CN115125313A

CN115125313A - 一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和CRISPR/Cas12a检测试剂盒

Info

Publication number: CN115125313A
Application number: CN202210607278.XA
Authority: CN
Inventors: 卢士英; 肖毅然; 柳溪林; 任洪林; 胡盼; 李岩松; 王洋; 王菡; 王聪; 郭禹汐
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2022-09-30

Abstract

本发明涉及一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒及应用，属于分子生物学检测技术领域。本发明提供了一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物对，所述引物对包括ail‑F和ail‑R，所述ail‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ail‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述引物对能够基于CRISPR/Cas12a实现致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化检测，快速且准确，灵敏度高，特异性强。

Description

一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和CRISPR/ Cas12a检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒及应用。

背景技术

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(pathogenic Yersinia enterocolitica)是一类重要的食源性致病菌，小肠结肠炎耶尔森菌能够在低温下增殖。人感染后可引起胃肠道症状、呼吸系统、心血管系统等疾病，甚至引起急性阑尾炎、败血症。近年来，由致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的耶尔森氏菌病在全球广泛流行，其中欧洲最为严重，我国在20世纪80年代也遭受过2次由耶尔森氏菌病引起的大流行。根据欧洲食品安全局(EFSA)2015年的一份报告，耶尔森菌病是欧洲最重要的食源性人畜共患病之一。在上世纪80年代中期我国证实有两次大的暴发流行，造成五百多人感染，其原因均为食物污染致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌引起的。在动物屠宰加工过程、运输、销售过程中都可能使肉产品受到污染，包括乳汁也可能被致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌污染。

传统的细菌检测技术包括病原分离培养、生化鉴定、血清学诊断等，作为检测的“金标准”国标方法已经臻于完善且标准化。但耗时长，单次检出量有限，并因含量低，常规方法灵敏度较难检出。PCR相关方法需经电泳后成像才能读取结果，易因操作不当污染而产生假阳性、费时等缺陷。中国食品安全国家标准GB 4789.8-2016中规定的食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定方法有冷富集、培养基培养、尿素酶试验、半固体动力试验、革兰氏染色镜检和生化鉴定。这些方法通常与PCR等核酸扩增方法结合使用，导致依赖大型仪器，反应时间长。实际应用上仍待开发灵敏度高，操作简便，实用性强的快速检测技术。为了减少致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的危害，亟待一种检测时间短，灵敏度高，特异性强的检测方法。

CRISPR/Cas12a受单链RNA(crRNA)引导，特异性结合靶DNA后， Cas12a的结构变化激发其酶活性，不仅可以顺式切割靶标DNA，还可以反式切割非靶标DNA。基于Cas12a的检测成功应用于人乳头瘤病毒(HPV) 的检测，在之后的几年中基于Cas12a的检测层出不穷。2019年复旦大学开发出基于CRISPR/cas12的快速可视化核酸检测平台，解决了气溶胶污染的问题。同一年，Cas12a被用于开发电化学生物传感器不仅提高了灵敏度还增强了便携性。这种传感器被命名为E-crispr，它使低成本医疗诊断成为可能。 2020年新冠爆发，Cas12a被应用于新型冠状病毒的检测。所以从广度上 Cas12a可以检测细菌，病毒，肿瘤标志物等，从深度上可以比其他方法更精准，灵敏的完成检测。然而CRISPR/Cas12a检测还未应用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒及应用。本发明所述引物对灵敏度高，特异性强，能够基于 CRISPR/Cas12a实现致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化检测，快速且准确。

本发明提供了一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物对，所述引物对包括ail-F和ail-R，所述ail-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ail-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述技术方案所述引物对在制备检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物对和反应体系。

本发明还提供了一种基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物对和特异性crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的是，所述试剂盒还包括RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂。

优选的是，所述RPA扩增试剂包括RPABasic冻干粉、RPA反应缓冲液和MgOAc。

优选的是，所述试剂盒包括RPA扩增体系，每50μL的RPA扩增体系包括：4mgRPABasic冻干粉，10μM ail-F和ail-R各2.4μL，RPA反应缓冲液29.5μL，280mM MgOAc 2.5μL，2μL模板DNA和DEPC水11.2μL。

