CN109266764B - 一种检测常见益生菌丰度的试剂盒 - Google Patents

一种检测常见益生菌丰度的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测常见益生菌丰度的试剂盒，本发明人通过自有技术，从大量的数据中分析并设计、筛选出特异性最好及扩增效率最高的引物，包括Faecalibacterium、lactobacillus、Bifidobacterium、Akkermansia muciniphil和总菌引物本发明的引物，扩增特异性好，扩增效率高，可以从复杂的肠道微生物菌群总DNA中特异性扩增出相应的益生菌，其结果与成熟的方法相同。本发明的试剂盒，可以实现对常见益生菌的快速、直观的检测，缩短了检测周期，降低了检测成本。

Description

一种检测常见益生菌丰度的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测常见益生菌丰度的试剂盒。
背景技术
肠道菌群大约包括两千多种菌。肠道菌群构成与生活习惯，饮食和宿主的基因密切相关，个体间存在着较大的差异。厚壁菌门，拟杆菌门，放线菌门，这三个门在人体肠道菌群中占支配地位，厌氧菌如拟杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、消化链球菌属等占了肠道菌群的主要部分，而兼性厌氧菌如乳酸杆菌属、肠球菌属、链球菌属、肠杆菌属等只占了很小的一部分。
肠道菌群与宿主构成动态平衡的微生态系统，参与多种生理活动：参与营养物质消化吸收，酵解纤维素、低聚糖等产生可吸收的短链脂肪酸等；参与营养物质合成，合成维生素B族，维生素K、叶酸等；参与免疫调节，肠道菌群在机体免疫发育过程中发挥着重要作用，保持机体免疫功能处于一个适度的活跃状态；参与神经调控，肠道菌群代谢产物中含有γ氨基丁酸与五羟色胺等神经递质，通过肠脑轴调控神经系统功能；参与生长发育与衰老，肠道菌群随着年龄的增长而发生着动态变化；构成肠道黏膜的保护屏障，肠道菌群维持肠道微生态平衡，形成生物屏障，抵御致病菌的侵袭。通过检测肠道菌群的组成情况，可以对个体肠道菌群的评估、干预提供可靠的判断依据。
目前检测肠道菌群方法主要包括16S rRNA测序及荧光定量PCR鉴定。16S测序通过16S通用引物扩增后通过二代测序方法鉴定肠道菌群的丰度，优点是通量较大，准确性高，缺点是操作时间长、建库流程复杂、周期较长、成本较高。荧光定量PCR肠道菌群丰度，通过设计特异性的引物对特定的DNA序列进行扩增，灵敏度、特异性高，缺点是通量较小，且引物特异性需要得到保障，优点是成本较低，实验周期较短、且成本较低。
肠道菌群组成复杂，且很多菌株极其接近，直接使用荧光PCR对肠道菌群进行扩增，往往存在特异性差，扩增效率低下，现有技术中缺乏可以应对这种复杂样本的引物。
如何高通量低成本地检测常见肠道菌群丰度，是一项具有挑战性的工作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高通量、低成本的常见肠道菌群丰度检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种检测肠道常见益生菌丰度的引物组，包括如下序列：
Faecalibacterium:
上游序列：GGTCTTCGGATTGTAAACTCCTG(SEQ ID NO：1)
下游序列：GTAATTCCGGACAACGCTTGTG(SEQ ID NO：2)
lactobacillus:
上游序列：GTGGAACTCCATGTGTAGCGG(SEQ ID NO：3)
下游序列：GGCGGAAACCCTCCAACAC(SEQ ID NO：4)
Bifidobacterium:
上游序列：CGGGTGAGTAATGCGTGACC(SEQ ID NO：5)
下游序列：TGATAGGACGCGACCCCA(SEQ ID NO：6)
Akkermansia muciniphila:
上游序列：CGGCACATGATACTGCGAGAC(SEQ ID NO：7)
下游序列：TCAGTTAATGTCCAGGAACCCG(SEQ ID NO：8)
总菌:
上游序列：CCTACGGGAGGCAGCAG(SEQ ID NO：9)
下游序列：ATTACCGCGGCTGCTGG。(SEQ ID NO：10)
一种检测肠道常见益生菌丰度的试剂盒，包括PCR反应体系，其引物组如上所示。作为上述试剂盒的进一步改进，PCR反应体系为qPCR反应体系。
作为上述试剂盒的进一步改进，qPCR反应体系的组成为：
成分 体积(μL)
荧光染料 5
正向引物(2.5μM) 0.5
反向引物(2.5μM) 0.5
模板DNA(2ng/μL) 1
UDG酶 0.01
水 补足至10μL
作为上述试剂盒的进一步改进，荧光染料为LightCycler 480SYBR Green IMaster。作为上述试剂盒的进一步改进，PCR的程序包括：
Figure BDA0001814669050000031
作为上述试剂盒的进一步改进，72℃时收集荧光。
一种测定肠道常见益生菌丰度的方法，包括：
1)提取粪便微生物基因组DNA作为模板DNA；
2)使用权利要求1所述的引物组对模板DNA进行扩增；
3)根据扩增结果确定肠道常见益生菌丰度。
作为上述方法的进一步改进，qPCR反应体系的组成为：
成分 体积(μL)
荧光染料 5
正向引物(2.5μM) 0.5
反向引物(2.5μM) 0.5
模板DNA(2ng/μL) 1
UDG酶 0.01
水 补足至10μL
作为上述方法的进一步改进，荧光染料为LightCycler 480SYBR Green IMaster。
作为上述方法的进一步改进，PCR的程序包括：
Figure BDA0001814669050000032
本发明的有益效果是：
本发明的引物，扩增特异性好，扩增效率高，可以从复杂的肠道微生物菌群总DNA中特异性扩增出相应的益生菌，其结果与成熟的方法相同。
本发明的试剂盒，可以实现对常见益生菌的快速、直观的检测，缩短了检测周期，降低了检测成本。
附图说明
图1是Faecalibacterium及其阴性对照的qPCR曲线；
图2是Lactobacillus及其阴性对照的qPCR曲线；
图3是Akkermansia muciniphila及其阴性对照的qPCR曲线；
图4是Bifidobacterium及其阴性对照的qPCR曲线；
图5是总菌及其阴性对照的qPCR曲线；
图6是不同扩增产物的凝胶电泳结果；
图7分别是Faecalibacterium和Lactobacillus扩增产物的熔解曲线；
图8分别是Akkermansia muciniphila、Bifidobacterium和总菌扩增产物的熔解曲线；
图9是对照组扩增产物的凝胶电泳结果。
具体实施方式
发明人通过一系列研究，创造性针对常见肠道菌群16S或其它特异基因设计了一系列引物，并改进实验条件，对PCR扩增步骤进行分步优化，实现对常见肠道菌群的准确检测，检测结果快速、直观、方便进对个体肠道菌群的评估。
下面结合实施例，对本发明的技术进行进一步的说明。
引物设计难点在于找到细菌基因中具有特异性的序列，细菌的种属复杂，各个种属之间存在着或远或近的亲缘关系，譬如同一个科或属的细菌序列存在着极大的同源性，因此设计的引物往往存在着非特异性的扩增，不能达到特异扩增目标产物的效果。本发明人通过自有技术，从大量的数据中分析并设计、筛选出特异性最好及扩增效率最高的引物，这些引物具有特异性高，没有非特异性扩增的特点，PCR操作本身是较为成熟的，条件根据引物本身的条件而变化。
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：
引物序列：
Faecalibacterium:
上游序列：GGTCTTCGGATTGTAAACTCCTG
下游序列：GTAATTCCGGACAACGCTTGTG
lactobacillus:
