CN114438214A - 结直肠癌肿瘤标志物及其检测方法与装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结直肠癌肿瘤标志物及其检测方法与装置。本发明提供了一种用于检测待测者是否为结直肠癌患者的系统，包括试剂、装置A和装置B；所述试剂能检测粪便DNA中靶标核酸；所述装置A能利用所述试剂检测待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量；所述装置B中设有功能模块；所述功能模块能根据利用所述装置A检测所得的所述待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量的检测结果确定所述待测者是否为结直肠癌患者。本发明方法准确率非常高，且本发明方法具有无创、成本低、操作简单、灵敏度高、检测周期快等优点。本发明为广大人群提供快速简便的结肠癌早期筛查、诊断的有效措施，为实现结直肠癌的早期预警、诊断和干预提供依据。
Description
本申请是申请号为201810676153.6、申请日为2018年06月27日、发明创造名称为“一种结直肠癌肿瘤标志物及其检测方法与装置”的分案申请
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种结直肠癌肿瘤标志物及其检测方法与装置。
背景技术
据统计，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在各类癌症中发病率排名第三，致死率排名第四，近55％的发病案例发生在较发达国家。在年龄小于40岁的人中发生率较低，但随着年龄增加发生率亦逐渐增高。通常认为饮食习惯的西方化会增加CRC发病率，但目前美国及其他高收入国家发病率却保持稳定甚至下降，推测与乙状结肠镜检查及结肠镜下的息肉切除术的增加有关。结直肠癌也是目前最可预防的肿瘤之一，医学界认为如果及早发现，肠癌是最易治愈的癌症。传统的结直肠癌筛选方法主要是结肠镜检查，另外还有活体组织检查和脱落细胞学检查，这几种检查方法都是侵入式的，尤其是脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。所以如果没有相关症状，很多人并不愿意去做结直肠癌的早期筛查。
人体肠道微生物组包含了数量巨大的微生物，它们参与食物药物代谢、人体免疫调节，在保持人体健康中起着极其重要的作用。研究疾病的不同阶段中微生物组成分的改变能够作为一种新的用于癌症诊断及预后效果测试的手段。
发明内容
为了有效的解决上述技术问题，本发明旨在通过筛选一种新的结直肠癌肿瘤标志物，使用Qpcr技术对结直肠癌病人的粪便DNA进行检测，从而实现无创低成本的早期筛查或诊断技术。
第一方面，本发明要求保护一种用于检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者的系统。
本发明所提供的用于检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者的系统，包括试剂、装置A和装置B；
所述试剂为能够检测粪便DNA中靶标核酸的试剂；
所述装置A为能够利用所述试剂检测待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量的装置(如实时荧光定量PCR仪)；
所述装置B中设有功能模块；所述功能模块能够根据利用所述装置A检测所得的所述待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量的检测结果确定所述待测者是否为结直肠癌患者。
进一步地，所述靶标核酸为SEQ ID No.1所示核酸序列或者为来源于微小微单胞菌(Parvimonas micra)且与SEQ ID No.1所示核酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性的核酸序列。
进一步地，所述试剂中含有如下(a1)或(a2)或(a3)所示的引物对：
(a1)由SEQ ID No.6所示的单链DNA和SEQ ID No.7所示的单链DNA组成的引物对；
(a2)由将SEQ ID No.6和SEQ ID No.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对。
(a3)由经SEQ ID No.1所示核酸序列设计所得的引物对，且能特异性扩增SEQ IDNo.1所示核酸序列的引物对。
进一步地，所述装置A能够按照包括如下步骤的方法检测所述待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量：采用所述试剂对所述靶标核酸进行PCR扩增，根据扩增结果确定所述待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量。
其中，所述PCR为实时荧光定量PCR。在本发明的具体实施方式中，具体为基于染料法的实时荧光定量PCR，所述染料具体为SYBR II。相应的，所述装置B中的所述功能模块能够按照如下确定所述待测者是否为结直肠癌患者：如果所述实时荧光定量PCR检测的所述靶标核酸的含量大于等于阈值，则所述待测者为或候选为结直肠癌患者；反之，则所述待测者不为或候选不为结直肠癌患者。
进一步地，所述阈值是所述装置B按照包括如下步骤的方法确定的：(b1)以由结直肠癌患者和非结直肠癌患者(正常对照)组成的群体为研究对象，采用所述试剂和所述装置A对所述群体中每个个体的粪便DNA中的所述靶标核酸分别进行同条件下的所述实时荧光定量PCR检测；(b2)根据所述装置A给出的所述实时荧光定量PCR的检测结果，按照结直肠癌患者和非结直肠癌患者的分组方式绘制ROC曲线，并从所述ROC曲线中找出灵敏度和特异性最佳的点；所述灵敏度和特异性最佳的点所对应的所述实时荧光定量PCR得到的所述靶标核酸的拷贝数(绝对数值)即为所述阈值。
其中，所述靶标核酸的拷贝数(绝对数值)是采用标准曲线法获得的，用的是已知拷贝数的标准品做的标准曲线。
在本发明的具体实施方式中，所述阈值具体为22.64374。
