CN109337995B - 土拉杆菌及其亚种的pcr检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供土拉杆菌及其亚种的PCR检测方法和试剂盒。所述试剂盒中至少含有检测土拉杆菌的通用引物(SEQ ID NO：1‑2)以及检测土拉杆菌亚种F.m、F.n、F.tu和F.h的特异性PCR引物(SEQ ID NO：3‑10)。本发明的PCR检测方法能够快速确定土拉杆菌，并对土拉杆菌进行亚种的确定，可直接对病料检测，避免了常规的细菌分离、培养和生化鉴定的复杂过程，缩短了检测时间，且操作方便，简单培训即能熟练使用，同时避免了操作人员直接接触病原，提高了检验过程的安全性。本方法敏感性高、特异性强，能将土拉杆菌亚种与其他亚种区分开来，且无任何交叉反应。本发明为基层分析单位检测提供有力的技术支持。

Description

土拉杆菌及其亚种的PCR检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于细菌检测技术领域，具体地说，涉及土拉杆菌及其亚种的PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

目前，国内外针对土拉杆菌的检测方法主要有生化检测方法、PCR方法、荧光RT-PCR方法，其中生化检测法需要进行病原的分离，目前国内大部分实验室不具备分离培养的防护条件；利用分子生物学方法，现有的PCR方法和荧光RT-PCR方法能够快速的进行土拉杆菌的鉴定。但是土拉杆菌共有四个亚种，其毒力和地域分布各有不同，土拉杆菌(弗朗西斯菌属)四个亚种的分布及毒力如下：Francisellatularensis subsp.Tularensis，F.tu，主要分布在北美洲区域，毒力非常强(＜10¹个CFU)。Francisellatularensissubsp.Holarctica，F.h，主要分布在欧洲、亚洲区域，毒力较强＜10³个CFU。Francisellatularensis subsp.Mediasiatica，F.m，主要分布在中亚沙漠地区，土耳其境内，无毒力。Francisellatularensis subsp.novicida subsp.nov.F.n，主要分布在中美洲和澳洲，有一定的毒力(＞10³个CFU)。

目前国内外报道的方法，均为土拉杆菌的通用抗原和抗体的检测方法，土拉杆菌亚种属特异性检测方法未见有分子生物学检测技术的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供土拉杆菌及其亚种的PCR检测方法和试剂盒。

为了实现本发明目的，发明人根据GenBank中公布的16S rRNA序列，比对了大肠杆菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、波氏杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌及土拉杆菌四个亚种的NCBI数据库中的序列，找到了相应的区别位点，用于土拉杆菌的PCR检测，获得了土拉杆菌的种属鉴定引物。

进一步在种属鉴定引物的基础上，通过对Francisellatularensissubsp.Tularensis，F.tu(aa8335551)、F.tu(aa2484351)、F.tu(aa12621151)、F.tu(aa161051)、Francisellatularensis subsp.Mediasiatica，F.m(aa189251)、Francisellatularensis subsp.novicida subsp.Nov，F.n(aa18802451_C1)、Francisellatularensis subsp.Holarctica，F.h(aa8335151)、F.n(aa18656951)等亚种的全基因序列通过大型数据服务器分析亚种的异同点，查找四个亚种的不同基因位点，查找后进行NCBI数据库的相应筛选工作，获得了各亚种的相关特异性基因，并根据其特异性基因进行了亚种的PCR引物设计。

第一方面，本发明提供检测土拉杆菌(Francisella tularensis)的通用引物，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-2所示。

第二方面，本发明提供检测土拉杆菌亚种的特异性PCR引物，检测土拉杆菌亚种(Francisellatularensis subsp.Mediasiatica，F.m)、(Francisellatularensissubsp.novicida，F.n)、(Francisellatularensis subsp.Tularensis，F.tu)和(Francisellatularensis subsp.Holarctica，F.h)的特异性PCR引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3-4、5-6、7-8和9-10所示。

第三方面，本发明提供检测土拉杆菌及其亚种的PCR引物组合，包括上述土拉杆菌的通用引物和上述四种土拉杆菌亚种的特异性PCR引物。

第四方面，本发明提供含有上述引物组合的检测试剂或试剂盒。

进一步地，本发明试剂盒中还包含阳性模板，所述阳性模板为分别携带土拉杆菌通用引物对应的目的片段、土拉杆菌F.h、F.m、F.tu、F.n亚种对应的目的片段的质粒；或者，所述阳性模板为分别携带土拉杆菌F.h、F.m、F.tu和F.n亚种DNA条形码的质粒。

