CN112029881B - 用于检测副干酪乳杆菌n1115的引物对及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，本发明公开了一种用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对及应用，该引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下有引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该引物对检测的特异性良好、灵敏度高以及传代稳定性高；本发明还提供了该引物对的一种应用，该引物对作为扩增引物，对待测样品的DNA提取液进行扩增，所得扩增产物进行RT‑qPCR检测，以检测样品中的副干酪乳杆菌N1115。本发明适用于针对副干酪乳杆菌N1115的快速检测，确定样品中是否含有副干酪乳杆菌N1115及其菌浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种用于检测益生菌的引物对及应用,具体地说是一种用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对及应用。
背景技术
副干酪乳杆菌 N1115（ Lactobacillus paracasei N1115，简称N1115），是从内蒙古牧区传统发酵乳制品中分离得到的一株功能性菌株。研究表明，N1115不仅具有耐酸、耐胆盐、促进肠道细胞生长等特性，还可以刺激T细胞增殖分化，调节细胞免疫应答过程，在提高机体抗感染能力的同时降低超敏反应的发生。但当在食品中的副干酪乳杆菌N1115过量增殖时，也会影响人体的免疫机能以及肠道的菌落平衡，因此，针对副干酪乳杆菌N1115的检验也是在相关食品原料、食品的生产和质量安全中必不可少的一环。
目前，益生菌的检测对于新食品原料、新食品研制和生产以及后续产品的质量安全控制来说意义重大。现有的检测方法仅限于乳酸菌总数和少数几种益生菌。如GB4789.35-2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》，GB 4789.34-2016《食品微生物学检验 双歧杆菌检验》中公开的检测方法，且这些检测方法均存在操作复杂、结果判读时间长等缺陷。
中国发明专利201510947685.5公开了一种检测 Lactobacillus paracaseiN1115菌株的引物对及检测N1115活菌数的方法，该方法基于pheS基因设计出了特异引物，需要PMA及光照等特殊步骤，这些步骤存在准备时间长，需要特殊设备及条件，无法满足在普通环境中进行检测等问题，且该方法前期对于待测样品中的DNA提取过程繁琐，检测极其不方便；而且，一旦样品中的N1115失活，该方法则无法检测出被测样品中是否含有副干酪乳杆菌N1115。
发明内容
为解决现有技术中存在的以上不足，本发明旨在提供一种用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对及应用，以达到定性定量地检测样品中的副干酪乳杆菌N1115的目的。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
本发明还提供一种用于检测副干酪乳杆菌 N1115的试剂盒，包含用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对、探针、CTAB裂解液、TE缓冲液和Mix缓冲液；
作为本发明的进一步限定，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
本发明还提供一种用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对的一种应用，所述用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对作为扩增引物，对待测样品的DNA提取液进行扩增，所得扩增产物进行RT-qPCR检测，以检测样品中的副干酪乳杆菌N1115；
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的有益效果是：
（1）本发明提供的用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对具有良好的特异性，同时具有良好的稳定遗传性，在分析过程中，能够稳定扩增目标DNA，确保分析检测的准确；
（2）本发明提供的含有用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对的试剂盒提取样品DNA，省去了传统方法中复杂的前处理工艺，能够更加高效，准确、直接地提取样品中的DNA，大幅度缩短检测时间，且在一般环境中也可以进行检测，同时也可以对103 CFU/mL到109CFU/mL的菌种密度的未知菌种进行定性分析；
（3）本发明提供的检测副干酪乳杆菌 N1115含量的方法不仅可以检测样品中是否存在副干酪乳杆菌N1115活菌，使用该方法也可以检测出存在被测样品中的失活副干酪乳杆菌N1115。
综上所述，本发明提供的用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对，具有良好的特异性和传代稳定性，利用含有该引物对的试剂盒以及利用该引物对进行扩增的副干酪乳杆菌检测方法，能够快速、准确地检测出被测样品中的副干酪乳杆菌N1115的菌浓度，提高含有副干酪乳杆菌N1115的食品的质量安全检测效率。
