CN101586151A - 预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用PCR方法检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的特异性引物、探针，特异性引物和探针在制备通过PCR扩增生物核酸样品检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的试剂中的用途、检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的试剂盒及试剂盒的用途。属于医药领域。

Description

预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒

技术领域

本发明涉及通过检测表皮生长因子受体的基因多态性，预测生长因子受体抑制剂药物的疗效。本发明属于医药领域。

背景技术

药物基因组学主要研究基因变异所致的不同患者对药物的不同反应，并在此基础上研制新的药物或新的用药方法。药物基因组学区别于一般意义上的基因学，它不是以发现人体基因组为主要目的，而是相对简单地用已知的基因学理论改善患者的治疗。药物基因组学不能简单地看成是预测易患病的体质，或者提供统计学资料用于预测发病危险性的试验，它是研究有关基因对药物作用本身产生的影响及与基因变异的关系，而这些变异又是不同个体产生不同药物效应的根本原因。药物基因组学以追求药物效应及安全性为目的，研究各种基因突变与药效及安全性之间的关系。药物基因组学主要在基因水平研究药效的差异，由于基因分析技术的发展，药物基因组学对医药行业会越来越大。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)基因位于7号染色体短臂7p12-14区，由28个外显子组成。所编码的蛋白质属I型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，分子量约为170KDa。EGFR的前体为含有1210个氨基酸残基的单一多肽链，其中24个氨基酸为信号肽段，在翻译加工时被裂解，故成熟的EGFR是由1186个氨基酸组成的受体酪氨酸蛋白激酶。EGFR包括胞外区、跨膜区、胞内区三个部分，外显子15编码单一的跨膜序列以及这一序列两边的少量氨基酸残基，跨膜区由23个氨基酸残基组成，将受体锚定在胞膜上。EGFR的胞外区由外显子2-14编码。由621个氨基酸组成，是其与相应的配体结合所在部位。酪氨酸激酶区由外显子由542个氨基酸残基组成，是典型的ATP结合位点和酪氨酸激酶区。

EGFR广泛分布于正常的哺乳动物上皮细胞表面，平均每个细胞受体个数为5×10⁴-10×10⁴。研究表明EGFR配体通过与EGFR相互作用，将有丝分裂信号向下传递，从而调控细胞周期、调节细胞生长与分化和促进损伤修复。正常组织中，EGFR呈低表达或不表达，而在包括非小细胞肺癌在内的多种上皮源性肿瘤中EGFR呈过表达，且与肿瘤增生、转移、放化疗敏感性下降关系密切，是极具发展前途的基因治疗靶位。

在对肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、食管癌、肺癌、头颈部肿瘤和脑肿瘤的研究发现，EGFR信号传导失调的肿瘤占相当大的比重(Kim HG，[J].Histol Histopathol，1999，14(4)：1175-1182)。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管生成、粘附、侵袭、转移和肿瘤细胞的凋亡(NormannoN，J Cell Physiol，2003，194(1)：13-19)。

针对EGFR的靶向抑制剂主要有4类：①阻断EGFR胞外受体功能区的单克隆抗体(EGFR-Mab)；②抑制EGFR胞内酪氨酸激酶(TK)功能区自磷酸化的小分子药物(EGFR-TKI)；③阻断EGFR产生的反义核昔酸；④一些毒素与EGFR及其配位子或者单克隆抗体形成复合物，通过其毒性而达到杀死肿瘤细胞的目的。其中，小分子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)以吉非替尼(英文名Gefitinib，商品名：易瑞沙Iressa)和埃罗替尼(英文名：Erlotinib，商品名：特罗凯Tarceva)为代表.

