CN102443626B - 肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒，其包括用于检测肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动性基因突变的引物、探针。本发明的方法包括(1)提供4组71条引物和探针；(2)检测样品DNA模板的提取；(3)配制检测EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动突变的荧光PCR反应体系；(4)利用双环探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX或ROX荧光强度，根据FAM和HEX或ROX荧光强度判定结果。本发明的方法可以检测肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK基因的驱动性突变，该方法具有灵敏度高，特异性强，检测速度快，检测方便等特点。

Description

肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒。

背景技术

肺癌是世界范围内常见的癌症，发病率和死亡率居各癌症之首。2002年全世界肺癌的新发病率为138万，近一半(49.9％)发生在发展中国家。据2008年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万。肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤，肺癌的死亡例数远大于乳腺癌、结肠癌和前列腺癌死亡例数的总和(Orras JM，Fernandez E，Gonzalez JR，et.，al.Lung cancer mortality in European regions(1955-1997).AnnOncol，2003，14(1)：159-161；中华人民共和国卫生部，《2008年中国卫生统计》年鉴)。

肺癌从组织病理学上可以分为两大类：小细胞癌(SCLC)和非小细胞癌(NSCLC)，其中非小细胞癌约占所有肺癌病例数85％，包括鳞癌、腺癌和大细胞癌。发达国家的肺癌患者的5年生存率为15-20％，而我国肺癌患者5年生存率仅为10％。其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相匹配的科学的治疗方案，从而失去了治疗的最佳时机。因此，肺癌的基因突变检测和诊断技术，对于制定与之相匹配的科学有效的化疗方案，提高肺癌患者的生存率，延长生存期有着重大的现实意义。

肺癌的发生主要是由于暴露于致癌环境下，引起驱动性基因突变，导致突变细胞过度增殖而形成。肺癌的驱动性基因突变是一种恶性的基因突变，是导致肺癌发生、增值、转移和耐药的最根本的原因。美国国立癌症研究所的肺癌突变联盟组织14家研究单位，对1000例的肺腺癌的驱动突变进行检测。结果显示约60％的患者含有驱动性基因突变(MarkG.Kris，et al.Molecular Profiling Defines New Potential Targets for Lung CancerTreatment.ASCO.2011，)。进一步表明了检测肺癌驱动性突变对于肺癌的早期诊断，和化疗靶向用药的预后有着重要意义。

现任ASC0(American Society of Clinical Oncology)主席George W.Sledge认为基因组的研究迎来了肿瘤治疗的新纪元。根据基因分析，可分为“愚蠢”和“聪明”两类肿瘤，前者肿瘤，多为纯质性的单个驱动突变，治疗效果较好，即便耐药，也发生较迟；而后者多属异质性，即一种优势驱动突变与多重驱动突变并存的肿瘤，常见早发耐药。预示了癌症的治疗已进入了基因突变特异性治疗(Mutation Specific Therapy)的到来，即必须依据患者肿瘤基因突变分子来选择治疗药物，而不是依靠传统的肿瘤组织病理学分类来进行化疗。因此，肺癌的驱动性突变的检测是肺癌靶向药物的开发与用药的前提和基础。

多项研究证实，肺癌的驱动性基因突变主要包括EGFR、KRAS、EML4-ALK、BRAF、PI3KCA、AKT1、MEK1、MET、HER2、NAS和AKT等驱动性突变。研究显示在肺癌中EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK的驱动性突变率约占总突变的60％，其中EGFR驱动突变为20-30％、KRAS驱动突变为20％、BRAF驱动突变为5％、EML4-ALK驱动突变为7％(Pao W，Girard N.New driver mutations in non-small-cell lung cancer.Lancet Oncol 2011.12.175-80；Mark G.Kris，et al.Molecular Profiling Defines New Potential Targets for LungCancer Treatment.ASCO.2011)。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是一种酪氨酸激酶受体，由其介导的信号传导是包括肺癌在内的多种癌症的主要发病机理之一，是肺癌化疗的最主要靶点之一。目前，临床上EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)靶向治疗的药物主要有Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)。研究显示，这两种药物的疗效与肺癌患者组织中的EGFR基因外显子18-21上的突变呈正相关(Lynch TJ et al.N.Engl.J.Med.2004；350)。2011年《美国国立癌症综合网络(NCCN)临床实践指南》明确指出，EGFR基因是人体肿瘤中最常见的驱动性突变基因，在肺癌患者接受靶向药物化疗之前必须进行EGFR基因突变检测。因此，检测EGFR驱动性突变，可以有效预测上述两种药物的治疗的疗效。

