MX2014014356A - Metodo para la identificacion del origen de un cancer de origen primario desconocido. - Google Patents

Metodo para la identificacion del origen de un cancer de origen primario desconocido.

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Manel Esteller Badosa
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Fundació Inst D Investigació Biomédica De Bellvitge Idibell
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Abstract

La invención se refiere a métodos y reactivos para la identificación del origen de un carcinoma de origen primario desconocido (CPD) basada en la determinación del perfil de metilación en el genoma del CPD. La invención se refiere también a métodos para seleccionar una terapia adecuada para un paciente que padece un CPD así como a métodos para la medicina personalizada de pacientes que padecen un CPD basándose en el uso de un tratamiento que sea adecuado para el tumor primario del que deriva el CPD. La invención también se refiere a kits que comprenden reactivos adecuados para realizar los métodos anteriores así como a sistemas y programas informáticos que se pueden usar para implementar los métodos de la invención.

Description

MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL ORIGEN DE UN CÁNCER DE ORIGEN PRIMARIO DESCONOCIDO Campo de la Invención Esta invención proporciona materiales, métodos, algoritmos, kits, etc., para identificar el origen de un carcinoma de origen primario desconocido.
Antecedentes de la Invención El carcinoma de primario desconocido (CPD) es un conjunto de neoplasias malignas heterogéneas, confirmadas por biopsia en donde la enfermedad metastásica se presenta sin un sitio de tumor primario o tejido de origen (TdO) identificable. Este problema representa aproximadamente el 3-5 por ciento de todos los cánceres, lo que lo hace la séptima neoplasia maligna más común. El pronóstico y la pauta terapéutica de los pacientes dependen del origen del tumor primario, lo que subraya la necesidad de identificar el sitio del tumor primario. Actualmente se usan una variedad de métodos para resolver este problema. Se pueden usar marcadores tumorales en suero para el diagnóstico diferencial. Aunque carecen de la especificidad adecuada, se pueden usar en combinación con información patológica y clínica. Se pueden usar métodos inmunohistoquímicos (1HQ) para identificar el linaje del tumor pero muy pocos marcadores 1HQ son específicos al 100 por cien. Por tanto, los patólogos con frecuencia usan un panel de marcadores IHQ. Varios estudios han demostrado precisiones del 66-88 por ciento usando de cuatro a 14 marcadores IHQ. Las pruebas diagnósticas más caras incluyen métodos tales como rayos X del tórax, escáner tomográfico computarizado (TAC) y escáner tomográfico de emisión de positrones (PET). Cada uno de estos métodos puede identificar el primario en del 30 al 50 por ciento de los casos. A pesar de estas teenologías sofisticadas, la capacidad de resolver casos de CPD solo es del 20-30 por ciento antes de la muerte. Un nuevo planteamiento prometedor está en la capacidad de determinar perfiles de expresión génica en todo el genoma para identificar el origen de los tumores. Para que estas tecnologías de determinación de perfiles de expresión sean útiles en el marco clínico, se deben salvar dos principales obstáculos. Primero, puesto que la determinación de perfiles de expresión génica se realizó por completo en tejidos primarios, los marcadores génicos candidatos se deben validar en tejidos metastásicos para confirmar que su expresión específica de tejido se conserva en metástasis. Segundo, la tecnología de determinación de perfil de expresión génica debe poder utilizar muestras de tejidos fijados en formalina, embebidos en parafina (FFEP), ya que las muestras de tejidos fijados son el material estándar en la práctica actual. La fijación en formalina produce la degradación del ARN por l/o que los protocolos de micromatrices existentes no funcionan de forma tan exacta. Además, la tecnología de determinación del perfil debe ser robusta, reproducible y fácilmente accesible.
Según esto, hay una necesidad en la técnica para métodos para la identificación del origen de un CPD que salven los problemas de los métodos conocidos en la técnica anterior. Sumario de la Invención En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para identificar el origen de un cáncer de origen primario desconocido (CPD) que comprende los pasos de: (i) determinar el perfil de metilación en una región seleccionada de un ADN aislado de dicho CPD y (ii) comparar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario en donde una identidad sustancial entre el perfil de metilación obtenido en el paso (i) y el perfil de metilación del tumor primario es indicativo de que el CPD deriva de dicho tumor primario.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para seleccionar una terapia para un cáncer de origen primario desconocido (CPD) que comprende los pasos de: (i) determinar el perfil de metilación en una región seleccionada de un ADN aislado de dicho CPD y (ii) comparar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario en donde una identidad sustancial entre el perfil de metilación obtenido en (i) y el perfil de metilación del tumor primario es indicativo de que el CPD se debe tratar con una terapia que sea adecuada para dicho tumor primario.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para tratar un cáncer de origen primario desconocido (CPD) en un sujeto que comprende los pasos de: (i) determinar el perfil de metilación en una región seleccionada de un ADN aislado de dicho CPD, (ii) comparar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario y (iii) tratar el sujeto con una terapia adecuada para dicho tumor primario, en donde el perfil de metilación obtenido en (i) muestra una identidad sustancial con el perfil de metilación del tumor primario.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit para su uso en un método según la invención que comprende una pluralidad de cebadores o sondas especificas para determinar un estado de metilación de un sitio CpG expresado por un CPD.
En aún otro aspecto, la invención se refiere a un sistema informático que se proporciona con medios para implementar los métodos según la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a un programa informático que comprende un código de programación para ejecutar los pasos de los métodos según la invención.
Descripción de las Figuras de la Invención Figura 1. A. Ejemplos de metilación de CpG especifica de tipos de cáncer en genes particulares validados adicionalmente por pirosecuenciación. Las barras corresponden a los sitios CpG analizados y el color negro representa el porcentaje de metilación. B. Gráfico de barras que muestra el porcentaje de genes enriquecidos para el complejo represor polycomb 2 (Lee et al., 2006, Cell 125: 301-313) (panel izquierdo) o para 3mK4H3 y/o 3mK27H3 (Pan et al., 2007, Cell Stem Cell 1: 299-312) (panel derecho) en células troncales embrionarias. Comparado con todos los genes estudiados con la matriz de metilación, el grupo de genes hipermetilados en cáncer está significativamente enriquecido para dominios bivalentes y dianas del complejo polycomb. C. Gráfico de densidad de los datos de expresión génica basados en la micromatriz en pacientes de cáncer de colon. Los genes hipermetilados (linea roja) y los genes hipometilados (linea verde) muestran niveles de expresión menores y mayores, respectivamente, comparados con el resto de los genes estudiados con la matriz de metilación (linea azul). Las diferencias en la expresión génica entre los distintos grupos de metilación son estadísticamente significativas (prueba de Kruskal-Wallis). Los datos de expresión génica se muestran en una escala log2.
Figura 2. Escenarios de cambios de metilación del ADN en tumorigénesis humana. Mapa de calor de la predicción de metilación en CpG que muestra la clasificación de CPD a un tipo tumoral específico.
Descripción Detallada de la Invención Los autores de la presente invención han desarrollado un método para la identificación del origen de un tumor de origen primario desconocido basado en la comparación de la huella de metilación del ADN con la huella de metilación de una colección de tumores primarios. Este método puede predecir el tipo de tumor de cerca del 100% de las muestras de CPD proporcionadas, es decir, siempre que el tipo tumoral esté representado en la colección original de canceres con huellas de metilación del ADN, el método proporcionará el órgano de origen. Además, el método tiene la ventaja de que, además de identificar el origen del CPD, también puede proporcionar información adicional sobre el tumor (por ejemplo, estado de receptores y predicción de quimiosensibilidad).
Por tanto, la identificación de origen primario de los CPD proporciona conocimiento de las posibilidades de supervivencia de un individuo que ha contraído el cáncer. También proporciona percepciones sobre qué tipo de tratamiento se debe ofrecer al individuo que ha contraído el cáncer, proporcionando de esta manera una respuesta de tratamiento mejorada al individuo. Asimismo, el individuo puede evitar un tratamiento que sea ineficaz en tratar el tipo particular de cáncer y por tanto ahorrar al individuo efectos secundarios graves asociados con el tratamiento que puede que incluso no sea adecuado para el tipo de cáncer. Es probable que para un experto en la materia, en al menos algunos casos, la identificación del sitio de origen de un CPD se correlacione con pronóstico o grado de respuesta. En tales circunstancias, es posible que el mismo conjunto de compañeros de interacción pueda actuar tanto en un panel de clasificación como en un panel pronóstico o predictivo.
Definiciones de terminos La expresión "cáncer de origen primario desconocido" o "CPD", como se usa en el presente documento, se refiere a un cáncer que se encuentra en uno o más sitios metastásicos pero para el que no se conoce el sitio primario.
Los términos "CG" o "CpG" se pueden usar de forma intercambiable y se refieren a regiones de una molécula de ADN donde un nucleótido de citosina se da a continuación de un nucleótido de guanina en la secuencia lineal de bases (hebra lineal) en la molécula de ADN. Los nucleótidos que forman una hebra lineal en una molécula de ADN están unidos a través de un fosfato. Por tanto, un sitio CG también se denomina como un sitio "CpG", taquigrafía para citosina-fosfato-guanina. La notación "CpG" se usa además para distinguir la secuencia lineal de citosina y guanina del apareamiento de bases CG de citosina y guanina, donde citosina y guanina se localizan en hebras opuestas de una molécula de ADN. Las citosinas en los dinucleótidos CpG se pueden metilar para formar 5-metilcitosina. En mamíferos, la metilación de la citosina en un gen puede apagar el gen. Las enzimas que añaden un grupo metilo a un citosina en una molécula de ADN se denominan ADN metiltransferasas.
Como se usa en el presente documento, el término "isla CpG" se refiere a una secuencia corta de ADN rica en el dinucleótido CpG y que se puede encontrar en la región 5' de aproximadamente la mitad de los genes humanos. El término "sitio CpG" se refiere al dinucleótido CpG dentro de las islas CpG. Las islas CpG típicamente tienen, pero no siempre, entre aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 1 kb de longitud.
El término "hipermetilación" se refiere al estado de metilación medio que corresponde a una presencia aumentada de 5-mCyt en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG en una secuencia de ADN de una muestra de ADN prueba, relativa a la cantidad de 5-mCyt encontrada en dinucleótidos CpG correspondientes en una muestra de ADN control normal.
El término "hipometilación" se refiere al estado de metilación medio que corresponde a una presencia disminuida de 5-mCyt en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG en una secuencia de ADN de una muestra de ADN prueba, relativa a la cantidad de 5-mCyt encontrada en dinucleótidos CpG correspondientes en una muestra de ADN control normal.
El término "metilación" como se usa en el presente documento, se refiere a la unión covalente de un grupo metilo en la posición C5 de la base nucleotídica citosina en los dinucleótidos CpG de regiones reguladoras de genes. El término "estado de metilación" o "nivel de metilación" se refiere a la presencia o ausencia de 5-metil-citosina ("5-mCyt") en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG en una secuencia de ADN. Como se usa en el presente documento, los términos "estado de metilación" y "nivel de metilación" se usan de forma intercambiable. Un sitio de metilación es una secuencia de nucleótidos unidos contiguos que es reconocida y metilada por una metilasa específica de secuencia. Una metilasa es una enzima que metila (es decir, une covalentemente un grupo metilo) uno o más nucleótidos en un sitio de metilación.
Como se usa en el presente documento, el término "perfil de metilación" se refiere a un conjunto de datos que representan los estados de metilación de uno o más loci en una molécula de ADN. El perfil puede indicar el estado de metilación de cada base en un individuo, puede tener información respecto a un subconjunto de pares de bases en un genoma o puede tener información respecto a densidad de metilación regional de cada locus.
El término "nivel de metilación" se refiere a la presencia o ausencia de 5-metil-citosina ("5-mCyt") en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG presentes en la secuencia de ADN de un gen de metilación de ADN diana. Como se usa en el presente documento, los términos "estado de metilación" y "nivel de metilación" se usan de forma intercambiable. El nivel de metilación en uno o más sitios de metilación CpG particulares (cada uno tiene dos secuencias de dinucleótido CpG) en una secuencia de ADN incluye "sin metilar", "completamente metilado" y "hemimetilado".
El término "tumor primario", como se usa en el presente documento, se refiere a un tumor que se originó en la localización u órgano en que está presente y no metastatizó a esa localización desde otra localización.
El término "cebador" en general se refiere a un oligonucleótido que actúa como un punto de iniciación de una síntesis dirigida por molde usando métodos tales como PCR (reacción en cadena de la polimerasa) o LCR (reacción en cadena de la ligasa) en las condiciones apropiadas.
El término "sonda de ácido nucleico" o "sonda" se refiere a un oligonucleótido marcado o sin marcar capaz de hibridar selectivamente a un ácido nucleico diana o molde en condiciones adecuadas.
El término "estadísticamente significativo" o "significativamente" se refiere a significancia estadística y en general significa una concentración del marcador de dos desviaciones estándar (2 DE) por debajo de lo normal, o menor. El término se refiere a la evidencia estadística que de que hay una diferencia. Se define como la probabilidad de hacer una decisión para rechazar la hipótesis nula cuando la hipótesis nula es realmente cierta. La decisión con frecuencia se toma usando el valor de p.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar" y "tratamiento" se refiere a administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una composición de modo que el sujeto tenga una reducción en al menos un síntoma de la enfermedad o una mejora en la enfermedad, por ejemplo, resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a, alivio de uno o más síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (por ejemplo, sin empeoramiento), retraso o disminución de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (sea parcial o total), sea detectable o no detectable. En algunas formas de realización, tratar se puede referir a prolongar la supervivencia comparada con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Por tanto, el experto en la materia se da cuenta de que un tratamiento puede mejorar el estado de la enfermedad, pero puede no ser una cura completa para la enfermedad. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" incluye profilaxis. De forma alternativa, el tratamiento es "eficaz" si la progresión de una enfermedad se reduce o para. En algunas formas de realización, el término "tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia comparado con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen los ya diagnosticados con una enfermedad o afección, así como los que probablemente desarrollen una enfermedad o afección debido a susceptibilidad genética u otros factores que contribuyen a la enfermedad o afección, tal como un ejemplo no limitante, peso, dieta y salud de un sujeto son factores que pueden contribuir a la probabilidad de que un sujeto desarrolle diabetes mellitus. Esos en necesidad de tratamiento también incluyen sujetos en necesidad de atención médica o quirúrgica, cuidados o tratamiento. El sujeto habitualmente está enfermo o herido, o tiene riesgo aumentado de ponerse enfermo relativo a un miembro medio de la población y en necesidad de tal atención, cuidado o tratamiento.
El término "medio legible por ordenador" se puede referir a cualquier dispositivo de almacenamiento usado para almacenar datos, accesible mediante un ordenador, asi como cualquier otro medio para proporcionar acceso a los datos mediante un ordenador. Los ejemplos de un medio legible por ordenador de tipo dispositivo de almacenamiento incluyen: un disco duro magnético; un disquete; y un disco óptico, tal como un CD-ROM y un DVD; una cinta magnética; un microprocesador de memoria.
El término "software" se usa de forma intercambiable en el presente documento con "programa" y se refiere a reglas prescritas para operar un ordenador. Los ejemplos de software incluyen: software; segmentos de código; instrucciones; programas informáticos; y lógica programada.
El término "sistema informático" se puede referir a un sistema que tiene un ordenador, donde el ordenador comprende un medio legible por ordenador que incorpora software para operar el ordenador.
El término "neoplasia linfoide", como se usa en el presente documento, se refiere a una neoplasia que surge de un cambio maligno en un linfocito B o T e incluye, sin limitación, cualquier tipo de linfoma. Los dos tipos principales de linfomas son la enfermedad de Hodgkin y el linfoma no de Hodgkin. La enfermedad de Hodgkin es una enfermedad relativamente sencilla que implica solo cuatro tipos principales. En cambio, el linfoma no de Hodgkin (NHL) es un término aplicado a muchos tipos diferentes de cáncer linfático incluyendo los siguientes subtipos: linfoma precursor de células B, linfoma linfocitico pequeño/leucemia linfocitica crónica, linfomas de zonas marginales (linfoma de zona marginal nodal, MALT extranodal, esplénico), leucemia de células pilosas, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de células B grandes difuso, linfoma de Burkitt, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma periférico de células T y micosis fungoide. Otras neoplasias linfoides que no están estrictamente relacionadas con el linfoma no de Hodgkin, pero que están cubiertas por esta invención incluyen leucemia linfoblástica aguda, linfoma linfoplasmacitoide, leucemia linfocitica crónica de células T/leucemia prolinfocitica, y cualquier otro cáncer de origen linfoide que no se clasifique fácilmente.
El término "cáncer de cabeza y cuello", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de cánceres biológicamente similares que empiezan en el aparato aerodigestivo superior, incluyendo el labio, cavidad oral (boca), cavidad nasal (interior de la nariz), senos paranasales, faringe y laringe. El 90% de los cánceres de cabeza y cuello con carcinomas de células escamosas (SCCHN), [1] que se originan del revestimiento mucoso (epitelio) de estas regiones. Los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) constituyen la gran mayoría de los cánceres de cabeza y cuello, y surgen de las superficies mucosas en toda esta región anatómica. Estos incluyen tumores de las cavidades nasales, senos paranasales, cavidad oral, nasofaringe, orofaringe, hipofaringe y laringe.
El término "cáncer pancreático" o "cáncer de páncreas" como se usa en el presente documento se refiere a cáncer que deriva de células pancreáticas incluyendo, pero no limitado a, adenocarcinomas, carcinomas adenoescamosos, carcinomas de células en anillo de sello, carcinomas hepatoides, carcinomas coloides, carcinomas sin diferenciar, carcinomas sin diferenciar con células gigantes de tipo osteoclasto y carcinomas de células de isletas.
El término "cáncer endometrial", como se usa en el presente documento, se refiere a una neoplasia maligna que surge del revestimiento interno del útero (endometrio). El término se refiere a, pero no está limitado a carcinomas de endometrio y adenocarcinomas de endometrio. Los cánceres endometriales, como se usa en el presente documento, también incluyen otros tipos celulares bien conocidos tales como carcinoma seroso papilar, carcinoma de células claras, carcinoma endometroide papilar y carcinoma mucinoso.
Como se usa en el presente documento, "cáncer de colon", también llamado "cáncer colorrectal" o "cáncer de intestino", se refiere a una neoplasia maligna que surge en el intestino grueso (colon) o el recto (el final del colon), e incluye tumores cancerosos en el colon, recto y apéndice, incluyendo adenocarcinoma.
Como se usa en el presente documento "cáncer de próstata" describe un crecimiento incontrolado (maligno) de células originarias de la glándula de la próstata.
El término "glioma", como se usa en el presente documento", se refiere a un tipo de cáncer que empieza en el cerebro o la columna vertebral y que surge de células de glia y/o sus precursores incluyendo ependimomas (gliomas derivados de células ependimales), astrocitomas (gliomas derivados de astrocitos y que incluye glioblastoma multiforme, oligodendrogliomas (gliomas derivados de oligodendrocitos) y gliomas mezclados, tales como oligoastrocitomas (derivados de células de diferentes tipos de glía).
El término "cáncer ovárico", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de tumores que se originan en los ovarios e incluye, sin limitación, cáncer ovárico seroso, cáncer ovárico no invasor, cáncer ovárico de fenotipo mezclado, cáncer ovárico mucinoso, cáncer ovárico endometroide, cáncer ovárico de células claras, cáncer ovárico seroso papilar, célula de Brenner y adenocarcinoma sin diferenciar.
El término "cáncer de pulmón", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier crecimiento celular incontrolado en los tejidos del pulmón, incluyendo, pero no limitado a, carcinoma de pulmón microcitico, carcinoma microcitico combinado, carcinoma de pulmón no microcitico, carcinoma sarcomatoide, tumor de las glándulas salivares, tumor carcinoide, carcinoma adenoescamoso, blastoma pleuropulmonar y tumor carcinoide.
El término "cáncer de vejiga", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquiera de varios tipos de tumores malignos de la vejiga urinaria e incluye, sin limitación, carcinoma de células de transición, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, sarcoma y carcinoma microcitico.
El término "melanoma" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier forma de cáncer que empieza en los melanocitos. Melanoma incluye, pero no está limitado a, los siguientes subtipos; lentigo maligno, melanoma lentigo maligno, melanoma de extensión superficial, melanoma lentiginoso acral, melanoma mucoso, melanoma nodular, melanoma polipoide, melanoma desmoplásico, melanoma amelanótico, melanoma de tejido blando y melanoma metastásico.
El término cáncer de mama o neoplasia maligna de mama se usa comúnmente como el nombre genérico para cánceres que se originan del tejido mamario, lo más comúnmente del revestimiento interno de los conductos de la leche o de los lóbulos que suministran leche a los conductos. Dependiendo del estado de receptor detectado mediante inmunohistoquimica, en particular de la presencia o ausencia de receptor de estrógeno (ER), receptor de progesterona (PR) y del nivel de expresión de HER2/neu (expresión normal/subexpresión frente a sobreexpresión), los cánceres de mama se pueden dividir en cáncer de mama positivo para ER (ER+), cáncer de mama negativo para ER (ER-), cáncer de mama positivo para PR (PR+), cáncer de mama negativo para PR (PR-), cáncer de mama positivo para HER2 (HER2+) (cáncer que sobreexpresa HER2), cáncer de mama negativo para HER2 (HER2-) (cáncer que expresa niveles normales de HER2 o subexpresa HER2, o que no expresa un nivel detectable de HER2), cáncer de mama negativo para receptores de hormonas, es decir, cáncer de mama sin receptores de estrógeno ni de progesterona (abreviado mediante cáncer de mama ER-/PR-); y cáncer de mama triple negativo, es decir, cáncer de mama sin receptores de estrógenos ni de progesterona y con expresión normal/subexpresión (o con la ausencia de un nivel de expresión detectable) de HER2 (abreviado mediante cáncer de mama ER-/PR-/HER2-). Dependiendo de su patrón de expresión génica, los cánceres de mama se pueden dividir en cáncer de mama subtipo A luminal, cáncer de mama subtipo B luminal, cáncer de mama de tipo normal, cáncer de mama HER2+ y cáncer de mama de tipo basal (Sorlie et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci.98:10869-10874). Los subtipos luminales A y B son en gran parte positivos para ER. En contraste, los cánceres de mama HER2+ muestran una expresión alta aumentada de genes asociados con el amplicón HER2 y los cánceres de mama de tipo normal comparten características moleculares de tejido mamario normal.
Como se usa en el presente documento, el término "neoplasias mieloides" se refiere a cánceres de células del linaje mieloide, por ejemplo, leucemias mieloides (mielocítica o mielógena) derivadas de granulocitos (por ejemplo, neutrófilos, eosinófilos y basófilos) o monocitos; por ejemplo, leucemia mielocítica crónica, leucemia mielocítica aguda, leucemia neutrofílica crónica, leucemia eosinofílica crónica y síndromes mielodisplásicos.
El término "cáncer testicular", como se usa en el presente documento, se refiere a un cáncer que se desarrolla en los testículos. El término "cáncer testicular" incluye, pero no está limitado a, cáncer maligno tal como seminomas, no seminomas, coriocarcinoma, carcinoma embrionario, teratoma inmaduro, tumores del saco vitelino, tumores de células de Lcydig y Sertoli, PNET, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma y mesotelioma.
El término "tumor de estómago" o "cáncer de estómago" se refiere a cualquier tumor o cáncer del estómago incluyendo, por ejemplo, adenocarcinomas (tal como de tipo difuso o de tipo intestinal), y formas menos prevalentes tales como linfomas, leiomiosarcomas y carcinomas de células escamosas.
Método para la determinación del origen de un cáncer de origen primario desconocido (CPD) En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para identificar el origen de un cáncer de origen primario desconocido (CPD) (en adelante primer método de la invención) que comprende los pasos de: (i) determinar el estado de metilación en al menos un sitio CpG en un ADN aislado de una muestra que contiene células de dicho CPD y (ii) comparar el estado de metilación de dicho al menos un sitio CpG obtenido en (i) con el estado de metilación del mismo sitio CpG en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario en donde una identidad sustancial entre el estado de metilación obtenido en (i) y el estado de metilación del tumor primario es indicativo de que el CPD deriva de dicho tumor primario.
En algunas formas de realización, el nivel de metilación se determina en una isla CpG o en una no isla CpG.