II期IDEAL1和IDEAL2的临床试验表明，ZD1839单药治疗化疗失败的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的有效率分别为18.4％和11.8％，疾病稳定率(SD)分别为54.4％和42.2％(MuXL，[J].Clin Cancer Res，2005，11：4289-4294.Chabner BA.[J].Oncologist，2004，9：245-246)。研究发现它主要是通过竞争性阻断胞内TK功能区的ATP结合位点而阻止EGFR的自磷酸化，进而经过以下途径来提高肿瘤细胞放射敏感性①EGFR-TKI能增强放疗诱导的细胞周期再分布效应，使更多的细胞集中在G1-M期，而S期细胞更少；②提高放射治疗诱导的肿瘤细胞凋亡；③抑制放疗引起的肿瘤细胞损伤的修复。另外，也有研究发现，ZD1839还能抑制肿瘤内的血管生成而进一步提高肿瘤的放射敏感性。

EGFR属于I型生长因子受体家族，具有受体酪氨酸激酶活性。EGFR的酪氨酸激酶功能区含有3个重要结构：①氨基端小叶(N-lobe)，由5条平行的b-折迭构成，其中的ATP磷酸结合环(P-Loop)的GSGSFG序列是ATPγ-磷酸基团的主要结合位点；②αC螺旋(αChelix)，此螺旋中含有ATP的α-和β-磷酸基团结合位点。当αC螺旋与ATP结合后，其构象发生改变，从而引起受体自身磷酸化和激酶活化；③羧基端小叶(C-lobe)，此小叶中的活化环(A-loop)是酪氨酸激酶的活性中心，由20～30个氨基酸组成，其中DFG序列在所有酪氨酸激酶中高度保守，改变此序列的组成或构象将显著影响激酶活性。

迄今为止发现的EGFR基因突变90％以上位于外显子18～21，这些突变可以分为4种类型：

1.第18外显子2155位G→A置换，导致甘氨酸719密码子错义突变成半胱氨酸(L861Q)。

2.外显子19碱基缺失主要是第746～752位密码子的碱基缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸(ELREATS)序列丢失，这一缺失改变了受体ATP结合囊(ATP-bindingpocket，ABP)的角度，从而显著增强癌细胞对Gefitinib的敏感性(SodellaR，.Science，2004，305：1163-1167.KosakaT，Cancer Res，2004，64：8919-8923.)。据不完全统计，目前国内外已发现的外显子19基因突变至少有22种不同的类型。

3.外显子20的点突变或碱基插入突变点突变主要是第790位密码子出现C-T转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸(T790M)，这一突变仅见于药物治疗后复发者，突变使得癌细胞对Gefitinib和Erlotinib产生抗性(PaoW，PLoS Medicine，2005，2：57-61)。碱基插入突变出现在第770～775位密码子，在GACAACCCCCACGTGTGC序列之间(主要在CCCCC序列两侧)存在8种不同的插入方式，插入的片段为3～9个碱基。这类插入突变的临床意义目前尚不清楚(Shigmatsu H，.JNCI，2005，97：339-346)。

4.外显子21的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸(简称L858R)，此突变位于DFG序列附近，其作用是使A-loop的稳定性提高，癌细胞对Gefitinib和Erlotinib的敏感性明显增强。

美国哈佛医学院Lynch等(LynchTJ，NEnglJ Med，2004，350：2129-2139.)报道了16例接受Gefitinib治疗的肺癌病人，9例有效者中8例存在EGFR基因突变(其中4例为del E746-A750，2例为外显子21L858R，1例为L861Q，另1例的突变出现在外显子18，为G719C，而7例无效者均为野生型，首次揭示EGRF基因突变与药物疗效的关系。此后不久，该院另一组研究者Paez等(PaezJG，Science，2004，304：1497-1500.)也报道，在9例肺癌病人中，5例Gefitinib治疗有效者均为EGFR突变型(4例为外显子19缺失突变，1例为L858R)，而4例无效者均为野生型。美国华盛顿大学Pao等(Pao WPNAS，2004，101：13306-13311).报道了类似的研究结果，在10例Gefitinib治疗有效者7例检测到EGFR基因突变(其中6例为外显子19缺失突变，1例为L858R)，而8例无效者均为野生型。但该作者还率先报道，7例经Erotinib治疗有效者中5例存在EGFR基因突变(3例为外显子19缺失突变，3例为L858R，其中1例同时存在外显子19和21突变)，而10例无效者均为野生型。

