CN114438201A - 一种肿瘤标志物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物和医学检验领域，涉及一种肿瘤标志物组合及其应用，本发明的肿瘤标志物组合可用于制备预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后的制品；尤其是利用肿瘤标志物组合中的GDF15和ACVR1基因的甲基化水平及表达改变，预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后。本发明的制品可应用检测肿瘤组织、肿瘤组织培养物、体液中GDF15和ACVR1两个基因甲基化降低、表达量增加以实现预测肿瘤、鉴别肿瘤恶性程度和评估肿瘤预后等，其中所述的GDF15和ACVR1的单独检测和联合应用。本发明可为有效评估肿瘤恶性程度及预后，提供可靠的方法。

Description

一种肿瘤标志物组合及其应用
技术领域
本发明属生物和医学检验领域，涉及一种肿瘤标志物组合及其应用，本发明的肿瘤标志物组合可用于制备预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后的制品；尤其是利用肿瘤标志物组合中的GDF15和ACVR1基因的甲基化水平及表达改变，预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后。
背景技术
现有技术公开了转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路与肿瘤发生及进程具有紧密作用[1]。尽管TGF-β信号通路通常在肿瘤形成及进展中被激活，然而其与肿瘤间的关系却错综复杂，时而促进，时而抑制[1]。因此，本发明的研究团队推测在TGF-β众多信号通路中，可能只有部分通路才是其促进肿瘤恶性进展的关键；在进一步研究中发现：一些肿瘤细胞中，高表达TGF-β超级家族中的两个重要因子，生长与分化因子15(Growth and Differentiation Factor 15,GDF15)[2]和ACVR1(activin A receptortype 1)[3]。GDF15是TGF-β超家族BMP亚家族中的一员，在多种肿瘤中表达增高[2，4]，并与肥胖、糖尿病、恶病质等多种疾病相关[5-7]。ACVR1(activin A receptor type 1)激活素是属于结构相关信号蛋白转化生长因子β(TGFβ)超家族的二聚生长和分化因子，在肿瘤中常存在着突变[3]；有研究者指出突变ACVR1阻止小胶质细胞分化，以驱动小儿胶质瘤的发生[8]。但有研究者认为ACVR1基因表达的激活，才是驱动癌症发生及进程的关键。另一方面，GDF15和ACVR1与肿瘤之间的关系尚未完全明确，而且GDF15和ACVR1甲基化和表达量改变与肿瘤恶性程度及预后间的明确关系，也未证实。
基于现有技术的研究基础与现状，本申请的发明人拟提供一种肿瘤标志物组合及其应用，本发明的肿瘤标志物组合可用于制备预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后的制品；尤其是利用肿瘤标志物组合中的GDF15和ACVR1基因的甲基化水平及表达改变，预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后。
与本发明相关的参考文献：
1.Calon A,Tauriello DV,Batlle E.TGF-beta in CAF-mediated tumor growthand metastasis.Semin Cancer Biol.2014；25:15-22.
2.Tarfiei GA,et al.GDF15 induced apoptosis and cytotoxicity in A549cells depends on TGFBR2expression.Cell Biochem Funct.2019Jul；37(5):320-330.
3.Valer JA,et al.ACVR1 Function in Health and Disease.Cells.2019；8(11):1366.
4.Li C et al.GDF15 promotes EMT and metastasis in colorectalcancer.Oncotarget.2016Jan 5；7(1):860-72.
5.Luan HH,et al.GDF15 Is an Inflammation-Induced Central Mediator ofTissue Tolerance.Cell.2019；178(5):1231-1244.e11.
6.Hsu JY,et al.Non-homeostatic body weight regulation through abrainstem-restricted receptor for GDF15.Nature.2017；550(7675):255-259.
7.Coll AP,et al.GDF15 mediates the effects of metformin on bodyweight and energy balance.Nature.2020Feb；578(7795):444-448.
