CN102453765B - Pik3ca基因驱动突变的检测探针、引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测人类PIK3CA基因驱动突变的引物、探针及试剂盒，涉及到基因突变的检测。本发明的方法包括：(1)提供6组18条引物和探针；(2)检测样品DNA模板的提取；(3)配制检测PI3KCA基因驱动突变的荧光PCR反应体系；(4)利用双环探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，根据FAM和HEX荧光强度判定结果。本发明的方法可以同时检测PIK3CA基因5种驱动性突变，该检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测快速准确等特点。

Description

PIK3CA基因驱动突变的检测探针、引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种PIK3CA基因驱动突变的检测探针、引物及试剂盒。
背景技术
PIK3CA(Phosphatidylinositol-3-Kinases，磷脂酰肌醇-3-激酶)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，由一个相对分子质量为110×103的催化亚基p110和一个相对分子质量85×103的调节亚基p85构成。PIK3CA参与多种信号通路，调节细胞的生长和增值等主要生理功能。由PIK3CA活化而产生的类脂产物，3.4-二磷酸磷脂酰肌醇和3.4.5-三磷酸磷脂酰肌醇，可作为第二信使激活下游细胞内的多种靶蛋白分子，形成一个信号级联放大复合体，最终调节细胞的增殖、分化和迁移。
PIK3CA激活的Akt(Protein Kinase B)可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9和mTOR等。PIK3CA/Akt信号通路与人类恶性肿瘤的发生密切相关，通过磷酸化不同类型的底物，可激活下游主要效应靶基因，其持续活化会使正常的细胞转化为肿瘤细胞。
多项研究证实，由PIK3CA介导的信号通路与肿瘤发生转移密切相关。PIK3CA介导的AKT信号通路通过细胞内信号转导途径活化，获得不同的转录因子，使上皮细胞表型发生不同程度的转化，降低细胞间黏附力，增强运动能力，从而促进肿瘤细胞运动转移。其次PIK3CA参与调控肿瘤的血管生成，PIK3CA通过与E-Cadherin、β-Catenin和血管内皮生长因子受体(VEGFR)形成复合物，激活其下游通路，参与血管内皮生长因子介导的内表皮信号传递(Katso R，et al.Cellular function of phosphoinositide 3-kinases：implications for development，homeostasis，and cancer.Annu Rev Cell Dev Biol2001；17：615-675)。PIK3CA介导的信号通路异常激活，会刺激肿瘤细胞恶性增殖和血管形成，增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。PIK3CA参与了多种因子介导的肿瘤细胞的转移，针对其突变靶点设计的药物是防止癌细胞转移，提高癌症化疗效果的关键靶点蛋白。
研究显示，PIK3CA基因驱动性突变在可发生在多种癌症中，包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胃癌，其中在乳腺癌的突变率可高达40％(Campbell IG，et al.Mutationof the PIK3CA gene in ovarian and breast cancer.Cancer Res 2004；64)，在肝癌的突变率约为35％(Lee JW，et al.PIK3CA gene is frequency mutated in breastcarcinomas and hepatocellular carcinomas.Oncogene 2005；24：1477-80)。PIK3CA基因的点突变常发生于外显子9和外显子20，通过高灵敏的检测方法对上述突变位点检测，对于肿瘤患者的早期筛查、诊断及预后具有重要意义。
临床药物GDC-0941(Genentech)，BEZ235(Novartis)为PIK3CA的突变抑制剂类药物，其主要通过与PIK3CA的催化亚单位p110结合，非竞争性和不可逆地抑制PIK3CA激酶活性，阻断PIK3CA介导的信号通路，从而导致癌细胞凋亡。通过抑制PIK3CA信号转导通路，抑制癌细胞生长，已经成为癌症化疗的一个重要靶点。研究表明，PIK3CA的突变会导致肿瘤患者对EGFR的靶向药物治疗产生耐药性(Jhawer M，et al.PIK3CAMutation/PTEN Expression Status Predicts Response of Colon Cancer Cells to theEpidermal Growth Factor Receptor Inhibitor Cetuximab.Cancer Res 2008；68，1953)。因此，在实施化疗之前，通过高灵敏的方法对PIK3CA基因驱动突变的检测对于延长患者生存期，避免过度化疗，指导临床科学用药有重要意义。
目前，包括PIK3CA基因在内的基因驱动突变的检测方法主要为DNA直接测序法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；检测操作复杂，效率低，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的病理组织的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量的漏检和假阴性的发生。包括PIK3CA基因在内的驱动性基因突变属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性等特点，而且多数驱动性突变的检测为小样本组织。因此，直接测序等技术远不能达到其实际应用的需求，迫切需要开发一种高灵敏度与高特异性的PIK3CA驱动性突变基因检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对PIK3CA基因驱动性突变的检测，从而为临床个体化用药方案提供科学参考依据。
针对上述问题，本发明开发一种高灵敏，快速、操作简便的PIK3CA基因驱动突变检测方法和检测试剂盒。该方法的检测灵敏度可达到0.1％，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于PIK3CA基因突变检测的引物和双环探针，通过对其驱动性突变的检测实现癌症的化疗预后，其特异引物与双环探针包括如下序列：
本发明另一方面提供一种用于检测PIK3CA基因驱动突变检测试剂盒，其PCR反应扩增体系如下：
Figure BDA0000105270670000032
本发明另一方面提供一种用于检测PIK3CA基因驱动性突变方法，其方法包括以下步骤：
(1)根据Cosmic数据公布的人类PIK3CA为野生型基因序列，针对PIK3CA的5个驱动性突变点，来设计特异性简并引物和特异性双环探针。