第五方面，本发明提供鉴别上述四种土拉杆菌亚种的DNA条形码，即各亚种的特有核酸序列，土拉杆菌F.h、F.m、F.tu和F.n亚种的DNA条形码的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：11-14所示。

在本发明的一个具体实施方式中，通过PCR扩增分别得到含有上述四种土拉杆菌亚种DNA条形码的核酸片段，连接EZ-T载体而成，转化DH5α感受态细胞，提取纯化质粒载体，测序证实插入片段的正确性，成功构建EZ-h、EZ-n、EZ-ft、EZ-m等土拉杆菌质粒标准品，并使用OD260/280定量，-80℃保存备用。

第六方面，本发明提供所述引物组合、含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒，或者所述DNA条形码的以下任一应用：

1)在(非诊断目的)检测土拉杆菌及其亚种中的应用；

2)在制备土拉杆菌及其亚种的检测试剂或试剂盒中的应用。

第七方面，本发明提供(非诊断目的)检测土拉杆菌及其亚种的方法，利用上述引物组合或含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒对待测样品进行PCR检测。

所述方法包括以下步骤：

1)提取待测样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，分两个反应管进行PCR扩增反应；其中，一个反应管中加入土拉杆菌的通用引物、土拉杆菌F.m和F.tu亚种的特异性PCR引物，另一个反应管中加入土拉杆菌的通用引物、土拉杆菌F.n和F.h亚种的特异性PCR引物；

3)分析PCR扩增产物；其中，土拉杆菌的通用引物、土拉杆菌F.h、F.m、F.tu和F.n亚种的特异性PCR引物扩增的目的片段大小分别为312bp、99bp、141bp、698bp和170bp。

优选地，PCR反应体系为：10×PCR buffer 2μL，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，MgCl₂ 1μL，上、下游引物各1μL，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板5μL，加去离子水至20μL。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃40s，50℃30s，72℃1min，共32个循环；72℃10min。

检测过程中，同时设立阴性对照(模板为去离子水)和阳性对照(阳性模板)。质控标准为同时满足阴性质控和阳性质控时，土拉杆菌质粒标准品EZ-h、EZ-n、EZ-ft、EZ-m阳性条带为99bp、170bp、698bp和141bp，否则无效。

结果判定：通过观察样品PCR扩增产物电泳检测图，根据特异性扩增产物的目的条带是否出现来判定。反应管1和反应管2，都有330bp左右的条带，判定土拉杆菌阳性(图1)；反应管1，出现141bp的片段时，判定为土拉杆菌F.m亚种阳性(图2)；反应管1，出现698bp的片段时，判定为拉杆菌F.tu亚种阳性(图2)；反应管2，出现170bp的片段时，判定为土拉杆菌F.n亚种阳性(图3)；反应管2，出现99bp的片段时，判定为土拉杆菌F.h亚种阳性(图3)。

反应条件优化：确定的最佳退火温度为50℃，单条引物添加量为1uL(20pmol/L)，各引物对的浓度为1∶1。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)操作简便，易推广。本发明检测方法基于普通PCR技术，对于仪器设备和操作人员的技能要求相对较低，有利于基层各部门推广应用。

(二)可靠性强。使用双管反应多重PCR检测，保证结果的可靠性。降低误操作带来的不良数据。

(三)安全性高。对土拉杆菌的分型方面，既无需借助生化试验，也无需进行菌株培养，避免了操作人员直接接触病原，提高了检验过程的安全性。

(四)灵敏度高，特异性好。本发明提供的引物，能够达到10¹～10³个拷贝的检测灵敏度，可与荧光PCR相媲美。同时，通过特异性试验，表明引物具有很好的特异性。

(五)本方法适用于动物分泌液、组织和土壤样品等复杂环境条件下土拉杆菌及其亚种的检测。

(六)本方法可以灵敏、快速、特异性的检测土拉杆菌及其4个亚种，能将土拉杆菌亚种与其他亚种区分开来，且无任何交叉反应。为人类和动物疾病控制中心，商检、卫生、海关、公安、技术监督和科研的基层分析单位检测提供有力的技术支持。