优选的是，所述CRISPR/Cas12a检测试剂包括Cas12a酶、ssDNA荧光猝灭探针和NEBuffer 3.1。

优选的是，所述ssDNA荧光猝灭探针为在如SEQ ID NO.4核苷酸序列 5’端标记有6-FAM且3’标记有BHQ-1的物质。

优选的是，所述试剂盒包括CRISPR/Cas12a检测体系，每20μL的 CRISPR/Cas12a检测体系包括：1μM Cas12a酶2μL，1μM crRNA 2μL， NEBuffer3.12μL，5μM ssDNA荧光猝灭探针2μL，RPA扩增产物2μL和 DEPC水10μL。

本发明提供了一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对，本发明所述引物对能够基于CRISPR/Cas12a实现致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化检测，快速且准确，灵敏度高，特异性强。利用本发明的试剂盒及检测方法进行致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测，可以实现在45分钟内完成检测，结果实现可视化。本发明不需要昂贵的设备，并且减少了诊断的成本和时间进行现场检测。本发明的试剂盒具有操作简单、检测快速、特异性强、结果可视化等优点，这对于致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测具有重大意义。

附图说明

图1为本发明提供的CRISPR/Cas12a检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的原理图；

图2为本发明提供的针对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因的特异性PCR引物的筛选结果图(P表示阳性对照，N表示阴性对照)；

图3为本发明提供的针对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因的特异性RPA引物的筛选结果(P表示阳性对照，N表示阴性对照)；

图4为本发明提供的不同引物浓度RPA扩增的电泳图；

图5为本发明提供的不同反应温度RPA扩增的电泳图；

图6为本发明提供的不同反应时间RPA扩增的电泳图；

图7为本发明提供的crRNA结构分析图；

图8为本发明提供的CRISPR/Cas12a的可行性验证结果图；

图9为本发明提供的CRISPR/Cas12a可视化荧光时间优化结果图；

图10为本发明提供的不同食源性致病菌进行的特异性检测的荧光动力学曲线；

图11为本发明提供的不同食源性致病菌进行的特异性检测的终点荧光柱形图和可视化结果图；柱形图中，从左到右分别为致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(pathogenicYersinia enterocolitica)，单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)，福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)和非致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(non-pathogenic Yersinia enterocolitica)；

图12为本发明提供的不同致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组浓度进行的灵敏度检测的荧光动力学曲线；

图13为本发明提供的不同致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组浓度进行的灵敏度检测的终点荧光柱形图和可视化结果；

图14为本发明提供的不同致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌质粒浓度进行的灵敏度检测的荧光动力学曲线；

图15为本发明提供的不同致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌质粒浓度进行的灵敏度检测的终点荧光柱形图和可视化结果；

图16为本发明提供的生猪肉中不同致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌菌液浓度进行的灵敏度检测的荧光动力学曲线；

图17为本发明提供的生猪肉中不同致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌菌液浓度进行的灵敏度检测的荧光动力学曲线和可视化结果；

图18为本发明提供的生猪肉中不同致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌浓度与荧光强度的标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物对，所述引物对包括ail-F和ail-R，所述ail-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：GTCTGTTAATGTGTACGCTGCGAGTGAAAG，所述ail-R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示：TATCCCTGATGAGTATAAGCAAACGAACCT。本发明所述ail作为黏附侵袭位点基因，只存在于致病菌株中，本发明将其用于鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的靶基因，本发明优选根据GenBank中ail (CP009846.1)进行引物的设计。经筛选，本发明所述引物对灵敏度高、特异性强，能够高效用于致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的CRISPR/Cas12a检测。

本发明还提供了一种基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物对和特异性crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示： UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACCUGAAGUACCGUUAUGAA。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a 检测试剂。

在本发明中，所述RPA扩增试剂优选包括RPABasic冻干粉、RPA反应缓冲液和MgOAc。在本发明中，所述试剂盒优选包括RPA扩增体系，每50μL 的RPA扩增体系包括：4mgRPABasic冻干粉，10μM ail-F和ail-R各2.4μL， RPA反应缓冲液29.5μL，280mM MgOAc 2.5μL，2μL模板DNA和DEPC水 11.2μL。

