CN109680086A

CN109680086A - 一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用

Info

Publication number: CN109680086A
Application number: CN201910142671.4A
Authority: CN
Inventors: 朱永亮; 穆延召; 杨敏; 陆敏
Original assignee: Suzhou Puruisen Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Puruisen Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明提供了一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用；本发明通过设计并验证得到特异性的引物组，基于引物组摸索验证检测体系，各步骤各条件相互配合，协同增持，使其检测结果稳定准确，检测步骤简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用。

背景技术

结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在各类癌症中发病率排名第三，致死率排名第四，近55％的发病案例发生在较发达国家。在年龄小于40岁的人中发生率较低，但随着年龄增加发生率亦逐渐增高。通常认为饮食习惯的西方化会增加CRC发病率，但目前美国及其他高收入国家发病率却保持稳定甚至下降，推测与乙状结肠镜检查及结肠镜下的息肉切除术的增加有关。结直肠癌也是目前最可预防的肿瘤之一，医学界认为如果及早发现，肠癌是最易治愈的癌症。传统的结直肠癌筛选方法主要是结肠镜检查，另外还有活体组织检查和脱落细胞学检查，这几种检查方法都是侵入式的，尤其是脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。所以如果没有相关症状，很多人并不愿意去做结直肠癌的早期筛查。

哺乳动物的胃肠道密集地定殖有与其宿主以共生方式共存的数百种微生物物种，统称为微生物群的微生物影响众多的宿主健康方面，包括营养物代谢、肠组织的体内稳态、先天性和适应性免疫反应的发展，且更一般而言防御肠感染。细菌通过接触依赖性和可溶因子介导的抑制直接以及间接通过调节和诱导宿主免疫反应来拮抗肠道致病菌，但个别细菌对于定植抗特异性病原体的抗性的作用尚未充分了解。人体肠道微生物组包含了数量巨大的微生物，它们参与食物药物代谢、人体免疫调节，在保持人体健康中起着极其重要的作用。研究疾病的不同阶段中微生物组成分的改变能够作为一种新的用于癌症诊断及预后效果测试的手段。

因此，研发一种用于结直肠癌检测的微小微单胞菌引物组、检测体系及其应用，实现准确简便的检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足和市场的需求，本发明提供了一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用，通过设计特异性的引物并摸索反应浓度和条件，构建性能良好的检测体系和使用方便的试剂盒，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，一种检测微小微单胞菌的引物组，所述引物组包括微小微单胞菌引物对：SEQ ID NO.1-2。

优选地，所述引物组还包括总菌引物对：SEQ ID NO.3-4。

微生物16S rRNA序列包含9个可变区和10个高度保守区，本发明中，发明人为保证引物特异性，选择在保守区内设计引物，得到微小微单胞菌引物对；另外相对于其他可变区，V3-V4区能够覆盖98％以上的细菌，且V3-V4区扩增产物长度符合qPCR对引物预期产物的长度要求；以此为条件，设计得到一对符合要求的总菌引物，可以对粪便样本中的所有微生物的总量进行鉴定。

根据细菌名称在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nμccore/)上下载细菌的16S rRNA序列，而后利用引物设计软件Primer Primer 5设计细菌特异性引物；qPCR引物设计要求：引物长度18-25bp左右，避免产生二级结构，GC含量50-60％，Tm值60-65℃，产物长度100-250bp。所述特异性引物包括随机碱基，所述随机碱基的个数为3-5个，通过加入随机碱基，调控随机碱基的数量，提高检测特异性。

本发明中，发明人设计引物组并验证其特异性，比对出的序列均为细菌16SrRNA序列或全基因组序列。用引物通过PCR扩增出目的片段，然后进行电泳，产物条带与预期一致，且无任何杂带，对引物扩增出的片段进行一代测序，将测序所得序列在NCBI网站上Nμcleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)功能进行序列比对，与预期产物序列相似度高于90％。

确定的微小微单胞菌引物对为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，总菌引物为：SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4，

确定条件：1)扩增产物单一且大小与预期一致；2)扩增产物测序结果与预期产物序列相似度高；3)融解曲线峰形为单峰且集中；4)扩增效率在90％-105％之间。

序列表见表1；

表1. 6种细菌的引物信息

第二方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物组。

优选地，所述试剂盒还包括qPCR SYBRGreen Mix、ddH₂O和PCR反应液。

优选地，所述PCR反应液包括10-80mmol/L的Tris-HCl、10-40mmol/L的硫酸铵、1-5.5mmol/L的MgCl₂和100-500μmol/L的dNTPs。