本发明的另一个实施例，所述装置A能够按照包括如下步骤的方法检测所述待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量：采用所述试剂对所述靶标核酸进行测序文库构建，利用测序仪检测所述待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量。相应的，所述装置B中的所述功能模块能够按照如下确定所述待测者是否为结直肠癌患者：如果所述测序仪检测的所述靶标核酸的含量大于等于阈值，则所述待测者为或候选为结直肠癌患者；反之，则所述待测者不为或候选不为结直肠癌患者。
进一步地，所述阈值是所述装置B按照包括如下步骤的方法确定的：(b1)以由结直肠癌患者和非结直肠癌患者(正常对照)组成的群体为研究对象，采用所述试剂和所述装置A对所述群体中每个个体的粪便DNA中的所述靶标核酸经行测序文库构建，利用测序仪检测所述群体中每个个体的粪便DNA中的所述靶标核酸的含量；(b2)根据所述装置A给出的检测结果，按照结直肠癌患者和非结直肠癌患者的分组方式绘制ROC曲线，并从所述ROC曲线中找出灵敏度和特异性最佳的点；所述灵敏度和特异性最佳的点所对应的所述测序仪得到的所述靶标核酸的拷贝数(绝对数值)即为所述阈值。
第二方面，本发明要求保护引物对。
本发明所提供的引物对具体可为如下(a1)或(a2)或(a3)所示的引物对：
(a1)由SEQ ID No.6所示的单链DNA和SEQ ID No.7所示的单链DNA组成的引物对。
(a2)由将SEQ ID No.6和SEQ ID No.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对。
(a3)由经SEQ ID No.1所示核酸序列设计所得的引物对，且能特异性扩增SEQ IDNo.1所示核酸序列的引物对。
第三方面，本发明要求保护核酸探针。
本发明所提供的核酸探针能特异性的捕获SEQ ID No.1所示核酸序列。
第四方面，本发明要求保护含有前文所述引物对或核酸探针的试剂或试剂盒。
第五方面，本发明要求保护前文所述引物对或前文所述核酸探针或前文所述的试剂或试剂盒在如下任一中的应用：
(A1)制备检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者的产品；
(A2)检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者。
第六方面，本发明要求保护靶标核酸或其编码蛋白在如下任一中的应用：
(B1)作为结直肠癌肿瘤标志物；
(B2)检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者。
其中，所述靶标核酸为SEQ ID No.1所示基因或者为来源于微小微单胞菌(Parvimonas micra)且与SEQ ID No.1所示核酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性的核酸序列。
第七方面，本发明要求保护一种检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者的方法。
本发明所提供的检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者的方法，可包括如下步骤：
(a)检测待测者的粪便DNA中靶标核酸的含量；
(b)根据步骤(a)的检测结果确定所述待测者是否为结直肠癌患者。
进一步地，步骤(a)中，所述靶标核酸为SEQ ID No.1所示核酸序列或者为来源于微小微单胞菌(Parvimonas micra)且与SEQ ID No.1所示基因具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性的核酸序列。
进一步地，步骤(a)中，可按照包括如下步骤的方法检测所述待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量：采用引物对对所述靶标核酸进行PCR扩增，根据扩增结果确定所述待测者的粪便DNA中所述靶标核酸的含量；
所述引物对可为如下(a1)或(a2)或(a3)所示的引物对：
(a1)由SEQ ID No.6所示的单链DNA和SEQ ID No.7所示的单链DNA组成的引物对；
(a2)由将SEQ ID No.6和SEQ ID No.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对。
(a3)由经SEQ ID No.1所示核酸序列设计所得的引物对，且能特异性扩增SEQ IDNo.1所示核酸序列的引物对。
其中，步骤(a)中，所述PCR可为实时荧光定量PCR。在本发明的具体实施方式中，具体为基于染料法的实时荧光定量PCR，所述染料具体为SYBR II。
相应地，步骤(b)中，可按照如下确定所述待测者是否为结直肠癌患者：如果所述实时荧光定量PCR检测的所述靶标核酸的含量大于等于阈值(cut off)，则所述待测者为或候选为结直肠癌患者；反之，则所述待测者不为或候选不为结直肠癌患者。
进一步地，所述阈值可按照包括如下步骤的方法确定：(b1)以由结直肠癌患者和非结直肠癌患者(正常对照)组成的群体为研究对象，对所述群体中每个个体的粪便DNA中的所述靶标核酸分别进行同条件下的所述实时荧光定量PCR检测；(b2)根据所述实时荧光定量PCR的检测结果，按照结直肠癌患者和非结直肠癌患者的分组方式绘制ROC曲线，并从所述ROC曲线中找出灵敏度和特异性最佳的点；所述灵敏度和特异性最佳的点所对应的所述实时荧光定量PCR得到的所述靶标核酸的拷贝数(绝对数值)即为所述阈值。
其中，所述靶标核酸的拷贝数(绝对数值)是采用标准曲线法获得的，用的是已知拷贝数的标准品做的标准曲线。
在本发明的具体实施方式中，所述阈值具体为22.64374。
本发明在有病例对照(case-control)的人群中对微小微单胞菌的特异性基因进行定量PCR(qPCR)检测，确定基因的量，分析并验证这些基因预测结直肠癌的概率。开发结直肠癌患者的肠道微生物基因检测试剂盒及检测方法，结果显示本发明方法准确率非常高，且本发明方法具有无创、成本低、操作简单、灵敏度高、检测周期快等优点。本发明为广大人群提供快速简便的结肠癌早期筛查、诊断的有效措施，为实现结直肠癌的早期预警、诊断和干预提供依据。