KRAS基因参与编码细胞内信号传递的蛋白，KRAS基因突变，主要集中发生在12、13、61特定的密码子上，占突变的90％以上。目前，临床上靶向药物Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)对无突变的KRAS基因有较好的治疗效果，对突变的KRAS基因患者无效。2011年《美国国立癌症综合网络(NCCN)临床实践指南》明确指出，KRAS基因是人体肿瘤中最常见的驱动性突变基因，在肺癌患者接受靶向药物化疗之前必须进行KRAS基因突变检测。当KRAS驱动基因突变发生时，不建议病人使用Cetuximab(爱必妥)或Panitumumab(帕尼单抗)进行分子靶向治疗(Lievre et al.KRAS Mutations As anIndependent Prognostic Factor in Patients With Advanced Colorectal Cancer TreatedWith Cetuximab.J.Clin.Oncol.2008；26)。因此，KRAS驱动突变基因的检测，可以预后Cetuximab(爱必妥)或Panitumumab(帕尼单抗)两种药物的疗效。

BRAF基因是RAF-MEK-ERK信号转导通路中的主要成员之一，是一种丝/苏氨酸特异性激酶，在细胞增值、分化和凋亡方面发挥主要作用。约90％的BRAF基因突变发生在Exon15的1799核苷酸上，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。研究发现，V600E突变可模拟T599和S602两个位点的磷酸化过程，从而使BRAF蛋白激活异常。临床研究表明，靶向药物Sorafenib(索拉非尼)和PLX4032与BRAF基因驱动突变呈正相关(Roche and Plexxikon’s PLX4032 shows 81％ response in metastatic melanomapatients in Ph I trial.The Pharma Letter.2011.8)。因此，检测BRAF驱动基因突变，可以用来有效预测上述两种靶向药物化疗的预后效果。

EML4-ALK基因为棘皮动物微管结合蛋白4(EML4)与间变淋巴瘤激酶(ALK)形成的融合基因，研究发现EML4-ALK可诱导肿瘤生成，给予ALK抑制剂后肿瘤可迅速消退。在目前已报道的研究中EML4-ALK融合基因在非小细胞肺癌中的阳性率约为7％，EML4-ALK融合基因已成为肺癌临床治疗新靶点。临床研究表明，新药Crizotinib(克里唑蒂尼)对于ALK融合基因有很好的治疗效果(A Phase III Trial of Crizotinib Versus Standard OfCare In Patients With Advanced Non-Small Cell Lung Cancer(NSCLC)With a SpecificAlteration of the Anaplastic Lymphoma Kinase(ALK)Gene.Pfizer Oncology.2011；6)。因而，对用EML4-ALK驱动性突变的检测是实施Crizotinib化疗预后必需的指标。

目前，约有70％的肺癌患者仍接受化疗，为了使肺癌患者能接受到最好的治疗，提高生存率，延长患者生存期。实施以驱动性基因突变分型治疗是肿瘤化疗必然趋势。对肺癌患者肿瘤药物靶点及相关的驱动性基因突变的了解是实施肺癌突变特异性治疗(MutationSpecific Therapy)和制定正确化疗方案的前提和基础。2011年《美国国立癌症综合网络(NCCN)临床实践指南》已经明确把EGFR，KRAS，BRAF等驱动性突变的检测应该在实施化疗前成为常规化。因此，在实施化疗之前对于肺癌主要的驱动性突变的检测，对于提高了肺癌患者的生存率，延长患者生存期，避免过度治疗有着主要的现实意义。

驱动性突变基因属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性等特点。因而，驱动性突变基因分子检测必须具备较高的灵敏度。研究发现，驱动性突变的量往往都低于直接测序等技术所能达到的检测限，所以直接测序等技术无法满足驱动性突变基因检测的实际需求。因此，迫切需要开发一种高灵敏度与高特异性的驱动性突变基因检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对肺癌患者进行多重“驱动性基因突变”联合的检测，从而为制定肺癌患者的个体化用药方案和耐药处理方案提供科学参考依据。

本发明提供了一种高灵敏度和高特异性的肺癌驱动性突变的检测方法及试剂盒。该方法可以实现肺癌的多重“驱动性基因突变”联合检测，大大缩短了检测的时间，提高了肺癌驱动性突变检测的灵敏度和准确率，从而实现了肺癌驱动性突变的早期检测和化疗靶向用药的准确预后。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肺癌驱动性基因突变检测的引物和探针，包括EGFR，KRAS，BRAF和EML4-ALK驱动性基因突变的检测探针和引物，通过对驱动性突变的检测实现肺癌驱动突变的早期诊断和化疗预后，其特异引物与双环探针包括如下序列：

表1EGFR驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列

表2KRAS驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列

1)Codon-12第2位核苷酸由G突变为A的一对上下游引物序列如下：

KRAS-M1-F：TGGTAGTTGGAGCTGA  (SEQ ID NO：25)