优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；

优选地，所述阴性质控品包括无菌水；

优选地，所述阳性质控品包括具核梭杆菌基因组DNA。

第三方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系包含第一方面所述的引物组。

优选地，所述检测体系还包括DNA、qPCR SYBRGreen Mix和dd ddH₂O；

优选地，所述qPCR SYBRGreen Mix的浓度为；

优选地，所述DNA的添加量为1.00-1.25ng/μL，例如可以是1.00ng/μL、1.05ng/μL、1.10ng/μL、1.15ng/μL、1.20ng/μL或1.25ng/μL。

本发明中，发明人以体系中Vazyme ChamQΜniversal SYBR qPCR Master Mix试剂推荐的反应体系为基础，测试体系中模板DNA的添加量；通过Qμbit测定样本DNA浓度，设置DNA起始量梯度进行实验，Ct值≤35对应的DNA起始量为可接受范围。

优选地，所述引物组的引物的浓度为0.25-1.25ng/μL，例如可以是0.25ng/μL、0.30ng/μL、0.40ng/μL、0.50ng/μL、0.60ng/μL、0.70ng/μL、0.80ng/μL、0.90ng/μL、1.00ng/μL、1.10ng/μL或1.25ng/μL。

优选地，所述检测体系的检测条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃1min，45个循环。

本发明中，发明人根据第一方面提供的引物组的正反向引物的Tm值±5℃设置温度梯度进行qPCR实验，根据融解曲线及产物电泳图反复摸索验证，各步骤各条件相互配合，选择融解峰单一集中且电泳条带单一明亮的温度，最终确定微小微单胞菌引物最适退火温度为60℃。

体系优化完成后，发明人通过标准曲线测试反应性能：以已知浓度的质粒为模板，10倍梯度稀释制作标准曲线，若曲线的扩增效率达到90-105％，线性相关系数R2>0.98，且每个梯度重复样本之间Ct值接近，则说明反应体系性能良好。

本发明通过设计并验证得到特异性的引物组，基于引物组摸索验证检测体系，各步骤各条件相互配合，协同增持，使其检测结果稳定准确，检测步骤简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物组、第二方面所述的试剂盒或第三方面所述的检测体系用于制备检测结直肠癌的药物和/或试剂的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提供的引物组特异性好，准确性高；本发明提供的引物组制备的检测体系性能良好，曲线的扩增效率达到90-105％，线性相关系数R2>0.98，且每个梯度重复样本之间Ct值接近；制备得到的试剂盒用于检测时操作简便，易于推广。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1

(1)检测样本和菌种

研究所需菌株来源于受试者的粪便样本，采集粪便样本前三个月内受试者未服用抗生素及类似药物，参考常安易TM粪便采集盒说明书，采集受试者的粪便样本，于本实验室2-8℃保存，不超过24小时。

(2)引物设计和鉴定

微生物16S rRNA序列包含9个可变区和10个高度保守区，为保证引物特异性，故选择在保守区内设计引物；另相对于其他可变区，V3-V4区能够覆盖98％以上的细菌，且V3-V4区扩增产物长度符合qPCR对引物预期产物的长度要求；以此为条件，设计得到一对符合要求的引物，可以对粪便样本中的所有微生物的总量进行鉴定。

根据细菌名称在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nμccore/)上下载细菌的16S rRNA序列，而后利用引物设计软件Primer Primer 5设计细菌特异性引物；qPCR引物设计要求：引物长度18-25bp左右，避免产生二级结构，GC含量50-60％，Tm值60-65，产物长度100-250bp，得到序列见表1；

引物设计完成后通过NCBI网站Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)功能鉴定引物的特异性，比对出的序列均为细菌16S rRNA序列或全基因组序列；用引物通过PCR扩增出目的片段，然后进行电泳，产物条带与预期一致，且无任何杂带，对引物扩增出的片段进行一代测序，将测序所得序列在NCBI网站上NucleotideBLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)功能进行序列比对，与预期产物序列相似度高于90％。

根据正反向引物的Tm值±5℃设置温度梯度进行qPCR实验，根据融解曲线及产物电泳图确定最适退火温度。(选择融解峰单一集中且电泳条带单一明亮的温度。)最终确定微小微单胞菌的引物最适退火温度为60℃。

实施例2试剂盒的组装

PCR反应液：Tris-HCl：10-80mmol/L，pH8.5；硫酸铵：10-40mmol/L；MgCl₂：1-5.5mmol/L；dNTPs：100-500μmol/L；引物终浓度为0.25-1.25ng/μL。