附图说明

图1为本发明中利用土拉杆菌通用引物PCR检测4个土拉杆菌亚种的结果；其中，M:DL200；1-4：分别为土拉杆菌F.m亚种、土拉杆菌F.n亚种、土拉杆菌F.tu亚种、土拉杆菌F.h亚种；K：空白对照。

图2为本发明中利用通用引物、土拉杆菌F.m和F.tu亚种的特异性PCR引物检测土拉杆菌亚种的结果；其中，M:DL200；1-4：分别为混合模板和引物、土拉杆菌F.tu亚种、土拉杆菌F.m亚种、土拉杆菌通用引物扩增。

图3为本发明中利用通用引物、土拉杆菌F.n和F.h亚种的特异性PCR引物检测土拉杆菌亚种的结果；其中，M:DL200；1-4:分别为混合模板和引物、土拉杆菌F.h亚种、土拉杆菌F.n亚种、通用引物。

图4为本发明实施例5中土拉杆菌亚种F.m敏感性PCR检测结果；其中，M:DL200；1-6:分别为体系中含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝的模板PCR电泳照片，K为空白对照。(F.m引物检测敏感度可以达到10²拷贝)

图5为本发明实施例5中土拉杆菌亚种F.h敏感性PCR检测结果；其中，M:DL200；1-6:分别为体系中含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝的模板PCR电泳照片，K为空白对照。(F.h引物检测敏感度可以达到10²拷贝)

图6为本发明实施例5中土拉杆菌亚种F.n敏感性PCR检测结果；其中，M:DL200；1-6:分别为体系中含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝的模板PCR电泳照片，K为空白对照。(F.n引物检测敏感度可以达到10¹拷贝)

图7为本发明实施例5中土拉杆菌亚种F.tu敏感性PCR检测结果；其中，M:DL200；1-6:分别为体系中含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝的模板PCR电泳照片，K为空白对照。(F.tu引物检测敏感度可以达到103拷贝)M:DL200；1-6:分别为体系中含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝的模板PCR电泳照片，K为空白对照。(F.tu引物检测敏感度可以达到10³拷贝)

图8为本发明实施例5中土拉杆菌种属鉴定引物(通用引物)敏感性PCR检测结果；其中，M:DL200；1-6:分别为体系中含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝的模板PCR电泳照片，7为空白对照。(土拉杆菌种属鉴定引物引物检测敏感度可以达到10³拷贝)

图9为本发明实施例4中土拉杆菌亚种F.m特异性PCR检测结果；其中，M:DL200；Y:阳性样本；1-8:分别为大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、巴氏杆菌、立克次氏体、鹦鹉热衣原体、波氏杆菌。

图10为本发明实施例4中土拉杆菌亚种F.h特异性PCR检测结果；其中，M:DL200；1:阳性样本；2-9:分别为大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、巴氏杆菌、立克次氏体、鹦鹉热衣原体、波氏杆菌。

图11为本发明实施例4中土拉杆菌亚种F.n特异性PCR检测结果；其中，M:DL200；Y:阳性样本；1-8:分别为大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、巴氏杆菌、立克次氏体、鹦鹉热衣原体、波氏杆菌。

图12为本发明实施例4中土拉杆菌亚种F.tu特异性PCR检测结果；其中，M:DL200；Y:阳性样本；1-8:分别为大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、巴氏杆菌、立克次氏体、鹦鹉热衣原体、波氏杆菌。

图13为本发明实施例4中土拉杆菌种属鉴定引物(通用引物)特异性PCR检测结果；其中，M:DL200；Y:阳性样本；1-8:分别为大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、巴氏杆菌、立克次氏体、鹦鹉热衣原体、波氏杆菌。

图14为本发明实施例3中土拉杆菌临床样本检测反应管1的PCR电泳结果；其中，M:DL200；1-30:分别为编号1-30的临床样本提取的DNA进行的PCR电泳结果。

图15为本发明实施例3中土拉杆菌临床样本检测反应管2的PCR电泳结果；其中，M:DL200；1-30:分别为编号1-30的临床样本提取的DNA进行的PCR电泳结果。

图16为本发明实施例1中土拉杆菌各亚种的同源性比较结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1土拉杆菌PCR试剂盒引物的设计