En un primer paso, se determina el perfil de metilación de una región seleccionada en un ADN aislado de dicho CPD. La determinación se lleva a cabo en una muestra que contiene células derivadas del CPD. La muestra biológica puede ser virtualmente cualquier muestra biológica, particularmente una muestra que contiene ARN o ADN del sujeto. La muestra biológica puede ser una muestra de tejido que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000.000, de aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 10.000.000 o de aproximadamente 1.000.000 hasta aproximadamente 10.000.000 de células somáticas. Sin embargo, es posible obtener muestras que contengan números menores de células, incluso una única célula en formas de realización que utilizan un protocolo de amplificación tal como PCR. La muestra no necesita contener ninguna célula intacta, siempre que contenga suficiente material biológico para evaluar el perfil de metilación. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada que comprenda materia celular del tumor. Los tipos de muestra adecuados incluyen lineas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, líquidos corporales, heces, efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y todas las posibles combinaciones de las mismas.
En una forma de realización preferida, la muestra es una muestra de CPD. La muestra se puede suministrar en cortes histológicos, biopsias, tejido embebido en parafina, tejido congelado, tejido fijado en formalina, líquidos corporales, heces, efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de las mismas.
El ADN genómico se aísla después de la muestra. El ADN se puede aislar por cualquier medio estándar en la téenica, incluyendo el uso de kits comercialmente disponibles. Brevemente, en donde el ADN de interés está encapsulado por una membrana celular, la muestra biológica se debe romper y lisar por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. La solución de ADN se puede limpiar después de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo mediante digestión con proteinasa K. El ADN genómico se recupera luego de esta solución. Esto se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos incluyendo precipitación con sales, extracción orgánica o unión del ADN a un soporte en fase sólida. La elección del método estará afectada por varios factores incluyendo tiempo, gastos y cantidad requerida de ADN.
En donde la muestra de ADN no está encerrada en una membrana (por ejemplo, ADN circulante de una muestra de sangre) se pueden emplear métodos estándar en la técnica para el aislamiento y/o purificación de ADN. Tales métodos incluyen el uso de un reactivo degenerante de proteínas, por ejemplo, sal caotrópica, por ejemplo clorhidrato de guanidinio o urea; o un detergente, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio (SDS), bromuro de cianógeno. Los métodos alternativos incluyen, pero no están limitados a precipitación con etanol o precipitación con propanol·, concentración al vacío entre otros por medio de una centrífuga. El experto en la materia también puede hacer uso de dispositivos tales como dispositivos filtros, por ejemplo, ultracentrifugación, superficies o membranas de sílice, partículas magnéticas, partículas de poliestireno, superficies de poliestireno, superficies cargadas positivamente y membranas cargadas positivamente, membranas cargadas, superficies cargadas, membranas cargadas cambiadas, superficies cargadas cambiadas.
Una vez se han extraído los ácidos nucleicos, el ADN bicatenario genómico se usa en el análisis, el análisis de metilación se puede llevar a cabo por cualquier medio conocido en la téenica. En la técnica se conocen una variedad de procedimientos de análisis de metilación y se pueden usar para practicar la invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de sitios CpG en una muestra de tejido. Además, estos métodos se pueden usar para la cuantificación absoluta o relativa de los ácidos nucleicos metilados. Tales ensayos de metilación implican, entre otras técnicas, dos pasos principales. El primer paso es una reacción o separación específica de metilación, tal como (i) tratamiento con bisulfito, (ii) unión específica de metilación, o (iii) enzimas de restricción específicas de metilación. El segundo paso principal implica (i) amplificación y detección, o (ii) detección directa, mediante una variedad de métodos tales como (a) PCR (amplificación específica de secuencia) tal como Taqman®, (b) secuenciación de ADN de ADN sin tratar y tratado con bisulfito, (c) secuenciación mediante ligación de sondas modificadas con colorantes (incluyendo ligación y corte cíclicos), (d) pirosecuenciación, (e) secuenciación de moléculas únicas, (f) espectrometría de masas, o (g) análisis por transferencia de tipo Southern.
Además, se puede usar la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados del ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el método descrito por Sadri y Hornsby (1996, Nucí. Acids Res.24:5058-5059), o COBRA (Análisis combinado de restricción con bisulfito) (Xiong y Laird, 1997, Nucleic Acids Res.25:2532- 2534). El análisis COBRA es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación de ADN en loci de genes específicos en cantidades pequeñas de ADN genómico. Brevemente, se usa la digestión con enzimas de restricción para revelar las diferencias de secuencias dependientes de metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito sódico. Las diferencias de secuencia dependientes de metilación se introducen primero en el ADN genómico por tratamiento estándar con bisulfito según el procedimiento descrito por Frommer y col. (Frommer et al, 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 1827-1831). La amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito se realiza después usando cebadores específicos para los sitios CpG de interés, seguido por la digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel y detección usando sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y sin digerir de una manera linealmente cuantitativa a través de un amplio espectro de niveles de metilación de ADN. Además, esta téenica se puede aplicar de forma fidedigna a ADN obtenido de muestras de tejido embebidas en parafina microdisecadas. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit basado en COBRA típico) para el análisis COBRA pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para genes específicos (o secuencia de ADN alterada por metilación o islas CpG); enzimas de restricción y tampón apropiado; oligo de hibridación con genes; oligo de hibridación control; kit de mareaje con quinasa para la sonda de oligo; y nucleótidos radioactivos. Además, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.
En una forma de realización, el perfil de metilación de sitios CpG seleccionados se determina usando PCR especifica de metilación (MSP). MSP permite evaluar el estado de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG en una isla CpG, independiente del uso de enzimas de restricción sensibles a metilación (Hermán et al., 1996, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93, 9821- 9826; Patentes en EE UU Nos.5.786.146, 6.017.704, 6.200.756, 6.265.171 (Hermán y Baylin), Publicación de patente en EE UU No. 2010/0144836 (Van Engeland et al); que se incorporan en el presente documento mediante referencia en su totalidad). Brevemente, el ADN se modifica mediante bisulfito sódico que convierte las citosinas sin metilar, pero no las metiladas, a uracilo y posteriormente se amplifica con cebadores específicos para ADN metilado frente a sin metilar. MSP requiere solo cantidades pequeñas de ADN, es sensible al 0,1 por ciento de alelos metilados de un locus de isla CpG determinada, y se puede realizar en ADN extraído de muestras embebidas en parafina. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit de MSP típico) para el análisis MSP pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR metilados y sin metilar para genes específicos (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG), tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados y sondas específicas. La prueba ColoSure™ es una prueba comercialmente disponible para cáncer de colon basada en la teenología MSP y medida de la metilación del gen de la vimentina (Itzkowitz et al, 2007, Clin Gastroenterol. Hepatol. 5(1), 111-117). De forma alternativa, se puede usar PCR específica de metilación multiplexada cuantitativa (QM-PCR), como describen Fackler y col. Fackler et al, 2004, Cáncer Res. 64(13) 4442-4452; o Fackler et al, 2006, Clin. Cáncer Res.12(11 Pt 1) 3306-3310.
En una forma de realización, el perfil de metilación de sitios CpG seleccionados se determina usando los métodos MethyLight y Heavy Methyl. Los ensayos MethyLight y Heavy Methyl son un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza teenología de PCR en tiempo real con fluorescencia (Taq Man®) que no requiere manipulaciones adicionales después del paso de PCR (Eads, C.A. et al, 2000, Nucleic Acid Res.28, e 32; Cottrell et al, 2007, J. Urology 177, 1753, patentes en EE UU No.6.331.393 (Laird et al), cuyo contenido se incorpora al presente documento mediante referencia en su totalidad). Brevemente, el proceso MethyLight empieza con una muestra mezcla de ADN genómico que se convierte, en una reacción con bisulfito sódico, a un conjunto mezclado de diferencias de secuencia dependientes de metilación según procedimientos estándar (el proceso del bisulfito convierte residuos de citosina sin metilar a uracilo). Se realiza después PCR con fluorescencia bien en una reacción de PCR "no sesgada" (con cebadores que no solapan con sitios de metilación CpG conocidos) o en una reacción "sesgada" (con cebadores de PCR que solapan con dinucleótidos CpG conocidos). La discriminación de secuencia se puede producir a nivel del proceso de amplificación o a nivel del proceso de detección con fluorescencia, o ambos. El ensayo MethyLight se puede usar como una prueba cuantitativa para patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde la discriminación de secuencia se produce a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que solapa con un sitio de metilación putativo particular. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en la ni los cebadores ni la sonda recubren ningún nucleótido CpG. De forma alternativa, se logra una prueba cualitativa para metilación genó ica probando el conjunto de PCR sesgada con oligonucleótidos control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión fluorescente de la téenica "MSP") o con oligonucleótidos que cubren potenciales sitios de metilación. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit basado en MethyLight típico) para análisis MethyLight pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para genes específicos (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG); sondas TaqMan®; tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y Taq polimerasa. La tecnología MethyLight se usa para las pruebas comercialmente disponibles para cáncer de pulmón (ensayo epi proLung BL Reflex); cáncer de colon (ensayo epi proColon y ensayo mSEPT9) (Epigenomics, Berlín, Alemania) publicación de PCT No. WO 2003/064701 (Schweikhardt y Sledziewski), cuyo contenido se incorpora al presente documento mediante referencia en su totalidad.
MethyLight cuantitativo usa bisulfito para convertir ADN genómico y los sitios metilados se amplifican usando PCR con cebadores independientes de metilación. Las sondas de detección específicas para los sitios metilados y sin metilar con dos fluoróforos diferentes proporcionan una medida cuantitativa simultánea de la metilación. La técnica Heavy Methyl empieza con la conversión con bisulfito del ADN. A continuación bloqueantes específicos previenen la amplificación del ADN sin metilar. El ADN genómico metilado no se une a los bloqueantes y sus secuencias se amplificarán. Las secuencias amplificadas se detectan con una sonda específica de metilación. (Cottrell et al, 2004, Nuc. Acids Res.32, elO, cuyo contenido se incorpora al presente documento mediante referencia en su totalidad).
La téenica Ms-SNuPE es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basada en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido por extensión de cebador de nucleótido único (Gonzalgo y Jones, 1997, Nucleic Acids Res.25, 2529-2531). Brevemente, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito sódico para convertir la citosina sin metilar a uracilo al tiempo que deja la 5-metilcitosina sin cambios. Se realiza después la amplificación de la secuencia diana deseada usando cebadores de PCR específicos para ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y usa como molde para análisis de metilación en el/los sitio(s) CpG de interés. Se pueden analizar cantidades pequeñas de ADN (por ejemplo, secciones patológicas microdisecadas) y evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en sitios CpG. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en kit basado en Ms-SNuPE típico) para análisis Ms-SNuPE pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para genes específicos (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; kit de extracción de gel; cebadores de control positivo; cebadores Ms-SNuPE para genes específicos; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos radioactivos. Además, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de sulfonación; y componentes de recuperación de ADN.
En otra forma de realización, el estado de metilación de sitios CpG seleccionados se determina usando métodos de detección de metilación basados en unión diferencial. Para la identificación de regiones diferencialmente metiladas, un planteamiento es capturar ADN metilado. Este planteamiento usa una proteina, en la que el dominio de unión a metilo de MBD2 se fusiona al fragmento Fe de un anticuerpo (MBD-FC) (Gebhard et al, 2006, Cáncer Res.66:6118-6128; y publicación de PCT No. WO 2006/056480 A2 (Relhi), cuyos contenidos se incorpora al presente documento mediante referencia en su totalidad). Esta proteina de fusión tiene varias ventajas sobre anticuerpos específicos de metilación convencionales. La MCB-FC tiene mayor afinidad hacia ADN metilado y se une a ADN bicatenario. Lo más importante las dos proteínas se diferencian en el modo en que unen ADN. Los anticuerpos específicos de metilación se unen al ADN estocásticamente, lo que significa que solo se puede obtener una respuesta binaria. El dominio de unión a metilo de MBD-FC, por otra parte, se une a moléculas de ADN independientemente de su estado de metilación. La fuerza de esta interacción proteína-ADN se define por el nivel de metilación de ADN. Después de unirse a ADN genómico, se pueden usar soluciones eluato de concentraciones de sal crecientes para fraccionar ADN metilado y sin metilar lo que permite una separación más controlada (Gebhard et al, 2006, Nucleic Acids Res. 34: e82). Por consiguiente, este método, llamado inmunoprecipitación de metil-CpG (MCIP), no solo enriquece, sino que también fracciona el ADN genómico según el nivel de metilación, lo que es particularmente positivo cuando la fracción de ADN sin metilar también se debe investigar.
De forma alternativa, se pueden usar anticuerpos contra 5-metilcitidina para unir y precipitar ADN metilado. Los anticuerpos están disponibles de Abeam (Cambridge, MA), Diagenode (Sparta, NJ) o Eurogentec (c/o AnaSpec, Fremont, CA). Una vez separados los fragmentos metilados, se pueden secuenciar usando téenicas basadas en micromatrices tal como el ensayo de recuperación de islas CpG metiladas (MIRA) o inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) (Pelizzola et al, 2008, Genome Res. 18, 1652-1659; O'Geen et al, 2006, BioTechniques 41(5), 577-580, Weber et al, 2005, Nat. Genet. 37, 853-862; Horak y Snyder, 2002, Methods Enzymol, 350, 469-83; Lieb, 2003, Methods Mol Biol, 224, 99-109). Otra téenica es columna de dominio de unión a metil-CpG/segregación de moléculas parcialmente fundidas (MBD/SPM, Shiraishi et al, 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96(6):2913-2918). 5.3.4. Methylation Specific Restriction Enzymatic Methods Por ejemplo, hay enzimas sensibles a metilo que preferente o sustancialmente cortan o digieren en su secuencia de reconocimiento de ADN si no está metilada. Por tanto, una muestra de ADN sin etilar se cortará en fragmentos más pequeños que una muestra de ADN metilado. De forma similar, una muestra de ADN hipermetilado no se cortará. En cambio, hay enzimas sensibles a metilo que cortan en su secuencia de reconocimiento de ADN solo si está metilada. Las enzimas sensibles a metilo que digieren ADN sin metilar adecuadas para su uso en los métodos de la tecnología incluyen, pero no están limitadas a, Hpall, Hhal, Maell, BstUI y Acil. Una enzima que se puede usar es Hpall que corta solo la secuencia CCGG sin metilar. Otra enzima que se puede usar es Hhal que corta solo la secuencia GCGC sin metilár. Ambas enzimas están disponibles de New England BioLabs®, Inc. También se pueden usar combinaciones de dos o más enzimas sensibles a metilo que digieren solo ADN sin metilar. Las enzimas adecuadas que digieren solo ADN metilado incluyen, pero no están limitadas a, Dpnl, que solo corta en secuencias 5'-GATC completamente metiladas y McrBC, una endonucleasa, que corta ADN que contiene citosinas modificadas (5-metilcitosina o 5-hidroximetilcitosina o N4-metilcitosina) y corta en el sitio de reconocimiento 5'... PumC(N40-3000) PumC... 3' (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA). Los métodos y procedimientos de corte para las enzimas de restricción seleccionadas para cortar ADN en sitios específicos los conoce bien el experto en la materia. Por ejemplo, muchos suministradores de enzimas de restricción proporcionan información sobre las condiciones y tipos de secuencias de ADN cortadas por enzimas de restricción específicas, incluyendo New England BioLabs, Pro-Mega Biochems, Boehringer-Mannheim, y similares. Sambrook y col. (véase, Sambrook et al. Molecular Biology: A Laboratory Approach, Coid Spring Harbor, N.Y. 1989) proporcionan una descripción general de métodos para usar enzimas de restricción y otras enzimas.
La téenica MCA es un método que se puede usar para cribar patrones de metilación alterados en ADN genómico, y para aislar secuencias específicas asociadas con estos cambios (Toyota et al, 1999, Cáncer Res.59, 2307-2312, patente en EE UU No. 7.700.324 (Issa et al.) cuyos contenidos se incorpora en el presente documento mediante referencia en su totalidad). Brevemente, se usan enzimas de restricción con diferentes sensibilidades a metilación en citosina en sus sitios de reconocimiento para digerir ADN genómico de tumores primarios, líneas celulares y tejidos normales antes de amplificación por PCR con cebadores arbitrarios. Los fragmentos que muestran metilación diferencial se clonan y secuencian después de resolver los productos de PCR en geles de poliacrilamida de alta resolución. Los fragmentos clonados se usan después como sondas para análisis de tipo Southern para confirmar la metilación diferencial de estas regiones. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit basado en MCA típico) para análisis MCA pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para cebado arbitrario de ADN genómico; tampones y nucleótidos de PCR, enzimas de restricción y tampones apropiados; oligos o sondas de hibridación de genes; oligos o sondas para hibridación control.
En otra forma de realización, el estado de metilación de sitios CpG seleccionados se determina usando fusión de alta resolución sensible a metilación (HRM). Recientemente, Wojdacz y col describieron la fusión de alta resolución sensible a metilación como un téenica para evaluar la metilación (Wojdacz y Dobrovic, 2007, Nuc. Acids Res.35(6) e41; Wojdacz et al. 2008, Nat. Prot.3(12) 1903-1908; Balic et al, 2009 J. Mol. Diagn. 11 102- 108; y publicación de patente en EE UU No. 2009/0155791 (Wojdacz et al), cuyos contenidos se incorporan en el presente documento mediante referencia en su totalidad). Una variedad de máquinas de PCR a tiempo real disponibles comercialmente tienen sistemas HRM incluyendo Roche LightCycler480, Corbett Research RotorGene6000 y Applied Biosystems 7500. También se puede combinar HRM con otras técnicas de amplificación tal como pirosecuenciación como describen Candiloro y col. (Candiloro et al, 2011, Epigenetics 6(4) 500-507). Se puede usar cualquiera de SEQ ID NO 1-353, o partes de las mismas, en un ensayo HRM.
En otra forma de realización, el estado de metilación del locus CpG seleccionado se determina usando un ensayo de extensión de cebador, incluyendo una reacción de amplificación por PCR optimizada que produce dianas amplificadas para análisis usando espectrometría de masas. El ensayo también se puede hacer en multiplex. La espectrometría de masas es un método particularmente eficaz para la detección de polinucleótidos asociados con los elementos reguladores diferencialmente metilados. La presencia de la secuencia polinucleotídica se verifica comparando la masa de la señal detectada con la masa esperada del polinucleótido de interés. La fuerza relativa de la señal, por ejemplo, pico de masa en un espectro, para una secuencia polinucleotídica particular indica la población relativa de un alelo especifico, lo que permite, por tanto, calcular la relación del alelo directamente a partir de los datos. Este método se describe en detalle en la publicación PCT No. WO 2005/012578A1 (Beaulieu et al.) que se incorpora en el presente documento mediante referencia en su totalidad. Para el análisis de metilación se puede adoptar el ensayo para que detecte cambios de secuencia C a T dependientes de metilación introducidos con bisulfito. Estos métodos son particularmente útiles para realizar reacciones de amplificación multiplexadas y reacciones de extensión de cebadores multiplexadas (por ejemplo, ensayos de extensión de masa de cebador homogénea multiplexada (hME)) en un único pocilio para aumentar adicionalmente el rendimiento y reducir el coste por reacción para reacciones de extensión de cebador.
Otros métodos para el análisis de metilación de ADN incluyen barrido genómico de marcas de restricción (RLGS, Costello et al, 2002, Meth. Mol Biol, 200, 53-70), análisis de diferencias representativas sensibles a metilación (MS-RDA, Ushijima y Yamashita, 2009, Methods Mol Biol 507, 117-130). Las téenicas de matrices de alto rendimiento comprensivas para metilación relativa (CHARM) se describen en el documento WO 2009/021141 (Feinberg e Irizarry). Las micromatrices de Roche® NimbleGen® incluyen inmunoprecipitación de cromatina en chip (ChIP-chip) o inmunoprecipitación de ADN metilado en chip (MeDIP-chip). Estas herramientas se han usado para una variedad de aplicaciones de cáncer incluyendo melanoma, cáncer de hígado y cáncer de pulmón (Koga et al, 2009, Genome Res., 19, 1462-1470; Acevedo et al, 2008, Cáncer Res., 68, 2641-2651; Rauch et al, 2008, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 105, 252-257). Otros han descrito conversión con bisulfito, hibridación con sonda candado, circularización, amplificación y secuenciación de la siguiente generación o multiplexada para detección de alto rendimiento de metilación (Deng et al, 2009, Nat. Biotechnol 27, 353-360; Ball et al, 2009, Nat. Biotechnol 27, 361-368; patente en EE UU No.7.611.869 (Fan)). Como una alternativa a la oxidación con bisulfito, Baycyt y col. han descrito oxidantes selectivos que oxidan 5-metilcitosina, sin reaccionar con timidina, que van seguidos por PCR o pirosecuenciación (documento WO 2009/049916 (Bayeyt et al.). Estas referencias para estas téenicas se incorporan en el presente documento mediante referencia en su totalidad.
Después de la reacción o separación del ácido nucleico de una manera especifica de metilación, el ácido nucleico se puede someter a análisis basado en secuencia. Además, una vez se ha determinado que una secuencia genómica de melanoma particular está hipermetilada o hipometilada comparada con el equivalente benigno, se puede determinar la cantidad de esta secuencia genómica. Posteriormente, esta cantidad se puede comparar a un valor control estándar y servir como una indicación para el melanoma. En muchos casos, es deseable amplificar una secuencia de ácido nucleico usando cualquiera de varios procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos que se conocen bien en la técnica. Específicamente, la amplificación de ácidos nucleicos es la síntesis química o enzimática de copias de ácido nucleico que contienen una secuencia que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que se amplifica (molde). Los métodos y kits de la invención pueden usar cualquier método de amplificación o detección de ácidos nucleicos que conoce el experto en la materia, tal como los descritos en las patentes en EE UU Nos. 5.525.462 (Takarada et al); 6.114.117 (Hepp et al); 6.127.120 (Graham et al); 6.344.317 (Urnovitz); 6.448.001 (Oku); 6.528.632 (Catanzariti et al); y publicación PCT No. WO 2005/111209 (Nakajima et al); todas ellas se incorporan en el presente documento mediante referencia en su totalidad.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos se amplifican por amplificación por PCR usando metodologías que conoce el experto en la materia. Sin embargo, el experto en la materia reconocerá que la amplificación se puede lograr por cualquier método conocido, tal como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación con Q-replicasa, amplificación por círculo rodante, amplificación por transcripción, replicación de secuencia autosostenida, amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA), cada una de la cuales proporciona suficiente amplificación. También se puede usar la teenología del ADN ramificado para demostrar cualitativamente la presencia de una secuencia de la tecnología, que representa un patrón de metilación particular, o para determinar cuantitativamente la cantidad de esta secuencia genómica particular en una muestra. Nolte revisa la amplificación de señal de ADN ramificado para la cuantificación directa de secuencias de ácidos nucleicos en muestras clínicas (Nolte, 1998, Adv. Clin. Chem.33:201-235).
El proceso de PCR se conoce bien en la técnica y por tanto no se describe en detalle en el presente documento. Para una revisión de los métodos y protocolos de PCR, véase, por ejemplo, Innis et al, eds., PCR Protocols, A Guide to Methods and Application, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.1990; patente en EE UU No.4.683.202 (Mullís); que se incorporan en el presente documento mediante referencia. Los reactivos y protocolos de PCR también están disponibles de vendedores comerciales, tales como Roche Molecular Systems. La PCR se puede llevar a cabo como un proceso automatizado con una enzima termoestable. En este proceso, la temperatura de la mezcla de reacción ciela a través de una región desnaturalizante, una región de hibridación de cebadores y una región de reacción de extensión, automáticamente. Las máquinas específicamente adaptadas para este fin están comercialmente disponibles.
Las secuencias amplificadas también se pueden medir usando reacciones de corte invasivas tales como la teenología Invader® (Zou et al, 2010, Association of Clinical Chemistry (AACC) presentación en póster el 28 de julio 2010, "Sensitive Quantification of Methylated Markers with a Novel ethylation Specific Technology", disponible en www.exactsciences.com; y la patente en EE UU No.7.011.944 (Prudent et al.) que se incorpora en el presente documento mediante referencia en su totalidad).