(2)提取检测样本中基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血、血浆和胸腔积液等组织中的DNA。
(3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。
(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。
本发明的有益效果是：本发明采用了特异性引物和双环探针技术，可以特异性地检测乳腺癌，胃癌等癌症的PIK3CA基因驱动性突变。此方法：(1)建立了实时PCR体系实现对PIK3CA基因5种驱动突变同时检测；(2)灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；(3)特异性强，10ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；(4)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
附图说明
图1为本发明检测阴性对照检测PCR图。
图2为本发明检测PI3KCA基因5种突变的其中一种检测PCR图。
图3为灵敏度分析试验结果PCR图。
图4为选择性试验结果PCR图。
具体实施方式
本发明以野生型细胞系H460的基因组为DNA野生型为检测模板，以基因工程构建的突变质粒为模板，建立PIK3CA实时荧光PCR检测反应体系，针对突变位点设计特异引物和双环探针，检测PIK3CA基因驱动突变的方法包括以下步骤：
(1)针对突变位点设计合成特异性引物和双环探针：
根据COSMIC数据库公布的PIK3CA基因序列为野生型序列，针对PIK3CA基因外显子9和外显子20的5个突变位点设计特异性简并引物和特异性双环探针。通过特异性引物和双环探针优化，实现高灵敏和快速检测，PIK3CA基因5个突变位点见表1。
基本原理：
本发明设计探针的基本原理是利用双环探针为一条寡核苷酸，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶标序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构。如序列PI-M1-P5，其中，带下划线的部分结合成环，带方框的部分结合成另一环，双环探针环形结构的消失引起荧光的产生。双环探针可以在该反应中，将完全匹配的靶序列检测出来。该技术与“特异引物技术”相结合，可以阻止非特异性扩增，使检测基因突变的灵敏度和准确性得到大幅度提高，运用上述基本原理，设计检测PIK3CA基因5个突变位点的双环探针及内控双环探针。
应用Premier 6.0引物设计软件设计双环探针和特异引物核苷酸序列，设计的5对特异性引物和5条双环探针及内控探针引物的序列如表2所示。
(2)检测样本处理与DNA的提取：
检测样本包括新鲜病理组织，石蜡包埋组织、全血、血浆和胸腔积液。对于鲜病理组织和石蜡组织样品，样品切成5-10μm，加入1mL二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1mL无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，加入500μL BufferAW1，6000×g(8000rpm)离心1min，小心打开盖子加入500μL Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离心1min，空管离心20000×g(14000rpm)离心3min，加入100μL BufferATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离心1min。对于全血、血浆和胸腔积液，其体积不少于800μL，使用TIANGEN的DNA提取试剂盒提取基因组DNA。提取具体操作步骤按试剂盒操作说明进行操作。
所提DNA溶于Tris-HCl中(10mmol/L，PH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(3)建立PCR扩增反应体系：
应用上述设计的双环探针和特异引物，取5μL提取的DNA作为反应模板，采用如下PCR反应体系进行扩增，PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0000105270670000052
Figure BDA0000105270670000061
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准：
检测FAM和HEX荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞18)是表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1
以PIK3CA基因外显子20的H1047R驱动突变为例检测本发明实时荧光PCR检测反应体系。实验用质粒模板1株(含H1047R)，细胞系2株，分别为H1650(PIK3CA基因野生型)和H460(PIK3CA基因野生型)。利用上述荧光PCR检测PIK3CA基因外显子20的H1047R驱动突变的方法如下：
(1)样本DNA提取
样品切成5-10μm，加入1mL二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1mL无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μl无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，小心打开盖子加入500μL Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离心1min，空管离心20000×g(14000rpm)离心3min，加入100μL Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离心1min。所提DNA溶于Tris-HCl中(10mmol/L，PH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)荧光PCR扩增反应体系
将上述所提DNA样本应于如下实时荧光PCR扩增体系进行扩增，PIK3CA荧光PCR扩增体系为：
Figure BDA0000105270670000071
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(3)检测结果判定
采用MX3000P实时荧光PCR仪进行扩增，在后31个循环退火阶段检测FAM和HEX的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。质粒和细胞系的PCR检测结果分别见图1和图2。
灵敏度分析：将突变质粒DNA连续10倍梯度稀释。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，5拷贝DNA基因组即可检出。