1.材料

选取NCBI数据库中的4个土拉杆菌亚种的典型序列，序列号如下：AJ1749949、AM233362、AM286280、CP000437、CP000439、CP000915、CP002558、CP003862、CP010115、CP010446、CP025778。

2.方法

使用美国医学图书馆的资料库进行以上代表序列的比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，查找各亚种的特异性序列。

3.结果

土拉杆菌各亚种的同源性比较结果见图16；特异性片段分析结果见表1：

表1

通过进一步分析特有基因的片段，每个亚种各筛选到一个特有基因，设计的引物见表2：

表2

实施例2土拉杆菌质粒标准品的构建

1.材料

EZ-T Fast Ligation Kit Genstar，2×Taq PCR StarMix with Loading Dye均购自北京康润诚业生物科技有限公司；

Biospin胶回收试剂盒：购自杭州博日生物科技有限公司；

土拉杆菌4个亚种的模板：由山东省滨州畜牧兽医研究院重点实验室提供。

2.方法

按照2×Taq PCR StarMix with Loading Dye的说明书，使用表1引物进行土拉杆菌4个亚种的目的片段及土拉杆菌通用检测片段(即通用引物扩增的目的片段，SEQ ID NO：15)的扩增；扩增完毕后，使用Biospin胶回收试剂盒分别回收5个片段；回收的目的片段，按照EZ-T Fast Ligation Kit说明书进行回收目的片段的连接。转化DH5a，并使用PCR检测，对检测阳性的菌株进行测序。

PCR反应体系为：10×PCR buffer 2μL，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，MgCl₂ 1μL，上、下游引物各1μL，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板5μL，加去离子水至20μL。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃40s，50℃30s，72℃1min，共32个循环；72℃10min。

3.结果

通过测序结果证实，成功构建EZ-ty、EZ-h、EZ-n、EZ-ft、EZ-m等5个土拉杆菌质粒标准品。

实施例3土拉杆菌PCR样本检测以及方法准确性评价

1.材料

野兔未知的临床样本30份。

土拉杆菌荧光RT-PCR检测试剂盒：TaqMan

Francisetularensis DetectionKit，购自ThermoFisher。

2.方法

(1)基因组的提取

临床样本的制备，取患病动物的疑似病料或者拭子，加入适量的PBS，后续的提取步骤按照细菌商品化DNA提取试剂盒法的方法进行，即得到高纯度细菌基因组DNA，保存于-20℃备用。

阳性标准质粒的制备及定量：使用以上设计的引物，扩增目的片段，连接EZ-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取纯化质粒载体，测序证实插入片段的正确性，并使用OD260/280定量，-80℃保存备用。

(2)反应条件的确定和优化

在引物的设计方面，局限于特异性基因，种属鉴定引物、土拉杆菌F.m亚种引物、土拉杆菌F.n亚种引物、土拉杆菌F.tu亚种引物、土拉杆菌F.h亚种引物目的片段大小分别为336bp、141bp、170bp、698bp和99bp。在实际的操作和应用中，为了更加直观简单的区分待检样品中是否含有土拉杆菌及亚种分型，分为两个反应管，第一个反应管中加入土拉杆菌种属、土拉杆菌F.m亚种和土拉杆菌F.tu亚种的引物(312bp、141bp和698bp)，第二个反应管中加入土拉杆菌种属、土拉杆菌F.n亚种引物和土拉杆菌F.h亚种的引物(312bp、170bp和99bp)。

设计引物时，使5对引物的退火温度均接近50℃，本发明分别在48℃、49.1℃、50℃、51.4℃和52℃等5个梯度进行了温度梯度PCR，筛选最佳退火温度；在退火温度优化过程中，各引物对的比例均为添加量均为1uL(20pm/L)。温度梯度PCR结果显示，最佳退火温度为50℃，与预期相符。各引物的比列为1∶1，目的条带均较亮。

(3)PCR反应体系

PCR反应体系为20μL：10×PCR buffer 2μL，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，MgCl₂1μL，上、下游引物各1μL，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，DNA模板5μL，加去离子水至20μL。同时设立阴性和阳性对照。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃40s，50℃30s，72℃1min，共32个循环；72℃10min。