Las tecnologías de secuenciación de la siguiente generación adecuadas están ampliamente disponibles. Los ejemplos incluyen plataforma 454 Life Sciences (Roche, Branford, CT) (Margulies et al.2005 Nature, 437, 376-380); analizador genómico de Illumina, ensayo de metilación GoldenGate, o ensayo de metilación Infinium, es decir, Infinium HumanMethylation 27K BeadArray o matriz de metilación VeraCode GoldenGate (Illumina, San Diego, CA; Bibkova et al, 2006, Genome Res. 16, 383-393; patentes en EE UU Nos. 6.306.597 y 7.598.035 (Macevicz); 7.232.656 (Balasubramanian et al.)); o secuenciación de ADN por ligación, sistema SOLiD (Applied Biosystems/Life Technologies; patentes en EE UU Nos. 6.797.470, 7.083.917, 7.166.434, 7.320.865, 7.332.285, 7.364.858, y 7.429.453 (Barany et al); o la tecnología de secuenciación de ADN Helicos True Single Molecule (Harris et al, 2008 Science, 320, 106-109; patentes en EE UU Nos. 7.037.687 y 7.645.596 (Williams et al); 7.169.560 (Lapidus et al); 7.769.400 (Harris)), la molécula única, tecnología de tiempo real (SMRT™) de Pacific Biosciences, y secuenciación (Soni y Meller, 2007, Clin. Chem. 53, 1996-2001) que se incorporan en el presente documento mediante referencia en su totalidad. Estos sistemas permiten la secuenciación de muchas moléculas de ácidos nucleicos aisladas de una muestra a altos órdenes de multiplexado de una forma paralela. Cada una de estas plataformas permite la secuenciación de moléculas clonalmente expandidas o únicas sin amplificar de fragmentos de ácidos nucleicos. Ciertas plataformas implican, por ejemplo, (i) secuenciación por ligación de sondas modificadas con colorantes (incluyendo ligación cíclica y corte), (ii) pirosecuenciación, y (iii) secuenciación de moléculas únicas.
La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ácidos nucleicos basado en secuenciar por síntesis, que se basa en la detección de un pirofosfato liberado en la incorporación de nucleótidos. En general, la secuenciación por síntesis, implica sintetizar, un nucleótido cada vez, una hebra de ADN complementaria a la hebra cuya secuencia se busca. Se pueden inmovilizar ácidos nucleicos de estudio a un soporte sólido, hibridar con un cebador de secuenciación, incubar con ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5'-fosfosulfato y luciferina. Las soluciones de nucleótidos se añaden y eliminan secuencialmente. La incorporación correcta de un nucleótido libera un pirofosfato, que interacciona con ATP sulfurilasa y produce ATP en presencia de adenosina 5'-fosfosulfato, estimulando la reacción de luciferina, que produce una señal quimioluminiscente que permite la determinación de la secuencia. Las máquinas para la pirosecuenciación y los reactivos específicos de metilación están disponibles de Qiagen Inc. (Valencia, CA). Véase también, Tost y Gut, 2007, Nat. Prot.2 2265-2275. Un ejemplo de un sistema que puede usar un experto en la materia basado en la pirosecuenciación en general implica los siguientes pasos: ligar un ácido nucleico adaptador a un ácido nucleico de estudio e hibridar el ácido nucleico de estudio a una bola; amplificar una secuencia de nucleótidos en el ácido nucleico de estudio en una emulsión; separar las bolas usando un soporte sólido multipocillo de picolitros: y secuenciar las secuencias de nucleótidos amplificadas por la metodología de pirosecuenciación (por ejemplo, Nakano et al., 2003, J. Biotech. 102, 117-124). Se puede usar tal sistema para amplificar exponencialmente productos de amplificación generados por un proceso descrito en el presente documento, por ejemplo, ligando un ácido nucleico heterólogo al primer producto de amplificación generado por un proceso descrito en el presente documento.
En algunas formas de realización, la determinación del perfil de metilación en el primer método de la invención comprende determinar el estado de metilación de más de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 o 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750 o 1000 sitios CpG en una muestra de ADN. En un aspecto de esta forma de realización, el método de la invención se usa para determinar el estado de metilación desde 1 a 1000 sitios CpG, de 2 a 1000 sitios CpG, de 3 a 1000 sitios CpG, de 4 a 1000 sitios CpG, de 5 a 1000 sitios CpG, de 6 a 1000 sitios CpG, de 7 a 1000 sitios CpG, de 8 a 1000 sitios CpG, de 9 a 1000 sitios CpG, o de 10 a 1000 sitios CpG.
En un segundo paso, el primer método de la invención comprende comprar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario.
El tumor primario puede ser leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; carcinoma corticosuprarrenal; cánceres relacionados con sida; linfoa relacionado con sida; cáncer anal; cáncer de apéndice; astrocitomas; teratoide atípico/tumor rabdoide; carcinoma de células básales; cáncer de vejiga; glioma de tronco encefálico; tumor cerebral (incluyendo glioma de tronco encefálico, teratoide atipico/tumor rabdoide del sistema nervioso central, tumores embrionarios del sistema nervioso central, astrocitomas, craniofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores paranquimales pineales de diferenciación intermedia, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineoblastoma); cáncer de mama; tumores bronquiales; linfoma de Burkitt; cáncer de sitio primario desconocido; tumor carcinoide; carcinoma de sitio primario desconocido; teratoide atipico/tumor rabdoide del sistema nervioso central; tumores embrionarios del sistema nervioso central; cáncer cervical; cánceres de la infancia; cordoma; leucemia linfocitica crónica; leucemia mielógena crónica; trastornos mieloproliferativos crónicos; cáncer de colon; cáncer colorrectal; craniofaringioma; linfoma de células T cutáneo; tumores de las células de isletas del páncreas endocrino; cáncer endometrial; ependimoblastoma; ependimoma; cáncer esofágico; estesioneuroblastoma; sarcoma de Ewing; tumor de células germinales extracraneal; tumor de células germinales extragonadal; cáncer del conducto biliar extrahepático; cáncer de vesícula biliar; cáncer gástrico (estómago); tumor carcinoide gastrointestinal; tumor de células del estroma gastrointestinal; tumor del estroma gastrointestinal (GIST); tumor trofoblástico gestacional; glioma; leucemia de células pilosas; cáncer de cabeza y cuello; cáncer de corazón; linfoma de Hodgkin; cáncer hipofaríngeo; melanoma infraocular; tumores de células de isletas; sarcoma de Kaposi; cáncer de riñón; histiocitosis de células de Langehans; cáncer de laringe; cáncer de labio; cáncer de hígado; histiocitoma fibroso maligno; cáncer de huesos; meduloblastoma; meduloepitelioma; melanoma; carcinoma de células de Merkel; carcinoma de piel de células de Merkel; mesotelioma; cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto; cáncer de boca; síndromes neoplásicos endocrinos múltiples; mieloma múltiple; mieloraa múltiple/neoplasia de células plasmáticas; micosis fungoide; síndromes mielodisplásicos; neoplasias mieloproliferativas; cáncer de la cavidad nasal; cáncer nasofaríngeo; neuroblastoma; linfoma no de Hodgkin; cáncer de piel no melanoma; cáncer de pulmón no microcítico; cáncer oral; cáncer de la cavidad oral; cáncer orofaríngeo; osteosarcoma; otros tumores cerebrales y de la médula espinal; cáncer ovárico; cáncer epitelial ovárico; tumor ovárico de células germinales; tumor ovárico de bajo potencial maligno; cáncer pancreático; papilomatosis; cáncer de senos paranasales; cáncer paratiroideo; cáncer pélvico; cáncer de pene; cáncer faríngeo; tumores parenquimales pineales de diferenciación intermedia; pineoblastoma; tumor pituitario; neoplasia de células plasmáticas/ieloma múltiple; blastoma pleuropulmonar; linfoma primario del sistema nervioso central (SNC); cáncer de hígado hepatocelular primario; cáncer de próstata; cáncer rectal; cáncer renal; cáncer de células renales (riñón); cáncer de células renales; cáncer de aparato respiratorio; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer de las glándulas salivares; síndrome de Sezary; cáncer de pulmón microcítico; cáncer de intestino delgado; sarcoma de tejido blando; carcinoma de células escamosas; cáncer de cuello escamoso; cáncer de estómago (gástrico); tumores neutroectodérmicos primitivos supratentoriales; linfoma de células T; cáncer testicular; cáncer de garganta; carcinoma de timo; timoma; cáncer tiroideo; cáncer de células de transición; cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter; tumor trofoblástico; cáncer de uréter; cáncer uretral; cáncer uterino; sarcoma uterino; cáncer vaginal; cáncer vulval; macroglobulinemia de Waldenstrom; o tumor de Wilm. En algunas formas de realización, el cáncer comprende un cáncer gastrointestinal, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, cáncer de hígado, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), cáncer esofágico, cáncer pancreático o cáncer colorrectal.
En una forma de realización preferida, el tumor primario se selecciona del grupo que consiste en neoplasia linfoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioma, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de mama, una neoplasia mieloide, cáncer testicular, cáncer de estómago.
En una forma de realización preferida del primer método de la invención, se determina el perfil de metilación determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 1A o en la tabla IB y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de una neoplasia linfoide. En las siguientes tablas, se definen los sitios CpG usando el código GoldenGate que se puede ver como GEN_P/EXXX_R/F, en donde GEN es el nombre del gen, P/E indica si el sitio CpG está presente en el promotor o exón, XXX corresponde a la distancia en pares de bases del sitio CpG al sitio de inicio de la transcripción como se describe en la base de datos http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?org=human y R/F indica que el sitio está presente en la cadena directa o inversa de la molécula de ADN. El diseño de GoldenGate se hizo usando la versión 36.1 del genoma humano (o su equivalente UCSG hgl8).
Neoplasias Neoplasias linfoides linfoides Hiparmetilación C6I Hipómetilación (n:200) (n:54) DBC1_P351_R S DDR1_P332_R N NEFL_P209_R S BLK_P14_F N HTR1B_P222_F S LTA_P214_R N HS3ST2 E145 R S N0TCH4 P938 F N Neoplasias Neoplasias linfoides Hipermetilación linfoides CGI (n:200) Hipometilación (n:54) IGSF4_P86_R S RUNX3_P393_R S DLK1_E227_R S BLK_P668_R N SLC22A3_E122_R S PADI4_P1011_R N ISL1_P379_F S RUNX3_P247_F S MY0D1_E156_F S PLA2G2A_P528_F N DBC1_E204_F S HLA-DOB_E432_R N IGFBP3_P423_R S LCK_E28_F S S0X1_P294_F S DES_P1006_R N FAT_P279_R S PMP22_P975_F N MOS_E60_R S TMPRSS4_P552_F N SLIT2_P208_F S RHOH_P953_R N HS3ST2_P171_F S IL18BP_E285_F N PALM2-AKAP2_P420_R S KLK11_P103_R N CFTR_P372_R S RUNX3_E27_R N HTR1B_E232_R S BGN_P333_R N RAB32_P43_R S AOC3_P890_R N DI03_P674_F S LEFTY2_P561_F N NGFB_E353_F S CCL3_E53_R N CHGA_E52_F S IL12B_P1453_F S IGF2_E134_R S NOS2A_P288_R N SFRP1_P157_F S NAT2_P11_F N SFRP1_E398_R S E2F5_P516_R S FGFR2_P460_R S MPL_P657_F N PTGS2_P308_F S PTHR1_P258_F N SEMA3C_E49_R S PRSS1_E45_R N EYA4_P794_F S PLA2G2A_E268_F N GATA6_P726_F S CPA4_E20_F N CDH13_P88_F S PI3_P1394_R N CDH13_E102_F S TRIM29_P135_F N TFAP2C_E260_F S EPHXl_E152_F N TUSC3_E29_R S EPHX1_P1358_R N PITX2_E24_R S DLCl_P695_F N MLF1_E243_F S DSG1_P159_R N PLS3_E70_F S SFTPB_P689_R N WNT2_P217_F S IGF1_P933_F N FRZB_E186_R S CLDN4_P1120_R N EYA4_E277_F S IGFl_E394_F N HOXA9_E252_R S HLA-DPB1_P540_F N ISL1_E87_R S CSF1R_P73_F N HOXA9_P1141_R S AIM2_E208_F N FZD9 E458 F S IL1B P829 F N Neoplasias Neoplasias linfoides linfoides Hipermetilación CGI CGI (n:200) Hipómetilación (n:54) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Neoplasias Neoplasias linfoides linfoides Hipermetilación CGI CGI Hipómetilación (n:200) (n:54) NTRK2_P395_R S IPF1_P234_F s FGF3_P171_R s 1 HH_E186_F s ASCL1_P747_F s DES_E228_R s DCC_P177_F s SLIT2_E111_R s SOX2_P546_F s TPEF_seq_44_S88_R s ASCL2_P609_R s SOX17_P303_F s TNK1_P41_R s DCC_E53_R s NRG1_E74_F s AGTRl_P41_F s MAF_P826_R s 1 HH_P246_R s TMEFF2_P152_R s PRKCDBP_E206_F s IGFBP2_P306_F s C0L18A1_P365_R s TFAP2C_P765_F s RAB32_E31_R s CCKBR_P480_F s SLC5A8_P38_R s FOSL2_E384_R s EGFR_P260_R s EPHA7_E6_F s DAPK1_E46_R s PTGS2_P52_R s WT1_P853_F s PDGFRA_E125_F N NTSRl_P318_F s IGSF4_P454_F s CYP1B1_E83_R s RBP1_P426_R s PLXDC2_E337_F s WT1_E32_F s PALM2-AKAP2_P183_R s F2R P839 F s Neoplasias Neoplasias linfoides linfoides Hipermetilación CGI C6I Hipómetilación (n:200) (n:54) RASGRF1_E16_F S NOTCH3_P198_R s CEBPA_P706_F s EVI1_E47_R s HS3ST2_P546_F s LOX_P313_R s DAPK1_P345_R s CDH11_E102_R s ERG_E28_F s GRB10_E85_R s GATA6_P21_R s CCNA1_E7_F s EPHA5_P66_F s HOXB13_E21_F s NPY_E31_R s EPHB1_E202_R s IGFBP7_P297_F s C0L18A1_P494_R s NOTCH3_E403_F s TUSC3_P85_R s MT1A_P49_R s BMP2_E48_R s IGFBP1_E48_R s ERBB4_P255_F s IGFBP2_P353_R s CALCA_P75_F s ADCYAP1_P55_R s PAX6_P50_R s IGF2AS_E4_F s GABRB3_P92_F s RIPK4_P172_F s TWIST1_E117_R s ALK_E183_R s EPHA3_P106_R s TBX1_P885_R s PAX6_E129_F s RET_seq_53_S374_F s TWIST1_P355_R s GRB10_P260_F s BDNF_E19_R s CDH1 P45 F s Neoplasias linfoides Neoplasias linfoides Hipermetilación CGI CGI (n:200) Hipómetilación (n:54) EPHA5_E158_R S TRIP6_P1090_F S DIO3_P90_F S OPCML_E219_R S FGF5_P238_R S HRASLS_E72_R S ASCL1_E24_F S EPHA7_P205_R S H0XA11_E35_F S HLF_E192_F S IRAK3_P185_F S INHA_P1189_F S PYCARD_P150_F S MT1A_P600_F S LOX_P71_F S PDGFRA_P1429_F S FLT4_P180_R S GAS7_E148_F S DST_E31_F S TEK_E75_F N THBS1_E207_R S ROR2_E112_F S IGFBP1_P12_R S HIC2_P498_F S MMP2_E21_R S 1HH_P529_F S INHA_P1144_R S PROK2_P390_F S NRG1_P558_R S TGFBI_P173_F S FZD9_P175_F S MEST P62 R S Tabla 1A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en neoplasias linfoides (n:200). Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Neoplasias Neoplasias linfoides (hipermetilación) linfoides CGI (hipómetila (n:69) (n:27) IGSF4_P86_R S DDR1_P332_R N FAT_P279_R S LTA_P214_R N RAB32_P493_R S NOTCH4_P938_F N IGF2_E134_R S BLK_P668_R N FGFR2_P460_R S PLA2G2A_P528_F N PTGS2_P308_F S LCK_E28_F S SEMA3C_E49_R S DES_P1006_R N TFAP2C_E260_F S PMP22_P975_F N ONECUT2_E96_F S RHOH_P953_R N FAT_P973_R S IL18BP_E285_F N IMPACT_P234_R S BGN_P333_R N TJP1_P390_F S NAT2_P11_F N IGFBP3_E65_R S E2F5_P516_R S CDH11_P203_R S MPL_P657_F N CDHl_P52_R S PLA2G2A_E268_F N ETV1_P515_F S EPHX1_E152_F N EGFR_E295_R S EPHX1_P1358_R N NTRK2_P10_F S SFTPB_P689_R N CTSL_P81_F S IGF1_P933_F N RBP1_E158_F S IGF1_E394_F N FGFR2_P266_R S HLA-DPB1_P540_F N DAPK1_P10_F S CSF1R_P73_F N RET_seq_54_S260_F S IL1B_P829_F N TJP1_P326_R S GRB7_P160_R N ERBB4_P541_F S MMP9_E88_R N NTRK2_P395_R S KRT13_P676_F N SOX2_P546_F S SMARCB1 P220 R S TNK1_P41_R S MAF_P826_R S 1HH_P246_R S IGFBP2_P306_F S C0L18A1_P365_R S RAB32_E314_R S CCKBR_P480_F S EGFR_P260_R S EPHA7_E6_F S DAPK1_E46_R S PDGFRA_E125_F N IGSF4_P454_F S PLXDC2_E337_F S PALM2-AKAP2 P183 R S F2R_P839_F S CEBPA_P706_F S EVI1_E47_R S LOX P313R S DAPK1_P345_R S GRB10_E85_R S HOXB13_E21_F S NOTCH3_E403_F S MT1A_P49_R S BMP2_E48_R S IGFBP1__E48_R S ERBB4_P255_F s IGFBP2_P353_R s PAX6_P50_R s RIPK4_P172_F s PAX6_E129_F s GRB10__P260_F s CDH1_P45_F s HRASLS_E72_R s EPHA7_P205_R s HLF_E192_F s INHA_P1189_F s L0X_P71_F s PDGFRA_P1429_F s DST_E31_F s THBS1_E207_R s 1HH_P529_F s INHA_P1144_R s Tabla IB: Lista sitios CpG con hipermetilación e hipómetilación erencial espe ífica altamente especifica en neoplasias linfoides (n:200). Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 2A o en la tabla 2B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer de cabeza y cuello.
Cáncer de cabeza y Cáncer de cabeza y cuello cuello CGI (hipermetilación) (hipómetilación) (n:171) (n:20) LCN2_P141_R N MMP2_P303_R S PI3_P274_R N ERN1_P809_R S KRT13_P341_R N MT1A_P600_F S SLC22A18_P216_R N DLC1_E276_F N TMPRSS4_E83_F N RAB32_P493_R S LCN2_P86_R N ICAM1_P386_R S VAMP8_P2 1_F N JAK3_P156_R N KRT5_E196_R S RUNX3_P247_F S TRIP6_P1274_R S TNFSF8_E258_R N TRIM29_P261_F N HLA-DPA1_P28_R N DSG1_P159_R N RUNX3_P393_R S PENK_E26_F S 0SM_P188_F S LY6G6E_P45_R N MPO_P883_R N TRIP6_P1090_F S DLC1_P695_F N PSCA_P135_F N FANCE_P356_R S JAK3_P1075_R N RUNX3_E27_R N STAT5A_P704_R N SERPINA5_P156_F N MSTlR_E42_R S HLA-DPA1_P205_R N HLA-DOB_E432_R N TNFSF8_P184_F S EMR3_P39_R N DLC1 P88 R N NBL1_E205_R N NBL1_P24_F N ZIM3_P718_R N FGF1_P357_R N MAP3K8_P1036_F S TGFB3_E58_R N AATK_E63_R N SERPINB5_P19_R S MSH2_P1008_F S CREBBP_P712_R S MMP14_P13_F S GRB7_P160_R N SFN_E118_F S GLI2_E90_F N MST1R_P87_R S TNFRSF1A_P678_F N GLI2_P295_F S IL1RN_E42_F N BCR_P422_F S CXCL9_E268_R N FGF1 E5 F N FER_P581_F N SEPT9_P58_R S TRIM29_P135_F N SRC_P164_F N WEE1_P924_R N ALOX12_E85_R S KCNK4_E3_F S EGF_E339_F N S100A2_P1186_F N MOS_E60_R S CD9_P585_R S AATK_P519_R S H0XA5_E187_F S EPHA5_P66_F S PTPN6_P282_R N CLDN4_P1120_R N SNCG_P98_R S AATK_P709_R S HOXA9_E252_R S DHCR24_P652_R N CSF1R_P73_F N KRT5_P308_F N FRK_P36_F N EPHA2_P203_F S IL1RN_P93_R N IFNGR2_P377_R S RIPK3_P124_F N IL12B_P392_R N KLK11_P103_R N HS3ST2_E145_R S H0XA9_P1141_R S IGF1_E394_F N SLC14A1_P369_R N LEFTY2_P561_F N DDIT3_P1313_R S PADI4_P1158_R N H0XA11_P698_F S HOXB2_P99_F S FASTK_P598__R S TRIM29_E189_F S LIG3 P622 R N SNCG_E119_F N SPDEF_P6_R N SNCG_P53_F S CALCA_E174_R S AL0X12_P223_R S OGG1_E400_F S HS3ST2_P171_F S CEACAM1_P44_R N CALCA_P171_F S DBC1_E204_F S DES_P1006_R N DDR1_P332_R N NPR2_P1093_F S NID1_P677_F N GSTM2_P453_R N GRB7_E71_R N KCNK4_P171_R N HTR1B_E232_R S GFAP__P56_R N S0X1_P294_F S IL1A_E113_R N PITX2_E24_R S HOXA5_P479_F S PADI4_P1011_R N PLAT_E158_F N ASCL1_P747_F S HTR1B_P222_F S DSG1_E292_F N PRSS8_E134_R S AIM2_E208_F N CSF3_P309_R N CHI3L2_E10_F N SOX17_P303_F S RARA_P176_R N ZIM3_P451_R S DIO3_E230_R S DLK1_E227_R S ASB4_P391_F N SOX17_P287_R S CAPG_E228_F N CSFlR E26 F N ARHGDIB_P148_R N FZD9_E458_F S CYP2E1_P416_F N THBS2_P605_R N TAL1_P594_F S MMP14_P208_R N SEPT9_P374_F S FGFR4_P610_F N ZP3_P220_F N IGFBP5_P9_R S SEPT5_P441_F S SPARC_P195_F N S100A4_E315_F N PENK_P447_R S S100A2_E36_R N PTHR1_P258_F N TNFRSF10C_P7_F S CD9_P504_F S RAD50_P191_F S MYH11_P22_F S 1HH_E186_F S BMP4_P199_R S DCC_P471_R S PTPRH_E173_F N BCR_P346_F S EYA4_E277_F S SERPINEl_P519_F N PTK6_E50_F S TBX1_P885_R S ESR1_P151_R S CD81_P272_R S SEMA3A_P658_R N TGFBI_P173_F S HGF_E102_R N CTSL_P264_R S TNK1_P221_F S NOTCH3_P198_R S VAMP8_P114_F N EPHA2_P340_R N BAX_E281_R S CPA4 E20 F N CD82_P557_R S IGFBP3_P423_R S CTSD_P726_F S MY0D1_E156_F S SEPT5_P464_R S TPEF_seq_44_S88_R S CPA4 P1265 R N Tabla 2A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer de cabeza y cuello. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Cáncer de cabeza y Cáncer de cabeza cuello y cuello C6I (hipermetilación) (hipometilación) (n:97) (n:10) LCN2_P141_R N ERN1_P809_R S PI3_P274_R N MT1A_P600_F S KRT13_P341_R N DLC1_E276_F N SLC22A18_P216_R N RAB32_P493_R S TMPRSS4_E83_F N ICAM1_P386_R S VAMP8_P241_F N JAK3_P156_R N KRT5_E196_R S TNFSF8_E258_R N TRIP6_P1274_R S FANCE_P356_R S DSG1_P159_R N SERPINA5_P156_F N LY6G6E_P45_R N DLC1 P88 R N PSCA_P135_F N JAK3_P1075_R N MST1R_E42_R S HLA-DOB_E432_R N EMR3_P39_R N NBL1_E205_R N NBL1_P24_F N ZIM3_P718_R N FGF1_P357_R N AP3K8_P1036_F S AATK_E63_R N SERPINB5_P19_R S MSH2_P1008_F S CREBBP P712 R S MMP14_P13_F S GRB7_P160_R N SFN_E118_F S GLI2_E90_F N MST1R_P87_R S TNFRSF1A_P678_F N GLI2_P295_F S ILlRN_E42_F N CXCL9_E268_R N FGF1_E5_F N FER__P581_F N SEPT9_P58_R S TRIM29_P135_F N SRC_P164_F N WEE1_P924_R N EGF_E339_F N AATK_P519_R S CLDN4 P1120 R N CSF1R_P73_F N KRT5_P308_F N FRK_P36_F N EPHA2_P203_F S RIPK3_P124_F N IL12B_P392_R N KLKll_P103_R N IGF1E394 F N PADI4_P1158_R N HOXB2_P99_F S FASTK_P598_R S TRIM29_E189_F S LIG3_P622_R N SPDEF_P6_R N OGG1_E400_F S CEACAM1_P44_R N CALCA_P171_F S DES_P1006_R N NPR2_P1093_F S NID1_P677_F N KCNK4_P171_R N GFAP_P56_R N IL1A_E113_R N H0XA5_P479_F S PADI4_P1011_R N PLAT__E158_F N DSG1 E292 F N PRSS8_E134_R S AIM2_E208_F N CSF3_P309_R N ZIM3_P451_R S ASB4_P391_F N CAPG_E228_F N CSF1R_E26_F N CYP2E1_P416_F N THBS2_P605_R N MMP14_P208_R N FGFR4_P610_F N ZP3_P220_F N S100A4_E315_F N S100A2_E36_R N PTHRl_P258_F N RAD50_P191_F S PTPRH_E173_F N PTK6E50F S SEMA3A_P658_R N HGF_E102_R N CTSL__P264_R S TNK1_P221_F S VAMP8_P114_F N EPHA2_P340_R N CPA4__E20_F N CD82_P557__R S CTSD_P726_F S CPA4 P1265 R N Tabla 2B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica altamente especifica en cáncer de cabeza y cuello, Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 3A o en la tabla 3B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer pancreático.