8.Fortin F.et al.Mutant ACVR1 Arrests Glial Cell Differentiation toDrive Tumorigenesis in Pediatric Gliomas.2020,37(3):308-323.。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤标志物组合及其应用，本发明的肿瘤标志物组合可用于制备预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后的制品；尤其是利用肿瘤标志物组合中的GDF15和ACVR1基因的甲基化水平及表达改变，预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后。
本发明研究了GDF15和ACVR1与肿瘤之间的关系，研究发现：在恶性程度高的肿瘤中GDF15和ACVR1的表达量显著性增加，研究结果提示：GDF15和ACVR1基因激活，可能在肿瘤的恶性进程中具有关键性作用。本申请进一步研究发现GDF15和ACVR1基因激活与肿瘤的恶性程度及临床预后之间具有密切关系；基于此，本申请提出：检测GDF15和ACVR1基因激活，可以作为预测肿瘤恶性程度和预后的有效指标。
本发明提供了一种肿瘤标志物组合，其包括两种辅助肿瘤检测、恶性分级及预后判定的标志物，所述的标志物是GDF15和ACVR1,本发明研究结果表明所述的肿瘤预测、分级、预后与GDF15和ACVR1基因在肿瘤细胞中甲基化改变、基因表达量改变相关。
本发明提供了一种肿瘤标志物组合，所述的标志物是GDF15和ACVR1，其可应用检测肿瘤组织、肿瘤组织培养物、体液中GDF15和ACVR1这两个基因甲基化降低、表达量增加以实现预测肿瘤、鉴别肿瘤恶性程度和评估肿瘤预后。
本发明提供了为简便且以高精度检测癌症、分析癌症恶性程度及预后评估提供了一种方法；所述方法涉及的肿瘤标志物是GDF15和ACVR1基因，所述的肿瘤预测、分级、预后与GDF15和ACVR1基因在肿瘤细胞中甲基化改变、基因表达量改变相关，其中甲基化降低、表达量高预示肿瘤恶性程度高及预后不良。
本发明方法中包括：单独利用GDF15或ACVR1激活对肿瘤进行分级或预后判断；联合利用GDF15和ACVR1的激活来对肿瘤进行分级或预后判断；GDF15和/或ACVR1与其它潜在指标联合后用以对肿瘤进行分级或预后判断；GDF15联合ACVR1后再与其它潜在指标相结合用以对肿瘤进行分级或预后判断：
其中，
S1单独利用GDF15或ACVR1的甲基化和表达来对肿瘤进行分级和预后判断；
S2联合利用GDF15和ACVR1的甲基化和表达来对肿瘤进行分级和预后判断；
S3 GDF15和/或ACVR1与其它潜在指标联合后用以对肿瘤进行分级和预后判断；
S4 GDF15联合ACVR1后再与其它潜在指标相结合用以对肿瘤进行分级或预后判断；
本发明中研究显示：在恶性程度高的肿瘤中，存在GDF15和ACVR1基因功能的激活，导致所述基因表达量的增加，从而促进肿瘤的恶性进程。
本发明中研究显示导致GDF15和ACVR1基因表达量增加，可以由基因的甲基化、乙酰化等修饰改变、上游激动剂增加、拮抗剂减少等因素所致。
本发明中研究显示：无论是GDF15还是ACVR1基因表达产物的增加，均与各种肿瘤的恶性进程及不良预后高度相关，并可作为肿瘤不良预后的标志物。
本发明中研究显示：无论是GDF15还是ACVR1基因甲基化程度的降低，均与多种肿瘤的恶性进程及不良预后高度相关；所述的GDF15和ACVR1基因在肿瘤细胞中突变、基因甲基化改变、基因表达量改变，这三项检测指标可以单独使用，也可以任意组合联合应用。
本发明中研究显示：联合利用GDF15和ACVR1基因表达量的增加，有利于提高对各种肿瘤的恶性进程及不良预后评估的效率，提高灵敏度；以及联合利用GDF15和ACVR1基因甲基化的降低，有利于提高对各种肿瘤的恶性进程及不良预后评估的效率，提高灵敏度。
本发明中，可以直接检测GDF15和ACVR1表达的绝对量，表达量增加；也可以和正常组织(包括癌旁组织)的比值，来预测肿瘤恶性程度、转移能力、耐药性、生存期等恶性指标的评估，以及对肿瘤进行分子分型等。
本发明中，在免疫组化、免疫荧光结果以阳性程度及阴性作为相应基因蛋白判定依据，阳性强的预后差；包括肿瘤组织阳性及细胞外阳性。
本发明中，Western blot以阳性程度及阴性，或定量作为相应基因表达蛋白产物判定依据，浓度高的恶性程度高、预后差；流式细胞术以阳性细胞比例作为判定，阳性率高的恶性程度高、预后差；免疫学方法、化学法检测肿瘤组织或肿瘤分泌的GDF14和ACVR1浓度，浓度高的恶性程度高、预后差。
本发明中，所述的RT-PCR检测所述基因的RNA产物，逆转录后，涉及到PCR包括：普通PCR、荧光定量PCR、巢式PCR、多重PCR、数字PCR等。
本发明中，所述的基因的表达量包括：和自身内参的比较、和自身内参的比较后再与癌旁组织、和自身内参的比较后再与正常组织相比较。
本发明中涉及到检测上述基因表达产物包括：蛋白质和RNA。
本发明中涉及到检测的上述基因产物，既包括肿瘤细胞中的，也包括各种原因进入体液中的mRNA、DNA、蛋白，包括是完整和片段。