(4)结果判定

通过观察样品PCR扩增产物电泳检测图，根据特异性扩增产物的目的条带是否出现来判定。反应管1和反应管2，都有330bp左右的条带，判定土拉杆菌阳性(图1)；反应管1，出现141bp的片段时，判定为土拉杆菌F.m亚种阳性(图2)；反应管1，出现698bp的片段时，判定为拉杆菌F.tu亚种阳性(图2)；反应管2，出现170bp的片段时，判定为土拉杆菌F.n亚种阳性(图3)；反应管2，出现99bp的片段时，判定为土拉杆菌F.h亚种阳性(图3)。

对照组按照上述方法进行相应的样品处理和基因组提取，同时使用商品化荧光RT-PCR检测试剂盒的操作按照说明书进行。与本发明的检测方法进行符合性检验。

3.结果

本发明的PCR扩增结果以1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR体系的特异性结果见图14-15。对照组土拉杆菌的检测结果，直接在荧光PCR设备罗氏480上读取。结果显示第3、9、18、26、28号样本本发明的检测方法呈现阳性，与购买的进口荧光PCR检测试剂盒一致，符合率100％。

同时本发明的检测方法，能够区分出3、18、26号样本为F.tu亚种，9、28号样本为F.h亚种。

实施例4土拉杆菌PCR试剂盒特异性检测

1.材料

大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、巴氏杆菌、波氏杆菌标准菌株：均由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室保存；

立克次氏体、鹦鹉热衣原体6BC：中国农业大学动物医学院保存；

细菌DNA提取试剂盒：购自杭州博日生物科技有限公司。

2.方法

细菌悬液的制备：各菌的单菌落接种相应的培养基10mL，37℃培养摇床培养至OD₆₀₀为0.7-1时，后续的提取步骤按照细菌DNA提取试剂盒法的方法进行。

PCR反应体系及反应条件同实施例3优化后的体系及反应条件。

3.结果

检测结果及说明，以1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR体系的特异性结果见图9-13。表明各对引物具有良好的特异性。

实施例5土拉杆菌PCR试剂盒敏感性检测

1.材料

质粒标准品：实施例2中构建的质粒；

2×Taq PCR StarMix with Loading Dye购自北京康润诚业生物科技有限公司。

2.方法

模板的制备，将构建的含有目的片段的质粒载体，精确定量后，使每个反应体系中分别含有10¹、10²、10³、10⁴、10⁵和10⁶个拷贝的质粒作为模板，进行各引物的敏感度测定。PCR反应体系及反应条件同实施例3优化后的体系及反应条件。

3.结果

以1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR体系的检测各目的基因的敏感性结果见图4-8。土拉杆菌种属、土拉杆菌F.m亚种、土拉杆菌F.tu亚种、土拉杆菌F.n亚种引物、土拉杆菌F.h亚种引物的敏感度分别达到10³、10²、10³、10¹、10²个拷贝，灵敏度均在10³以上。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院 中国农业大学

<120> 土拉杆菌及其亚种的PCR检测方法和试剂盒

<130> KHP181116509.2

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggagtcggt gtaaaggctc t 21

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaacttaat gatggtaact atcaa 25

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccagattta gaaaccaga 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaccctattt agagcacct 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accctagtaa gaaagagca 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaatatcatc ggaatagcc 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggagttcgtg ggcaaggaca aggag 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttatgtcaga aactttcaag tatct 25

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttttggtatt ctcgctgta 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taccccgttc tcccttgtt 19

<210> 11

<211> 150

<212> DNA

<213> 土拉杆菌亚种(Francisellatularensis subsp. Holarctica)

<400> 11

atgaagttca aaataaataa aatgattaaa aaatgtaaaa aaattaaata taaactctcc 60

ggcaaatatt ttggtattct cgctgtagca accattacct gcagatcaac aatcacaaca 120

aaaagtataa caagggagaa cggggtatga 150

<210> 12

<211> 1392

<212> DNA

<213> 土拉杆菌亚种(Francisellatularensis subsp. Mediasiatica)