本发明适用于对食品中是否含有副干酪乳杆菌 N1115的进行快速定性定量分析。
附图说明
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。
图1为SNP位点分析结果截图；
图2为N1115染色体DNA扩增曲线及线性拟合；
图3为N1115引物对于菌种内不同菌株的特异性；
图4为N1115引物对于不同菌种的特异性；
具体实施方式
以下结合附图和本发明的优选实施例对本发明进行说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和理解本发明，并不用于限定本发明；
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。
实施例1 筛选用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对及探针
本实施例提供的一种用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对的筛选过程如下：
下载GenBank数据库中多个副干酪乳杆菌菌株基因组，包括ATCC_334、BD-II、CAUH35、EG、FAM18149、HD1.7、HDS-01、IIA、JCM_8130、KL1、L9、LC2W、LC355、LOCK919、Lpc10、TK1501、TMW、Zhang全基因组序列，以N1115菌株作为参考菌株，其他菌株的基因组序列通过随机打断的方式模拟形成150bp的二代测序数据，通过BWA软件将这些模拟数据定位到参考菌株上，通过变异检测软件SAMtools进行SNP Calling，并对原始结果进行过滤，得到Excel分析结果,见图1，其中。CHROM为SNP位点所在染色体；POS为SNP位点坐标；REF为参考序列在该位点的基因型；其他列为每个个体该位点的基因型（“：”前字母为该位点的基因型；“：”后字母为该位点基因型变异可信度）分析共得到9129个特异性位点。结合现有N1115菌株基因组注释信息 ，寻找位于开发阅读框架中的特异性位点。特异位点前后共约200 bp片段，使用Primer Express 3.0进行引物对及探针设计，选择包含特异性位点的引物对及探针。通过引物特异性位点个数及位置，并结合Tm值、引物末端稳定性、GC含量、二级结构等参数，得到30套理论可行的引物对及探针，并优选其中的5套引物对及探针进行合成。最终经过试验验证，得到一组用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对及探针，位于开放阅读框架CDS 247，具体序列见表1。该引物对及探针由上海英俊生物技术服务有限公司合成。
表1： 用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对及探针的核苷酸序列表
本实施例所筛选的引物对及探针完成后，可以储存备用，检测时无需重新筛选。
实施例2 一种检测副干酪乳杆菌 N1115的方法
1)取待测样品溶液，稀释至质量浓度为50 ng/μL，加至第一个2 mL的微量离心管中，12000 rpm离心10min后，加入40μL浓度为20mg/mL的溶菌酶，37℃孵育30 min后，加入56℃预热的700μL CTAB裂解液和10μL蛋白酶K，振荡混匀后，置于56℃水浴中处理2h，期间每隔30min混匀一次；处理结束后冷却至室温，加入900μL体积比为Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇=25:24:1的混合溶剂A，经充分混匀并13000 rpm离心15 min后，过滤且向滤液中，加入750 μL 体积比为三氯甲烷：异戊醇=24:1的混合溶剂B，室温13000 rpm震荡离心15 min，取上清液600 μL加入到1200μL无水乙醇中，充分混匀，静置2 min后，室温下13000 rpm离心10min，过滤，滤饼用浓度为70%的乙醇洗涤，晾干滤饼，将晾干的滤饼加入到100 μL TE缓冲液溶解，即得DNA提取物溶液C。
其中，CTAB裂解液的配制方法为称取1.00 g CTAB，16.38 g NaCl，2.42 g Tris，1.50 g Na2EDTA，加水溶解，调节pH至8.0，定容至200 mL，高压灭菌，即得CTAB裂解液。
2）对DNA提取物溶液进行RT-qPCR分析
取1.0 µL DNA提取物溶液C、1.2µL实施例1所提供的引物对及探针、7.5 µL Mix反应缓冲液及5.3 µL去离子水（DW）配制扩增反应液，将所得扩增反应液置于荧光PCR仪中进行扩增并实时监控扩增反应，记录并整理CT值为19.0297。
需要说明的是，上述所用试剂，如浓度为20mg/mL的溶菌酶、CTAB裂解液、蛋白酶K、混合溶剂A、混合溶剂B、TE缓冲液、Mix反应缓冲液以及实施例1所提供的引物对及探针均在试剂盒内，本实施例也可以当做含有用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对试剂盒的使用说明。
实施例3 用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对的最低检出限测定