上游序列：GTGGAACTCCATGTGTAGCGG
下游序列：GGCGGAAACCCTCCAACAC
Bifidobacterium:
上游序列：CGGGTGAGTAATGCGTGACC
下游序列：TGATAGGACGCGACCCCA
Akkermansia muciniphila:
上游序列：CGGCACATGATACTGCGAGAC
下游序列：TCAGTTAATGTCCAGGAACCCG
总菌:
上游序列：CCTACGGGAGGCAGCAG
下游序列：ATTACCGCGGCTGCTGG。
qPCR反应体系的组成为：
成分 体积(μL)
荧光染料 5
正向引物(2.5μM) 0.5
反向引物(2.5μM) 0.5
模板DNA(2ng/μL) 1
UDG酶 0.01
水 补足至10μL
荧光染料为LightCycler 480SYBR Green I Master。
粪便微生物基因组DNA处理和常见肠道菌定量流程
提取粪便微生物基因组DNA并调整其浓度为2ng/μL；
按照qPCR反应体系组成，在光学96孔PCR板中配制qPCR反应体系。每个样本5对引物，每对引物2个反应孔，共10个反应孔。每个PCR板做5个阴性对照(每对引物一个阴性对照)；
在荧光定量PCR仪上进行PCR，PCR的程序包括：
Figure BDA0001814669050000051
72℃收集荧光
qPCR结束，将Baseline置于扩增曲线对数增长期前期，得到各个孔的Ct值，去掉数据不可用的孔(Ct值大于30，扩增效率低等)，求出同一样本的相同引物做的重复孔的Ct值的平均值，用总菌引物得到的平均Ct值减去待测菌引物的平均Ct值，得到ΔCt值，2ΔCt(2的ΔCt次方)即为待测菌占总菌的比例。
标准品浓度梯度：
标准品浓度梯度ng/μl，总菌标准品为四种标准品混合按照1:1:1:1混合。
引物扩增效果的验证
扩增结束后，按如下程序测定其熔解曲线，
Figure BDA0001814669050000061
实验结果：
图1～5分别是Faecalibacterium、Lactobacillus、Akkermansia muciniphila、Bifidobacterium和总菌及其阴性对照的qPCR曲线。从图中可以看出，引物具有很好的扩增效率。
将标准品梯度稀释，稀释成为1ng/μl，0.1ng/μl,0.01ng/μl,0.001ng/μl，后进行qPCR观察其线性程度，如下表，可见梯度稀释后引物CT值的线性度很好，证明引物在各个浓度条件下均具有良好的扩增效果。
Figure BDA0001814669050000062
PCR产物进行凝胶电泳结果如图6所示，其中Fae代表Faecalibacterium，Lac代表Lactobacillus，Akk代表Akkermansia muciniphila，Bif代表Bifidobacterium。从图中可以看出，扩增产物条带单一、清晰，说明扩增产物具有很高的纯度，所使用的引物具有很好的特异性。
扩增产物的熔解曲线如图7和图8所示。从图中可以看出，Faecalibacterium、Lactobacillus、Akkermansia muciniphila、Bifidobacterium和总菌的溶解曲线峰都非常单一，引物特异性好。
对比例：
发明人根据常规方法，针对上述菌群的16S RNA保守序列设计引物并进行扩增，所使用的引物序列如下：
Faecalibacterium:
上游序列：AGATGGCCTCGCGTCCGA(SEQ ID NO：11)
下游序列：CCGAAGACCTTCTTCCTCC(SEQ ID NO：12)
lactobacillus:
上游序列：AGCAGTAGGGAATCTTCCA(SEQ ID NO：13)
下游序列：CACCGCTACACATGGAG(SEQ ID NO：14)
Bifidobacterium:
上游序列：GGGTGGTAATGCCGGATG(SEQ ID NO：15)
下游序列：TAAGCCATGGACTTTCACACC(SEQ ID NO：16)
Akkermansia muciniphila:
上游序列：GTCATGTGGGAGCAAATTAAAAAG(SEQ ID NO：17)
下游序列：GTATCATGTGCCGTCCGCG(SEQ ID NO：18)
扩增产物的凝胶电泳结果如图9所示。从图中可以清楚地看出扩增结果中具有明显的非特异性条件，说明常规方法设计得到的引物特异差，扩增结果不可靠，无法用于常见益生菌的丰度检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 一种检测常见益生菌丰度的试剂盒
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
ggtcttcgga ttgtaaactc ctg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gtaattccgg acaacgcttg tg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
gtggaactcc atgtgtagcg g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
ggcggaaacc ctccaacac 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
cgggtgagta atgcgtgacc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
tgataggacg cgacccca 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
cggcacatga tactgcgaga c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 8
tcagttaatg tccaggaacc cg 22
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 9
cctacgggag gcagcag 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 10
attaccgcgg ctgctgg 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 11
agatggcctc gcgtccga 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 12
ccgaagacct tcttcctcc 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 13
agcagtaggg aatcttcca 19
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 14
caccgctaca catggag 17
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 15
gggtggtaat gccggatg 18
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 16
taagccatgg actttcacac c 21
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 17
gtcatgtggg agcaaattaa aaag 24
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 18
gtatcatgtg ccgtccgcg 19