Cáncer Cáncer pancreático (hipermetilación) (j pancreá (n:150) (hipóme (n:98) CDH13_E102_F S SERPINB5_P19_R S GAS7_E148_F S S100A2_P1186_F N TWIST1_E117_R S PI3_P274_R N CCNA1_P216_F S SFN_E118_F S SLIT2_P208_F S IAPP_E280_F N FLT3_E326_R S TRIM29_P135_F N CCNA1_E7_F S PTPRH_P255_F N NPY_P295_F S N0S2A_E117_R N GALR1_E52_F S CYP2E1_P416_F N WT1_E32_F S SFTPA1_E340_R N RASGRF1_E16_F S CREBBP_P712_R S SFRP1_E398_R S NDN_P1110_F N TPEF_seq_44_S88_R S TRI29_E189_F S MYODl_El56_F S CSF2_E248_R N NTRK3_P636_R S ITK_P114_F N MDRl_seq_42_S300_R S TRIM29_P261_F N DBC1_P351_R S TRIP6_P1090_F S EYA4_E277_F S IL1RN_E42_F N FGF8_P473_F S SEPT9_P58_R S HS3ST2_P171_F S GLI2_P295_F S S0X1_P294_F S TFF2_P178_F N CDH13_P88_F S CXCL9_E268_R N NTRK3_P752_F S TFF1_P180_R N SEZ6L_P249_F S MST1R_E42_R S NTRK3_E131_F S PI3_E107_F N DLK1_E227_R S GLI2_E90_F N H0XA9_Pl141_R S NBLl_P24_F N SOX17_P303_F S CSF2_P605_F N MYH11_P22_F S NOS3_P38_F N SOXl_P1018_R S TMPRSS4_P552_F N HIC2_P498_F S UGT1A1_P315_R N OS_E60_R S NID1_P677_F N IGFBP3_P423_R 1 NBL1_E205_R N ERG_E28_F S S100A2_E36_R N HS3ST2_E145_R S LCN2_P141_R N FLT1_P302_F S UGT1A1_E11_F N TBX1_P885_R S PRSS1_E45_R N TAL1_P594_F S IFNG_E293_F N S0X17_P287_R S NCL_P1102_F S HOXA9_E252_R S APBA2_P305_R N ADCYAP1 P398 F S SPI1 P929 F N _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Cáncer Cáncer pancreático pancreá (hipermetilación) CGI (n : 150) (hipóme (n : 98) NPY_E31_R S CTLA4_P1128_F N TFPI2_P152_R s GABRA5_P862_R N TFPI2_E141_F s GFAP_P56_R N PITX2_E24_R s MMP10_E136_R N DES_E228_R s KLK10_P268_R N ASCL1_E24_F s IL12B_P1453_F S GSTM2_E153_F s PADI4_P1011_R N NPY_P91_F s PWCR1_P357_F N FZD9_E458_F s AATK_E63_R N TIMP3_seq_7_S38_F s HLA-DOB_E432_R N NGFB_P13_F s IL1RN_P93_R N MMP2_P197_F s FRK_P36_F N DBC1_E204_F s EPHA2_P203_F S GSTM2_P109_R N SPP1_P647_F N CDH11_E102_R s PTHR1_P258_F N ADCYAP1_P455_R s BAX E281 R S C0L1A1_P5_F s TWIST1_P355_R s ATP10A_P147_F s FRZB_E186_R s SMO_P455_R s CALCA_E174_R s HCK_P858_F s PENK_E26_F s MMP2_E21_R s TIAM1_P117_F s TSP50_P137_F s PTCH2_P568_R s BMP3_E147_F s GUCY2D_E419_R s ASCL2_P609_R s GDF10_P95_R s CCND2_P887_F s GDF10_E39_F s FLT3_P302_F s IGFBP7_P297_F s SLC5A8_P38_R s FGF5_E16_F s CALCA_P75_F s POMC_P53_F s DCC E53 R s Cáncer Cáncer pancreático pancreá (hipermetilación) CGI (n:150) (hipóme (n:98) KIT_P405_F S ZIM2_P22_F S ASCL1_P747_F S TUSC3_P85_R S TMEFF1_P234_F S POMC_P400_R S POC_E254_F S FGF3_E198_R S BDNF_E19_R S EYA4_P508_F S ROR2_E112_F S SGCE_E149_F S HCK_P46_R S ADCYAP1_E163_R S TPEF_seq_44_S36_F S ADAMTS12_P250_R S H0XA5_E187_F S NRG1_E74_F S MCAM_P265_R S ER_seq_al_S60_F S MT1A_P600_F S GSTM1_P266_F S GSTM2_P453_R N EPHA5_P66_F S FAP4_P197_F N RET_P717_F N HIC2 P528 R S Tabla 3A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer pancreático. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Cáncer Cáncer pancreático (hipermetilación) CGI Pancre^ (hipóme (n:150) (n:98) FGF8_P473_F S CYP2E1_P416_F N SEZ6L_P249_F S CREBBP_P712_R S FLT1_P302_F S NDN_P1110_F N FLT1 P615 R S CSF2 E248 R N Cáncer Cáncer pancreático (hipermetilación) CGI pancreá (n:150) (hipome (n:98) SEZ6L_P299_F S SEPT9_P58_R S FLT1_E444_F S TFF1_P180_R N NEFL_E23_R S CSF2_P605_F N C0L1A2_P48_R S LCN2_P141_R N MYHl1_P236_R S UGT1A1_E11_F N MMP2_P197_F S NCL_P1102_F S C0L1A1_P5_F S SPI1_P929_F N SMO_P455_R S FGFR4_P610_F N PTCH2_P568_R S SEPT9_P374_F S GDF10_P95_R S MST1R_P87_R N GDF10_E39_F S SLC22A3_P634_F S POMC_P53_F S KIAAO125_E29_F N ZIM2_P22_F S SNCG_E119_F N TMEFF1_P234_F S GUCY2F_P255_F N POMC_E254_F S GML_P281_R N FGF3_E198_R S LIG3_P622_R N SGCE_E149_F S WNT8B_E487_F N ADCYAP1_E163_R S BMP4_P199_R S TPEF_seq_44_S36_F S GABRG3_E123_R N MCAM_P265_R S MAPK4_E273_R N RET_P717_F N FGF1_P357_R N HIC2 P528 R S AP0A1_P261_F N PWCR1_P811_F N CTLA4_P1128_F N GFAP_P56_R N KLK10_P268_R N PWCR1_P357_F N IL1RN_P93_R N FRK_P36_F N EPHA2_P203_F S Tabla 3B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial altamente especifica en cáncer pancreático, Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 4A o en la tabla 4B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer endometrial.
Cáncer Cáncer endometrial ndometri hipermetilación ómetilac (n:102) (n:22) PENK_E26_F S BLK_P14_F N DLK1_E227_R S IFNG_E293_F N S0X1_P294_F S MEST_P62_R S NEFL_P209_R S EMR3_E61_F N HTR1B_P222_F S PTHLH_E251_F N NPY_P295_F S NBL1_P24_F N CDH13__P88_F S SPP1_P647_F N CDH13_E102_F S CEACAM1_P44_R N HTR1B_E232_R S MST1R_E42_R S DCC_P471_R S NID1_P677_F N ADCYAP1_P455_R S PTHLH_P15_R N ADCYAP1_P398_F S MEST_P4_F S TPEF_seq_44_S88_R S PI3_E107_F N NPY_E31_R S PTPN6_P282_R N PENK_P447_R S PTPRH_E173_F N HS3ST2_E145_R S EMR3_P39_R N HS3ST2_P171__F S IL2_P607_R N CFTR_P372_R S CLDN4_P1120_R N DBC1E204 F S TRIP6_P1090_F S ASCL2_P360_F S ASB4_P52_R N MOS_E60_R S GFI1_P208_R S TERT_P360_R S TRIP6 P1274 R S EPHA5_E158_R S DBC1_P351_R S OPC L_E219_R S DI03_P674_F S DCC_P177_F S SOX1_P1018_R S THY1_P149_R S RASSF1_E116_F S ASCL1_P747_F S GSTM2_E153_F S SLC5A8_E60_R S MYODl E156 F S ISL1_E87_R S GUCY2D_E419_R S H0C?9 E252R S HCK_P858_F S ZNF215_P129_R S PRKCDBP_E206_F S SEPT9_P374_F S PLS3_E70_F S CD40_P372_R S TMEFF2_E94_R S CALCA_E174__R S GSTM1_P266_F S CYP1B1_E83_R S SPARC_P195_F N SLC22A3_E122_R S TMEFF2_P152_R S ISL1_P379_F S DIO3_P90_F S NTRK3_P752_F S RASSF1_P244_F S H0XA11_P698_F S AGTR1_P41_F S MLF1_E243_F S EYA4_E277_F S HLA-F_E402_F S NTRK3_P636_R S FLI1_E29_F S BDNFE19R S TJP2_P330_R S TSP50_P137_F S ISL1_P554_F S ABO_P312_F S STAT5A_E42_F N FGF2_P229_F S MFAP4_Pl0_R N MME E29_F S MDRl_seq_42_S300_R S MLH1_P381_F S GSTM2_P109_R N GSTM2_P453_R N NTSR1_P318_F S JAK3_E64_F S NRG1_P558_R S TUSC3_E29_R S ZNF215 P71 R S _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Tabla 4A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer endometrial. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Cáncer CGI Cáncer endometrial endomet (hipermetilación) CGI (hipóme (n:102) (n:22) HLA-F_E402_F S PTHLH_E251_F N ABO_P312_F S PTHLH_P15_R N MLH1_P381_F S IL2_P607_R N JAK3 E64 F S ASB4_P52_R N GFI1 P208 R S Tabla 4B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial altamente especifica en cáncer endometrial. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 5D o en la tabla 5B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer de colon. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Cáncer de colon Cáncer d (hipermetilación) CGI (hipómet (96) (3) AGTR1_P41_F S DBC1_E204_F S FLT3_E326_R S TBX1_P885_R S DLK1E227R S CDH13_P88_F S TPEF_seq_44_S88_R S ESR1_E298_R S NTRK3_E131_F S THY1_P149_R S NPY_P91_F S ER_seq_al_S60_F S ALK_E183_R S FGF5_E16_F S ALK_P28_F S TWIST1_P355_R S ADCYAP1_P398_F S ESR1_P151_R S SOX17_P287_R S IRAK3_P13_F S GABRB3_P92_F S S0X1_P294_F S H0XA5_E187_F S HTR1B E232 R S EPHA5_E158_R S CDH13_E102_F S MOS__E60_R S MY0D1_E156_F S CHFR_P501_F S EYA4_P508_F S HIC-l_seq_48_S103_R S CYP1B1_E83_R S KDR_P445_R S MYH11_P22_F S ADAMTS12_E52_R S NTRK3_P636_R S DCC_P471_R S TUSC3_E29_R S KDR_E79_F S CSPG2_E38_F S PENK_P447_R S HCK P858 F S Cáncer de colon Cánc (hipermetilación) CGI (hip (96) (3) ADCYAP1_P455_R S CSPG2_P82_R S NRG1_P558_R S IGF2AS_E4_F S GABRB3_E42_F S CCNA1_P216_F S SOX17_P303_F S CDH11_P354_R S FGF3_P171_R S GSTM2_P109_R N DBC1_P351_R S OPCML_E219_R S WT1_P853_F S C0L1A2_E299_F S TFPI2_E141_F S PDE1B_P263_R S IRAK3_E130_F S HS3ST2_P546_F S MMP2_P303_R S NEFL_P209_R S TIAM1_P117_F S TUSC3 P85 R S Tabla 5A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer de colon. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Cáncer de colon Cáncer de colon CGI (hipometilación) (hipermetilación) (3) (1) ALK_P28_F S NEU1_P745_F S CSPG2_E38_F S PDE1B_P263_R S Tabla 5B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial altamente especifica en cáncer de colon. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se definen en la tabla 6A o en la tabla 6B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer de próstata.
Cáncer de próstata Cáncer de (hipermetilación ) próstata (n:76) (hipómetil (n:4) GSTP1E322R S MEST P4F S GSTM2_E153_F S DLC1_P695_F N RARB_P60__F S MEST_P62_R S C0L18A1_P494_R S PTPN6_P282_R N PDGFRB P273 F S APC_P14_F S MFAP4_P10_R N SCGB3A1_E55_R S ALOX12_P223_R S POMC_P400_R S ALOX12_E85_R S GSTM2_P109_R N PDGFRB_E195_R N TJP2_P330_R S IGFBP7_P297_F S GSTP1_P74_F S GSTPl_seq_38_S153_R S RARA_P176_R N RARB_E114_F S NEU1_P745_F S ADAMTS12_E52_R S TRIP6_E33_F S SERPINE1_E189_R S SEPT9_P374_F S MFAP4_P197_F N ADAMTS12_P250_R S CFTR_P372_R S KIT_P367_R S PDGFRB_P343_F S TERT_P360_R S GSTM2_P453_R N CD40_P372_R S HFE E273 R S Cáncer de próstata Cáncer (hipermetilación ) prósta C6I (n:76) (hipom (n:4) RASSFl_E116_F S HHIP_E94_F s TBX1_P885_R s NOTCH4_E4_F N FGF2_P229_F s HDAC9_E38_F N SPARC_P195_F N CD9_P585_R S KIT_P405_F S APC_Ell7_R S RBP1_P426_R S HDAC9_P137_R N EYA4_E277_F S SERPINE1_P519_F N GADD45A_P737_R N NGFR_P355_F S C0L1A2_E299_F s PTGS2_P524_R s APC_P280_R s S PARC_E 50_R s SLC1A1_P369_R N SNCG_E119_F N CDKN1B_P1161_F N CSPG2_P82_R S PTCH2_E173_F S PYCARD_P150_F S CCND2_P887_F S KLK10_P268_R N TMEFF1_P626_R S TRIM29_P261_F N PYCARD_E87_F S PYCARD_P393_F N CCND2_P898_R S LEFTY2_P561_F N CHI3L2_E10_F N CD9_P504_F S VIM_P811_R S CDH13_E102_F S RARA_E128_R N IFNGR2_P377_R S TEK E75 F N Cáncer de próstata Cáncer de (hipermetilación ) próstata CGI (n:76) (hipómetil (n:4) SLC14A1_E295_F N SLC5A5 E60 F S Tabla 6A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial específica en cáncer de próstata. Islas CpG asociadas (CGI): Sí (S) o no (N). _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ T hipermetilación diferencial altamente especifica en cáncer de próstata. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 7A o en la tabla 7B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un glioma.
Glioma Glioma hipermetilación CGI hipometilac (n:66) (n:64) FZD9_E458_F S MPO_P883_R N H0XA11_P698_F S IL8_E118_R N TES_P182_F S NOTCH4_E4_F N HOXA9_E252_R S CASP10_P334_F N CD81_P272_R S SERPINE1_P519_F N HTR1B_E232_R S M P14_P13_F S TNFRSFl0A_P171_F S CCL3_E53_R N TNFRSF10A_P91_F S CASP10_P186_F N HOXA9_P1141_R S S100A2_E36_R N TES_E172_F S HLA-DPA1_P205_R N TALl_P594_F S MMP9_P189_F N HTR1B_P222_F S JAK3_P1075_R N FLT3_E326_R S TRIP6_P1090_F S AHR_P166_R S PTHR1_P258_F N GATA6_P21_R S TRIP6_P1274_R S MEST_E150_F S PADI4_P1011_R N IRAK3_E130_F S MMP2_P303_R S PENK_E26_F S CSF3R_P8_F N MOS_E60_R S S100A2_P1186_F N NEFL_P209_R S SH3BP2_E18_F N H0XA11_E35_F S GSTM2_E153_F S NPY_P295_F S EMR3_P39_R N GATA6_P726_F S PSCA_E359_F N TNFRSF10D_E27_F S HDAC1_P414_R S DSC2_E90_F S CASP10_E139_F N HOXA5_E187_F S PRSS1_E45_R N DI03_P674_F S ALPL_P433_F S ALOX12 E85 R S RIPK3 P24 F N Glioma Glioma hipermetilación CGI hipómetilac (n:66) (n:64) ISL1_P379_F S EMR3_E61_F N TFAP2C_P765_F S RIPK3_P124_F N IRAK3_P13_F S TMPRSS4_P552_F N MEST_P62_R S HLA-DPA1_P28_R N IRAK3_P185_F S GFAP_P1214_F N PCTK1_E77_R S LEFTY2 P561_F N GFI1_P45_R S STAT5A_P704_R N NPY_E31_R S CD86_P3_F N DIO3_E230_R s TNFSF10_E53_F N DDIT3_P1313_R s NOS2A_P288_R N FLT3_P302_F s KLK11_P103_R N EST_P4_F s FGFR2_P460_R S IPF1_P750_F s SPDEF_P6_R N TUSC3_E29_R s STAT5A_E 2_F N BCR_P346_F s VAV1_P317_F N FZD9_P175_F s DSG1_P159_R N HOXA9_P303__F s FAS_P322_R N IPF1_P234_F s SPP1_E140_R N DNAJC15_P65_F s CHI3L2_E10_F N PALM2-AKAP2_P420_R s PGR_P790 F N MDRl_seq_42_S300_R s TNFSF8 P184_F S PRKCDBP_E206_F s TJP2_P518_F S AHR_E103_F s GSTM2_P453_R N RASSFl_E116_F s ITK__P114_F N MY0D1_E156__F s CPA4_E20_F N DSP_P36_F s PI3_P1394_R N ISL1_E87_R s MPO_E302_R N TAL1_E122_F s ACVR1_P983__F N ICA1_P72_R s GSTM2_P109_R N IGFBP1_P12_R s LTB4R_E64_R N RARA_P176_R N CCR5_P630_R N DIO3_P90_F s KRT1_P798_R N WRN_P969_F s AOC3_P890_R N PENK P447 R s IL10_P85_F N TERT_P360_R s SPI1_E205_F S SOX17_P287_R s IFNG E293 F N SFRP1_P157_F s WT1_P853_F s Tabla 7A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en glioma. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Glioma Glioma (hipermetilación) CGI (hipome (n:15) (p:29) TES_P182_F S IL8_E118_R N TNFRSF10A_P171_F S CASP10_P334_F N TNFRSF10A_P91_F S SERPINE1_P519_F N TES_E172_F S MMP14_P13_F S AHR_P166_R S CASP10_P186_F N MEST_E150_F S MMP9_P189_F N PCTK1_E77_R S SH3BP2_E18_F N GFI1_P45_R S GSTM2_E153_F S MEST_P4_F S CASP10_E139_F N DNAJC15P65 F S ALPL_P433_F S AHR_E103_F S RIPK3_P24_F N DSP_P36_F S GFAP_P1214_F N TAL1_E122_F S STAT5A_P704_R N ICA1_P72_R S CD86_P3_F N WRN _P969_F S TNFSF10_E53_F N FGFR2_P460_R S SPDEF_P6_R N STAT5A_E42_F N VAV1_P317_F N FAS_P322_R N SPP1_E140_R N CHI3L2_E10_F N TJP2_P518_F N GSTM2_P453_R N ACVR1_P983_F N GSTM2_P109_R N LTB4R_E64_R N IL10_P85__F N SPI1_E205_F S Tabla 7B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial altamente especifica en glioma. Islas CpG asociadas (CGI): Sí (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 8A o en la tabla 8B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer ovárico.
Cáncer ovárico Cáncer ovárico hipermetilación CGI hipómetilación (n:40) (n:16) CFTR_P372_R S MEST_P4_F S HCK_P858_F S PI3_E107_F N MOS_E60_R S NBL1_P24_F N HOXA9_E252_R S PTPN6_P282_R N TAL1_P594_F S WEE1_P924_R N DI03 P674 F S S100A2 P1186F N PENK__E26__F S NID1_P677_F N S0X1_P294_F S CTLA4_E176_R N LEFTY2_P561_F N GLI2_E90_F N CALCA_E174_R S MST1R_E42_R S THY1_P149_R S GPATC3_P410_R N H0XA11_P698_F S TRI29_E189_F S ALOX12_P223_R S GLI2_P295_F S DIO3_P90_F S EMR3_E61_F N GLI3_P453_R S MSH2_P1008_F S ATP10A_P147_F S IFNG E293 F N ASCL1_P747_F S MFAP4_P10_R N HS3ST2_E145_R S ALOX12_E85_R S DCC_E53_R S HS3ST2_P171_F S FRZB_E186_R S THY1_P20_R S TNFRSF10C_P7_F S HOXA9_P303_F S DDR2_P743_R N RASSF1_P244_F S DBC1_P351_R S MFAP4_P197_F N ZNF215_P71_R S EPHA5_P66_F S HCK P46_R S MMP2_P303_R S CYP1B1_E83_R S PITX2_E24_R S ZNF215 P129_R S TSP50 P137 F S Cáncer ovárico Cáncer hipermetilación CGI hipómet (n:40) (n:16) SEPT9_P374_F S SEPT5__P441_F S Tabla 8A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer ovárico. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Cáncer ovárico * Cáncer ovár CGI (n:3) (n:4) GLI3_P453_R S WEE1_P924_R N THY1_P20_R S CTLA4_E176_R N DDR2 P743 R N GPATC3_P410_R N MSH2 P1008 F S Tabla 8B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial altamente especifica en cáncer ovárico. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se definen en la tabla 9A o en la tabla 9B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer de pulmón.
Cáncer de pulmón Cáncer de pulmón hipermetilación (n CGI hipometilación 39) (n: 1) HOXA9_E252_R S SPI1_P48_F N MOS_E60_R S HS3ST2_E145_R S EYA4_P794_F S TAL1_P594_F S STAT5A_E42_F N HOXA9_P1141_R S TPEF_seq_44_S88__R S Cáncer de pulmón Cáncer hipermetilación (n: CGI hipómet 39) (n: 1) FZD9_E458_F S DIO3_P90_F S FRZB__E186_R S HCK_P858_F S DLKl_E227_R S JAK3_P156_R N NOTCH4_E4_F N ASCL2_P609_R S H0XA11_P698_F S SOX17_P287_R S PENK_E26_F S HS3ST2_P171_F S HTR1B_E232_R S GP1BB P278R S S0X1_P294_F S P0MC_P400_R S CFTR_P372_R S FGF2_P229_F S CDH13_P88_F S RBP1_P426_R S CALCA_E174_R S CSPG2_P82_JR S APC_P14_F S ZNF215_P71_R S CHGA_E52_F S H0XB13_P17_R S C0L1A2_E299_F S TJP2_P518__F S GAS7_E148_F S TBX1_P885_R S GSTM2 E153 F S Tabla 9A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer de pulmón. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N). _ _ _ Tabla 9B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial altamente especifica en cáncer de pulmón. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 10A o en la tabla 10B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer de vejiga.
