載の検出方法。
(29)5’TACCTTGTTACGACTTCACCCCA 3’(配列番号29)
(30)5’ TACCTTGTTACGACTTCGTCCCA 3’(配列番号30)
(31)5’TACCTTGTTACGACTTAGTCCCA 3’(配列番号31)
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