Claims (8)

1.一种检测肠道常见益生菌丰度的引物组，包括如下序列：
Faecalibacterium:
上游序列：GGTCTTCGGATTGTAAACTCCTG
下游序列：GTAATTCCGGACAACGCTTGTG
lactobacillus:
上游序列：GTGGAACTCCATGTGTAGCGG
下游序列：GGCGGAAACCCTCCAACAC
Bifidobacterium:
上游序列：CGGGTGAGTAATGCGTGACC
下游序列：TGATAGGACGCGACCCCA
Akkermansia muciniphila:
上游序列：CGGCACATGATACTGCGAGAC
下游序列：TCAGTTAATGTCCAGGAACCCG
总菌:
上游序列：CCTACGGGAGGCAGCAG
下游序列：ATTACCGCGGCTGCTGG。
2.一种检测肠道常见益生菌丰度的试剂盒，包括PCR反应体系，其特征在于：所述PCR反应体系的引物组如权利要求1所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：PCR反应体系为qPCR反应体系。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：qPCR反应体系的组成为：
成分 体积(μL) 荧光染料 5 正向引物(2.5μM) 0.5 反向引物(2.5μM) 0.5 模板DNA(2ng/μL) 1 UDG酶 0.01 水 补足至10μL
。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：荧光染料为LightCycler 480SYBRGreen I Master。
6.一种非诊断目的的测定肠道常见益生菌丰度的方法，包括：
1)提取粪便微生物基因组DNA作为模板DNA；
2)使用权利要求1所述的引物组对模板DNA进行扩增；
3)根据扩增结果确定肠道常见益生菌丰度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：扩增反应的体系为：
成分 体积(μL) 荧光染料 5 正向引物(2.5μM) 0.5 反向引物(2.5μM) 0.5 模板DNA(2ng/μL) 1 UDG酶 0.01 水 补足至10μL
。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：扩增反应的程序包括：
Figure FDA0003159968150000021
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