KRAS-M1-R：CTGCACCAGTAATATG  (SEQ ID NO：26)

2)Codon-12第2位核苷酸由G突变为C的一对上下游引物序列如下：

KRAS-M2-F：TGGTAGTTGGAGCTGC  (SEQ ID NO：27)

KRAS-M2-R：CTGCACCAGTAATATG  (SEQ ID NO：28)

3)Codon-12第2位核苷酸由G突变为T的一对上下游引物序列如下：

KRAS-M3-F：TGGTAGTTGGAGCTGT  (SEQ ID NO：29)

KRAS-M3-R：CTGCACCAGTAATATG  (SEQ ID NO：30)

4)Codon-12第1位核苷酸由G突变为A的一对上下游引物序列如下：

KRAS-M4-F：TGGTAGTTGGAGCTA  (SEQ ID NO：31)

KRAS-M4-R：CTGCACCAGTAATATG  (SEQ ID NO：32)

5)Codon-12第1位核苷酸由G突变为C的一对上下游引物序列如下：

KRAS-M5-F：TGGTAGTTGGAGCTC  (SEQ ID NO：33)

KRAS-M5-R：CTGCACCAGTAATATG  (SEQ ID NO：34)

6)Codon-12第1位核苷酸由G突变为T的一对上下游引物序列如下：

KRAS-M6-F：TGGTAGTTGGAGCTT  (SEQ ID NO：35)

KRAS-M6-R：CTGCACCAGTAATATG  (SEQ ID NO：36)

7)Codon-13第2位核苷酸由G突变为T的一对上下游引物序列如下：

KRAS-M7-F：TGGTGGAGCTGGTGA  (SEQ ID NO：37)

KRAS-M7-R：CTGCACCAGTAATATG  (SEQ ID NO：38)

8)与目标核酸扩增而得到的扩增产物杂交的双链置换探针序列及其修饰如下：

KRAS-P：FAM-5’CGTGCCTTGACGATACAGCT3’-NH2(SEQ ID NO：39)

5’-GTATCGTCAAGGCACTCTTG-3’-DABCYL(SEQ ID NO：40)

9)以HGH基因作为扩增模板的一对内控引物，分别命名为HGH-F、HGH-R，序列如下：

HGH-F：5′-GCCTTCCCAACCATT-3′(SEQ ID NO：41)

HGH-R：5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO：42)

10)以一段HGH基因作为杂交对象的一对内控双链置换探针，序列如下：

HGH-P：HEX-5’TTGACAACGCTATGCTC3’-NH2(SEQ ID NO：43)

5’GAGCATAGCGTTGTCA-3’-Dabcyl  (SEQ ID NO：44)

表3BRAF(V600E)驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列

BRAF-F：TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA    SEQ ID NO：45

BRAF-R：GCAGCATCTCAGG                SEQ ID NO：46

BRAF-P：FAM-CCCATGGAGTGGG

ATCA

-3-BHQ1 SEQ ID NO：47

表4EML4-ALK驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列

EML4-ALK-反转录1：TCAGGTCACTGATGGAGGAG    (SEQ ID NO：48)

EML4-ALK-逆转录2：CAGGAGGAGCAATGATCTTG    (SEQ ID NO：68)

1号：M 1、2、3

EML4-ALK-M-F：GCCCACACCTGGGAAAGGACCT    (SEQ ID NO：49)

EML4-ALK-M-F：CAGACAAGCATAAAGATGTCAT    (SEQ ID NO：50)

EML4-ALK-M-F：ACACCTTGACTGGTCCCCAGAC    (SEQ ID NO：51)

EML4-ALK-M-R：AGGTGCGGAGCTTGCTCAGCT     (SEQ ID NO：52)

EML4-ALK-M-P：FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQ1

(SEQIDNO：53)

2号：M 4、5

EML4-ALK-M-F：GCAGAAGGAAAGGCAGATCAAT    (SEQ ID NO：54)

EML4-ALK-M-F：TCTGTGGGATCATGATCTGAATC   (SEQ ID NO：55)

EML4-ALK-M-R：TCAGGTCACTGATGGAGGAGGTC   (SEQ ID NO：56)

EML4-ALK-M-P：FAM-5-TGTATGACCGACTACAACCCCAACTACTGGGT-3-BHQ1

(SEQ ID NO：57)

3号：M 6、7

EML4-ALK-M-F：CCAGAGATCTAGTTTCTATCCAC    (SEQ ID NO：58)

EML4-ALK-M-F：ATCTCTGAAGATCATGTGGCCTC    (SEQ ID NO：59)

EML4-ALK-M-R：AGGTGCGGAGCTTGCTCAGCT      (SEQ ID NO：60)

EML4-ALK-M-P：FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQ1

(SEQIDNO：61)