Cáncer de vejiga Cáncer de vejiga hipermetilación CGI hipometilación CGI (n:36) (n:80) HOXA9_E252__R S TRIM29_P261_F N H0XA11_P698_F S PI3_E107_F N TJP2_P330_R S CEACAM1_P44_R N TJP2_P518_F S IFNGE293 F N PENK_E26_F S NOS2A_E117_R N CYP1B1_E83_R S NOS3_P38_F N WT1_P853_F S PSCA_P135_F N TAL1_P594_F S PTPRH_P255_F N DLK1_E227_R S TMPRSS4_E83_F N SLIT2_P208_F S SRC_E100_R N HOXA9_P303_F S CDH17_P376_F N FLT3_E326_R S AATK_E63_R N SOX17P287 R S THBS2P605R N PENK_P447_R S CDH17_E31_F N NPY_E31_R S KRT5_E196_R S NPY_P295_F S P2RX7 P597_F N SOXl_P294_F S IL1RN_E42_F N CDH11_P354__R S AIM2_P624_F N TPEF_seq_44_S88_R S NBL1_P24_F N MY0D1_E156__F S PI3_P274_R N HOXA11_E35_F S NID1_P677_F N LEFTY2 P561F N SERPINB5_P19_R S GST 1_P266__F S S100A2_P1186_F N SLIT2 Elll R S SLC14A1 E295 F N Cáncer de vejiga Cáncer de vejiga hipermetilación C6I hipometilación C6I (n:36) _ (n:80) HS3ST2_E145_R S CLDN4_P1120_R N GSTM1_P363_F S EMR3_E61_F N TERT_P360_R S PTPRH_E173_F N HS3ST2_P171_F S BCR_P422_F S PITX2_E24_R S TRIM29_P135_F N TERT_E20_F S EMR3_P39_R N NPR2_P618_F S VAMP8_P114_F N NEFL_P209_R S MST1R_E42_R S ISLl_P554_F S PTPN6_P282_R N TWIST1_P355_R S TRPM5_P979_F N HIC-l__seq_48_S103_R S IGFBP1_P12_R S S0X1 P1018 R S VAMP8_E7_F N SFN_E118_F S TFF2_P178_F N IGFBP1_E48_R S EDNRB_P709_R N GPR116_E328_R N CXCL9_E268_R N VAMP8_P241_F N UGT1A1_P315_R N PGR_P790_F N GLI2_P295_F S CASP8_E474_F N GABRA5_P862_R N TRIP6_P1090_F S AIM2_E208_F N NID1_P714_R N HDAC1_P414_R S TIMP1_P615_R N BRCA1_P835_R S PTK6_E50_F S ARHGDIB_P148_R N PRSS8_E134_R S VAVl_E9_F S KRT13_P341_R N OSM_P188_F S GABRA5_P1016_F N RIPK3P124F N TRIM29_E189_F S CSF1R_E26_F N JAK3_P1075_R N NBL1 E205 R N Cáncer de vejiga Cáncer de vejiga hipermetilación CGI hipometilación C6I (n:36) (n:80) LCN2_P86_R N MMP19_E274_R N GLI2_E90_F N ZP3P220F N MP10_E136_R N HPN_P823__F N AFF3_P122_F N SRC_P164_F N PADI4_E24_F N CAPG_E228_F N MAPK10_E26_F N SFTPA1_E340_R N PSCA_E359_F N APBA2 P305R N Tabla 10A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer de vejiga. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Cáncer de vejiga Cáncer de veji (hipermetilación) CGI (hipometilació (n:2) (n:27) TERT_E20_F S TMPRSS4_E83_F N NPR2_P618_F S SRC_E100_R N CDH17 P376F N THBS2_P605_R N CDH17_E31_F N KRT5_E196_R S P2RX7_P597_F N AIM2_P624_F N SLC14Al_E295_F N BCR_P422_F S VAMP8_P114_F N TRPM5_P979_F N IGFBP1_P12_R S VAMP8_E7_F N IGFBP1_E48_R S EDNRB_P709_R N GPR116_E328__R N NIDl_P714_R N TIMP1_P615_R N ARHGDIB P148 R N KRT13_P341_R N GABRA5_P1016_F N CSF1R_E26_F N MMP19_E274_R N HPN_P823_F N PADI4_E24_F N MAPK10 E26 F N Tabla 10B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer de vejiga. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 11A o en la tabla 11B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un melanoma.
Melanoma Melanoma hipermetilación CGI hipometil (n:28) (n:5) ALOX12_P223_R S EVI2A_P94_R N ALOX12_E85_R S IFNG_E293_F N MET_E333_F S PI3_P1394_R N SNCG_Ell9_F N TNFSF8_P184_F S GRB7 E71_R N VAV1 E9 F S AATK P709R S DDR1_P332_R N DHCR24_P652_R N SNCG_P53_F S RARA P176_R N IL1RN_P93_R N TGFB3_E58_R N TNFRSF10D_E27_F S STAT5A_P704_R N C0L1A2_P407_R N POMC_P400_R S IGFBP5_P9_R S SNCG_P98_R S BMP4_P123__R S CYP1B1 E83 R S Melanoma Melanom hipermetilación CGI hipómet (n:28) (n:5) KCNK4_E3_F S IL17RB_P788_R S IL6_E168_F N BMP4P199R S S100A2_P1186_F N FRZB_E186_R S TRIP6_P1090_F S LCN2_P86_R N Tabla 11A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en melanoma.
Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N) Melanoma Melanoma (hipermetilación) CGI (hipermetilación) CGI (n:4) (n:1) MET__E333_F S EVI2A P94 R N COL1A2_P407_R N IL17RB_P788_R S IL6 El68 F N Tabla 11B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial altamente especifica en melanoma. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 12A o en la tabla 12B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de cáncer de mama.
Cáncer de mama Cáncer de mama (hipometilación) CGI (hipometilación) CGI (n:18) (n:l) CFTR_P372_R S PI3_E107_F N HOXA9_E252_R S RBP1_P426_R S TNFRSF10D E27 F S Cáncer de mama Cáncer de mama (hipómetilación) CGI (hipóme ilación) CGI (n:18) (n:l) MME_E29_F S TSP50_P137_F S TERT_P360_R S APC_P14_F S GSTP1_E322_R S RASSF1_E116_F S S0X1_P294_F S SOX17_P287_R S MOS_E60_R S CDH13_P88_F S APC_E117_R S BMP4_P123_R ’ S IRAK3_P185_F S IGFBP3 P423 R S Tabla 12A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer de mama. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 13A o en la tabla 13B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de una neoplasia mieloide.
Neoplasias Neoplasias mieloides mieloides hipermetilación CGI hipometilac (n:15) (n:2) FOSL2_E384_R S TRIP6_P1274_R S PTPN6_P282_R N LM02_E148_F N FZD9_E458_F S HS3ST2_E145_R S DBC1_P351_R S HIC-l_seq_48_S103_R S EPHB1_E202_R S MOS E60 R S DBC1_E204_F S MY0D1_E156_F S BAX_E281_R S CFTR_P372_R S DI03_P674_F S CDH11_P354_R S IGSF4C E65 F S Tabla 13A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en neoplasias mieloides. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Neoplasias CGI Neoplasias mieloides mieloides ( (n:1) IGSF4C_E65_F S LM02_E148_F N Tabla 13B: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en neoplasias mieloides. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 14A o en la tabla 14B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer testicular Cáncer testicular hipermetilación (n:10)_ BCR_P346_F S SEPT5_P464_R S GSTM1_P363_F S IPF1_P750_F S BCR_P422_F S HOXA5_E187_F S TBX1_P520_F N HIC-l_seq_48_S103_R S ARHGDIB_P148_R N GPATC3_P410_R N Tabla 14A: Lista de sitios CpG con hipermetilación diferencial especifica en cáncer testicular (n:10). Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Cáncer de Cáncer de testículo testículo (hipermetilación) CGI CGI (hipómetilación) (n:2) (n:1) TBX1_P520_F N H19_P1411_R S GPATC3_P410_R N Tabla 14A: Lista de sitios CpG con hipermetilación diferencial altamente específica en cáncer testicular (n:10). Islas CpG asociadas (CGI): Sí (S) o no (N).
En otra forma de realización del primer método de la invención, el perfil de metilación se determina determinando el estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en la tabla 15A o en la tabla 15B y el perfil de metilación resultante se compara con el perfil de metilación en los mismos sitios CpG en una muestra de ADN de un cáncer de estómago.
Cáncer de Cáncer de estómago estómago CGI hipermetilación (n:7) hipometila (n:2) GAS7_E148_F S TNFSF8_P184_F S TGFB3_E58_R N CSF3R_P8_F N SFRP1_P157_F S S0X1_P294_F S MDRl_seq_42_S300_R S HS3ST2_E145_R S CCKAR P270 F N Tabla 15A: Lista de sitios CpG con hipermetilación e hipometilación diferencial especifica en cáncer de estómago. Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Cáncer de estómago (hipermetilación) (n:l)_ CCKAR_P270_F N Tabla 15B: Lista de sitios CpG con hipermetilación diferencial altamente especifica en cáncer de estómago (n:l).
Islas CpG asociadas (CGI): Si (S) o no (N).
Una vez que se han comparado el perfil de metilación del CPD y de uno o más tumores primarios, el CPD se identifica como que deriva de un tumor primario determinado en donde se encuentra una identidad sustancial entre el perfil de metilación obtenido en el paso (i) y el perfil de metilación de dicho tumor primario. Se entenderá que el perfil de metilación del CPD se puede comparar con el perfil de metilación de los tumores primarios de una manera recursiva o secuencial (el perfil de metilación de CPD se compara con el perfil de metilación de un primer tumor primario y si no se encuentra identidad sustancial, entonces el perfil de metilación del CPD se compara con el perfil de metilación de un segundo tumor primario y asi consecutivamente hasta que se encuentra un tumor primario cuyo perfil de metilación muestra una identidad sustancial con el perfil de metilación de CPD). De forma alternativa, el perfil de metilación de CPD se puede comparar con todas las entradas en un conjunto de datos de perfiles de metilación de una colección de tumores primarios, y seleccionar el tumor primario que muestra un perfil de metilación que muestra una identidad sustancial con el perfil de metilación del CPD.
La comparación de los perfiles de metilación y la correlación entre la identidad de los perfiles y la determinación del origen del CPD se puede hacer usando cualquier método matemático apropiado del estado de la téenica. Los métodos matemáticos bien conocidos para establecer correlaciones entre conjuntos de datos emplean métodos como análisis discriminante (AD) (por ejemplo, AD lineal, cuadrático, regularizado), análisis funcional discriminante (AFD), métodos de núcleo (por ejemplo, SVM), escalado multidimensional (EMD), métodos no paramétricos (por ejemplo, clasificadores de los k vecinos más próximos), MCP (mínimos cuadrados parciales), métodos de árbol (por ejemplo, regresión lógica, CART, métodos de bosques aleatorios, métodos de boosting/bagging), modelos lineales generalizados (por ejemplo, regresión logística), métodos basados en componentes principales (por ejemplo, SIMCA). Modelos aditivos generalizados, métodos basados en lógica difusa, redes neurales y métodos basados en algoritmos genéticos. El experto en la materia no tendrá problemas en seleccionar un método apropiado para evaluar una combinación de biomarcadores de la presente invención. En una forma de realización, el método usado en correlacionar una combinación de biomarcadores de la presente invención, por ejemplo, para diagnosticar una lesión cerebral, se selecciona de AD (por ejemplo, análisis discriminante lineal, cuadrático, regularizado), AFD, métodos de núcleo (por ejemplo, SVM), EMD, métodos no paramétricos (por ejemplo, clasificadores de los k vecinos más próximos), MCP (mínimos cuadrados parciales), métodos de árbol (por ejemplo, regresión lógica, CART, métodos de bosques aleatorios, métodos de boosting), o modelos lineales generalizados (por ejemplo, regresión logística) y análisis de componentes principales.
Los detalles referidos a estos métodos estadísticos se encuentran en las siguientes referencias: Ruczinski et al.,12 J. OF COMPUTATIONAL AND GRAPHICAL STATISTICS 475-511 (2003); Friedman, J. FL, 84 J. OF THE AMERICAN STATISTICAL ASSOCIATION 165-75 (1989); Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome, The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001); Breiman, L., Friedman, J. FL, Olshen, R. A., Stone, C. J. Classification and regression trees, California: Wadsworth (1984); Breiman, L., 45 MACHINE LEARNING 5-32 (2001); Pepe, M. S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003); y Duda, R. O., Hart, P. E., Stork, D. G., Pattern Classification, Wilcy Interscience, 2a Edición (2001).
Como entenderán los expertos en la materia, la determinación del origen del CPD usando el método de la invención, aunque se prefiere que sea, no necesita ser correcta para el 100% de los CPD que se van a diagnosticar o evaluar. Sin embargo, el término, requiere que una parte estadísticamente significativa de los CPD se puedan identificar correctamente. Si la determinación del origen de un CPD es estadísticamente significativa lo puede determinar sin más el experto en la materia usando herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, índices de clasificación con validación cruzada, y similares. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wilcy & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95%, Los valores de p son, preferiblemente, 0,01, 0,005 o menores.
El rendimiento del método según la invención para la identificación del origen de un CPD típicamente se evalúa usando medidas estadísticas. El rendimiento de la caracterización se puede evaluar midiendo la sensibilidad, especificidad y medidas relacionadas. Un verdadero positivo es un sujeto con una característica, por ejemplo, una enfermedad o trastorno, correctamente identificado como que tiene la característica. Un falso positivo es un sujeto sin la característica que la prueba incorrectamente identifica como que tiene la característica. Un verdadero negativo es un sujeto sin la característica que la prueba identifica correctamente como que no tiene la característica. Un falso negativo es una persona con la característica que la prueba identifica incorrectamente como que no tiene la característica. La capacidad de la prueba de distinguir entre estas clases proporciona una medida del rendimiento de la prueba.
La especificidad de una prueba se define como el número de verdaderos negativos dividido por el número de negativos reales (es decir, la suma de verdaderos negativos y falsos positivos). La especificidad es una medida de cuántos sujetos se identifican correctamente como negativos. Una especificidad del 100 por cien significa que la prueba reconoce todos los negativos reales -por ejemplo, todas las personas sanas serán reconocidas como sanas. Una especificidad menor indica que más negativos serán determinados como positivos.
La sensibilidad de una prueba se define como el número de verdaderos positivos dividido por el número de positivos reales (es decir, la suma de verdaderos positivos y falsos negativos). La especificidad es una medida de cuantos sujetos se identifican correctamente como positivos. Una sensibilidad del 100 por cien significa que la prueba reconoce todos los positivos reales -por ejemplo, todas las personas enfermas serán reconocidas como enfermas. Una sensibilidad menor indica que más positivos se pasarán por alto al ser determinados como negativos.
La precisión de una prueba se define como el número de verdaderos positivos y verdaderos negativos dividido por la suma de todos los positivos verdaderos y falsos y todos los negativos verdaderos y falsos. Proporciona un número que combina medidas de sensibilidad y especificidad.
El método según la presente invención se puede usar para caracterizar el origen de un CPD con al menos el 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, o 70 por ciento de sensibilidad, tal como al menos el 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, o 87 por ciento de sensibilidad. En algunas formas de realización, el fenotipo se caracteriza con al menos el 87,1, 87.2, 87,3, 87,4, 87,5, 87,6, 87,7, 87,8, 87,9, 88,0, o 89 por ciento de sensibilidad, tal como al menos el 90 por ciento de sensibilidad. El fenotipo se puede caracterizar con al menos el 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por cien de sensibilidad.
El método según la presente invención se puede usar para caracterizar el origen de un CPD con al menos el 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, o 97 por cien de especificidad, tal como al menos el 97,1, 97,2, 97.3, 97,4, 97,5, 97,6, 97,7, 97,8, 97,8, 97,9, 98,0, 98,1, 98,2, 98,3, 98,4, 98,5, 98,6, 98,7, 98,8, 98,9, 99,0, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 o 100 por cien de especificidad.
En otra forma de realización, el método de la invención comprende además la determinación en el CPD del estado de metilación de sitios CpG que son indicativos de un quimiosensibilidad a diferentes fármacos. Esto permitiría no solo la identificación del origen del CPD sino también decidir sobre las estrategias terapéuticas para el CPD. Los sitios CpG adecuados que se pueden usar según la presente invención incluyen, sin limitación, MGMT-temodal/dacarbazina (Esteller, New England Journal of Medicine 2000; Oaz et al., Clin Cáncer Res 2004, etc.), WRN-irinotecano/topotecano (Agrelo et al., Proc Nati Acad Sci USA 2006) y BRCA1-oxaliplatino/cisplatino/inhibidores de PARP (Veeck et al., Journal of Clinical Oncology 2010).
Métodos para seleccionar una terapia para un cáncer de origen primario desconocido (CPD) Los métodos divulgados en la presente invención son útiles para determinar el origen de un CPD. Puesto que los CPD se atacan terapéuticamente usando una terapia que se usa para el tumor primario, la identificación del origen del CPD permitirá el diseño de terapias específicas para el CPD basándose en la naturaleza del tumor primario.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para seleccionar una terapia para un cáncer de origen primario desconocido (CPD) (en adelante segundo método de la invención) que comprende los pasos de: (i) determinar el perfil de metilación en una región seleccionada de un ADN aislado de dicho CPD y (ii) comparar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario en donde una identidad sustancial entre el perfil de metilación obtenido en (i) y el perfil de metilación del tumor primario es indicativo de que el CPD se debe tratar con una terapia que es adecuada para dicho tumor primario.
Los pasos (i) y (ii) se llevan a cabo esencialmente como se describe en el primer método de la invención.
En una forma de realización preferida, el tumor primario se selecciona del grupo que consiste en una neoplasia linfoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioma, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de mama, una neoplasia mieloide, cáncer testicular, cáncer de estómago.
En una forma de realización preferida, la determinación del perfil de metilación según el segundo método de la invención comprende la determinación del estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en las tablas 1 a 15 en donde (i) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 1A o en la tabla IB se compara con el estado de metilación de una neoplasia linfoide, (ii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 2A o 2B se compara con el estado de metilación de un cáncer de cabeza y cuello, (iii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 3A o 3B se compara con el estado de metilación de un cáncer pancreático, (iv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 4A o 4B se compara con el estado de metilación de de un cáncer endometrial, (v) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 5A o 5B se compara con el estado de metilación de un cáncer de colon, (vi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 6A o 6B se compara con el estado de metilación de un cáncer de próstata, (vii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 7A o 7B se compara con el estado de metilación de un glioma, (viii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 8A o 8B se compara con el estado de metilación de un cáncer ovárico, (ix) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 9A o 9B se compara con el estado de metilación de un cáncer de pulmón, (x) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 10A o 10B se compara con el estado de metilación de de un cáncer de vejiga, (xi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 11A o 11B se compara con el estado de metilación de un melanoma, (xii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 12A se compara con el estado de metilación de un cáncer de mama, (xiii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 13A o 13B se compara con el estado de metilación de de una neoplasia mieloide, (xiv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 14A o 14B se compara con el estado de metilación de un cáncer testicular y/o (xv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 15A o 15B se compara con el estado de metilación de un cáncer de estómago.
Una vez el patrón de metilación del CPD se ha emparejado con el patrón de metilación de un cáncer primario, se selecciona una terapia que sea adecuada para dicho cáncer primario. Las terapias adecuadas se muestran en la tabla 16.
Tabla 16. Cánceres y tratamientos quiioterapéuticos de primera linea correspondientes.
El término "compuesto basado en platino", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto que contiene un átomo de platino capaz de unirse y entrecruzar ADN, induciendo la activación de la reparación de ADN y por último desencadenando apoptosis. Los compuestos basados en platino para el tratamiento del cáncer incluyen, sin limitación, carboplatino, cisplatino [cis- diaminodicloroplatino, (CDDP)], oxaliplatino, iproplatino, nedaplatino, tatranitrato de triplatino, tetraplatino, satraplatino (JM216), JM118 [cis-aminodicloro (II)], JM149 [cis-aminodicloro (ciclohexilamina) trans hidroxoplatino (IV)], JM335 [trans aminodicloro dihidroxo platino (IV)], transplatino, ZD0473, cis, trans, cis- Pt(NH3)(C6H11NH2)(OOCC3H7)2C1, malanato-1,2- diaminociclohexanoplatino(II), 5-sulfosalicilato-trans-(1,2- diaminociclohexano)platino(II) (SSP), poli-[(trans-1,2- diaminociclohexano)platino]-carboxiamilosa (POLY-PLAT) y 4- hidroxi-sulfonilfenilacetato(trans-1,2-diaminociclohexano) platino(II) (SAP) y similares. En una forma de realización particular del primer método de la invención, el compuesto basado en platino se selecciona de carboplatino, cisplatino y oxaliplatino; preferiblemente, es cisplatino. Cuando el sujeto padece cáncer de pulmón o cáncer de vejiga el tratamiento quimioterapéutico de primera linea se basa en compuestos basados en platino, preferiblemente cisplatino. Cuando el sujeto padece cáncer de ovario, particularmente cáncer epitelial de ovario, el tratamiento terapéutico de primera linea se basa en compuestos basados en platino.
"Antimetabolito", como se usa en el presente documento, se refiere en un sentido amplio, a sustancias que alteran el metabolismo normal y sustancias que inhiben el sistema de transferencia de electrones para prevenir la producción de intermedios ricos en energía, debido a sus similitudes estructurales o funcionales con metabolitos que son importantes para los organismos vivos (tales como vitaminas, coenzimas, aminoácidos y sacáridos). Los antimetabolitos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, antimetabolitos del ácido fólico (aminopterina, denopterina, metotrexato, edatrexato, trimetrexato, nolatrexed, lometrexol, pemetrexed, raltitrexed, piritrexim, pteropterina, leucovorina, 10-propargil-5,8-dideazafolato (PDDF, CB3717)), análogos de purina (cladribina, clofarabina, fludarabina, mercaptopurina, pentostatina, tioguanina) y análogos de pirimidina (capecitabina, citarabina o ara-C, decitabina, fluorouracilo, 5-fluorouracilo, doxifluridina, floxuridina y gemcitabina). En una forma de realización preferida el antimetabolito se selecciona de 5-fluorouracilo y gemcitabina. Cuando el sujeto padece cáncer de colon el tratamiento quimioterapéutico de primera línea son antimetabolitos, preferiblemente 5-fluorouracilo. Cuando el sujeto padece cáncer pancreático, cáncer de vejiga o cáncer de vesícula biliar el tratamiento quimioterapéutico de primera línea son antimetabolitos, preferiblemente gemcitabina. Cuando el sujeto padece cáncer hepatobiliar, el tratamiento quimioterapéutico de primera línea se basa en antimetabolitos, preferiblemente basado en fluoropiriidina. Ejemplos de fluoropirimidinas útiles en el tratamiento de cáncer hepatobiliar son 5-fluorouracilo, tegafur y capecitabina.
El término "citoquinas" se refiere a agentes inmunomoduladores, tales como interleuquinas e Ínterferones, que son polipéptidos secretados por células específicas del sistema inmune y que llevan señales localmente entre células. Las citoquinas adecuadas para su uso en la presente invención son, sin limitación, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interleuquina 2, interleuquina 12, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interleuquina 4 (IL-4), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 18 (IL-18) e interferón alfa 2b. En una forma de realización preferida la citoquina usada es interferón. Cuando el sujeto padece melanoma el tratamiento quimioterapéutico de primera línea en fase III son citoquinas, preferiblemente interferón.
El término "terapia hormonal" se refiere a la administración de un agente antitumoral que actúa principalmente interaccionando con (por ejemplo, interfiriendo con) una ruta hormonal que es específica o relativamente específica a tipo(s) de células particulares. Dicho tratamiento tiene como fin bloquear, inhibir o reducir el efecto de hormonas, específicamente bloquear el efecto de estrógenos o progesterona, o de forma alternativa, disminuir los niveles de estrógenos o progesterona, incluyendo terapia anti-estrógeno o anti-progesterona y terapia de ablación de estrógenos o progesterona. La terapia hormonal incluye, sin limitación, tamoxifeno, toremifeno, anastrozol, arzoxifeno, lasofoxifeno, raloxifeno, nafoxidina, fulvestrant, aminoglutetimida, testolactona, atamestano, exe estano, fadrozol, formestano, letrozol, goserelina, leuprorelina o leuprólido, buserelina, histrelina, megestrol y fluoximesterona. En una forma de realización preferida la terapia hormonal es terapia de privación de andrógenos. El término "terapia de privación de andrógenos" o "terapia de supresión de andrógenos" se refiere a tratamientos que reducen los niveles de las hormonas masculinas, andrógenos, en el cuerpo. La terapia de privación de andrógenos incluye, sin limitación, agonistas de GnRH tales como leuprólido, buserelina, goserelina e histrelina. Cuando el sujeto padece cáncer de próstata, el tratamiento quimioterapéutico de primera linea es terapia hormonal, preferiblemente terapia de privación de andrógenos. Cuando el sujeto padece de cáncer de mama, el tratamiento quimioterapéutico de primera linea es terapia hormonal sola o terapia hormonal combinada con mezclas citostáticas. El término "mezcla citostática", en el contexto de la presente invención y relacionado con el tratamiento de cáncer de mama, se refiere a una combinación de una antracielina, un fármaco alquilante de ADN y un antimetabolito. Ejemplos de "mezclas citostáticas", según la presente invención son, sin limitación FAC (adriamicina/ciclofosfamida/5-fluorouracilo), FEC (5-fluorouracilo/epirrubicina/ciclofosfamida) y CNF (ciclofosfamida/mitoxantrona/5-fluorouracilo). En una forma de realización preferida la mezcla citostática se selecciona de FAC, FEC y CNF.