在本发明中，所述CRISPR/Cas12a检测试剂优选包括Cas12a酶、ssDNA 荧光猝灭探针和NEBuffer 3.1。在本发明中，所述ssDNA荧光猝灭探针优选为在如SEQ ID NO.4核苷酸序列5’端标记有6-FAM且3’标记有BHQ-1的物质：6-FAM-/TTTTTT/BHQ-1。在本发明中，所述试剂盒优选包括 CRISPR/Cas12a检测体系，每20μL的CRISPR/Cas12a检测体系包括：1μMCas12a酶2μL，1μM crRNA 2μL，NEBuffer3.12μL，5μM ssDNA荧光猝灭探针2μL，RPA扩增产物2μL和DEPC水10μL。

本发明所提供的基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌DNA的方法的基本原理(如图1所示)是：致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因首先通过RPA扩增技术扩增特异性DNA片段，再通过 Cas12a/crRNA的复合物特异性结合激活Cas12a酶切活性，反式切割ssDNA 荧光报告物，通过荧光信号来检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌。

在本发明中，所述试剂盒的检测方法优选包括以下步骤：

(1)以总DNA为模板，以ail-1F和ail-1R为引物进行重组酶聚合酶扩增(RPA)反应，得到扩增产物；

(2)将步骤(1)得到的扩增产物和CRISPR/Cas12a检测体系进行孵育并进行荧光检测。

在本发明中，RPA扩增反应的时间优选为15min，CRISPR/Cas12a检测的时间优选为30min，RPA扩增和CRISPR/Cas12a检测的温度优选分别为 37℃。本发明所述荧光检测优选使用酶标仪或蓝光透射仪进行，更优选的，本发明在酶标仪中观察动力学荧光曲线，或在470～520nm波长的蓝光透射仪下肉眼观察产生的荧光。

通过使用本发明的试剂盒，成功地缩短了操作时间，检测时间在45min 以内，同时对于其他食源性致病菌没有观察到交叉反应，具有很高的特异性。结合ssDNA荧光猝灭探针可对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌进行现场可视化检测，使用470～520nm波长的蓝光透射仪进行照射，观察反应体系扩增产物是否呈现荧光，就可以判定检测结果，或者使用酶标仪、荧光定量PCR 对荧光强度进行定量。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例中未注明具体成分的试剂和原料均市售可得。下列实施例中的定量试验，均设置三次重复实验。

实施例1

引物筛选

1.1引物设计及筛选

本发明针对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌ail设计得到了3对引物，ail 基因高度保守一致。根据GenBank中ail(CP009846.1)基因的保守区域设计完成。所述引物的核苷酸序列如表1所示：

表1所述RPA引物

引物筛选：首先通过普通PCR对引物进行初步筛选，再利用RPA进行复筛。PCR扩增体系与程序：总体系20μL，包括2×M5 HiPerplus Taq HiFi PCR mix 10μL，上、下游引物各1μL(10mM)，基因组模板2μL，其余 DEPC水补足。95℃预变性2min，95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸2min。RPA扩增体系与程序：4mg RPABasic冻干粉，10μM上下游引物各2.4μL，RPA反应缓冲液29.5μL，280mM MgOAc2.5μL 以及DEPC水11.2μL，反应条件为39℃，20min。上述扩增产物和用于分子标记的DL500 DNA Marker于2％的琼脂糖凝胶中120V电泳30min，并利用凝胶成像系统观察结果PCR扩增反应结果如图2所示，ail-2F/R出现轻度假阳性。继续对ail-1F/R和ail-3F/R进行RPA扩增筛选，结果如图3，因 ail-3F/R引物对经RPA扩增后产生非特异性条带，而ail-1F/R引物对扩增效果很好，因此选择ail-1F为最佳上游引物，ail-1R为最佳下游引物用于RPA 扩增反应。

实施例2

RPA扩增反应优化与建立

2.1细菌的培养

在摇床28℃，150rpm培养12h得到菌液，用生理盐水10倍梯度稀释，制备不同浓度的活菌溶液，取适宜的3个连续梯度稀释液进行涂布平板计数；

2.2基因组DNA的提取

将菌液煮沸20min，12000rpm离心2min，留下上清备用；

2.3 RPA反应体系优化

考虑到RPA反应产物的量可能会影响后续CRISPR/Cas12a检测，对50μL 的扩增体系包含：

表2 RPA反应体系

反应成分	用量
		上游引物(10μM)	2.4μL
下游引物(10μM)	2.4μL
		RPA Basic冻干粉	4mg
RPA反应缓冲液	29.5μL
		DNA模板	2μL
DEPC水	11.2μL
		280mM MgOAc	2.5μL
共计	50μL