4号：M 8

EML4-ALK-M-F：ATAGGAACGCACTCAGGCAGAG    (SEQ ID NO：62)

EML4-ALK-M-R：AGGTGCGGAGCTTGCTCAGCT     (SEQ ID NO：63)

EML4-ALK-M-P：FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQ1(SEQ ID NO：64)

5号：M 9

EML4-ALK-M-F：ATCTCTGAAGATCATGTGGCCTC    (SEQ ID NO：65)

EML4-ALK-M-R：GCAGCCTGGCCCTTGAAGCACT     (SEQ ID NO：66)

EML4-ALK-M-P：FAM-5-GATCCCTCCCTGGATCTCCATATCCTCCTGGA-3-BHQ1   (SEQ ID NO：67)

6号：

ACTB-F：CTGGCATTGCCGACAGGA                    (SEQ ID NO：69)

ACTB-R：AGGAGCAATGATCTTGATCTTC                 (SEQ ID NO：70)

ACTB-P：FAM-CAGTAAGGAGATCACTGCCCTGGCACCCAAGGG-BHQ(SEQ ID NO：71)

本发明另一方面提供一种用于检测肺癌驱动性基因突变检测试剂盒，包括EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK的检测试剂盒，其PCR反应体系如下：

EGFR驱动突变荧光PCR反应体系：

1×PCR缓冲液

KRAS驱动突变荧光PCR反应体系：

1×PCR缓冲液

BRAF驱动突变荧光PCR反应体系：

1×PCR缓冲液

EML4-ALK驱动突变荧光PCR反应体系：

5×MMLV Buffer稀释为1×

引物   终浓度2pM

dNTP   0.5mM

M-MLV  200U/μL

补DEPC水至14μL

使用上述反转录体系得到cDNA模板，然后进行PCR扩增。EML4-ALK的PCR扩增体系如下：

Takara 10×PCR Buffer稀释为1×

本发明另一方面提供一种用于检测肺癌驱动性突变基因方法，包括EGFR，KRAS，BRAF和EML4-ALK驱动突变基因，其包括以下步骤：

(1)根据Cosmic数据公布的人类EGFR，KRAS，BRAF和EML4-ALK为野生型基因序列，针对EGFR，KRAS，BRAF和EML4-ALK的驱动性突变位点为基础，来设计特异性简并引物和和多个特异性双环探针。

(2)针对EGFR，KRAS，BRAF和EML4-ALK驱动性突变选定的突变位点设计简并引物和特异性双环探针。

(3)提取检测样本中基因组DNA，包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或石蜡切片、全血、血液、血浆胸腔积液等组织中的DNA。

(4)配制各反应荧光PCR扩增突变基因反应体系。

(5)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM和HEX荧

光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或35：阴性；Ct值小于32：阳性。

本发明再一方面提供用于肺癌驱动性突变，包括EGFR，KRAS，BRAF和EML4-ALK驱动性基因突变的靶向用药的指导方案。包括：(1)EGFR驱动突变阳性选择包括Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)在内的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)进行治疗；(2)KRAS驱动突变阳性选择不包含Cetuximab(爱必妥)或Panitumumab(帕尼单抗)在内的单抗药物进行分子靶向治疗；(3)BRAF驱动突变阳性宜选择包括Sorafenib(索拉非尼)和PLX4032在内的BRAF丝/苏氨酸激酶抑制剂进行治疗；(4)EML4-ALK驱动突变阳性宜选择包括Crizotinib(克里唑蒂尼)在内的ALK间变淋巴瘤激酶抑制剂进行治疗。

本发明的有益效果是：本发明采用了特异性引物和双环探针技术，可以特异性地检测出肺癌的驱动性突变基因。此方法：(1)建立了实时PCR体系可以对EGFR29种驱动突变，KRAS 7种驱动突变，BRAF V600E驱动突变和EML4-ALK 9种驱动突变实现多重全方位检测；(2)可在一个PCR管同时检测出多种驱动性突变，如KRAS的7种突变；(3)灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；(4)特异性强，10ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成；(6)对肺癌患者化疗靶向用药预后提供了必需检测的驱动性突变基因，即EGFR，KRAS，BRAF和EML4-ALK驱动性突变。

附图说明

图1为肺癌驱动突变化疗靶向用药检测示意图。

图2为实施例1中质粒和细胞株的PCR图，其中：

A：质粒；B：细胞株H460

图3为实施例2肺癌EGFR驱动性突变检测结果，其中：

A：Exon-18基因；B：Exon-19基因；C：Exon-20基因；D：Exon-21基因；

图4为实施例2肺癌KRAS驱动性突变检测结果，其中：

A：codon-12基因；B：codon-13基因；

图5为实施例2肺癌BRAF驱动性突变检测结果。

图6为实施例2肺癌EML4-ALK驱动性突变检测结果。其中：

A：EML4-ALK融合基因Exon-13、6a/b、20；B：EML4-ALK融合基因Exon-15、14；C：EML4-ALK融合基因Exon-18、2；D：EML4-ALK融合基因Exon-17。