El término "inhibidor mitótico" se refiere a compuestos que inhiben la mitosis o división celular desorganizando los microtúbulos. Ejemplos de inhibidores mitóticos incluyen, sin limitación, alcaloides de la vinca tales como vindesina, vincristina, vinblastina, vinorrelbina; taxanos tales como paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere™); colchicina (NSC 757), tiocolchicina (NSC 361792), derivados de colchicina (por ejemplo, NSC 33410), y alocolchicina(NSC 406042); halicondrina B (NSC 609395); dolastatina 10 (NSC 376128); maitansina (NSC 153858); rizoxina (NSC 332598); epotilona A, epotilona B; discodermolida; estramustina; nocodazol. En una forma de realización preferida el inhibidor mitótico es docetaxel. Cuando el sujeto padece cáncer de próstata, el tratamiento quimioterapéutico de segunda linea para un cáncer que es resistente a terapia hormonal es un tratamiento con inhibidores mitóticos, preferiblemente docetaxel.
"Fármacos alquilantes de ADN", como se usa en el presente documento, son agentes alquilantes usados en tratamiento contra el cáncer que son capaces de añadir un grupo alquilo al ADN de células que se dividen rápidamente produciendo de esta manera parada de la replicación y muerte celular. Los agentes alquilantes de ADN son mostazas de nitrógeno, nitrosoureas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo y triazenos, incluyendo, pero no limitados a, ciclofosfamida (Cytoxan™), busulfán, improsulfán, piposulfán, pipobromán, melfalán (L-sarcolisina), clorambucilo, mecloretamina o mustina, uramustina o mostaza de uracilo, novembicina, fenesterina, trofosfamida, ifosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), clorozotocina, fotemustina, nimustina, ranimnustina, semustina (metil-CCNU), estreptozocina, tiotepa, trietilenmelamina, trietilentiofosforamina, procarbazina, altretamina, dacarbazina, mitozolomida y temozolomida. En una forma de realización preferida el fármaco alquilante de ADN se selecciona de temozolomida, nitrosoureas y procarbazina. Cuando el sujeto padece glioma el tratamiento quimioterapéutico de primera linea son fármacos alquilantes de ADN, preferiblemente seleccionado de temozolomida, nitrosoureas, procarbazina y combinaciones de los mismos.
El término "fármaco dirigido a EGFR", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula que sea capaz de inhibir total o parcialmente la señalización a través de EGFR dirigiéndose al dominio extracelular del receptor y por tanto bloqueando la unión del ligando al receptor o inhibiendo la actividad tirosina quinasa del dominio citoplásmico. Los ejemplos de tales agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen a EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen a EGFR incluyen Acm 579 (ATCC CRL HB 8506), Acm 455 (ATCC CRL HB8507), Acm 225 (ATCC CRL 8508), Acm 528 (ATCC CRL 8509) (véase, la patente en EE UU. 4.943.533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tal como 225 quimerizado (C225) y 225 humano reformado (H225) (véase, el documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que se unen a EGFR mutante de tipo II (patente en EE UU No.5.212.290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a EGFR como se describe en la patente en EE UU No.5.891.996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR (véase el documento WO98/50433, Abgenix), Bevacizumab (Avastin), 2C3, HuMV833, cetuximab (Erbitux®), panitumumab (Vectibix®), nimotuzumab (TheraCim®), matuzumab, zalutuzumab, Acm 806 o IMC- 11F8. Ejemplos de inhibidores de la actividad tirosina quinasa de EGFR incluyen ZD1839 o Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca), CP-358774 (TARCEVA™; Genentech/OSI) y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), erlotinib (Tarceva), sutent (sunitinib), lapatinib, imatinib, sorafenib (nexavar), vandetanib, axitinib, bosutinib, cedivanib, dasatinib (sprycel), lestaurtinib, pazopanib y/o ARQ197. En una forma de realización preferida el fármaco dirigido a EGFR es sorafenib. Cuando el sujeto padece carcinoma hepatocelular el tratamiento quimioterapéutico de primera linea es un fármaco dirigido a EGFR, preferiblemente sorafenib.
El término "fármaco dirigido a HER-2" se refiere a un fármaco que se dirige contra la proteina del receptor del factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2) humano que se sobreexpresa en un subtipo particular de cánceres de mama (HER2+). Los fármacos dirigidos a HER2 incluyen, sin limitación, trastuzumab, lapatinib, pertuzumab, neratinib, trastuzumab-DMl e inhibidores de mTOR tales como everolimus o temsirolimus. En una forma de realización preferida el fármaco dirigido a HER2 es trastuzumab. Cuando el sujeto padece cáncer de mama HER2+ para receptores hormonales, el tratamiento de primera linea es un fármaco dirigido a HER-2, preferiblemente trastuzumab.
El término "fármaco dirigido a CD20" se refiere a un fármaco dirigido al antigeno CD20 en linfocitos B. Los fármacos dirigidos a CD20 incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-CD20 tales como rituximab, ocrelizumab, PRO70769, rhuH27, ofatumumab, veltuzumab, hA20, IMMU-106, AME-133, LY2469298, PR0131921, GA-101, tositumomab y RO5072759. En una forma de realización preferida el fármaco dirigido a CD-20 es rituximab. Cuando el sujeto padece linfoma de Hodgkin el tratamiento de primera linea se selecciona de quimioterapia combinada, rituximab y combinaciones de los mismos. "Quimioterapia combinada" quiere decir una combinación de fármacos anticancerosos que funcionan mediante mecanismos citotóxicos diferentes. La quimioterapia combinada para el tratamiento del linfoma de Hodgkin es, sin limitación, ABVD (adriamicina/bleomicina/vinblastina/dacarbazina), MOPP (mecloretamina/vincristina/procarbazina/prednisona), BEACOPP (bleomiciña/etoposido/adriamicina/ciclofosfamida/vincristina/p rocarbazina/prednisona), Stanford V (un derivado de mostaza tal como ciclofosfamida, mecloretamina o ifosfamida/doxorrubíciña/vinblastina/vincristina/bleomicina/et opósido/prednisona), ChIVPP/EVA (clorambucilo, vincristina, procarbazina, prednisona, etopósido, vinblastina, adriamicina) y VAPEC-B (vincristina/adriamicina/prednisona/etopósido/ciclofosfamida/b leo icina). Cuando el sujeto padece linfoma no de Hodgkin el tratamiento quimioterapéutico de primer linea es quimioterapia combinada seleccionada de, sin limitación, CHOP (ciclofosfamida/doxorrubicina/vincristina/prednisona), CHOP-R o R-CHOP (CHOP + rituximab), COP o CVP (ciclofosfamida/vincristina/prednisona), COPP (ciclofosfamida/vincristina/procarbazina/prednisona), m-BACOD (metotrexato/bleomicina/adriamicina/ciclofosfamida/vincristina /dexametasona), MACOP-B (metotrexato/leucovorina/adriamicina/ciclofosfamida/vincristin a/prednisona/bleomicina), ProMACE-MOPP (metotrexato/adriamicina/ciclofosfamida/etopósido + MOPP), ProMACE - CytaBOM (prednisona/ adriamicina/ ciclofosfamida/ etopósido/ citarabina/ bleomicina/vincristina/metotrexato/leucovorina) y R-FCM (rituximab/fludarabina/ciclofosfamida/mitoxantrona).
En otra forma de realización, el método de la invención comprende además, la determinación en el CPD del estado de metilación de sitios CpG que son indicativos de un quimiosensibilidad a diferentes fármacos. Esto permitiría mejorar la decisión terapéutica para el CPD. Los sitios CpG adecuados que se pueden usar según la presente invención incluyen, sin limitación, MGMT-temodal/dacarbazina (Esteller, New England Journal of Medicine 2000; Oaz et al., Clin Cáncer Res 2004, etc.), WRN-irinotecano/topotecano (Agrelo et al., Proc Nati Acad Sci USA 2006) y BRCA1-oxaliplatino/cisplatino/inhibidores de PARP (Veeck et al., Journal of Clinical Oncology 2010).
Métodos para el tratamiento personalizado de un sujeto que padece CPD Los métodos divulgados en la presente invención son útiles para determinar el origen de un CPD. Puesto que los CPD son atacados terapéuticamente usando una terapia que se usa para el tumor primario, la identificación del origen del CPD permitirá el diseño de terapias especificas para el CPD usando una terapia que previamente se ha confirmado que es adecuada para el tumor primario.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar un cáncer de origen primario desconocido (CPD) en un sujeto (en adelante tercer método de la invención) que comprende los pasos de: (i) determinar el perfil de metilación en una región seleccionada de un ADN aislado de dicho CPD, (ii) comparar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario y (iii) tratar al sujeto con una terapia adecuada para dicho tumor primario en donde el perfil de metilación obtenido en (i) muestra una identidad sustancial con el perfil de metilación del tumor primario.
Los pasos (i) y (ii) se llevan a cabo esencialmente como se describe en el primer y segundo métodos de la invención.
En una forma de realización preferida, el tumor primario se selecciona del grupo que consiste en una neoplasia linfoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioma, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de mama, una neoplasia mieloide, cáncer testicular, cáncer de estómago.
En una forma de realización preferida, la determinación del perfil de metilación según el tercer método de la invención comprende la determinación del estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en las tablas 1 a 15 en donde (i) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 1A o en la tabla IB se compara con el estado de metilación de una neoplasia linfoide, (ii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 2A o 2B se compara con el estado de metilación de un cáncer de cabeza y cuello, (iii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 3A o 3B se compara con el estado de metilación de un cáncer pancreático, (iv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 4A o 4B se compara con el estado de metilación de de un cáncer endometrial, (v) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 5A o 5B se compara con el estado de metilación de un cáncer de colon, (vi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 6A o 6B se compara con el estado de metilación de un cáncer de próstata, (vii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 7A o 7B se compara con el estado de metilación de un glioma, (viii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 8A o 8B se compara con el estado de metilación de un cáncer ovárico, (ix) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 9A o 9B se compara con el estado de metilación de un cáncer de pulmón, (x) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 10A o 10B se compara con el estado de metilación de de un cáncer de vejiga, (xi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 11A o 11B se compara con el estado de metilación de un melanoma, (xii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 12A se compara con el estado de metilación de un cáncer de mama, (xiii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 13A o 13B se compara con el estado de metilación de de una neoplasia mieloide, (xiv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 14A o 14B se compara con el estado de metilación de un cáncer testicular y/o (xv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 15A o 15B se compara con el estado de metilación de un cáncer de estómago.
La terapia que se va a administrar al paciente que padece el CPD se puede determinar después en base a la terapia que se aplica comúnmente al tumor primario (véanse las terapias adecuadas en la tabla 16).
En otra forma de realización, el método de la invención comprende además la determinación en el CPD del estado de metilación de sitios CpG que son indicativos de un quimiosensibilidad a diferentes fármacos. Esto permitiría no solo la identificación del origen del CPD sino también decidir sobre las estrategias terapéuticas para el CPD. Los sitios CpG adecuados que se pueden usar según la presente invención incluyen, sin limitación, MGMT-temodal/dacarbazina (Esteller, New England Journal of Medicine 2000; Oaz et al., Clin Cáncer Res 2004, etc.), WRN-irinotecano/topotecano (Agrelo et al., Proc Nati Acad Sci USA 2006) y BRCAl-oxaliplatino/cisplatino/inhibidores de PARP (Veeck et al., Journal of Clinical Oncology 2010).
Ki ts En otro aspecto, la invención se refiere a un kit para su uso en cualquiera de los métodos según la invención, en donde el kit comprende una pluralidad de cebadores o sondas para determinar un estado de metilación de un sitio CpG expresado por un CPD.
Para los kits para la detección de metilación, los kits pueden comprender al menos un polinucleótido que híbrida con al menos una de las secuencias biomarcadoras de metilación y al menos un reactivo para la detección de metilación génica. Los reactivos para la detección de la metilación incluyen, por ejemplo, bisulfito sódico, polinucleótidos diseñados para hibridar con una secuencia que es el producto de una secuencia marcadora si la secuencia marcadora no está metilada (por ejemplo, que contiene al menos una conversión C-U), y/o una enzima de restricción sensible a metilación o dependiente de metilación. El kit puede suministrar soportes sólidos en forma de un aparato de ensayo que se adapta para usar en el ensayo. En un aspecto particular, los kits para los métodos de ciertos aspectos de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, una o más enzimas de restricción dependientes de metilación, enzimas sensibles a metilación, reactivos de amplificación (por ejemplo, PCR), sondas y/o cebadores.
Los kits pueden contener además marcadores detectables, opcionalmente unidos a un polinucleótido, por ejemplo, una sonda, en el kit. También pueden estar incluidos en los kits otros materiales útiles en la realización de los ensayos, incluyendo, tubos de ensayo, pipetas de transferencia, y similares. Los kits también pueden incluir instrucciones escritas para el uso de uno o más de estos reactivos en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento.
En un cierto aspecto, estos kits pueden comprender una pluralidad de agentes para evaluar la metilación de una pluralidad de biomarcadores de metilación, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más de los biomarcadores de metilación descritos anteriormente, en donde el kit se almacena en un envase.
En otra forma de realización particular, los cebadores o sondas específicos para determinar un estado de metilación de un sitio CpG expresado por un CPD representan al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las cantidades totales de los reactivos en el kit.
Los kits pueden comprender además instrucciones para usar el kit para evaluar la metilación, medios para convertir los datos de metilación en valores de metilación y/o medios para analizar los datos o valores de metilación para generar un pronóstico. Los agentes en el kit para medir la metilación de biomarcadores pueden comprender una pluralidad de sondas y/o cebadores para extensión o amplificación sensible a metilación de los biomarcadores. En otra forma de realización, los agentes en el kit para medir la metilación de biomarcadores pueden comprender un conjunto de polinucleótidos complementarios a la secuencia de los ácidos nucleicos de los biomarcadores de la invención. También pueden estar incluidos medios posibles para convertir los datos de metilación en valores de metilación y para analizar los valores de metilación para generar puntuaciones que predigan supervivencia o pronóstico.
Los kits pueden comprenden un envase con una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de ensayos. Los envases pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase puede contener una composición que incluye una sonda que es útil para aplicaciones pronosticas o no pronosticas, tal como las descritas anteriormente. La etiqueta en el envase puede indicar que la composición se usa para una aplicación pronóstica o no pronóstica específica, y también puede indicar instrucciones para su uso in vivo o in vitro, tales como las descritas anteriormente. El kit de la invención típicamente comprenderá el envase descrito anteriormente y uno o más envases que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos del envase con instrucciones para su uso.
Sistemas y programas informáticos En otro aspecto, la invención se refiere a un sistema informático que se proporciona con medios para implementar el primer, segundo o tercer método según la invención. El sistema informático puede incluir: (a) al menos una memoria que contiene al menos un programa informático adaptado para controlar la operación del sistema informático para implementar un método que incluye: (i) recibir datos de metilación de ADN, por ejemplo, el perfil de metilación de un CPD y el perfil de metilación de uno o más tumores primarios, (ii) determinar el grado de identidad entre el perfil de metilación del CPD y el perfil de metilación de los tumores primarios y (b) al menos un procesador para ejecutar el programa informático.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un programa informático para controlar un sistema informático para ejecutar los pasos según el primer, segundo o tercer método de la invención.
El sistema informático puede incluir uno o más procesadores generales o de fines especiales y memoria asociada, incluyendo dispositivos de memoria volátil y no volátil. La memoria del sistema informático puede almacenar software o programas informáticos para controlar la operación del sistema informático para hacer un sistema de fines especiales según la invención o para implementar un sistema para realizar los métodos según la invención. El sistema informático puede incluir una unidad central de procesamiento (CPU) única o multinucleada basada en Intel o AMD x86, un procesador ARM o procesador de ordenador similar para procesar los datos. La CPU o microprocesador puede ser cualquier microprocesador de circuito integrado único o múltiple, de fines generales convencional tal como un procesador Intel Pentium, un procesador Intel 8051, un procesador RISC o MISS, un procesador Power PC o un procesador ALPHA. Además, el microprocesador puede ser cualquier microprocesador convencional o de fines especiales tal como un procesador de señal digital o un procesador gráfico. El microprocesador típicamente tiene líneas de dirección convencionales, líneas de datos convencionales, y una o más líneas de control convencionales. Como se describe posteriormente, el software según la invención se puede ejecutar en un sistema dedicado o en ordenador de fines generales que tenga un sistema operativo DOS, CPM, Windows, Unix, Linix u otro. El sistema puede incluir memoria no volátil, tal como memoria de disco y memoria de estado sólido para almacenar programas informático, software y datos, y memoria volátil, tal como ram de alta velocidad para ejecutar programas y software.
Los medios de almacenamiento físicos legibles por ordenador útiles en varias formas de realización de la invención pueden incluir cualquier medio de almacenamiento legible por ordenador físico, por ejemplo memoria en estado sólido (tal como memoria flash), medios y dispositivos de almacenamiento legibles por ordenador magnéticos y ópticos, y memoria que usa otras teenologías de almacenamiento persistente. En algunas formas de realización, un medio legible por ordenador puede ser cualquier medio tangible que permita que el ordenador acceda a datos y programas informáticos. Los medios legibles por ordenador pueden incluir medios tangibles volátiles y no volátiles, eliminables o no eliminables implementados en cualquier método o teenología capaz de almacenar información tal como instrucciones legibles por ordenador, módulos de programas, programas, datos, estructuras de datos, e información de bases de datos. En algunas formas de realización de la invención, medio legible por ordenador incluye, pero no está limitado a, RAM (memoria de acceso aleatorio), ROM (memoria de lectura solo), EPROM (memoria de lectura solo programable borrable), EEPROM (memoria de lectura solo programable borrable eléctricamente), memoria flash u otra tecnología de memoria, CD-ROM (memoria de lectura solo en disco compacto), DVD (discos versátiles digitales) u otro medio de almacenamiento óptico, casetes magnéticos, cinta magnética, almacenamiento de disco magnético u otro medio de almacenamiento magnético, otros tipos de memoria volátil y no volátil, y cualquier otro medio tangible que se pueda usar para almacenar información y que pueda leer un ordenador incluyendo y cualquier combinación adecuada de los anteriores.
La presente invención se puede implementar en un ordenador autónomo o como parte de un sistema de ordenadores en red. En un ordenador autónomo, todo el software y los datos pueden residir en dispositivos de memoria locales, por ejemplo, se puede usar un disco óptico o un dispositivo de memoria flash para almacenar el software informático para implementar la invención así como los datos. En formas de realización alternativas, se puede acceder al software o a los datos o a ambos mediante una conexión en red a dispositivos remotos. En una forma de realización de un sistema de ordenadores en red, la invención usa un entorno cliente-servidor en una red pública, tal como internet o una red privada para conectarse a los datos y recursos almacenados en localizaciones remotas y/o centralmente localizadas. En esta forma de realización, un servidor que incluye un servidor web puede proporcionar acceso, bien acceso abierto, pago por uso o acceso por suscripción, a la información proporcionada según la invención. En un entorno cliente-servidor, un ordenador cliente que ejecuta un software o programa cliente, tal como un navegador web, se conecta al servidor a través de una red. El software cliente o navegador web proporciona una interfaz de usuario para que un usuario de la invención introduzca datos e información y recibe acceso a datos e información. El software cliente se puede ver en una pantalla de un ordenador local u otro dispositivo de salida y puede permitir que el usuario introduzca información, tal como usando un teclado, ratón del ordenador u otro dispositivo de entrada. El servidor ejecuta uno o más programas informáticos que permiten al software cliente introducir datos, procesar datos según la invención y sacar datos al usuario, asi como proporcionar acceso a recursos de ordenadores locales y remotos. Por ejemplo, la interfaz de usuario puede incluir una interfaz gráfica de usuario que comprende un elemento de acceso, tal como una caja de texto, que permite la entrada de datos del ensayo, por ejemplo, los niveles de datos de metilación de ADN o los niveles de expresión génica del ADN de los genes diana de una población de células troncales pluripotentes de referencia y/o población de células troncales pluripotentes de interés, asi como un elemento de visualización que puede proporcionar una lectura gráfica de los resultados de una comparación con una tarjeta de puntuación, o conjuntos de datos transmitidos a o puestos a disposición por un procesador después de la ejecución de las instrucciones codificadas en un medio legible por ordenador.
En algunas formas de realización de la presente invención, los perfiles de metilación de tumores primarios, que se usan como referencias se pueden registrar, anotar y recuperar electrónica o digitalmente, de bases de datos incluyendo, pero no limitadas a, bases de datos de proteínas y ADN de GenBank (NCBI) tales como genoma, EST, SNPS, Traces, Celara, Ventor Reads, Watson reads, HGTS, etc.; bases de datos del Instituto Suizo de Bioinformática, tales como bases de datos ENZYME, PROSITE, SWISS-2DPAGE, Swiss-Prot y TrEMBL; el paquete de software Melanie o el servidor WWW ExPASy, etc., SWISS-MODEL, Swiss-Shop y otras herramientas computacionales basadas en red; la base de datos Comprehensive Microbial Resource (El Instituto de Investigación genómica). La información resultante se puede almacenar en una base de datos relacional que se puede emplear para determinar homologías entre los datos o genes o proteínas de referencia en y entre genomas.
En algunas formas de realización de este aspecto y todos los otros aspectos de la presente invención, el sistema puede comparar los datos en un "módulo de comparación" que puede usar una variedad de programas y formatos de software disponibles para la comparación operativa para comparar información de secuencias determinadas en el módulo de determinación con datos de referencia. En otra forma de realización, el módulo de comparación se configura para usar téenicas de reconocimiento de patrones para comparar información de secuencias de una o más entradas con uno más patrones de datos de referencia. El módulo de comparación se puede configurar usando software existente comercialmente disponible o de libre disposición para comparar patrones, y se puede optimizar para comparaciones de datos particulares que se realizan. El módulo de comparación también puede proporcionar información legible por ordenador relacionada con la información de secuencias que puede incluir, por ejemplo, detección de la presencia o ausencia de sitios de metilación CpG en secuencias de ADN; determinación del nivel de metilación.
En algunas formas de realización, el módulo de comparación proporciona un resultado de comparación legible por ordenador que se puede procesar en forma legible por ordenador mediante criterios predefinidos, o criterios definidos por un usuario, para proporcionar un informe que comprende contenido basado en parte en el resultado de comparación que se puede almacenar y dar salida según requiera un usuario usando un módulo de visualización. En algunas formas de realización, un módulo de visualización permite la visualización de un contenido basado en parte en el resultado de comparación para el usuario, en donde el contenido es un informe indicativo de los resultados de la comparación del perfil de metilación del CPD de interés con el perfil de metilación de una célula tumoral.
En algunas formas de realización, el módulo de visualización permite la visualización de un informe o contenido basado en parte en el resultado de comparación para el usuario final, en donde el contenido es un informe indicativo de los resultados de la comparación del perfil de metilación del CPD con el perfil de metilación de los tumores primarios seleccionados. En algunas formas de realización de este aspecto y todos los otros aspectos de la invención, el módulo de comparación, o cualquier otro módulo de la invención, puede incluir un sistema operativo (por ejemplo, UNIX, Windows) en el que corre un sistema de gestión de bases de datos relacional, una aplicación World Wide Web y un servidor World Wide Web. La aplicación World Wide Web puede incluir el código ejecutable necesario para la generación de instrucciones de lenguaje de bases de datos [por ejemplo, instrucciones de lenguaje de consulta estándar (SQL)]. Los ejecutables pueden incluir instrucciones SQL embebidas.
Además, la aplicación World Wide Web puede incluir un fichero de configuración que contiene apuntadores y direcciones a las varias entidades de software que comprende el servidor asi como a las varias bases de datos externas e internas que se deben acceder para dar servicio a las peticiones del usuario. El fichero de configuración también dirige peticiones para recursos de servidor al hardware apropiado según pueda ser necesario si el servidor se debe distribuir en dos o más ordenadores separados. En una forma de realización, el servidor World Wide Web soporta un protocolo TCP/IP. Las redes locales tal como esta, algunas veces se denominan "Intranets". Una ventaja de tales Intranets es que permiten la comunicación fácil con bases de datos de dominio público que residen en la World Wide Web (por ejemplo, el sitio World Wide Web de GenBank o Swiss Pro). Por tanto, en una forma de realización particular preferida de la presente invención, los usuarios pueden acceder directamente a datos (a través de enlaces hipertexto, por ejemplo) que residen en la bases de datos de internet usando una interfaz HTML proporcionada por los navegadores Web y servidores Web. En otras formas de realización de la invención, se pueden usar otras interfaces, tales como interfaces basadas en HTTP, FTP, SSH y VPN, para conectar a las bases de datos de internet.