2.3.1引物浓度优化

改变引物浓度，其他条件均不变，验证不同引物浓度RPA产物的电泳条带变化，结果如图4，选择终浓度为480nM为最优的引物浓度；

2.3.2 RPA扩增温度优化

改变RPA扩增温度，其他条件均不变，验证不同扩增温度的RPA产物电泳条带变化，结果如图5，选择37℃为RPA扩增最优温度；

2.3.3 RPA扩增时间优化

改变RPA扩增时间，其他条件均不变，验证不同扩增时间的RPA产物电泳条带变化，结果如图6，选择15min为RPA最优扩增反应时间。

实施例3

crRNA筛选及CRISPR/cas12a检测体系建立

3.1 crRNA序列设计

针对上述ail-1F/R扩增产物，选取PAM位点(TTTN，N为任意核苷酸) 后的基因片段，设计3个crRNA序列，具体序列如表3：

表3 crRNA序列

所设计的3个crRNA的结构分析如图7显示，crRNA-1的5’端(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU)能够形成被Cas12a识别的发夹结构，紧接着为20bp的线性靶基因序列，该结构有利于识别目标基因并激活 Cas12a的酶活性进而启动后续反应的发生；而crRNA-2靶基因部分自身形成了发夹结构，crRNA-3发夹结构与靶基因部分形成了互补结构，均阻碍了对目标基因的识别。因此本发明选取crRNA-1进行合成用于后续实验研究。通过对crRNA-1荧光动力学筛选，证实含crRNA-1及其引物对的反应体系用荧光定量PCR仪检测可以产生明显的荧光，如图8。

3.2最佳引物及crRNA的确定

根据以上筛选确定用于后续基于CRISPR/Cas12a检测体系的最佳引物和对应crRNA序列，具体如表4。

表4最佳引物和crRNA

3.3 CRISPR/Cas12a可视化荧光时间优化

本发明将CRISPR/Cas12a检测体系反应时间进行优化，以表5所述体系和条件进行检测，结果如图9(左为阳性实验组，右为阴性对照组)，确定最优反应时间为30分钟。

表5 CRISPR/Cas12a检测体系

反应成分	用量
		NEBuffer3.1缓冲液	2μL
Cas12a(1μM)	2μL
		crRNA(1μM)	2μL
ssDNA报告物(5μM)	2μL
		RPA产物	2μL
DEPC水	10μL
		共计	20μL

3.4特异性检测

特异性检测的基因组DNA采用实施例1中提取的基因组进行检测，包括致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌(pathogenic Yersinia enterocolitica)、单增李斯特菌(Listeriamonotygenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)，非致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌 (non-pathogenic Y.enterocolitica)。按照上述CRISPR/Cas12a检测体系以验证本发明方法的特异性。图10和图11酶标仪检测结果显示(从左至右对应致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、肺炎克雷伯菌、福氏志贺氏菌和非致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌，CRISPR/Cas12a对含有致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌基因的荧光强度有很高的特异性，其他细菌则没有荧光反应，本发明方法在检测过程中不存在交叉反应，特异性良好，可以实现可视化。

3.5灵敏度检测

3.5.1基因组灵敏度检测

将灵敏度检测所用的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组模板进行定量并梯度稀释，制备成的基因组浓度分别为1×10⁰ng/μL、1×10^-2ng/μL、 1×10^-4ng/μL、1×10^-6ng/μL、同时以DEPC水为阴性对照。采用实施例1方法提取基因组DNA，加入RPA扩增体系和不同浓度致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组DNA于管底，所述RPA扩增体系含有：4mg RPABasic冻干粉， 10μM上下游引物各2.4μL，RPA反应缓冲液29.5μL，280mM MgOAc2.5μL 以及DEPC水11.2μL。37℃反应15min后，将2μLRPA扩增产物加入 CRISPR/Cas12a检测体系混匀，37℃继续反应30min，所述CRISPR/Cas12a 检测体系含有：100nM的LbCas12a，100nMcrRNA，2μL的NEBuffer 3.1， 500nMssDNA荧光猝灭探针，2μL扩增产物以及10μLDEPC水。通过蓝光透射仪和酶标仪观察结果，与阴性对照相比荧光强度均具有统计学差异，如图 12和图13所示。