E：EML4-ALK融合基因Exon-2。

图7为实施例3肺癌EGFR驱动性突变检测结果，其中：

A：Exon-18基因；B：Exon-19基因；C：Exon-20基因；D：Exon-21基因；

图8为实施例3肺癌KRAS驱动性突变检测结果。

A：codon-12基因；B：codon-13基因；

图9为实施例3肺癌BRAF驱动性突变检测结果。

图10为实施例3肺癌EML4-ALK驱动性突变检测结果。

A：EML4-ALK融合基因Exon-13、6a/b、20；B：EML4-ALK融合基因Exon-15、14；C：EML4-ALK融合基因Exon-18、2；D：EML4-ALK融合基因Exon-17；E：EML4-ALK融合基因Exon-2。

具体实施方式

本发明针对目前对肺癌中主要驱动性突变基因，结合临床化疗靶向用药指导原则。针对DNA直接测序灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长等问题，难以达到驱动性突变检测所需要求，无法满足临床检测、早期诊断和指导用药等的需求。针对上述问题，设计出可以检测肺癌主要驱动突变一整套双环探针和特异引物，通过荧光PCR技术可以快速地检测出肺癌中EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK主要的驱动性突变基因，同时实现了单驱动性突变基因(如EGFR)的多突变位点的多重检测。

根据《美国国立癌症综合网络(NCCN)临床实践指南》对肺癌的化疗用药的检测指导原则，结合已有的研究报道(David R.G et at.，Evolving Treatment Algorithms forAdvanced Non-small Cell Lung Cancer：2009 Looking Toward 2012，Clin Lung Cancer2009 10：392-4)。本发明建立了肺癌化疗靶向用药驱动性突变检测方案，如图1所示。该图显示了肺癌患者在早期检测和欲实施化疗前所必需检测驱动突变基因，以及针对驱动突变基因给予相应的靶向性治疗药物。

基本原理：

本发明的基本原理是利用双环探针为一条寡核苷酸，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶标序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构。例如，序列21中，FAM-5′-CGTGCGTTCGGCACG

ATAAGG

-3′-BHQ1，其中，带下划线的部分结合成环，带方框的部分结合成另一环，双环探针环形结构的消失引起荧光的产生。双环探针可以在该反应中，将完全匹配的靶序列检测出来。该技术与“特异引物技术”相结合，使检测基因突变的灵敏度和准确性得到大幅度提高，应用上述基本原理，设计检测肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动性突变的引物、探针及检测试剂盒。

EGFR驱动性突变检测

以野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型的模板，以细胞系H1650为19-M1为模板，其它28种突变是以基因工程构建的突变质粒作为突变模板，建立单荧光PCR检测EGFR基因29种突变的反应体系，并将此体系用于EGFR突变快速检测。

待测EGFR突变位点的确定：根据Cosmic数据公布的人类EGFR为野生型基因序列，以EGFR外显子18、19、20和21的29个功能性突变位点为基础，来设计特异性引物和和多个特异性双环探针。突变位点详见表5。

引物设计与合成：针对上述选定的29个突变位点，应用Premier 6.0引物设计软件设计出29对特异性引物和29条双环探针，引物和探针序列如表1所示。

样品处理与DNA的提取：检测样品可以是手术切除的新鲜病理组织，或甲醛固定的石蜡包埋组织，或石蜡切片、全血、血液、血浆胸腔积液。新鲜病理组织，取1克左右，使用Qiagen的DNA提取试剂盒提取基因组DNA。石蜡包埋组织，使用Qiagen的组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。全血、血浆、血清胸腔积液，其中全血不少于200μL；血浆、血清胸腔积液不少于800μL。使用Qiagen的组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，上述具体操作步骤按试剂盒操作说明进行操作。

所提DNA溶于Tris-HCL中(10mmol/L，PH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCL(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板。用上述DNA模板进行荧光PCR扩增，荧光PCR扩增体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件为95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，35个循环；95℃变性25秒，60℃退火30秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

检测FAM和HEX荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或35：阴性；Ct值小于32：阳性。

KRAS驱动性突变检测

以野生型的细胞系H460的基因组DNA为野生型的模板，以细胞系SW480为KRAS-M4为模板，其它的6种突变以基因工程构建的突变质粒为突变模板，建立实时荧光PCR检测KRAS基因突变的反应体系。将此体系用于KRAS基因突变的高灵敏度检测。