附图说明
图1为本发明的技术路线图。
图2为20例结直肠癌患者与20例正常人检测结果的boxplot图和roc曲线。其中，a为boxplot图；b为roc曲线。
具体实施方式
本发明的技术路线图如图1所示。具体而言，研究方案如下：
1、微小微单胞菌(Parvimonas micra)特异序列筛选：具体通过MGWAS方法寻找结直肠癌肠道菌群标志物。
2、原材料准备：引物设计及测试；阳性标准品的订购。
1)引物设计：采用oligo7软件对筛选得到的特异菌群的特异序列进行引物设计，尽可能满足重要原则的基础上，要求上下引物扩增产物在70bp～200bp，预计每个基因设计各3～5套引物。
2)引物测试：引物测试通过普通PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测其条带，若目的条带大小与预期一致且条带单一，说明引物特异性好。
3)质控品的订购：质控品序列为本发明提供的特异菌的基因序列发给商业公司进行合成；质控品收到后加入一定量的超纯水，采用Q-bit定量后，-20度保存；用时进一步等梯度稀释到工作液浓度。
3、实时荧光定量PCR(简称Qpcr)实验检测：根据现有流程进行试剂配置及上机操作。
4、分析评估：计算这些基因标志物，预测结直肠癌的灵敏度和特异性。
5、大样本验证：对100例临床上确诊为结直肠癌的病人和100例正常人进行验证。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、结直肠癌肿瘤标志物的发现及其检测方法的建立
一、结直肠癌肿瘤标志物的发现
通过MGWAS方法从微小微单胞菌(Parvimonas micra)的基因组中寻找结直肠癌肠道菌群标志物。最终获得的结直肠癌肠道菌群标志物基因为来源于微小微单胞菌(Parvimonas micra)的SEQ ID No.1所示的基因(585bp)。
虽有文献报道该菌有潜力作为结肠癌的肿瘤标志物，但是同是该菌，其不同基因产生的效果却差别很大，本发明通过MGWAS方法筛选到了微小微单胞菌的5个不同基因序列，并对其设计引物进行进一步的测试。
本发明测试的微小微单胞菌的所有序列如下(表1)：
表1本发明测试的序列：
二、基于结直肠癌肿瘤标志物检测结直肠癌
基于Qpcr技术对结直肠癌患者和正常人粪便DNA进行测试，本发明测试的引物序列如表2所示。
表2本发明测试的引物序列
使用20例临床上被确诊为结直肠癌患病人的粪便DNA和20例正常人粪便DNA进行Qpcr检测。标准曲线法：本发明采用的标准品为分别含有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5对应序列的质粒标准品(南京金斯瑞公司合成，将SEQID No.1-5所示序列分别克隆到标准载体pUC57上)。商业公司寄过来的质粒标准品为干粉，将干粉离心后稀释，测定其浓度后换算为对应的拷贝数，然后进行梯度稀释，稀释5个梯度作为标准曲线。标准曲线的横坐标为拷贝数，纵坐标为CT值。所使用的试剂为：SYBR PremixEx Taq(TM)II(Perfect Real Time)，货号：DRR081A。
1、配制反应液：将引物、DNA模板、ROX Reference Dye、SYBR Premix Ex Taq II配制成10μl反应液，加入到96孔反应板上，具体如下：
2、Qpcr扩增：将96孔板放在Qpcr仪上，进行扩增检测。具体程序如下：95℃30sec；95℃5sec，60℃30sec，40个循环；4℃保存。
3、分析数据：使用Qpcr软件导出结果，根据Qpcr的定量结果(quantity值，即通过标准曲线计算得到的待测样本中靶标基因的拷贝数绝对值)使用R语言对数据进行分析作图，按照结直肠癌病人和正常人的分组方式画box plot图和roc曲线。
结果如图2所示。
图2中的a是一种箱形图，显示结直肠癌病人和正常人两组数据的分散情况；图中横坐标代表结直肠癌和正常人两类人群，纵坐标代表富集度。每个箱的最下面一条线代表下四分位数；中间那条线代表中位数；最上面那条线代表上四分位数；两个人群的中位数差距越大，代表两个人群区分的越开，该肿瘤标志物的检测效率越高。图中每个点代表Qpcr检测结果(quantity值，即通过标准曲线计算得到的待测样本中靶标基因的拷贝数绝对值)经过进一步计算对应的值。
图2中的b是接收者操作特征曲线(roc曲线)，图中横坐标代表特异性，纵坐标代表敏感性；中间那条对角线代表AUC＝0.5的情况，图中得到的AUC为0.94，说明该肿瘤标志物检测效果较好。图中圈起来的拐角处那个点即为灵敏度和特异性最佳的点，其对应的灵敏度和特异性分别为95％和95％(即20例正常人和20例结直肠癌病人中均仅有一人检测结果不正确)，对应的Qpcr的cut off值为22.64374，即Qpcr得到的quantity值(即通过标准曲线计算得到的待测样本中靶标基因的拷贝数绝对值)大于等于该值即可判断为结直肠癌病人，小于该值可判断为正常人(非结直肠癌患者)。
结果：本发明最终得到的特异性较好的靶标基因为SEQ ID No.1，其余SEQ IDNo.2至SEQ ID No.5所示靶标基因对应的效果均较差，无法区分结直肠癌病人和正常人。靶标基因为SEQ ID No.1的具体数据见表3。靶标基因为SEQ ID No.2的具体数据见表4。
表3靶标基因为SEQ ID No.1(所用引物为Pm1-F/Pm1-R)20例正常人和20例结直肠癌病人的Qpcr检测结果
注：表中“—”代表检测结果低于cut off值，判断结果为正常；“+”代表检测结果高于cut off值，判断结果为结直肠癌肿瘤患者。
表4靶标基因为SEQ ID No.2(所用引物为Pm2-F3/Pm2-R3)的20例正常人和20例结直肠癌病人的Qpcr检测结果
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 结直肠癌肿瘤标志物及其检测方法与装置
<130> GNCLN220862