除美国学者外，亚洲学者也相继报道了各自的研究结果。韩国汉城大学Han等(HanSW，JClinOncol，2005，23：1-9.)报道，17例EGFR突变型肺癌经Gefitinib治疗后11例显效64.7％，其中4例为外显子19缺失突变，5例为L858R，2例为外显子18突变G719A，而73例野生型肺癌中仅10例(13.7％)有效。此外，还首次报道，EGFR突变型的疾病进展时间(TTP)和总体生存率(OS)等指标均显著优于野生型，提示突变型病人经药物治疗的预后较好。

日本Aichi癌症中心医院(Mitsudomi J Clin Oncol，2005，11：2513-2520).也报道了EGFR基因突变、Gefitinib疗效与预后的关系。作者分析了经Gefitinib治疗的术后复发病人，发现20例治疗后肿瘤缩小≥30％的病人中，19例(95％)为EGFR突变型，而17例治疗后病情进展的病人中，仅2例(12％)为突变型。此外，还观察到，外显子19碱基缺失者的有效率(16/16例，100％)显著高于点突变(G719C，L858R和L861Q，5/8例，67％)，并且治疗有效者的生存率显著高于无效者，Kaplan-Meier检验揭示EGFR基因突变是影响预后的主要因素。

中国台湾研究者Huang等(HuangSF，ClinCancer Res，2004，10：8195-8203.)首先报道了我国EGFR基因突变与Gefitinib治疗的关系，在19例接受药物治疗的病人中，有效(PR)6例均为突变型(其中2例为外显子19缺失，2例L858R，2例为外显子21突变A839T和K846R)，而无效7例中仅1例为突变型。

北京协和医科大学Mu等(MuXL，Clin Cancer Res，2005，11：4289-4294.)报道了中国大陆的首份研究结果，22例经Gefitinib治疗的病人中7例有效(PR)，7例病情稳定(SD)，8例病情进展(PD)，在14例PR+SD病人中，10例为突变型(71.4％)，而PD病人均为野生型。与Mitsudomi等的报道不同之处是，6例L858R突变中5例为PR，1例为SD，而4例外显子19缺失中PR与SD各为2例。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中表皮生长因子突变，提供一种用PCR方法检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的探针：

SEQUENCE 1：VIC-ATTAAGAGAAGCAACATCT；

SEQUENCE 2：FAM-CCAAACAGCTGGGTG。

同时，本发明还提供一种用PCR方法检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的特异性引物：

SEQUENCE 3：CCGCAGCATGTCAAGATCAC

SEQUENCE 4：TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT。

同时，本发明又提供特异性引物CCGCAGCATGTCAAGATCAC、TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT和探针VIC-ATTAAGAGAAGCAACATCT、FAM-CCAAACAGCTGGGTG在制备通过PCR扩增生物核酸样品检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的试剂中的用途。其中，试剂包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、Mg²⁺。

同时，本发明又提供一种检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的试剂盒。

本发明提供的试剂盒包括：聚合酶链式反应扩增试剂组合物、检测表皮生长因子受体基因多态性的检测组合物、表皮生长因子受体基因野生/突变基因型阳性对照质粒。

其中，聚合酶链式反应扩增试剂组合物包括Taq DNA聚合酶、聚合酶链式反应缓冲液、dNTP混合物、Mg²⁺。扩增中各组分的比例经过试验进行优化。其中，Taq DNA聚合酶，是可以热启动的Taq DNA聚合酶。

其中，检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的检测组合物，包括：

探针：

SEQUENCE 1：VIC-ATTAAGAGAAGCAACATCT；

SEQUENCE 2：FAM-CCAAACAGCTGGGTG。

引物：

SEQUENCE 3：CCGCAGCATGTCAAGATCAC

SEQUENCE 4：TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT。

探针SEQUENCE1为针对第21外显子L861Q位点野生型的探针，而探针SEQENCE 2为针对第21外显子L861Q位点突变型的探针。引物SEQENCE 3、SEQENCE 4分别为针对EGFR基因第21外显子L861Q多态性位点的特异性正向引物和反向引物。

本发明涉及的检测表皮生长因子受体基因多态性的检测组合物，是针对EGFR基因的一个多态性位点的检测。在检测组合物中，探针可以是普通的Taqman探针，也可以是MGB探针。探针的的5’端用发光基团荧光标记，3’端采用淬灭基团荧光标记。5’端的标记荧光基团可以是FAM、ROX、TET、HEX、TAMRA、CY3、CY5、JOE、Texas red等中间的一种，3’端的标记基团可以是TAMRA，NFQ中的一种。