待测KRAS突变位点的确定：根据Cosmic数据公布的人类KRAS为野生型基因序列，以KRAS外显子12和13密码子为野生型的基因序列的7个位点为功能性突变为基础，来设计多对特异性引物和和多个条特异性双环探针。突变位点详见表7。

引物设计与合成：针对选定的7个突变位点，应用Premier 6.0引物设计软件设计7对特异引物和7条双环探针，引物和探针序列如表2所示。

样品处理与DNA的提取：样品适用范围包括新鲜肿瘤组织、石蜡包埋组织、血液、血浆胸腔积液。新鲜病理组织，取1克左右，使用Qiagen的DNA提取试剂盒提取基因组DNA。石蜡包埋组织，使用Qiagen的组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。血浆、血浆胸腔积液，其中全血不少于200μL；血浆、血清胸腔积液不少于800μL。使用Qiagen的组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，上述具体操作步骤按试剂盒操作说明进行操作。

所提DNA溶于Tris-HCL中(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCL(10mmol/L，pH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板。将该DNA模板运用荧光PCR体系进行扩增，荧光PCR扩增体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

采用MX3000P为荧光PCR扩增仪进行检测，检测荧光信号的Ct值。根据PCR扩增产生的Ct值判断结果：Ct值0或35表示阴性；Ct值小于28表示阳性；Ct值在28-35之间时，需要重新检测。检测过程所需时间90分钟即可完成。

BRAF驱动性突变检测

以野生型的细胞系H460的基因组DNA为野生型的模板，以细胞系HT-29为BRAF为模板，建立实时荧光PCR检测BRAF基因突变的反应体系。将此体系用于BRAF基因突变的高灵敏度检测。

BRAF突变位点的确定：根据Cosmic数据公布的人类BRAF为野生型基因序列，以BRAF基因第1799突变位点(V600E)为功能性突变为基础，来设计特异性简并引物和特异性双环探针。

引物设计与合成：针对选定的V600E突变位点，应用Premier 6.0引物设计软件设计单对特异性引物和双环探针，引物和探针序列如表3所示。

样品处理与DNA的提取：检测样品可以是手术切除的新鲜病理组织，或甲醛固定的石蜡包埋组织，或石蜡切片、全血、血液、血浆胸腔积液。新鲜病理组织，取1克左右，使用Qiagen的DNA提取试剂盒提取基因组DNA。石蜡包埋组织，使用Qiagen的组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。全血、血浆、血清胸腔积液，其中全血不少于200μL；血浆、血清胸腔积液不少于800μL。使用Qiagen的组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作步骤按试剂盒操作说明。

所提DNA溶于Tris-HCL中(10mmol/L，PH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCL(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板。用上述DNA模板进行PCR扩增，荧光PCR扩增体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

检测FAM和HEX荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或35：阴性；Ct值小于32：阳性。

EML4-ALK驱动性突变检测

EML4-ALK融合突变位点的确定：根据Cosmic数据公布的人类EML4和ALK为野生型基因序列，以检测EML4-ALK的9种融合基因突变为基础，来设计特异性简并引物和特异性双环探针，突变位点详见表9。

引物设计与合成：针对选定的9个突变位点，应用Premier 6.0引物设计软件设计9对引物和9条探针，引物和探针序列如表4所示。

样品处理与mRNA的提取：样品适用范围包括新鲜肿瘤组织、石蜡包埋组织、血液和血清。新鲜病理组织，取1克左右，使用TIANGEN的mRNA提取试剂盒提取其mRNA。石蜡包埋组织，使用Qiagen的组织mRNA提取试剂盒提取其RNA。全血、血浆、血清胸腔积液，其中全血不少于200μL；血浆、血清胸腔积液不少于800μL，使用TIANGEN的组织mRNA提取试剂盒提取其mRNA。上述具体操作步骤按试剂盒操作说明。

所提mRNA溶于Tris-HCL中(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.9-2.0，并读取其含量。将提取的mRNA 1μg作为其cDNA合成的模板，采用厦门艾德生物医药科技有限公司的试剂盒合成cDNA.逆转录体系为25μL：

5×MMLV Buffer稀释为1×

引物  终浓度2pM.

dNTP   0.5mM

M-MLV  200U/μL

补DEPC水至14μL

使用上述反转录体系得到cDNA模板，然后进行PCR扩增。EML4-ALK的PCR扩增体系如下：

Takara 10×PCR Buffer稀释为1×

实时PCR反应条件是95℃预变性3分钟，15个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸10秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

检测FAM荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM荧光强度，6号管(外控管)有信号，说明RNA的逆转录、PCR过程成功；1-5号管(突变管)以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于30：阳性。