本发明中所涉及的用于分析的生物样品包括但不限于体液、肿瘤组织及培养中的肿瘤细胞。
本发明所涉及的体液包括血液、尿液、胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、消化液、精液、肿瘤穿刺液、淋巴液等。
本发明所涉及的血液包括全血、血清、血浆、分离有核细胞、血液中的循环肿瘤细胞等。
本发明涉及的实用范围为广谱肿瘤，包括：肺癌、肝癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、皮肤癌、淋巴瘤、白血病、肾癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、神经系统肿瘤等所有肿瘤类型。
本发明中涉及的：基因产物的检测(包括蛋白水平和RNA水平，检测方法涉及：免疫组化、免疫荧光、Western blot、ELISA、流式细胞术检测、RT-PCR、免疫学检测、化学法检测、荧光定量PCR、mRNA Sequencing、mRNA array等检测技术，但不仅限于这些技术)、基因甲基化检测(包括各种检测基因甲基化的方法)等。
本发明所涉及所述的RT-PCR检测上述基因的RNA产物，逆转录后，涉及到PCR包括：普通PCR、荧光定量PCR、巢式PCR、多重PCR、数字PCR等。
本发明的有益效果是：
本发明涉及的肿瘤标志物及其组合可用于制备可用于制备预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后的制品，进一步用于恶性肿瘤的疗效评估、肿瘤药物筛选、肿瘤分子分型等。进一步，本发明提供了简便且高精度快速筛选是否存在恶性肿瘤、鉴定肿瘤恶性程度及判断预后的一种方法。
附图说明
图1.神经胶质瘤细胞株表达GDF15和ACVR1，其中，(A)神经胶质瘤细胞株U251，A172具有不同的成瘤能力；(B)RT-PCR结果显示：与A172相比，恶性程度高的U251细胞高表达GDF15和ACVR1；(C)免疫荧光结果显示：GFD15和ACVR1蛋白在恶性神经胶质瘤细胞中表达。
图2.mRNA Sequencing结果，显示：GDF15在不同神经胶质瘤病人中的表达及表达量与恶性程度及预后间的关系。(A)散点图显示：病人的不同分级、不同的生存期与GDF15间的关系，总体上mRNA含量高者恶性程度高、预后差；(B)胶质瘤不同恶性分级与GDF15表达量之间的关系；(C)GDF15表达量差异能有效的将不同生存预期的病人区分开。
图3.mRNA Sequencing结果，显示：ACVR1在不同神经胶质瘤病人中的表达及表达量与恶性程度及预后间的关系。(A)散点图显示：病人的不同分级、不同的生存期与ACVR1间的关系，总体上mRNA含量高者恶性程度高、预后差；(B)胶质瘤不同恶性分级与ACVR1表达量之间的关系；(C)ACVR1表达量差异能有效的将不同生存预期的病人区分开。
图4.甲基化检测结果，显示：GDF15在不同神经胶质瘤病人中的甲基化水平与恶性程度及预后间的关系。(A)散点图显示：病人的不同分级、不同的生存期与GDF15甲基化水平间的关系，总体上甲基化低恶性程度高、预后差；(B)胶质瘤不同恶性分级与GDF15甲基化之间的关系；(C)GDF15甲基化程度的差异能有效的将不同生存预期的病人区分开。
图5.甲基化检测结果，显示：ACVR1在不同神经胶质瘤病人中的甲基化水平与恶性程度及预后间的关系。(A)散点图显示：病人的不同分级、不同的生存期与ACVR1甲基化水平间的关系，总体上甲基化低恶性程度高、预后差；(B)胶质瘤不同恶性分级与ACVR1甲基化之间的关系；(C)ACVR1甲基化程度的差异能将不同生存预期的病人区分开。
具体实施方式
实施例1
实验研究显示，人神经胶质细胞株U251具有成瘤性，而野生型A172细胞不具有成瘤性(图1A)；RT-PCR结果显示：与A172细胞相比，U251细胞高表达生殖细胞GDF15和ACVR1基因(图1B)；免疫荧光证实GDF15和ACVR1蛋白在U251细胞中表达(图1C)。
进一步通过分析中国脑胶质瘤基因组图谱数据库，结果显示：GDF15 RNASequencing在恶性程度高的神经胶质瘤细胞中表达增高，不同生存预期的病人，其GDF15表达量的高低存在差异，总体上GDF15表达量高的病人，预后较差，生存期较短(图2A,B)；用GDF15表达量高低差异可以将具有不同生存预期的神经胶质瘤病人区分开(P<0.0001****)(图2C)；研究结果显示，用GDF15 RNA Sequencing结果对病人生存期评估的效率好，灵敏度高，特异性较好(表1)；
通过分析中国脑胶质瘤基因组图谱数据库，结果显示：ACVR1 RNA Sequencing在恶性程度高的神经胶质瘤细胞中表达增高，不同生存预期的病人，其ACVR1表达量的高低存在差异，总体上ACVR1表达量高的病人，预后较差，生存期较短(图3A,B)；用ACVR1表达量高低差异可以将具有不同生存预期的神经胶质瘤病人区分开(P<0.0001****)(图3C)；研究显示：用ACVR1 RNA Sequencing结果对病人生存期评估的效率好，灵敏度高，特异性较好(表1)；