同时，本发明还提供了本发明所述的试剂盒通过检测生物样品确定该生物样品表皮生长因子受体第21外显子基因型多态性的用途。

同时，本发明还提供了本发明所述的试剂盒通过检测生物样品预测表皮生长因子受体抑制剂治疗恶性肿瘤的疗效的用途。

其中，如果生物样品EGFR第21外显子为L861Q纯合突变型，则预测表皮生长因子受体抑制剂治疗恶性肿瘤的疗效好；如果为杂合型或者野生型，则预测表皮生长因子受体抑制剂治疗恶性肿瘤的疗效差。

在本发明提供的用途中，所述的试剂盒包括：聚合酶链式反应扩增试剂组合物、检测表皮生长因子受体基因多态性的检测组合物、表皮生长因子受体基因野生/突变基因型阳性对照质粒。

其中，聚合酶链式反应扩增试剂组合物包括Taq DNA聚合酶、聚合酶链式反应缓冲液、dNTP混合物、Mg²⁺。扩增中个组分的比例经过试验进行优化。其中，Taq DNA聚合酶，是可以热启动的Taq DNA聚合酶。

其中，检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的检测组合物，包括：

探针：

SEQUENCE 1：VIC-ATTAAGAGAAGCAACATCT；

SEQUENCE 2：FAM-CCAAACAGCTGGGTG。

引物：

SEQUENCE 3：CCGCAGCATGTCAAGATCAC

SEQUENCE 4：TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT。

探针SEQENCE1为针对第21外显子L861Q位点野生型的探针，而探针SEQENCE 2为针对第21外显子L861Q位点突变型的探针。引物SEQENCE 3、SEQENCE 4分别为针对EGFR基因第21外显子L861Q多态性位点的特异性正向引物和反向引物。

在本发明提供的用途中，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂药物是指针对于EGFR酪酸激酶活性区域的抑制剂，或者称为酪氨酸激酶抑制剂药物。优选地，本发明所指的EGFR抑制剂是指小分子酪氨酸激酶抑制剂。更加优选地，本发明所指的小分子酪氨酸激酶抑制剂指的是吉非替尼(英文名Gefitinib，商品名：易瑞沙Iressa)和埃罗替尼(英文名：Erlotinib，商品名：特罗凯Tarceva)。

在本发明提供的用途中，检测生物样本均为DNA或者mRNA样本，优选地，本发明针对的样本为来源于肿瘤组织的基因样本。在本发明提供的用途中，恶性肿瘤包括但不限于肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部鳞癌。

更加优选地，本发明针对的样本为来源于肺癌组织的样本，尤其是来源于非小细胞肺癌的基因组DNA样本。

在本发明提供的用途中所使用的基因扩增仪包括所有的2通道以上的荧光定量PCR仪，以及不设通道的光栅控制的荧光定量PCR仪。

本发明用于检测样本基因型的过程：

1.检测样本的准备

如样本为DNA样本，直接用紫外分光光度计检测样本浓度和纯度，要求样本的OD260/OD280比值在1.8-2.0，并将样本稀释至合适的浓度范围，具体为20ng/ml-400ng/ml之间。

如样本为mRNA，则需要逆转录反应，然后依照DNA的要求进行样本的准备。

2.样本目的基因片段的扩增

以欲检测的DNA样本为模板，使用检测混合物以及相应配套的阳性对照和阴性对照，在合适的基因扩增仪上，应用聚合酶链式反应(PCR)进行相应多态性位点的基因扩增。在合适的基因扩增仪上进行扩增。