总菌PCR反应液：Tris-HCl：50mmol/L，pH8.5；硫酸铵：25mmol/L；MgCl₂：2.5mmol/L；dNTPs：350μmol/L；

阴性对照PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl2：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；

阳性对照PCR反应液：Tris-HCl：40mmol/L，pH8.5；硫酸铵：30mmol/L；MgCl₂：3mmol/L；dNTPs：300μmol/L；

阴性质控品：无菌水；

阳性质控品：具核梭杆菌基因组DNA。

肠道微生态试剂盒结构如下表2所示：

表2

表2 5种细菌引物组研制肠道微生态试剂盒结构

实施例3

(1)粪便菌群基因组DNA提取

利用粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328，天根生化科技(北京)有限公司)提取待测粪便样本中的基因组DNA。

(2)qPCR反应体系和结果判定

以粪便菌群基因组DNA为模板，以粪便中总菌数为内参，采用实施例2制得的肠道微生态试剂盒，计算6种细菌占总菌的相对含量。

利用引物，在具有SYBRGreen检测通道的荧光定量PCR仪(西安天隆)上，对基因组进行扩增和荧光检测，荧光采集在60℃。

qPCR反应体系和条件如下：

(1)qPCR实验体系：20μL体系，qPCR SYBRGreen Mix(2*)10μL，正反向引物各0.5μL，DNA 1μL，ddH₂O 8μL；

(2)qPCR实验条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，最适退火温度退火60℃1min，共45个循环。

获得微小微单胞菌的Ct值和总菌Ct值，通过(细菌-Ct总菌)得到样本中微小微单胞菌在总菌中的相对含量。

从临床收集100例肠癌患者、200例腺瘤和100例正常人的粪便标本，检测微小微单胞菌的相对含量。利用数据分析软件SPSS 20，采用Mann-Whitney U检验对数据结果进行显著性分析。

整体比较，该菌在癌症组中含量较高；P值统计，与对照组相比，腺瘤组中该菌数量无显著差异(P>0.05)，癌症组中该菌数量显著增加(P<0.05)；将本研究结果与文献报导中的研究结果进行对比，结果一致。

分组	人数	平均值	P
				对照组	100	7.30E-06
肠癌组	100	9.30E-05	0.042<sup>a</sup>
				腺瘤组	200	9.53E-06	0.424<sup>a</sup>

注：a:与对照组进行比较，T-Test。

综上所述，本发明提供的引物组特异性好，制得的检测体系中各步骤各条件相互配合，协同增效，扩增准确稳定，组装的试剂盒用于检测微小微单胞菌，操作简便，易于推广，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州普瑞森基因科技有限公司

<120> 一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用

<130> 2019年

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtcactacgg aagaatttgt c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggcttgagcg ataataactt c 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tccgtgstgc ayggytgtcg tcag 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aggtacgtcr tccmcacctt cctc 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tgggagtcaa atctcggtgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cccaacatct cacgacacga 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcgaacgtga tttttgtgga aa 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggtaggttgc tcacgtgtta ctca 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ggcgtgctta acacatgcaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gtggctttgt ggtctcatgc 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ccttgtgstg cayggytgtc gtca 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

atccacgtcr tccmcacctt cctc 24

Claims

1.一种检测微小微单胞菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括微小微单胞菌引物对：SEQ ID NO.1-2。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括总菌引物对：SEQ IDNO.3-4。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括qPCRSYBRGreen Mix、dd ddH₂O和PCR反应液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括10-80mmol/L的Tris-HCl、10-40mmol/L的硫酸铵、1-5.5mmol/L的MgCl₂和100-500μmol/L的dNTPs。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；

优选地，所述阴性质控品包括无菌水；

优选地，所述阳性质控品包括具核梭杆菌基因组DNA。

7.一种检测体系，其特征在于，所述检测体系包含权利要求1或2所述的引物组。

8.根据权利要求7所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还包括DNA、qPCRSYBRGreen Mix和dd ddH₂O；

优选地，所述qPCR SYBRGreen Mix的浓度为2×；

优选地，所述DNA的添加量为1.00-1.25ng/μL；

优选地，所述引物组的引物的浓度为0.25-1.25ng/μL。

9.根据权利要求7或8所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系的检测条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃1min，45个循环。

10.一种如权利要求1或2所述的引物组、权利要求3-6中任一种所述的试剂盒或权利要求7-9中任一种所述的检测体系用于制备检测结直肠癌的药物和/或试剂的应用。