Las instrucciones informáticas se pueden implementar en software, firmware o hardware e incluyen cualquier tipo de paso programado emprendido por módulos del sistema de procesamiento de la información. El sistema informático se puede conectar a una red de área local (LAN) o una red de área amplia (WAN). Un ejemplo de la red de área local puede ser una red computacional corporativa, que incluya acceso a internet, a la se conectan ordenadores y dispositivos computacionales que comprenden el sistema procesador de datos. En una forma de realización, la LAN usa protocolos de red estándar en industria protocolos de control de transmisión/protocolo de internet (TCP/IP) para la comunicación. Se puede usar el protocolo de control de transmisión (TCP) como un protocolo de nivel de transporte para proporcionar un enlace de nivel de transporte fiable, orientado a la conexión entre sistemas informáticos. El nivel de red proporciona servicios al nivel de transporte. Usando un esquema de comunicación bidireccional, TCP proporciona el mecanismo para establecer, mantener y terminar conexiones lógicas entre sistemas informáticos. El nivel de transporte de TCP usa IP como su protocolo de nivel de red. Además, TCP proporciona puertos de protocolo para distinguir múltiples programas que se ejecutan en un único dispositivo incluyendo el número de puerto de destino y fuente con cada mensaje. TCP realiza funciones tales como transmisión de corrientes de bytes, definiciones de flujos de datos, reconocimientos de datos, retransmisiones de datos perdidos o corruptos, y múltiples conexiones multiplexadas a través de una única conexión de red. Por último, TCP es responsable de encapsular información en una estructura de datagrama. En formas de realización alternativas, la LAN puede ajustarse a otros estándares de red incluyendo, pero no limitado a, la Interconexión Sistemas Abiertos de la Organización Internacional de Normalización, IBM, SNA, NetWare de Novell y VINES de Banyan.
En algunas formas de realización de este aspecto y todos los otros aspectos de la presente invención, un módulo de comparación proporciona datos legibles por ordenador que se pueden procesar en forma legible por ordenador mediante criterios predefinidos, o criterios definidos por el usuario, para proporcionar un contenido recuperado que se puede almacenar y salir según requiera un usuario que usa un módulo de visualización.
Según algunas formas de realización de la invención, el sistema computarizado puede incluir o estar operativamente conectado a un módulo de visualización, tal como un monitor de ordenador, una pantalla táctil o sistema de visualización de video. El módulo de visualización permite que las instrucciones del usuario se presenten al usuario del sistema, ver entradas al sistema y para el sistema mostrar los resultados al usuario como parte de una interfaz de usuario. Opcionalmente, el sistema computarizado puede incluir o estar operativamente conectado a un dispositivo de impresión para producir copias impresas de la salida de información por el sistema.
En algunas formas de realización de la presente invención, se puede usar un navegador de World Wide Web para proporcionar una interfaz de usuario para permitir que el usuario interaccione con el sistema para introducir información, hacer peticiones y mostrar el contenido recuperado. Además, los varios módulos funcionales del sistema se pueden adaptar para usar un navegador web para proporcionar una interfaz de usuario. Usando un navegador Web, un usuario puede hacer peticiones para recuperar datos de fuentes de datos, tales como bases de datos e interaccionar con el módulo de comparación para realizar comparaciones y concordancia de patrones. El usuario puede señalar y clicar en elementos de la interfaz de usuario tales como botones, menús desplegables, barras de desplazamiento, etc., convencionalmente empleados en interfaces gráficas de usuario para interaccionar con el sistema y hacer que el sistema realice los métodos de la invención. Las peticiones formuladas con el navegador Web del usuario se pueden transmitir en una red a una aplicación Web que puede procesar o formatear la petición para producir una consulta de una o más bases de datos que se pueden emplear para proporcionar la información pertinente relacionada con los niveles de metilación del ADN y niveles de expresión génica, el contenido recuperado, procesar esta información y sacar los resultados.
*** La invención se describe a modo de los siguientes ejemplos que deben interpretar como meramente ilustrativos y no limitantes del ámbito de la invención.
EJEMPLO 1 Huella de metilación de ADN de tejidos normales humanos y cáncer humano Materiales y métodos Muestras de ADN Se recogieron muestras humanas de ADN de 1.819 muestras. Se excluyeron replicados usados para la validación (n=84), muestras que no alcanzaron el umbral del control de calidad (n=87) y los ADN metilados in vítro usados como marcador positivo del genoma completo para metilación en CpG (IVD; n=20). Por tanto, finalmente se analizaron las 1.628 muestras humanas. Posteriormente se explica un criterio para definir la calidad de una muestra. Se muestra una lista detallada de todas las muestras incluidas en el estudio en la tabla 17.
Tabla 17. Lista completa de las 1.628 muestras humanas incluidas en el estudio Tejidos Muestras Enfermedades normales n tu origénicas n no cancerosas n (n: 424) (n: 1054) (n: 150) Tejidos Tumores primarios sólidos (n: Aorta (n: 18) (n : 390) 61D Lesiones 1 Aorta 2 Vejiga 44 ateroescleróti 8 cas Aféresis 4 Mama 76 Vejiga 8 Cérvix 4 Sangre (n Sangre 18 „ nQ Colon 110 Lupus 7 Médula ósea 14 Endometrio 68 3 Autismo 0 Cerebro 3 6 Esófago 13 Alzheimer 5 Cirrosis 2 Ganglioneurom Mama 1 biliar 4 a primaria (PBC) Epitelio Esclerosis 1 21 Glioma bucal sistémica (SS) 0 Cerebelo 1 Cabeza-cuello 9 Cerebro (n: Cérvix 1 Riñón 26) 1 Colon 97 Hígado 19 Alzheimer 1 Demencia (con 1 Endometrio 2 Melanoma 21 cuerpos de 3 Lewy) Esófago 5 Neuroblastoma 16 Parkinson 1 Carcinoma de Cerebro 1 pulmón no 23 fetal microcítico Músculo (n : Corazón 2 Ovárico 17) 1 Hígado 5 Páncreas* 29 Miopatías 7 Pulmón 3 Próstata 14 Músculo 5 Estómago 16 Ovario 2 Testículo 23 Inmunodeficien Páncreas 7 cía , Neoplasias Inestabilidad ^ malignas centromérica y Próstata hema tológicas síndrome de 4 (n : 244) anomalías Leucemia faciales Piel 5 linfoblástica 58 (síndrome ICF) aguda (LLA) Leucemia Estómago 7 mieloblástica 34 aguda (LMA) Leucemia Glándula 1 linfocítica 25 suprarrenal crónica (LLC) Linfoma de Testículo 4 células B 49 grandes difuso (DLBCL) Linfoma folicular (FL) Líneas Linfoma celulares células normales manto (MCL) (n : 7) Linfoma de Linfoblasto Burkitt 18 ide molecular (mBL) Mielorna Melanocito 14 múltiple (MM) Síndromes mieloprolifer 13 ativos (MDS/MPS) Células Leucemia de troncales linaje 9 (n : 27) mezclado Adultas Embrionaria Metástasis s (n: 50) Colon a 32 Hígado Colon a 13 Cerebro Riñón a 5 Cerebro Lesiones premalignas (n: 25) Adenomas (colon) Mama 7 Hiperplasia g de endometrio Líneas celulares cancerosas (n: 82) Mama 6 Cérvix 4 Colon 10 Esófago 2 Cabeza-cuello 2 Leucemia 3 Hígado 3 Pulmón 10 Linfoma 23 Melanocito 2 Neuroblastoma 2 Páncreas 12 Próstata 3 Carcinoma de 42 primario desconocido (CPD) Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado y el estudio se realizó con la aprobación de los correspondientes Comités de Ética. Para las neoplasias malignas primarias, se macrodisecaron muestras de tejido reciente-congelado para obtener una pureza del 90-95% de tumor no necrótico y tejido no neoplásico adyacente no implicado. Para evaluar la calidad del conjunto de datos, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson de todos los pares de perfiles de metilación; casi todos los pares replicados tuvieron valores cercanos a 1. Para análisis posteriores, los replicados se combinaron haciendo la media de los perfiles de metilación de CpG de todos los registros para una muestra.
Análisis de metilación de ADN usando BeadArrays universales El perfil de metilación de ADN basado en micromatrices se realizó en todas las muestras con el panel I de metilación en cáncer GoldenGate (Illumina, Inc.). El panel se desarrolló para evaluar 1.505 sitios CpG seleccionados de 807 genes, que incluyen oncogenes y genes supresores de tumores, genes diferencialmente metilados o diferencialmente expresados previamente descritos, genes sellados, genes implicados en varias rutas de señalización, y los responsables de la reparación del ADN, control del ciclo celular, metástasis, diferenciación y apoptosis. Los análisis de metilación de ADN se realizaron en la Unidad de Genotipado Humano-CEGEN del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas español (Madrid, España), excepto para el 8% de los casos (127 neoplasias malignas hematológicas) donde el análisis se desarrolló en la sede de Illumina (San Diego, CA). No se observó variación entre laboratorios significativa.
El ensayo de metilación de ADN se realizó como han descrito previamente Bibikova y col. en 2006 (Bibikova et al. 2006. High-throughput DNA methylation profiling using universal bead arrays. Genome Res 16(3): 383-393). Brevemente, se diseñaron cuatro sondas para cada sitio CpG: dos oligos específicos de alelo (ASO) y dos oligos específicos de locus (LSO). Cada par de oligos ASO-LSO correspondía al estado metilado o sin metilar del sitio CpG. La conversión de las muestras de ADN con bisulfito se hizo usando el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research, Orange, CA). Después del tratamiento con bisulfito, los restantes pasos del ensayo fueron idénticos al ensayo de genotipado de GoldenGate (Fan et al. 2003. Highly parallel SNP genotyping. Coid Spring Harb Symp Quant Biol 68: 69-78) usando los reactivos y condiciones suministrados por Illumina. La hibridación de la matriz Ise realizó con un programa de gradiente de temperatura, y se hicieron imágenes de las matrices usando un lector de BeadArray (Illumina, Inc.). El procesamiento de las imágenes y la extracción de los datos de intensidad se realizaron como se ha descrito previamente (Galinsky. 2003. Automatic registration of microarray images. I. Rectangular grid. Bioinforma tics 19(14): 1824-1831; Galinsky. 2003. Automatic registration of microarray images. II. Hexagonal grid. Bioinformatics 19(14): 1832-1836). Cada punto de datos de metilación se representa por señales de fluorescencia de alelos M (metilado) y U (sin metilar). Se restó la intensidad del fondo calculada de un conjunto de controles negativos de cada punto de datos analítico. La relación de señales fluorescentes se calculó después de los dos alelos según la siguiente fórmula: Max(Mfi) Max{ £/,0)+ Max(Mfi)+ 100 Beta es una medida cuantitativa de los niveles de metilación de ADN de CpG específicos, y varía desde 0 para la no metilación completa a 1 para la metilación completa. Los valores Beta de metilación de ADN y los valores de p (medida de la calidad) para las 1.628 muestras están disponibles en el sitio web: http://ubio.bioinfo.enio.es/biotools/Human_DNA_Methylomes/ (user: data; password: 10HUMAN54). Los datos de secuencia de este estudio se han enviado a NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) con el número de acceso GSE28094.
Filtración de sondas y muestras Aunque el ensayo GoldenGate de Illumina es un método establecido muy reproducible para la detección de metilación de ADN, actualmente no hay procedimiento estándar para la filtración posterior de sondas y muestras comúnmente usado. Antes de analizar los datos de metilación, se exploraron varios modos de excluir posibles fuentes de sesgos biológicos y técnicos que podrían haber afectado y mejorado la exactitud de los resultados. Cada valor beta en la plataforma GoldenGate está acompañado por un valor P de detección. El criterio de filtración se basó en estos valores de P descritos por el ensayo. Se examinaron dos aspectos de filtrar sondas y muestras basándose en la detección de valores de P, seleccionado un umbral y un punto de corte. Los análisis indicaron que un valor umbral de 0,01 permite que se haga una distinción clara entre valores beta fiables y no fiables. Se seleccionó un valor de corte como el 5%. Siguiendo este criterio, todas las sondas con valores de P de detección >0,01 en el 5% o más de los casos se eliminaron primero. Como segundo paso, todas las muestras con valores de P de detección >0,01 en el 5% o más de sus sondas (restantes) se eliminaron. En total, se eliminaron 130 sondas y 87 muestras. Se verificaron sondas consistentemente no metiladas y metiladas y se eliminaron. Se ignoraron todas las muestras de lineas celulares y los inventores se concentraron en las restantes 1521 muestras (tejido primario). Todas las sondas que mostraron un grado de metilación <0,25 para todas las muestras de tejido primario se consideraron que estaban consistentemente sin metilar. De forma similar, las sondas con un grado de metilación >0,75 para todas las muestras de tejido primario se consideraron que estaban consistentemente metiladas. Se identificaron nueve sondas consistentemente sin metilar; ninguna de las sonda encajó la definición de los inventores para estar consistentemente metilada. Un factor biológico conocido es que una copia del cromosoma X está metilado en mujeres y, por tanto, se identificaron y eliminaron todas las sondas con metilación especifica de sexo prominente para evitar un sesgo escondido en análisis posteriores. Se consideró el conjunto de 1271 muestras con información de sexo; aproximadamente la mitad de ellas eran femeninas. Se definió una sonda como especifica de sexo si (1) la sonda mostraba una metilación diferencial significativa entre dos grupos de muestras, determinado por la prueba U de Mann-Whitncy con corrección FDR; y (2) los grados de metilación medios de las mujeres y hombres para esta sonda se diferenciaban en al menos 0,17 (una limitación del ensayo GoldenGate). Después de excluir 130 sondas que no tenían calidad suficiente, nueve que estaban consistentemente sin metilar y 44 que eran específicas de sexo, estuvieron disponibles 1322 sondas para análisis estadísticos adicionales.
Análisis de las sondas diferencialmente metiladas La gran cohorte de perfiles de metilación heterogéneos permite al inventor identificar sondas diferencialmente metiladas en una variedad de escenarios. Se examinaron por separado diferentes grupos de muestras de tejidos (tejidos primarios normales, enfermedades cancerosas y líneas celulares cancerosas). Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el entorno R para computación estadística (versión 2.10; http://www.R-project.org). A continuación se proporciona una explicación adicional sobre la detección de sondas y genes diferencialmente metiladas en cada escenario, análisis estadístico y representaciones gráficas.
Se usaron métodos diferenciales de análisis dependiendo de (1) el número de grupos comparados, y (2) cuando se comparan dos grupos, el número de muestras en los grupos "caso" y "control".
Se usaron métodos de red elástica para comparar varios grupos de muestras. Las sondas se seleccionaron mediante clasificadores de red elástica, entrenados con validación cruzada de 10 veces usando pérdida de clasificación errónea. Este planteamiento se diseñó para aplicaciones en las que el número de características (sondas) excede mucho el número de muestras analizadas. Estos métodos se han introducido recientemente en la comunidad bioinformática y se han aplicado en conjuntos de datos de SNP y expresión génica.
Se usó la prueba de Kruskal-Wallis con el algoritmo de Benjamini-Hochberg para calcular el índice de descubrimiento falso cuando se compararon dos grupos con un gran número de muestras. Nótese que todos los métodos se aplicaron después de un paso de prefiltración, como sugieren Martin-Subero y col. (Martin-Subero et al.2009, Blood 113: 2488-2497) y solo se consideraron sondas con diferencias de grupo de metilación medias de al menos 0,25.
Se implemento una estrategia específica para determinar sondas diferencialmente metiladas en casos donde se compararon dos grupos de muestras (casos y controles), y el grupo control era relativamente pequeño. Esta estrategia no incluye un paso de prefiltración, y se basa en un planteamiento heurístico, descrito brevemente a continuación. Con este algoritmo, se comparan un número muy pequeño de muestras control (sanos) con un grupo mayor de muestras casos (enfermos). Se definió una sonda P como no metilada en un conjunto de muestras control, cuando el valor de metilación medio para esta sonda era <0,25. De forma similar, se tomó que P estaba metilada si el valor medio de metilación era >0,75. P se describió como hipermetilada en las muestras caso si, y solo si, P estaba sin metilar en las muestras control y el valor beta de P era >0,75 en al menos el 10% de las muestras caso. Asimismo, un conjunto de sondas hipometiladas son esas sondas P que estaban metiladas en el grupo control y tenían valores de metilación <0,25 en al menos el 10% de las muestras en el grupo de casos. Otra situación en la que los métodos estadísticos estándar son inaplicables es cuando se comparan los perfiles de metilación de grupos de muestras muy pequeños (controles y casos). Se aplicó un planteamiento heurístico muy similar al anterior. Una sonda se clasificó primero en el grupo control como sin metilar si todos los valores de metilación para esta sonda entre las muestras en el grupo eran <0,5 y los valores medios eran <0,25. De forma alternativa, una sonda se consideró que estaba metilada en el grupo control si los valores observados para todas las muestran eran >0,5 y el valor medio era >0,75. Los criterios para la afiliación al grupo de casos fueron más estrictos: sondas sin metilar eran esas en las que el valor de metilación observado en todas las muestras era <0,25; los valores de metilación para todas las muestras en una sonda metilada eran >0,75. El conjunto de sondas diferencialmente metiladas consiste en todas las sondas que estaban metiladas en el grupo control pero sin metilar en el caso (sondas hipometiladas), asi como todas las sondas que estaban sin metilar en los controles pero metiladas en los casos (sondas hipermetiladas).
En todos los marcos, en los que se compararon los perfiles de metilación de dos grupos, las sondas diferencialmente metiladas se caracterizaron como que estaban hipometiladas o hipermetiladas con respecto a los grupos control, usando la prueba de Kruskal-Wallis con el algoritmo de Benjamini-Hochberg o métodos heurísticos. Se compararon las asociaciones entre sondas diferencialmente metiladas y localización CGI o no CGI usando la prueba exacta de Fisher. Además de la prueba exacta de Fisher, se calcularon valores de p basados en permutación para responder de interdependencias entre los estados de metilación de CpG diferentes. Brevemente, la prueba exacta de Fisher se realizó en 104 reasignaciones aleatorias de las muestras estudiadas y se calculó la proporción de los valores de p resultantes que es menor que o igual a la obtenida originalmente.
Para tejidos normales primarios las sondas se clasificaron como consistentemente sin metilar o consistentemente metiladas. El grupo consistentemente sin metilar consistía en todas las sondas con <0,25 de metilación en al menos el 99% de las muestras. Todas las sondas con >0,75 de metilación en al menos el 99% de las muestras formaron el grupo de las sondas consistentemente metiladas. Los genes con puntuación más alta con metilación de ADN especifica de tejido se definieron como genes con valores de metilación >0,75 en cada tipo de tejido.
Análisis de agrupamiento jerárquico y representaciones gráficas Se hicieron análisis estadísticos y se produjeron gráficos con R (versión 2.1.0) y Excel (Microsoft). El agrupamiento jerárquico y los mapas de calor con frecuencia contenían sondas específicas de tejido o cáncer calculadas mediante la prueba de Kruskal-Wallis y redes elásticas con clasificación errónea. Se usó la distancia Manhattan como la métrica apropiada. Un CpG metilado se representó siempre en rojo y un CpG sin metilar en verde. La lcyenda de seguimiento que acompaña a los mapas de calor representa la localización de CpG como dentro o fuera de una isla CpG (en rojo y azul, respectivamente).
El gráfico de desviación representa la variabilidad de los valores de metilación para muestras de conjunto. Las sondas se ordenan en el eje x y se clasifican con respecto a su metilación mediana, visualizada por una curva. El área amarilla encerrada con un límite gris representa el 5o y 95° percentil entre los valores de metilación para cada sonda. Se presenta información adicional sobre las sondas en código de color debajo del eje x; las sondas asociadas a islas CpG y no islas CpG (CGI y no-CGI) están marcadas en rojo y azul, respectivamente. La cantidad de variación en los perfiles de metilación se puede cuantificar como el área relativa de desviación (barras amarillas) en un gráfico de desviación, que es un número entre 0 y 1. Un área de cero indica que no hay variación, mientras que un valor de 1 representa que se observan todos los grados posibles de metilación para cada sonda. Se usó la prueba de Wilcoxon para calcular valores de p para la asociación entre variabilidad de metilación y solapamiento CGI. Se estimó la variabilidad de una sonda como la diferencia entre el 5o y 95° percentil de los valores de metilación de esta sonda. Se midieron las diferencias entre dos gráficos de desviación, considerando la mediana y variación en metilación. Para este fin, el número de muestras usadas en ambos gráficos primero se igualó y después se realizó una prueba de Wilcoxon por pares usando los valores de las secuencias visualizadas.
Pirosecuenciación Se diseñaron ensayos de pirosecuenciación para analizar y validar los resultados obtenidos de la matriz con diferentes escenarios. Se llevó a cabo la modificación con bisulfito sódico de 0,5 mg de ADN genómico aislado de diferentes tejidos con el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research Corporation) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN tratado con bisulfito se eluyó en volúmenes de 15 mi con 2 mi usados para cada PCR. El conjunto de cebadores para la amplificación por PCR y secuenciación se diseñaron con un programa especifico (diseño de ensayo PyroMark versión 2.0.01.15). Se diseñaron las secuencias de los cebadores para hibridar con sitios sin CpG para asegurar la amplificación independiente de metilación. Se realizó la PCR con cebadores biotinilados para convertir el producto de PCR a moldes de ADN monocatenarios. Se uso Vacuum Prep Tool (Biotage) para preparar productos de PCR monocatenarios según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de pirosecuenciación y la cuantificación de la metilación se realizaron en un sistema PyroMark Q24 versión 2.0.6 (QIAGEN). Los gráficos de valores de metilación muestran barras que identifican sitios CpG con valores desde el 0% (blanco) al 100% (negro).
Clasificación de los CPD Se usó regresión logística regularizada con L1 de método avanzado con clasificación errónea para clasificar las 42 muestras de CPD en el conjunto de datos en uno de los tipos de cáncer conocido. Al clasificar un CPD, este clasificador da probabilidades (valores entre 0 y 1) para cada tipo de cáncer conocido. Se derivó un mapa de calor de predicción de CPD en R (versión 2.1.0). Las muestras de CPD se seleccionaron en base a tener una probabilidad >30% de ser atribuidas a un tipo tumoral específico. La disposición de las muestras en el mapa de calor se estableció mediante (1) ordenación de los tipos tumorales por el número de CPD atribuidos a cada uno; y (2) dentro de cada tipo tumoral, clasificación de los CPD de la probabilidad de atribución más alta a la más baja.
Análisis de datos de expresión Se descargaron ficheros CEL que contenían datos de expresión génica en tejidos normales de la base de datos GEO usando las siguientes series de datos: Tabla 18: Lista de series de datos que contienen datos de expresión génica de tejidos normales de la base de datos GEO.
Los datos sin procesar se importaron en Flexarray (versión 1.4.1) y se normalizaron a RMA usando Affymetrix Power Tools (32bit, versión 1.12.0). Se usó el fichero de anotación de Affymetrix HG-Ul33_Plus_2.na30.annot.csv para seleccionar los ID de conjunto de sondas de Affymetrix que correspondía a genes con patrones de metilación específicos de tejido. Los conjuntos de sondas ambiguos asociados con más de un gen no se incluyeron. Si había múltiples conjuntos de sondas que correspondían al mismo gen, se hizo la media de sus valores de intensidad para dar datos de expresión con respecto a genes. Los datos de expresión seleccionados se importaron en Génesis (versión 1.7.1), centrados en mediada y normalizados respecto a genes. Se llevaron a cabo el agrupamiento jerárquico sin supervisar y mapas de calor usando los datos de expresión para los 354 genes (incluyendo los 511 sitios CpG específicos de tejido) en base al cálculo de la distancia Manhattan y agrupamiento de ligamiento medio. Se usaron los datos de expresión génica descargados de la base de datos GEO y la misma serie de datos para definir un gen como gen de mantenimiento. Se seleccionaron genes expresados en el 90% de los tejidos normales incluidos en el panel. Se usó el siguiente procedimiento: Se generaron llamadas ausente-presente de 99 muestras de tejidos normales usando la función "mas5calls" en el paquete R "affy". Se encontró que 8.643 conjuntos de sondas estaban presentes ("P") en >90% de las muestras. Para estos conjuntos de sondas, se determinaron los símbolos génicos correspondientes usando el fichero de anotación de Affymetrix HG-U133_Plus_2.na30.annot.csv, dando una lista de "³90%_genes_expresados" (5.427 genes identificados). La lista ">90%_genes_expresados" se cruzó con la lista "genes_sin_metilar en tejidos normales" y "otros_genes".
También se obtuvo experimentalmente un gráfico de densidad de datos de expresión génica basada en micromatrices en pacientes de cáncer de colon. Los datos de expresión se obtuvieron de 19 tumores colorrectales primarios para los que el inventor había obtenido perfiles de metilación de ADN. Se hibridaron 5 mg de ARN con la matriz de expresión Affymetrix Human GeneChip U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los datos de expresión se normalizaron y analizaron siguiendo los mismos procedimientos descritos anteriormente.