3.目的基因多态性荧光扫描和基因型判定。

将扩增产物放入合适的实时定量PCR仪，进行荧光扫描。根据阳性对照的扫描结果和荧光扫描结果判定样本的基因型。

4.预测表皮生长因子受体抑制剂疗效

根据基因型进行表皮生长因子受体抑制剂的疗效预测。具体的，如果样本为外显子21L861Q纯合突变型，则预测药物疗效好；如果为杂合型或者野生型则预测疗效差。

本发明的优点是：以特异性引物CCGCAGCATGTCAAGATCAC、TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT和探针VIC-ATTAAGAGAAGCAACATCT、FAM-CCAAACAGCTGGGTG为核心，在制备通过PCR扩增生物核酸样品检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q基因多态性的试剂，并提供一种通过检测PCR扩增生物核酸样品检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q基因多态性的试剂盒、试剂盒通过检测生物样品确定该生物样品表皮生长因子受体受体基因第21外显子L861Q多态性，以及通过检测生物样品预测表皮生长因子受体抑制剂治疗恶性肿瘤的疗效的用途。本发明PCR模板制备方法操作简单，无需特殊设备，PCR扩增后采用检测荧光信号的方法直接检测PCR产物从而得到基因型结果，不涉及到如电泳的污染和对于环境可能造成的污染，而且大通量高效率，准确性高，特别适合临床和科研的大规模人群使用，应用广泛。根据表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性结果对表皮生长因子受体抑制剂的疗效进行预测。本发明克服了临床选择表皮生长因子受体抑制剂类药物的盲目性，在基因型分析的基础上可以预测患者使用表皮生长因子受体抑制剂类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗，尽早有效地控制肿瘤，减少毒副作用，减少医疗成本。

本发明特别针对表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性位点基因型设计了PCR扩增引物和探针，与常规的扩增引物和探针相比较，扩增效率高、特异性好、省时，能够直接根据PCR产物的片段大小鉴定该位点的基因型，无需后续的检测步骤和相应的试剂、设备，有更好的使用价值。

附图说明

图1.质粒克隆斑PCR扩增结果图。1.marker，2.PCR扩增结果。

图2.46名服用吉非替尼的非小细胞肺癌患者基因型的测定结果SDS数据分析图。

具体实施方式

实施例1表皮生长因子受体基因野生/突变基因型阳性对照质粒的构建

材料和方法

仪器：离心机(Eppendorf 5415D)，PCR仪(ABI 2700)，凝胶成像系统(华电DH2000)

材料：pET28载体质粒，大肠杆菌菌株DH5α

操作步骤：

1.组织基因组DNA提取：

选取石蜡包埋的非小细胞肺癌的肿瘤组织，脱蜡后使用DNA提取试剂盒(QIAmp DNA kit)提取肿瘤组织中基因组DNA。

2.EGFR第21外显子基因片段的扩增

扩增表皮生长因子EGFR目的基因片段，使用下列引物扩增EGFR第21外显子基因片段。

SEQUENCE 5：CTCGGGTTC GCTCATGGCCTTTCATGGG，

SEQUENCE 6：TCCGGGCTT CATCCTCCCCTGCATGTGT。

在引物的5’端，分别包含有EcoR1和Hind111的酶切位点

PCR程序：

95℃10分钟预变性，95℃10秒，57℃10秒，72℃14秒钟，45个循环。72℃延伸7分钟。

3.扩增片段的克隆：

酶切

扩增片段使用EcoR1和HindIII双酶切，酶切条件为37℃1小时，酶切产物用纯化试剂盒进行纯化。

载体质粒PET28同样用EcoR1和HindIII双酶切，酶切条件为37℃1小时，酶切产物用纯化试剂盒进行纯化。

酶切片段连接

采用T4连接酶，按照载体和扩增产物1∶2的比例进行连接，连接条件为16℃，8小时。转化

连接产物转化DH5α感受态细菌，转化后在37℃振荡培养2小时，然后涂Amp抗性的平板，倒置培养10小时。

筛选

将平板上长出的克隆斑，采用PCR方法进行克隆鉴定，鉴定结果吻合的进行测序。从中筛选出表皮生长因子受体基因的野生型和突变型基因型序列正确的克隆作为阳性质粒。PCR扩增结果见图1。