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1

本例分别以EGFR基因外显子19上的E746_T751del驱动突变，KAS基因外显子12的Gly12Asp驱动突变，BRAF基因V600E驱动突变及EML4-ALK融合基因Variant 1的驱动突变为例来阐述本发明的荧光PCR检测上述基因驱动性突变。

实验用质粒模板1株(含E746_T751del，Gly12Asp，V600E，Variant 1、3a/b、2突变)，细胞系4株，分别为H460(EGFR，KRAS和EM4-ALK基因野生型)、293T(EGFR，KRAS和EM4-ALK基因野生型)、SW480(EGFR，KRAS和EM4-ALK基因野生型)、HT-29(BRAF基因野生型)，及68份待检测临床肺癌样本(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液、全血)。

利用上述荧光PCR检测EGFR基因外显子19上的E746_T751del驱动突变，KAS基因外显子12的Gly12Asp驱动突变，BRAF基因V600E驱动突变及EML4-ALK融合基因Variant 1的驱动突变的方法包括以下步骤：

(一)样品DNA与mRNA提取：

样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液标本。新鲜病理组织，取约1g左右，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA。全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。上述具体步骤按各试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。

石蜡包埋组织样本mRNA的提取，使用Qiagen的组织mRNA提取试剂盒提取其mRNA。使用TIANGEN的mRNA提取试剂盒提取全血、血浆、血清和胸腔积液的mRNA，其中全血不少于200μL；胸腔积液不少于800μL。上述具体操作步骤按试剂盒操作说明。

(二)将上述所提DNA样本分别应于如下实时荧光PCR进行扩增：

(1)EGFR的荧光PCR扩增体系为：

实时PCR反应条件为95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，35个循环；95℃变性25秒，60℃退火30秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

(2)KRAS的荧光PCR扩增体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

(3)BRAF的荧光PCR扩增体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

(4)EML4-ALK驱动性突变检测

所提mRNA溶于Tris-HCL中(10mmol/L，PH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.9-2.0，并读取其含量。将提取的mRNA 1μg作为其cDNA合成的模板，采用厦门艾德生物医药科技有限公司的试剂盒合成cDNA.逆转录体系为25μL：

5×MMLV Buffer稀释为1×

引物   终浓度2pM

dNTP   0.5mM

M-MLV  200U/μL

补DEPC水至14μL

使用上述反转录体系得到cDNA模板，然后进行PCR扩增。EML4-ALK的PCR扩增体系如下：

Takara 10×PCR Buffer稀释为1×

实时PCR反应条件是95℃预变性3分钟，15个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸10秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

(三)检测结果的判断：采用Mx3000P实时PCR扩增仪后35个循环退火阶段检测FAM和HEX或ROX荧光信号。结果判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准：EGFR和BRAF检测体系：Ct值为0或35表示阴性；Ct小于32表示阳性；KRAS检测体系：Ct值0或35表示阴性；Ct值小于28表示阳性；EML4-ALK检测体系：Ct值为0或31表示阴性；Ct值小于30表示阳性。

所检测的细胞系H460(EGFR，KRAS和EM4-ALK基因野生型)、293T(EGFR，KRAS和EM4-ALK基因野生型)、SW480(EGFR，KRAS和EM4-ALK基因野生型，HT-29(BRAF基因野生型)和突变质粒DNA经本发明的体系检测，只有突变质粒DNA有荧光信号，其它样品无荧光信号，进一步证明了荧光PCR的特异性(见图1)。

灵敏度分析：将突变质粒DNA连续10倍梯度稀释。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。

选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。然后将10⁵拷贝/μL的突变质粒DNA用20ng/μL和2ng/μL的H460DNA连续10倍稀释。结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为0.1％。

重复性试验：每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝和10拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.1个循环。

收集手术切除的肺癌标本，全血和血浆标本以及胸水标本共68例，其中49组织样品，3例血浆，6例胸水，10例全血。其中男性38例，女性30例。年龄为36-71岁，平均年龄为57岁。

对于上述四个基因驱动性突变，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：68例样品中有12例发生EGFR驱动性突变，7例发生KAS驱动性突变，3例发生BRAF驱动性突变，2例发生EML4-ALK驱动性突变(表5)。

表5荧光PCR检测结果与DNA直接测序结果的比较

本发明荧光PCR反应可同时检测多重驱动性突变，检测方便快捷，准确性高，可满足驱动性突变的快速诊断。该荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力均高于传统测序方法，10ng样品DNA中含0.1％的突变DNA即可检出。

实施例2

取2011年7月送我公司待检测的临床肺癌石蜡包埋组织样本1例，对其进行EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动性突变检测。

检测样本DNA的提取：DNA的提取使用Qiagen石蜡组织样本提取试剂盒，按照提取试剂盒的说明进行操作。所提DNA溶于Tris-HCL中(10mmol/L，pH 8.0)。经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.9，然后用Tris-HCL(10mmol/L，pH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板。将上述提取的DNA用作EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK的荧光PCR扩增模板。