研究结果表明：将GDF15 RNA Sequencing和ACVR1 RNA Sequencing结果相结合，可以提高对肿瘤恶性程度及预后评估的灵敏度，优于单项指标的使用(表1)；GDF15和ACVR1联用，对病人预后的判断的灵敏度与临床上现用的1p19q non-codel相比，能大幅提升特异性，本发明的检测标志物可以提高神经胶质瘤预后的可信度；
Figure BDA0002763632370000061
通过分析中国脑胶质瘤基因组图谱数据库，结果显示：在恶性程度高的神经胶质瘤细胞中GDF15甲基化水平低，总体上GDF15甲基化水平较低的病人，预后较差，生存期较短(图4A,B)；用GDF15甲基化水平高低可以将具有不同生存预期的神经胶质瘤病人区分开(P<0.0001****)(图4C)；用GDF15甲基化结果对病人预后评估的效率好，灵敏度高，特异性较好(表2)；
通过分析中国脑胶质瘤基因组图谱数据库，结果显示：在恶性程度高的神经胶质瘤细胞中ACVR1甲基化水平低，总体上ACVR1甲基化水平较低的病人，预后较差，生存期较短(图5A,B)；用ACVR1甲基化水平高低可以将具有不同生存预期的神经胶质瘤病人区分开(P<0.0001****)(图5C)；用ACVR1甲基化结果对病人预后评估的效率好，灵敏度高，特异性较好(表2)；
研究结果表明，将GDF15甲基化和ACVR1甲基化结果相结合，可以提高对肿瘤恶性程度及预后的评估的灵敏度(表2)。
本发明的研究结果表明，GFD15和ACVR1基因的激活和表达量的增加与神经胶质瘤的恶性程度相关，GFD15和ACVR1基因的激活和表达量的增加可以用于区分肿瘤的恶性程度及预后判断；联合GFD15和ACVR1基因激活和表达量的检测结果，有利于提高预测的灵敏度。
Figure BDA0002763632370000071

Claims (10)

1.一种肿瘤标志物组合，其特征在于，其包括生长与分化因子GDF15和ACVR1。
2.权利要求1的肿瘤标志物组合在用于制备预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后的制品中的用途；所述制品中利用肿瘤标志物组合中的GDF15和ACVR1基因的甲基化水平及表达改变，预测肿瘤、肿瘤恶性程度及预后。
3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的制品通过下述方法辅助肿瘤预测、临床分级及预后判断：其中，所述的肿瘤标志物是GDF15和ACVR1基因，所述的肿瘤预测、分级、预后与GDF15和ACVR1基因在肿瘤细胞中甲基化改变、基因表达量改变相关，其中甲基化降低、表达量高预示肿瘤恶性程度高及预后不良；其中包括，
S1单独利用GDF15或ACVR1的甲基化和表达来对肿瘤进行分级和预后判断；
S2联合利用GDF15和ACVR1的甲基化和表达来对肿瘤进行分级和预后判断；
S3 GDF15和/或ACVR1与其它潜在指标联合后用以对肿瘤进行分级和预后判断；
S4 GDF15联合ACVR1后再与其它潜在指标相结合用以对肿瘤进行分级或预后判断。
4.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的恶性肿瘤为广谱肿瘤，包括：肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、皮肤癌、淋巴瘤、白血病、肾癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、神经系统肿瘤类型。
5.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述制品检测肿瘤组织、体液包括血液、脑脊液、尿液、胸腔积液、肿瘤穿刺液、培养的肿瘤细胞等中GDF15和ACVR1基因改变、表达量的检测以及分泌的GDF15，作为预测肿瘤恶性程度、转移能力、耐药性、靶向药物筛选、分子分型、生存期预后评估指标。
6.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述制品检测基因表达产物包括：蛋白质和RNA。
7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述基因产物包括肿瘤细胞中的，和各种原因进入体液中的mRNA、DNA、蛋白，包括是完整和片段。
8.按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的血液包括全血、血清、血浆、分离有核细胞、血液中的循环肿瘤细胞。
9.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述检测基因包括：基因表达的检测包括蛋白水平和RNA水平，检测方法涉及：免疫组化、免疫荧光、Western blot、ELISA、流式细胞术检测、RT-PCR、免疫学检测、化学法检测、荧光定量PCR、mRNA Sequencing、mRNA array检测技术，基因甲基化检测。
10.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述恶性分级及预后判断包括：恶性程度、转移能力、耐药性、靶向药物的选择、生存期评估。
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