3.5.2质粒灵敏度检测

将灵敏度检测所用的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌质粒模板进行定量并梯度稀释，制备成的质粒浓度分别为1.25×10⁶copies/μL，1.25×10⁴copies/μL， 1.25×10²copies/μL，1.25×10⁰copies/μL，同时以DEPC水为阴性对照，通过蓝光透射仪和酶标仪观察结果，与阴性对照相比荧光强度均具有统计学差异，如图14和图15所示。

3.5.3菌液灵敏度检测

对培养后的菌液进行菌落计数，同时梯度稀释菌液使其浓度分别为 1.7×10⁴CFU/mL，1.7×10³CFU/mL，1.7×10²CFU/mL，1.7×10¹CFU/mL， 1.7×10⁰CFU/mL同时以DEPC水为阴性对照。将每个1g生猪肉样品均匀加入到1毫升不同浓度的稀释细菌溶液中进行匀浆，并分别加入8毫升的生理盐水溶液。然后，从每个样品中收集1毫升的基质溶液进行DNA提取。通过蓝光透射仪和酶标仪观察结果通过蓝光透射仪和酶标仪观察结果，与阴性对照相比荧光强度均具有统计学差异，结果如图16和图17所示。

3.5.4标准曲线建立

以致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌菌液浓度为横坐标，以该浓度下的荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。拟合出的标准曲线的回归方程为 Y＝663.3X+1927(R2＝0.9209)，最低检测限能够到达1.7CFU/mL其中，Y 代表荧光强度，X代表菌液浓度，标准曲线如图18所示。

从上述各实施例结果可看出：CRISPR/cas12a系统在crRNA探针介导下靶向识别致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因扩增产物，在激活Cas12a酶的dsDNA顺式切割活性的同时激活反式切割活性来非特异性地切割ssDNA 荧光猝灭探针，产生荧光信号。本发明的方法靶点特异性强，可对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌进行快速检测，灵敏度可达到单拷贝水平，猪肉基质中的菌液灵敏度达到1.7CFU/mL，整个过程可在恒温条件下进行，检测时间可控制在45分钟以内，可以应用于致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测用引物对和CRISPR/Cas12a检测试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtctgttaat gtgtacgctg cgagtgaaag 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatccctgat gagtataagc aaacgaacct 30

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga uaccugaagu accguuauga a 41

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgctgcgag tgaaagtagt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcgttgatg cggaaagatg 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatgtgtac gctgcgagtg aaagtag 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccctgatgag tataagcaaa cgaacct 27

<210> 8

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

uaauuucuac uaaguguaga uuauugguua ugcgcaaagc c 41

<210> 9

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uaauuucuac uaaguguaga ucuuauacuc aucagggaua 40

Claims

1.一种用于检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物对，其特征在于，所述引物对包括ail-F和ail-R，所述ail-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ail-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述引物对在制备检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒中的应用。

3.一种检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物对和反应体系。

4.一种基于CRISPR/Cas12a检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的现场可视化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物对和特异性crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂包括RPABasic冻干粉、RPA反应缓冲液和MgOAc。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA扩增体系，每50μL的RPA扩增体系包括：4mg RPA Basic冻干粉，10μM ail-F和ail-R各2.4μL，RPA反应缓冲液29.5μL，280mM MgOAc 2.5μL，2μL模板DNA和DEPC水11.2μL。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测试剂包括Cas12a酶、ssDNA荧光猝灭探针和NEBuffer 3.1。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光猝灭探针为在如SEQ IDNO.4核苷酸序列5’端标记有6-FAM且3’标记有BHQ-1的物质。

10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CRISPR/Cas12a检测体系，每20μL的CRISPR/Cas12a检测体系包括：1μM Cas12a酶2μL，1μM crRNA 2μL，NEBuffer3.12μL，5μM ssDNA荧光猝灭探针2μL，RPA扩增产物2μL和DEPC水10μL。