Acceso de datos Los datos de micromatrices de este estudio se han enviado a NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) con el número de acceso GSE28094.
Resultados Descripción de las 1628 muestras y análisis de 1505 sitios CpG Se estudió el ADN genómico de 1628 muestras humanas correspondientes a 424 tejidos normales (180 de leucocitos, 97 de mucosa de colon y 227 de otras muestras normales), 1054 muestras tumorigénicas (lesiones premalignas, tumores primarios y metástasis) y 150 trastornos no cancerosos. La tabla 17 muestra la lista completa de muestras estudiadas. La edad de los donantes varió de 6 meses a 102 años, con una edad media de 57 años. El cuarenta por ciento (n = 648) eran hombres y el 38% (N = 623) eran mujeres, el sexo del 22% restante (n = 357) no se conoce. El ochenta y siete por ciento (n = 1421) de las muestras eran de voluntarios y pacientes europeos, mientras que el 4% (n = 59) y el 2% (n = 36) eran de poblaciones asiática y norteamericana, respectivamente; el origen no se conocía para el 7% (n = 116) de los casos. Por último, el 93% (n = 1512) de las muestras eran tejidos primarios obtenidos en el momento de las intervenciones clínicamente indicadas, mientras que el 7% (n = 116) se obtuvieron de líneas celulares establecidas. Para todas estas muestras se obtuvieron las huellas de metilación del ADN, definidas por el estado de 1505 sitios CpG localizados de -1500 pb a +500 pb alrededor de los sitios de inicio de la transcripción (TSS) de 808 genes seleccionados usando el ensayo BeadArray de metilación de ADN GoldenGate (Illumina, Inc.). El panel de genes incluye oncogenes y genes supresores de tumores, genes sellados, genes implicados en varias rutas de señalización, y los responsables de la reparación del ADN, control del ciclo celular, metástasis, diferenciación y apoptosis. El sesenta y nueve por ciento (n = 1044) de los 1505 sitios CpG estudiados se localizan en una isla CpG canónica (Takai y Jones 2002, Proc Nati Acad Sci 99: 3740- 3745), mientras que el 31% (n = 461) se sitúan fuera de islas CpG. Todos los cromosomas humanos, excepto el cromosoma Y, se incluyen entre los sitios CpG analizados. Los sitios CpG en "orillas de islas CpG", regiones de densidad de CpG comparativamente baja a 2 kb de islas CpG, no se imprimen en la matriz usada, y su relevancia biológica ya se ha estudiado extensamente (Doi et al.2009, Nat. Genet., 41: 1350-1353; Irizarry et al.2009, Nat Genet 41: 178-186). Brevemente, en este caso, se diseñaron cuatro sondas para cada sitio CpG: dos oligos específicos de alelo (ASO) y dos oligos específicos de locus (LSO). Cada par de oligos ASO-LSO correspondía al estado metilado o sin metilar del sitio CpG. Después de la conversión por tratamiento con bisulfito, los restantes pasos del ensayo fueron idénticos a los del ensayo de genotipado de GoldenGate usando los reactivos y condiciones suministrados por Illumina, y se hicieron imágenes de las matrices usando un lector BeadArray (Illumina, Inc.). Cada punto de dato de metilación se representó mediante señales fluorescentes de los alelos M (metilados) y U (sin metilar). Antes de analizar los datos de metilación de CpG, se excluyeron posibles fuentes de sesgos téenicos que podrían haber influido en los resultados. Cada valor beta en la plataforma GoldenGate está acompañado por un valor P de detección, y se observó que un valor P umbral por encima de 0,01 indicaba valores beta poco fiables (130 CpG). También se excluyeron los sitios CpG del cromosoma X con metilación de ADN específica de mujer (Reik y Lewis 2005, Nat. Rev. Genet 6: 403-410) (44 CpG). Por último, también se excluyeron nueve sitios CpG que estaban sin metilar en todas las muestras normales y asociadas a enfermedad. Usando estos filtros, 1322 CpG demostraron ser fiables y se usaron posteriormente en el estudio. El estado de metilación preciso del ADN de cada dinucleótido CpG analizado en cada una de las 1628 muestras estudiadas está disponible libremente descargándolo de NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) con el número de acceso GSE28094.
Huella de metilación de ADN de tejidos normales humanos En primer lugar, se analizaron las huellas de metilación de ADN de 424 tejidos normales humanos. De los 424 tejidos normales estudiados, solo el 1% (n =17) de los CpG (correspondientes a 14 genes) estaban metilados en todas las muestras estudiadas. Estos dinucleótidos CpG exclusivamente metilados estaban situados preferentemente fuera de islas CpG (82%; prueba exacta de Fisher, p = l,97xl0~5). A la inversa, el 37% (n = 488) de los CpG, correspondientes a 359 extremos 5' de genes, estaban exclusivamente sin metilar en cada tejido normal estudiado. Estos dinucleótidos CpG siempre sin metilar estaban casi exclusivamente localizados en islas CpG (98%; prueba exacta de Fisher, p = 2,20x10-85) y estaban asociados con genes de expresión de mantenimiento (prueba exacta de Fisher, p = l,13xl0~4). Lo más importante, se encontró metilación de ADN diferencial significativa (prueba de orden de Kruskal-Wallis, p<2,21xl016) entre diferentes muestras normales de 511 dinucleótidos CpG usando clasificadores de redes elásticas, que permiten su distinción en base al tipo de tejido usando un planteamiento de agrupamiento jerárquico sin supervisar. Los 511 sitios CpG descritos corresponden a 359 genes y, proporcionando validación adicional a los datos, 220 genes (61%; 220) y 137 (38%) se identificaron previamente como genes con metilación de ADN especifica de tejido usando la misma plataforma de 1505 CpG (Byun et al.2009, Hum Mol Genet 18: 4808-4817) o una micromatriz de 27.000 CpG (Nagae et al. 2011, Hum Mol Genet doi: 10.1093/hmg/ddrl70), respectivamente. Ejemplos ilustrativos de genes encontrados en los tres conjuntos, y también conformados por secuenciación genómica con bisulfito en otro estudio independiente (Eckhardt et al. 2006, Nat Genet 38: 1378-1385), incluyen TBXl (caja-T 1), OSM (oncostatina M), y GPlBB (polipéptido beta de la glicoproteina Ib (plaquetas)).
Para los 359 genes con metilación de CpG especifica de tejido, se conocen sus patrones de expresión en los 21 tejidos normales (GEO Expression Omnibus, GEO; http://www.ncbi.nih.gov/geo/). El análisis de agrupamiento sin supervisar de la expresión de estos 359 genes discrimina cada tipo de tejido normal, como hizo la metilación de CpG, reforzando la asociación entre metilación de ADN y silenciamiento transcripcional del gen vecino para estas dianas. Notablemente, los sitios CpG para los que el estado de metilación era el más valioso para discriminar entre tipos de tejido eran los situados en extremos 5' de no islas CpG (prueba exacta de Fisher, p = 5,85xl0-49). Estos datos apoyan la hipótesis de hace mucho tiempo de que la mayoría de los genes de mantenimiento contienen islas CpG alrededor de sus sitios de inicio de la transcripción, mientras que la mitad de los genes específicos de tejido tienen una isla CpG en sus extremos 5', y la otra mitad son pobres en 5'-CpG. Los patrones de metilación de ADN específicos de tipo de tejido, que están en línea con las observaciones anteriores en seres humanos también coinciden con las capas de desarrollo en las que los tejidos se originan (endodermo, mesodermo o ectodermo), lo que implica la existencia de metilación de ADN específica de capa germinal (Sakamoto et al.2007, Genes Cells 12: 1123-1132).
Huella de metilación de ADN de cáncer humano También se estudiaron las huellas de metilación de ADN para 1054 muestras tumorigénicas humanas incluyendo 855 neoplasias malignas primarias (611 tumores sólidos de 19 tipos tisulares y 244 neoplasias malignas hematopoyéticas), 50 lesiones metastásicas, 25 lesiones premalignas, 82 lineas celulares cancerosas y 42 cánceres de origen primario desconocido (CPD) (Tabla 17). El mapa de metilación de ADN que emerge muestra un perfil especifico de tipo tumoral caracterizado por la ganancia progresiva de metilación en CpG en promotores asociados a islas CpG y una pérdida acumulada de metilación en CpG fuera de islas CpG en los diferentes pasos de la tumorigénesis.
Primero, el agrupamiento sin supervisar de los perfiles de metilación de ADN obtenidos de los 855 tumores primarios demostró que cada tipo de neoplasia maligna tenia su propio paisaje de metilación de ADN aberrante. Desde un punto de vista cuantitativo, 1003 sitios CpG (el 76% de los 1322 CpG validados) tenían niveles de metilación significativamente diferentes entre tipos tumorales (prueba de orden de Kruskal-Wallis, p<2,2xl0-16). La distinción de tumores primarios por su tejido de origen se mantuvo incluso cuando se restó la metilación de ADN específica de tipo tisular descrita anteriormente (511 sitios CpG) a partir del análisis de perfiles de metilación de ADN para cada tejido normal. Comparando cada tipo tumoral con su correspondiente tejido normal, 729 sitios CpG (el 55% de 1322 CpG) mostraron metilación de ADN diferencial. Usando estos sitios CpG diferencialmente metilados en tumor/normal, los tumores primarios humanos totales se caracterizaron por niveles aumentados de metilación del dinucleótido CpG: el 68% (n =496) estaban hipermetilados y el 32% (n = 233) estaban hipometilados (prueba de la t, p = 3,521xl0-5). Lo más importante, la localización de estos sucesos de metilación de ADN era diferente: la hipermetilación de dinucleótidos CpG se produjo en islas CpG (78%), mientras que la hipometilación de CpG estaba presente en extremos 5' de genes sin islas CpG (78%; prueba exacta de Fisher; p= 2,59xl047; valor de P de permutación <0,001). Un gráfico de desviación de metilación de ADN para los 1322 sitios CpG estudiados en todos los tejidos primarios normales (n = 390) frente a todos los tumores primarios (n = 855) muestra los sitios CpG hipermetilados en las islas CpG y los sitios hipometilados fuera de las islas CpG observados en neoplasias malignas (prueba de Wilcoxon de datos independientes, p < 2,2xlCT16). Los sitios CpG con metilación diferencial especifica de cáncer según el tipo tumoral en comparación con su tejido normal correspondiente se proporcionan en las tablas 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A, 10A, 11A, 12A, 13A, 14A y 15A. Esos sitios CpG con cambios de metilación altamente especifica que se dan solo en un tipo tumoral se muestran en la tablas IB, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8B, 9B, 10B, 1IB, 12B, 13B, 14B y 15B.
Para el mayor conjunto de muestras con tejidos normales-tumorales emparejados del mismo paciente (41 casos de cáncer colorrectal), se observó que de los 1322 sitios CpG estudiados, los dinucleótidos CpG en promotores con islas CpG el ADN se metilaba significativamente más en el 79% de los casos (34 de 43 pares normal/tumor; prueba de Wilcoxon, p = 2,47xl07), mientras que los CpG localizados en promotores sin islas CpG experimentaron más comúnmente sucesos de hipometilación de ADN, en el 51% de los casos (22 de 43 pares normal/tumor; prueba de Wilcoxon, p = 0,001). Considerando la población de tumores colorrectales como un todo, en el 68% de los casos (28 de 41) la neoplasia maligna primaria ganó metilación en dinucleótidos CpG en islas CpG de promotores y promotores sin islas CpG, mientras que en el 15% de los tumores (6 de 41) la ganancia de metilación en islas CpG se produjo en un contexto de pérdida de metilación en no islas CpG de promotores. De forma interesante, el 17% de los casos (siete de 41) representó una pérdida de metilación tanto en islas CpG de promotores como en promotores sin islas CpG (figura 3A). Por tanto, la presencia de hipermetilación de islas CpG de promotores parece ser una marca común de tumores humanos, pero hay subconjuntos de cánceres que presentan otros perfiles de metilación de ADN en sitios CpG de promotores que sugieren rutas de metilación de ADN aberrante adicionales y complejas en tumorigénesis. Por ejemplo, merece investigación adicional la posibilidad de que sucesos de hipometilación de ADN en CpG localizados en promotores sin islas CpG, típica de genes con expresión específica de tejido restringida (Illingworth y Bird 2009) pueda producir una pérdida de identidad celular en células transformadas.
Las huellas de metilación de ADN de cáncer humano obtenidas en este estudio también pueden proporcionar biomarcadores diagnóstico y pronósticos moleculares importantes adicionales para el tratamiento de neoplasias. Un ejemplo evaluado es el caso de las entidades clínicas clasificadas como cánceres de origen primario desconocido (CPD). Estos son pacientes que presentan enfermedades metastásicas para las que el sitio primario no se puede encontrar a pesar de la investigación estándar. La supervivencia mediana en estudios aleatorios de estos pacientes es extremadamente mala (Abbruzzese et al.1995, J Clin Oncol 13: 2094-2103); sin embargo, si fuera posible predecir el sitio del tumor primario, el paciente podría ser tratado con un programa específico de sitio, produciendo potencialmente mejor supervivencia que la proporcionada por el tratamiento no específico, para el que la mediana actual es solo 7 meses (Greco y Pavlidis 2009, Semin Oncol 36: 65-74). Se estimó que las muertes debidas a CPD eran 45.230 en 2007 en los Estados Unidos (Sociedad Americana de Cáncer 2007). Los CPD tienen una incidencia del 6% entre todos los tumores malignos, y en el 25% de los casos, el sitio primario no se puede identificar incluso tras la autopsia (Sociedad Americana de Cáncer 2007). La incapacidad de identificar el sitio primario del cáncer y la imposibilidad de proporcionar el tratamiento correcto tiene un gran impacto en el desenlace clínico esperado de estos pacientes.
Por tanto, las huellas de metilación de ADN de 42 CPD se han analizado y comparado los paisajes de metilación de ADN obtenidos con los de la colección de tumores malignos humanos anteriormente mencionada donde se conocía el tipo tisular original. No fue posible asignar un tipo tumoral determinado para estos CPD en el 69% (29 de 42) de los casos usando regresión logística regularizada con L1 con clasificación errónea (R, versión 2.10) para crear un mapa de calor de predicción (figura 2). También se logró un primario inductor propuesto en estos 29 casos mediante análisis de agrupamiento convencional. Lo más importante, la predicción del tipo tumoral de los CPD basada en los análisis de metilación del ADN se confirmó por completo en el 78% de los casos (7 de 9) para los que el análisis patológico detallado desarrollado con enmascaramiento en una fase posterior pudo proporcionar un diagnóstico. También se podría concluir que el restante 31% (13 de 42) de los casos de CPD estudiados no representaron ninguno de los 19 tipos tumorales incluidos en este análisis (tabla 17). Los tres tipos tumorales más comunes presentes en los CPD asignados por metilación de ADN fueron cáncer colorrectal (34%; 10 de 29), cáncer de pulmón no microcítico (17%, 5 de 29) y tumores de mama (17%, 5 de 29). Estos casos son particularmente interesantes porque la introducción de terapias dirigidas, tal como tratamiento con anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en cáncer colorrectal, inhibidores de molécula pequeña para mutaciones de EGFR en adenocarcinoma de pulmón, y opciones de quimioterapia más personalizada para cáncer de mama como función del estado hormonal y del receptor ERBB2 han mejorado el desenlace de dichos pacientes. Por tanto, es tentador proponer que la predicción de un sitio primario inductor para los CPD basado en los perfiles de metilación de ADN podría identificar una pauta de tratamiento más específica para dichos pacientes que mejoraría su calidad de vida y supervivencia.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar el origen de un cáncer de origen primario desconocido (CPD) que comprende los pasos de: (i) determinar el perfil de metilación en una región seleccionada de un ADN aislado de dicho CPD y (ii) comparar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario en donde una identidad sustancial entre el perfil de metilación obtenido en el paso (i) y el perfil de metilación del tumor primario es indicativo de que el CPD deriva de dicho tumor primario.
2. El método según la reivindicación 1 en donde el tumor primario se selecciona del grupo que consiste en una neoplasia linfoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioma, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de mama, una neoplasia mieloide, cáncer testicular, cáncer de estómago.
3. El método según la reivindicación 2 en donde la determinación del perfil de metilación comprende la determinación del estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en las tablas 1 a 15 en donde (i) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 1A o en la tabla IB se compara con el estado de metilación de una neoplasia linfoide, (ii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 2A o 2B se compara con el estado de metilación de un cáncer de cabeza y cuello, (iii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 3A o 3B se compara con el estado de metilación de un cáncer pancreático, (iv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 4A o 4B se compara con el estado de metilación de de un cáncer endometrial, (v) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 5A o 5B se compara con el estado de metilación de un cáncer de colon, (vi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 6A o 6B se compara con el estado de metilación de un cáncer de próstata, (vii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 7A o 7B se compara con el estado de metilación de un glioma, (viii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 8A o 8B se compara con el estado de metilación de un cáncer ovárico, (ix) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 9A o 9B se compara con el estado de metilación de un cáncer de pulmón, (x) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 10A o 10B se compara con el estado de metilación de de un cáncer de vejiga, (xi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 11A o 11B se compara con el estado de metilación de un melanoma, (xii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 12A se compara con el estado de metilación de un cáncer de mama, (xiii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 13A o 13B se compara con el estado de metilación de de una neoplasia mieloide, (xiv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 14A o 14B se compara con el estado de metilación de un cáncer testicular y/o (xv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 15A o 15B se compara con el estado de metilación de un cáncer de estómago.
El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el estado de metilación del ADN se mide por un método seleccionado del grupo que consiste en PCR especifica de metilación (MSP), un método basado en enriquecimiento (por ejemplo, MeDIP, MBD-seq y MethylCap), secuenciación con bisulfito y método basado en bisulfito (por ejemplo, RRBS, secuenciación con bisulfito, Infinium, GoldenGate, COBRA, MSP, MethyLight) y un método de digestión de restricción (por ejemplo, MRE-seq) o conversión diferencial, restricción diferencial, peso diferencial del gen diana metilado en ADN de células troncales pluripotentes comparado con los datos de metilación de ADN de los mismos genes diana.
Un método para seleccionar una terapia para un cáncer de origen primario desconocido (CPD) que comprende los pasos de: (i) determinar el perfil de metilación en una región seleccionada de un ADN aislado de dicho CPD y (ii) comparar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario en donde una identidad sustancial entre el perfil de metilación obtenido en (i) y el perfil de metilación del tumor primario es indicativo de que el CPD se debe tratar con una terapia que sea adecuada para dicho tumor primario.
El método según la reivindicación 5 en donde el tumor primario se selecciona del grupo que consiste en una neoplasia linfoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioma, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de mama, una neoplasia mieloide, cáncer testicular, cáncer de estómago.
El método según la reivindicación 6 en donde la determinación del estado de metilación comprende la determinación del estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en las tablas 1 a 15 en donde (i) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 1A o en la tabla IB se compara con el estado de metilación de una neoplasia linfoide, (ii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 2A o 2B se compara con el estado de metilación de un cáncer de cabeza y cuello, (iii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 3A o 3B se compara con el estado de metilación de un cáncer pancreático, (iv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 4D o 4B se compara con el estado de metilación de de un cáncer endometrial, (v) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 5A o 5B se compara con el estado de metilación de un cáncer de colon, (vi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 6A o 6B se compara con el estado de metilación de un cáncer de próstata, (vii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 7A o 7B se compara con el estado de metilación de un glioma, (viii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 8A o 8B se compara con el estado de metilación de un cáncer ovárico, (ix) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 9A o 9B se compara con el estado de metilación de un cáncer de pulmón, (x) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 10A o 10B se compara con el estado de metilación de de un cáncer de vejiga, (xi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 11A o 11B se compara con el estado de metilación de un melanoma, (xii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 12A se compara con el estado de metilación de un cáncer de mama, (xiii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 13A o 13B se compara con el estado de metilación de de una neoplasia mieloide, (xiv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 14A o 14B se compara con el estado de metilación de un cáncer testicular y/o (xv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 15D o 15B se compara con el estado de metilación de un cáncer de estómago.
El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el estado de metilación del ADN se mide por un método seleccionado del grupo que consiste en PCR especifica de metilación (MSP), un método basado en enriquecimiento (por ejemplo, MeDIP, MBD-seq y MethylCap), secuenciación con bisulfito y método basado en bisulfito (por ejemplo, RRBS, secuenciación con bisulfito, Infinium, GoldenGate, COBRA, MSP, MethyLight) y un método de digestión de restricción (por ejemplo, MRE-seq) o conversión diferencial, restricción diferencial, peso diferencial del gen diana metilado en ADN de células troncales pluripotentes comparado con los datos de metilación de ADN de los mismos genes diana.
Un método para tratar un cáncer de origen primario desconocido (CPD) en un sujeto que comprende los pasos de: (i) determinar el perfil de metilación en una región seleccionada de un ADN aislado de dicho CPD, (ii) comparar el perfil de metilación de dicha región seleccionada con el perfil de metilación de la misma región en una muestra de ADN aislada de al menos un tumor primario y (iii) tratar al sujeto con una terapia adecuada para dicho tumor primario en donde el perfil de metilación obtenido en (i) muestra una identidad sustancial con el perfil de metilación del tumor primario.
10. El método según la reivindicación 9 en donde el tumor primario se selecciona del grupo que consiste en una neoplasia linfoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de próstata, glioma, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de mama, una neoplasia mieloide, cáncer testicular, cáncer de estómago.
11. El método según la reivindicación 10 en donde la determinación del estado de metilación comprende la determinación del estado de metilación en uno o más sitios CpG como se define en las tablas 1 a 15 en donde (i) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 1A o en la tabla IB se compara con el estado de metilación de una neoplasia linfoide, (ii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 2A o 2B se compara con el estado de metilación de un cáncer de cabeza y cuello, (iii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 3A o 3B se compara con el estado de metilación de un cáncer pancreático, (iv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 4A o 4B se compara con el estado de metilación de de un cáncer endometrial, (v) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 5A o 5B se compara con el estado de metilación de un cáncer de colon, (vi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 6A o 6B se compara con el estado de metilación de un cáncer de próstata, (vii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 7A o 7B se compara con el estado de metilación de un glioma, (viii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 8A o 8B se compara con el estado de metilación de un cáncer ovárico, (ix) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 9A o 9B se compara con el estado de metilación de un cáncer de pulmón, (x) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 10A o 10B se compara con el estado de metilación de de un cáncer de vejiga, (xi) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 11A o 11B se compara con el estado de metilación de un melanoma, (xii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 12A se compara con el estado de metilación de un cáncer de mama, (xiii) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 13A o 13B se compara con el estado de metilación de de una neoplasia mieloide, (xiv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 14A o 14B se compara con el estado de metilación de un cáncer testicular y/o (xv) el estado de metilación en uno más sitios CpG como se definen en la tabla 15A o 15B se compara con el estado de metilación de un cáncer de estómago.
El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el estado de metilación del ADN se mide por un método seleccionado del grupo que consiste en PCR especifica de metilación (MSP), un método basado en enriquecimiento (por ejemplo, MeDIP, MBD-seq y MethylCap), secuenciación con bisulfito y método basado en bisulfito (por ejemplo, RRBS, secuenciación con bisulfito, Infinium, GoldenGate, COBRA, MSP, MethyLight) y un método de digestión de restricción (por ejemplo, MRE-seq) o conversión diferencial, restricción diferencial, peso diferencial del gen diana metilado en ADN de células troncales pluripotentes comparado con los datos de metilación de ADN de los mismos genes diana.
13. Un kit para su uso en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende una pluralidad de cebadores o sondas específicos para determinar un estado de metilación de un sitio CpG expresado por un CPD.
14. El kit según la reivindicación 13 que comprende cebadores y sondas específicos para determinar el estado de metilación en uno o más sitio CpG como se define en las tablas 1 a 15.
15. Un sistema informático que se proporciona con medios para implementar los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
16. Un programa informático que comprende un código de programación para ejecutar los pasos de los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 si se llevan a cabo en un ordenador.
17. Un medio de datos legible por ordenador que comprende un programa informático según la reivindicación 15 en forma de un código de programación legible por ordenador. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a métodos y reactivos para la identificación del origen de un carcinoma de origen primario desconocido (CPD) basada en la determinación del perfil de metilación en el genoma del CPD. La invención se refiere también a métodos para seleccionar una terapia adecuada para un paciente gue padece un CPD asi como a métodos para la medicina personalizada de pacientes gue padecen un CPD basándose en el uso de un tratamiento que sea adecuado para el tumor primario del que deriva el CPD. La invención también se refiere a kits que comprenden reactivos adecuados para realizar los métodos anteriores asi como a sistemas y programas informáticos que se pueden usar para implementar los métodos de la invención.
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