选择性分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将野生型细胞系(H460)DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。然后将105拷贝/μL的突变质粒DNA用20ng/μL和2ng/μL的H460细胞系的DNA连续10倍稀释。结果表明本发明的荧光PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出5拷贝的突变DNA，检测能力为0.1％。
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝和10拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.4个循环。
检测结果表明，本发明的检测体系可以准确检测质粒和细胞系的PIK3CA基因的突变，检测的灵敏度可达到0.1％。
实施例2
运用本发明检测临床样本，取送我公司检测的临床乳腺癌标本共90例，其中70例石蜡包埋组织样品，20例血液样本；男性42例，女性48例，年龄为35-72岁，平均年龄为58岁。利用本发明双环探针和荧光PCR体系检测90例临床样本的PIK3CA基因驱动突变步骤如下。
(1)临床病理样本DNA提取
对于鲜病理组织和石蜡组织样品，样品切成5-10μm，加入1mL二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1mL无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，加入500μL Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，小心打开盖子加入500μL BufferAW2，6000×g(8000rpm)离心1min，空管离心20000×g(14000rpm)离心3min，加入100μL Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离心1min。对于全血、血浆样本，其体积不少于800μL，使用TIANGEN的DNA提取试剂盒提取基因组DNA。提取具体操作步骤按试剂盒操作说明进行操作。
所提DNA溶于Tris-HCl中(10mmol/L，PH 8.0)，经紫外分光光度计检测其浓度，然后用Tris-HCl(10mmol/L，PH 8.0)溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)荧光PCR扩增体系
所提DNA样本运用如下荧光PCR反应体系进行扩增，荧光PCR扩增体系为：
Figure BDA0000105270670000081
实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(3)结果判定
采用MX3000P实时荧光PCR仪进行扩增，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。质粒和细胞系的PCR检测结果见图1和图2。
在所检测的90例乳腺癌的临床样本中，男性突变19例，女性突变15例，石蜡组织样本突变27例，血液突变样本7例，总的突变率为37.8％。同时，在足够量样本下，采用直接测序法进行对比检测，结果表明本发明的体系与直接测序法的符合率达到100％，进一步证明了本发明体系检测的准确性。
本发明荧光PCR反应体系可同时检测PIK3CA基因5种驱动性突变，检测方便快捷，准确性高，可满足PIK3CA基因驱动性突变的快速诊断。该荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力均高于传统测序方法。
表1人类PIK3CA基因5种体细胞驱动突变
Figure BDA0000105270670000091
表2人类PIK3CA基因5种突变8个PCR反应检测各管检测的突变点
  管号   试剂管   反应体积   荧光信号
  ①   H1047R反应混合液   650μL   FAM，HEX
  ②   H1047L反应混合液   650μL   FAM，HEX
  ③   E542K反应混合液   650μL   FAM，HEX
  ④   E545K反应混合液   650μL   FAM，HEX
  ⑤   E545D反应混合液   650μL   FAM，HEX
  ⑥   外控反应混合液   650μL   FAM
  ⑦   Taq酶(PIK3CA)   50μL   /
  ⑧   PIK3CA阳性质控   250μL   /
表3引物和探针序列表
Figure BDA0000105270670000101
表4荧光PCR检测结果与DNA直接测序结果的比较
Figure BDA0000105270670000102
Figure IDA0000105270740000011
Figure IDA0000105270740000021
Figure IDA0000105270740000031
Figure IDA0000105270740000041

Claims (5)

1.用于检测PIK3CA基因突变的引物及探针，包括下列6组18条引物和探针：
PIK3CA驱动突变特异性引物和双环探针：其序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15，以及作为对照的MTHFR引物和探针，其序列为SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：18；以上的引物和探针列表如下：
Figure FDA00003075379800011
2.一种检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的6组18条引物和探针。
3.如权利要求2所述的检测PIK3CA基因突变的检测试剂盒，包括如下的荧光PCR的反应体系，PIK3CA驱动突变荧光PCR反应体系：
1×PCR缓冲液
Figure FDA00003075379800012
Figure FDA00003075379800021
。
4.如权利要求2所述的PIK3CA基因突变检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测方法包括以下步骤：
(1)提供权利要求1所述的6组18条引物和探针；
(2)待测样品的处理和模板DNA的提取；
(3)配制荧光PCR扩增反应体系；
(4)用步骤（1）的引物和探针扩增待测驱动性基因突变靶序列；
(5)利用双环探针与特异性引物的杂交，检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值，Ct>18，是表明上样DNA的量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。
5.如权利要求4所述的一种PIK3CA基因突变检测试剂盒，其特征在于：步骤（2）所述的待检测样品包括手术切除的新鲜病理组织，石蜡包埋病理组织，全血，血浆，血清和胸腔积液。
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