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 585
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ttttttaata cttttgaaga gaaaactgaa ctttttcttg aagagaacgg aagtgaatat 540
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gaagtggaag aagttatcag gactgtaaat agtaacgata agatagtaca agctgttaga 480
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tctgtcaggt tagatactga a 21
Claims (5)
1.引物对，为如下(a1)或(a2)或(a3)所示的引物对：
(a1)由SEQ ID No.6所示的单链DNA和SEQ ID No.7所示的单链DNA组成的引物对；
(a2)由将SEQ ID No.6和SEQ ID No.7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；
(a3)由经SEQ ID No.1所示核酸序列设计所得的引物对，且能特异性扩增SEQ ID No.1所示核酸序列的引物对。
2.核酸探针，为能特异性的捕获SEQ ID No.1所示核酸序列的核酸探针。
3.含有权利要求1所述引物对或权利要求2所述核酸探针的试剂或试剂盒。
4.权利要求2所述的核酸探针或权利要求3所述的试剂或试剂盒在如下任一中的应用：
(A1)制备检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者的产品；
(A2)检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者。
5.靶标核酸或其编码蛋白在如下任一中的应用：
(B1)作为结直肠癌肿瘤标志物；
(B2)检测或辅助检测待测者是否为结直肠癌患者；
所述靶标核酸为SEQ ID No.1所示核酸序列或者为来源于微小微单胞菌且与SEQ IDNo.1所示基因具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性的核酸序列。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109457033B (zh) * | 2018-12-29 | 2020-03-10 | 山东省肿瘤防治研究院（山东省肿瘤医院） | 用于结肠癌筛查的标志物 |
| CN109609639B (zh) * | 2019-01-14 | 2022-04-26 | 深圳微健康基因科技有限公司 | 结直肠癌检测方法及系统 |
| CN109680086A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-04-26 | 苏州普瑞森基因科技有限公司 | 一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用 |
| CN109735623B (zh) * | 2019-03-07 | 2022-01-18 | 天津市第三中心医院 | 一种结直肠癌生物标志物 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6602659B1 (en) * | 1996-05-03 | 2003-08-05 | Thomas Jefferson University | Methods of and kits and compositions for diagnosing colorectal tumors and metastasis thereof |
| US20130102487A1 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Centro de Invetigacion Biomedica en Red de Enfermedades Hepaticas y Digestivas | Plasma micrornas for the detection of early colorectal cancer |
| US20140045180A1 (en) * | 2010-12-16 | 2014-02-13 | Genomictree, Inc. | Method for detecting methylation of colorectal cancer specific methylation marker gene for colorectal cancer diagnosis |
| CN105018594A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-11-04 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种结直肠癌早期诊断标记物及相关试剂盒 |
| CN105473739A (zh) * | 2013-08-06 | 2016-04-06 | 深圳华大基因科技有限公司 | 结直肠癌生物标志物 |
| CN106399570A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-02-15 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统 |
| CN106987638A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-07-28 | 浙江唯实医学检验有限公司 | 用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物、探针、试剂盒及检测方法 |