样本mRNA的提取使用Qiagen(RNeasy FFPE kit)石蜡组织样本提取试剂盒，按照提取试剂盒的说明进行操作。所提mRNA溶于Tris-HCL中(10mmol/L，PH 8.0)。经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD₂₆₀/OD₂₈₀为2.0，并读取其含量。将提取的mRNA 1μg作为其cDNA合成的模板，采用厦门艾德生物医药科技有限公司的试剂盒合成cDNA.逆转录体系为25μL：

5×MMLV Buffer稀释为1×

引物   终浓度2pM.

dNTP   0.5mM

M-MLV  200U/μL

补DEPC水至14μL

使用上述反转录体系得到cDNA模板，然后进行PCR扩增。EML4-ALK的PCR扩增体系如下：

Takara 10×PCR Buffer稀释为1×

实时PCR反应条件是95℃预变性3分钟，15个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸10秒，15个循环；95℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

采用MX3000P为荧光PCR扩增仪进行检测，检测荧光信号的Ct值。实验的产生的Ct值为0或35，表明为EML4-ALK基因为野生型基因。检测结果见图7。

将上述所提DNA样本应于分别如下实时荧光PCR进行扩增：(1)EGFR的荧光PCR扩增体系为：

实时PCR反应条件为95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，35个循环；95℃变性25秒，60℃退火30秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

采用MX3000P为荧光PCR扩增仪进行检测，检测荧光信号的Ct值。PCR扩增产生的Ct值小于32，表明为EGFR基因发生驱动性突变。检测结果如图3所示。

(2)KRAS的荧光PCR扩增体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

采用MX3000P为荧光PCR扩增仪进行检测，检测荧光信号的Ct值。Ct值为0或35表示阴性；即没有发生突变。检测结果如图4所示。

(3)BRAF的荧光PCR扩增体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，35个循环。后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。

采用MX3000P实时PCR扩增仪进行扩增，后35个循环开始检测FAM和HEX荧光信号。检测的Ct值小于32，表明BRAF基因为野生型。结果如图6所示。

结果表明所检测的EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动性突变基因，EGFR为驱动突变；KRAS，BRAF和EML4-ALK都为野生型。驱动性突变检测结果汇总表如11所示。因此，根据四个基因的驱动性突变实验检测结果，只有EGFR为发生驱动突变，该肺癌患者在进行化疗时宜选择EGFR突变抑制剂靶向药物，如Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)，进行化疗为宜。

实施例3

取2011年7月送我公司检测肺癌患者石蜡包埋组织样本1例。对其进行EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动性突变检测。

按照实施例1所述检测之试剂盒和方法对组织样本进行DNA和mRNA提取，提取步骤按照试剂盒说明书操作步骤进行操作。然后用Tris-HCL(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板。该模板DNA用作EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK的荧光PCR扩增模板。

EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK的荧光PCR扩增体系和扩增条件分别按实施例2所述条件进行操作。采用MX3000P实时PCR扩增仪进行扩增，后35个循环开始检测FAM和HEX荧光信号。检测各个基因驱动性突变的Ct值，其EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动性突变的检测结果分别见图7、图8、图9和图10。

结果表明所检测的四个基因中，BRAF发生驱动突变，EGFR、KRAS和EML-ALK为野生型。四个基因驱动性突变检测结果汇总表见表12。基于上述驱动性基因突变的检测结果，该肺癌患者在进行化疗时宜选择BRAF突变抑制剂靶向药物，如靶向化疗药物Sorafenib和PLX4032，进行化疗为宜。

表5EGFR基因的29种驱动性突变

表6EGFR基因29种驱动性突变8个PCR反应检测各管检测的突变点

表7KRAS基因的12和13密码子上7种驱动性突变

表8KRAS基因7种驱动性突变8个PCR反应检测各管检测的突变点

表9EML4-ALK的9种融合驱动性突变

表10EML4-ALK融合基因9种驱动性突变8个PCR反应检测各管检测的突变点

表11肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动性突变检测结果汇总表

表12肺癌EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK驱动性突变检测结果汇总表

Claims (2)

1.用于检测肺癌驱动性基因突变的引物及探针，包括下列4组71条引物和探针：

(1)EGFR驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列：其序列为SEQ ID NO：1至SEQID NO24；

(2)KRAS驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列：SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：44；

(3)BRAF驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列：SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：47；以及

(4)EML4-ALK驱动突变特异性引物和双环探针核苷酸序列：SEQ ID NO：48至SEQ IDNO：71。

2.一种检测肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒，包括：权利要求1所述的4组71条引物和探针。

Images