取以实施例2中制备的DNA提取物溶液分别配置成DNA提取物的质量浓度为50 ng/μL、5 ng/μL、0.5 ng/μL、0.05 ng/μL、0.005 ng/μL、0.0005ng/μL和0.00005 ng/μL的待测样液，所得任一种质量浓度的DNA提取物溶液均分成10组平行试验样品，分别加入1.2μL实施例1所提供的引物探针组Q，按照Premix Ex Taq（Probe qPCR）说明书，配置扩增反应液，将扩增反应液置于荧光PCR仪中实时监控扩增反应，记录并整理CT值，扩增结果如表2所示；
同时，设置10组不添加任何DNA提取物溶液的空白试验样品，分别加入1.2μL实施例1所提供的用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对，按照Premix Ex Taq（Probe qPCR）说明书，配置扩增反应液，将扩增反应液置于荧光PCR仪中实时监控扩增反应，记录并整理CT值，扩增结果如表2所示。
其中，10组空白试验样品均未出峰（即为检测结果为阴性）；DNA提取物溶液浓度50ng/μL ~0.0005 ng/μL时，每种浓度对应的10组样品均出峰（即检测结果为阳性），而质量浓度0.00005 ng/μL的DNA提取物溶液的10组试验样品中出峰样品仅为4个。故该方法定性方法检出限为0.0005 ng/μL。最终实验结果Ct值的标准偏差SD介于0.10～1.43之间，相对标准偏差RSD介于0.53%～4.31%之间，误差较小可忽略不计，证明建立的实时荧光定量PCR方法的DNA浓度定量精确度较好。以DNA浓度的对数值（lg[DNA]）为x轴，Ct值为y轴作图，并做线性拟合得到公式y=-3.4716x+25.616，R2为0.9988，线性拟合度好。其中斜率k=-3.4716，故扩增效率E=10-1/K-1=94.11%。
表2：不同浓度的DNA提取物溶液的Ct值
实施例4 用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对的特异性试验
本实施例使用实施例1中所提供的用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对，分别选取14株副干酪乳杆菌种内株和41株其他益生菌进行RT-qPCR扩增，检测方法与实施例2中相同，每株菌种进行两组平行实验，所得扩增结果显示，在14种副干酪乳杆菌种内株除N1115外菌株扩增均为阴性，N1115菌株扩增为阳性，见图3，N1115菌株对应每组平行样品Ct值分别为19.0297和20.2145；41株其他益生菌扩增结果均为阴性见图4。这表明本发明所设计的用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对对N1115菌株检测具有很好的特异性，见表3。
表3：用于检测副干酪乳杆菌 N1115的引物对的特异性验证实验数据
实施例5 用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对的传代稳定性试验
本实施例将副干酪乳杆菌N1115进行连续传代III至VIII代，在传代过程中分别从第3代至第8代的副干酪乳杆菌N1115中提取每代的DNA并通过实施例2的方法制备得到待测DNA提取物溶液III~VIII；
分别取待测DNA提取物溶液III~VIII 1.0μL通过与实施例2相同的RT-qPCR分析方法检测分析，记录并整理CT值，与实施例2的检测结果对比，并分析Ct值差异性，结果见表4，表明检测用特异性引物传代稳定性好。
表4：用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对传代稳定性的测试数据结果
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 石家庄君乐宝乳业有限公司
<120> 用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对及应用
<130> 2020.9.15
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tcattagtgg cggtggtcaa 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aaccggctga ttgtccaaat a 21
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
acatcatgac gctggc 16
Claims (2)
1.一种用于检测副干酪乳杆菌N1115含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对、探针、CTAB裂解液、TE缓冲液和Mix缓冲液；
其中所述用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测副干酪乳杆菌N1115含量的试剂盒的一种非疾病诊断目的的应用，其特征在于:所述用于检测副干酪乳杆菌N1115的引物对、探针、Mix缓冲液配置扩增反应液，对待测样品的DNA提取液进行扩增，所得扩增产物进行RT-qPCR检测，以检测样品中的副干酪乳杆菌N1115。
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