<400> 12

gtggagcaaa atagtaactt attcacagtt tactgtaaca atgaatattt caaaaaacat 60

ataaaatcta agtatggaaa tcttatttta tcaacaatcc aagagtgtca tggtaatgat 120

ttaattattg aatattctaa taaaaaattc tctggcgaaa aaattactga ggttatcaca 180

gctggaccac aagctaattt ttttagcaca acaagtgttg agataaaaga tgaatcagaa 240

gatacaaaag tagtacaaga acctaaaata tcaaagaagt ctaatagtaa agacttttct 300

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gaatactctt ttggtttacc gttaaaagaa aaatatgttt ttgatagttt tgttgttgga 420

gatgctaaca aaattgctag agcagcggct atgcaggtat cgataaatcc aggtaaatta 480

cataaccctt tattcattta tggtggtagt ggtttaggta aaactcactt aatgcaagca 540

ataggtaatc atgcaagaga agttaatcct aatgccaaaa ttatttatac aaattcagaa 600

caatttatta aagattatgt aaattctatt cgtttacaag atcaagatga gtttcaaaga 660

gtttatagat ctgcggatat acttttgatt gatgatattc aatttatcgc tggtaaagag 720

ggtactgctc aggagttttt ccatactttt aatgcattgt atgaaaatgg taaacagata 780

attctaacta gtgataagta tccaaatgaa atagaagggc ttgaagaaag actagtttcg 840

cgttttggtt atggtttaac agtttctgtt gatatgccag atttagaaac cagaatagct 900

atcttgctca aaaaagctca tgatttaggt cagaaattac ctaacgaaac agcagctttt 960

attgctgaga atgtacgtac taatgtcaga gaactagaag gtgctctaaa tagggttctt 1020

actacctcta aatttaatca taaagatcct actatcgaag tagcacaagc ttgcttaaga 1080

gatgttataa aaatacaaga aaagaaagta aaaatagata atatccaaaa ggttgttgct 1140

gatttttata gaatcagggt aaaagattta acttctaatc aaagaagtag aaatatagct 1200

agaccaagac agatagcaat gagtttagca cgtgaactaa catcacatag tttgccagaa 1260

ataggcaatg cttttggtgg tagagaccat acgacagtta tgcatgctgt taaagctata 1320

actaaattaa gacaaagcaa tacttcaata tcggatgatt atgagttgct tttagataaa 1380

atttctcgtt aa 1392

<210> 13

<211> 1227

<212> DNA

<213> 土拉杆菌亚种(Francisellatularensis subsp. Tularensis)

<400> 13

gtggttgaat taaataattt tttgtctaaa gcaaatattg agtgggttaa aatacaagat 60

aaagaaagtt atcctatatt aggagttcgt gggcaaggac aaggagttta tataaataga 120

atagctaatg gtaaagagct aactatgaaa aaataccaaa aatctgagcc ttatcattta 180

tttttttgta aggttagaac agtcaaaggt caatggggag tagtttatcc agaatatgct 240

aatagctatg cttccagcaa tatgcaatat ttgaaaattg atttagataa aatattaccc 300

gagtatttag agatgttgct taaactcaaa aaaataactg atatttggga taaaaacgca 360

ataggtgcag atggtaggca ttttccatta aaaattttat taactctaca aatcccactg 420

ccaccaatag aaatacaaaa gcaaattgta caagcctatg aagataaaat aaatcttgca 480

aatcaactag agcaaagagc tgaaaagctc gaagctaaaa tagaaaaata tctatatgca 540

aaattaggta ttgagcaagc acaagagcaa aagcaagata aaaaaggtct acttaagttt 600

gtgaggtttg agcaattaca acgctgggat actgattttt ttaagcaaaa agaaggttat 660

tcatcaaaat atgaaactgt ttcttatgaa gatttatttg ttagcttaaa taatggtatt 720

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aattacataa ataatgataa gcctttttat gtgaataagt ataaagaatc agatttgatt 840

gaaaaaggaa cattgttaat aacgaggaaa ggaacagttg gaaactctta ttatcttgat 900

aaggatggtt catttgttgc atcttcagaa atatttatca taaagttgaa tgataaagtt 960

aatggtaatt acttgtctga aataaattta tctagttttg tgaaaaaaca gtatcgagaa 1020

aagtcaacag ggactataat gccaagtctt tcacaaccaa aactaaaaag catcttaata 1080

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tatataaaag cactagaaca acaagcagag caaaatagag aaaatgctct aaggaatttt 1200

gaagtcgaga tttttagtaa agaatga 1227

<210> 14

<211> 3903

<212> DNA

<213> 土拉杆菌亚种(Francisellatularensis subsp. novicida)