4.阳性质粒的扩增和纯化。

阳性克隆采用1L的培养瓶，大量培养。培养后碱法纯化质粒，分光光度计检测纯度和浓度后-20℃冷冻保存。

实施例2利用试剂盒进行非小细胞肺癌样本基因型的测定

1.样本的准备

取30份服用吉非替尼的非小细胞肺癌患者的肿瘤组织(新鲜组织或者石蜡块)，提取基因组DNA。

2.PCR扩增混合液的配置

按照表1配置PCR扩增混合液

表1PCR扩增混合液配置表

组分	体积ul
		Taq DNA聚合酶5U/ul	0.5
10×PCR buffer	2.5
		Mg2+25mM	3
dNTP 1.25mM	4
		引物1SEQUENCE3	0.4
引物2SEQUENCE4	0.4
		探针1SEQUENCE1	0.25
探针2SEQUENCE2	0.25
		DNA模板	11.25
H2O	2.45
		Total	25

分别配置30份PCR反应混合液，另外，配置两个基因型的阳性对照样本混合液和一份阴性样本混合液。

3.PCR扩增反应

反应条件如下：95℃10分钟，92℃15秒，60℃1分钟40个循环。

4.单核苷酸多态性SNP分析

PCR反应结束后采用SDS数据分析软件进行基因型分析，分析结果见图2：

由图2可以得知，VIC荧光为野生型(TT)，FAM荧光为纯合突变型(TA)，中间荧光为杂合型(AA)，根据图谱可以得到表2。

5.吉非替尼疗效预测

根据上述检测的结果，基因型为纯合突变型AA的患者服用吉非替尼后，药物疗效要优于服用吉非替尼小基因型为TT野生型和杂合型TA的患者。

表2 30名服用吉非替尼的非小细胞肺癌患者基因型

<110>北京华安佛医药研究中心有限公司

     深圳奥萨医药有限公司

<120>预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

attaagagaa gcaacatct    19

<210>2

<211>13

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ccaaacagct gggtg               15

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ccgcagcatg tcaagatcac          20

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

tccttctgca tggtattctt tctct    25

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

ctcgggttcg ctcatggcct ttcatggg    28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

tccgggcttc atcctcccct gcatgtgt    28

Claims (14)

1.一种用PCR方法检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的特异性引物：

CCGCAGCATGTCAAGATCAC、TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT。

2.一种用PCR方法检测表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q多态性的探针：VIC-ATTAAGAGAAGCAACATCT、FAM-CCAAACAGCTGGGTG。

3.特异性引物CCGCAGCATGTCAAGATCAC、TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT和探针VIC-ATTAAGAGAAGCAACATCT、FAM-CCAAACAGCTGGGTG在制备通过PCR扩增生物核酸样品检测表皮生长因子第21外显子基因L861Q多态性的试剂中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的试剂中含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和Mg²⁺。

5.一种检测表皮生长因子第21外显子基因L861Q多态性的试剂盒，包括：聚合酶链式反应扩增试剂组合物、检测表皮生长因子受体基因多态性的检测组合物和表皮生长因子野生/突变基因型阳性对照质粒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中聚合酶链式反应扩增试剂组合物包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、Mg²⁺、聚合酶链式反应缓冲液。

7.根据权利要求书6所述的试剂盒，其特征在于：检测表皮生长因子受体基因L861Q多态性的检测组合物包括：

探针：VIC-ATTAAGAGAAGCAACATCT

FAM-CCAAACAGCTGGGTG；

引物：CCGCAGCATGTCAAGATCAC；

TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT。

8.根据权利要求7中所述的试剂盒，其特征在于：探针是MGB探针。

9.根据权利要求8中所述的试剂盒，其特征在于：探针的5’端用发光基团荧光标记，3’端用淬灭基团荧光标记。

10.根据权利要求9中所述的试剂盒，其特征在于：探针5’端的标记荧光基团选自FAM、ROX、TET、HEX、TAMRA、CY3、CY5、JOE、Texas red中的一种，3’端的标记基团是TAMRA或NFQ。

11.根据权利要求5所述的试剂盒检测表皮生长因子受体基因第21外显子多态性的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于所述的表皮生长因子受体基因第21外显子为表皮生长因子受体基因第21外显子L861Q位点。

13.根据权利要求5所述的试剂盒通过检测生物样品预测表皮生长因子受体抑制剂治疗恶性肿瘤的疗效的用途。

14.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：恶性肿瘤包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部鳞癌。

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