| CN107043823A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-08-15 | 郴州市第人民医院 | 一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用 |
| CN108103195A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-01 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011160585A1 (en) * | 2010-06-23 | 2011-12-29 | The Chinese University Of Hong Kong | Micro-rna markers for colorectal cancer |
| WO2016019505A1 (en) * | 2014-08-05 | 2016-02-11 | Bgi Shenzhen Co., Limited | Use of eubacterium in the prevention and treatment for colorectal cancer related diseases |
| CA2962466C (en) * | 2014-10-21 | 2023-01-10 | uBiome, Inc. | Method and system for microbiome-derived diagnostics and therapeutics |
| CN107904286A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-04-13 | 苏州普瑞森基因科技有限公司 | 一种结直肠癌微生物标志物及其应用 |
-
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Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6602659B1 (en) * | 1996-05-03 | 2003-08-05 | Thomas Jefferson University | Methods of and kits and compositions for diagnosing colorectal tumors and metastasis thereof |
| US20140045180A1 (en) * | 2010-12-16 | 2014-02-13 | Genomictree, Inc. | Method for detecting methylation of colorectal cancer specific methylation marker gene for colorectal cancer diagnosis |
| US20130102487A1 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Centro de Invetigacion Biomedica en Red de Enfermedades Hepaticas y Digestivas | Plasma micrornas for the detection of early colorectal cancer |
| CN105473739A (zh) * | 2013-08-06 | 2016-04-06 | 深圳华大基因科技有限公司 | 结直肠癌生物标志物 |
| CN105018594A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-11-04 | 广州医科大学附属第三医院 | 一种结直肠癌早期诊断标记物及相关试剂盒 |
| CN106399570A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-02-15 | 杭州诺辉健康科技有限公司 | 用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统 |
| CN106987638A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-07-28 | 浙江唯实医学检验有限公司 | 用于检测与结直肠癌相关的血浆多基因甲基化程度的引物、探针、试剂盒及检测方法 |
| CN107043823A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-08-15 | 郴州市第人民医院 | 一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用 |
| CN108103195A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-01 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MANASI S SHAH等: "Leveraging sequence-based faecal microbial community survey data to identify a composite biomarker for colorectal cancer", BMJ, pages 1 - 11 * |
| 刘玉兰;何凤屏;徐新;吴青松;李定云;马占忠;郭艳乐;唐盛;尹卫东;龚海涛;刘艺;林恒先;: "实时荧光定量PCR检测结直肠癌患者粪便肿瘤型M2-PK DNA及临床应用研究", 国际检验医学杂志, no. 11, pages 9 - 11 * |
| 无: "Parvimonas micra strain KCOM 1535, complete genome", NCBI, pages 1 - 4 * |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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