<400> 14

atgtcaattt atcaagaatt tgttaataaa tatagtttaa gtaaaactct aagatttgag 60

ttaatcccac agggtaaaac acttgaaaac ataaaagcaa gaggtttgat tttagatgat 120

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gatgtttatt ttaaacttaa aaagagtgat gatgataatc tacaaaaaga ttttaaaagt 300

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gagaactcga ctttggctaa tggttgggat aaaaataaag agcctgacaa tacggcaatt 1860

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ttttctgata ctcaaagata taattctata gatgaatttt atagagaagt tgaaaatcaa 2280

ggctacaaac taacttttga aaatatatca gagagctata ttgatagcgt agttaatcag 2340

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aatttattgc taaaagaaaa agcaaatgat gttcatatat taagtataga tagaggtgaa 2760

agacatttag cttactatac tttggtagat ggtaaaggca atatcatcaa acaagatact 2820

ttcaacatca ttggtaatga tagaatgaaa acaaactacc atgataagct tgctgcaata 2880

gagaaagata gggattcagc taggaaagac tggaaaaaga taaataacat caaagagatg 2940

aaagagggct atctatctca ggtagttcat gaaatagcta agctagttat agagtataat 3000

gctattgtgg tttttgagga tttaaatttt ggatttaaaa gagggcgttt caaggtagag 3060

aagcaggtct atcaaaagtt agaaaaaatg ctaattgaga aactaaacta tctagttttc 3120

aaagataatg agtttgataa aactggggga gtgcttagag cttatcagct aacagcacct 3180

tttgagactt ttaaaaagat gggtaaacaa acaggtatta tctactatgt accagctggt 3240

tttacttcaa aaatttgtcc tgtaactggt tttgtaaatc agttatatcc taagtatgaa 3300

agtgtcagca aatctcaaga gttctttagt aagtttgaca agatttgtta taaccttgat 3360

aagggctatt ttgagtttag ttttgattat aaaaactttg gtgacaaggc tgccaaaggc 3420

aagtggacta tagctagctt tgggagtaga ttgattaact ttagaaattc agataaaaat 3480

cataattggg atactcgaga agtttatcca actaaagagt tggagaaatt gctaaaagat 3540

tattctatcg aatatgggca tggcgaatgt atcaaagcag ctatttgcgg tgagagcgac 3600

aaaaagtttt ttgctaagct aactagtgtc ctaaatacta tcttacaaat gcgtaactca 3660

aaaacaggta ctgagttaga ttatctaatt tcaccagtag cagatgtaaa tggcaatttc 3720

tttgattcgc gacaggcgcc aaaaaatatg cctcaagatg ctgatgccaa tggtgcttat 3780

catattgggc taaaaggtct gatgctacta ggtaggatca aaaataatca agagggcaaa 3840

aaactcaatt tggttatcaa aaatgaagag tattttgagt tcgtgcagaa taggaataac 3900

taa 3903

<210> 15

<211> 312

<212> DNA

<213> 土拉杆菌(Francisella tularensis)

<400> 15

tggagtcggt gtaaaggctc tagtggcgca gctaacgcga taagtactcc gcctggggac 60

tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc ggtggagcat 120

gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcct gcgaactttc 180

tagagataga ttggtgcctt cgggaacgca gtgacaggtg ctgcacggct gtcgtcagct 240

cgtgttgtga aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctattg atagttacca 300

tcattaagtt gg 312

Claims (5)

1.检测土拉杆菌亚种的特异性PCR引物，其特征在于，检测土拉杆菌亚种（Francisellatularensis subsp. novicida，F.n）、（Francisellatularensis subsp.Tularensis，F.tu）和（Francisellatularensis subsp. Holarctica，F.h）的特异性PCR引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5-6、7-8和9-10所示。

2.含有权利要求1所述引物的检测试剂或试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含阳性模板，所述阳性模板为土拉杆菌F.h、F.tu、F.n亚种特异性特异性PCR引物对应的目的片段的质粒。

4.权利要求1所述引物或者权利要求2或3所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

1）在非诊断目的检测土拉杆菌亚种F.h、F.tu、F.n中的应用；

2）在制备土拉杆菌亚种F.h、F.tu、F.n的检测试剂或试剂盒中的应用。

5.非诊断目的检测土拉杆菌亚种F.h、F.tu、F.n的方法，其特征在于，利用权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒对待测样品进行PCR检测。

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