KR20120086028A - 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단 - Google Patents

웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단 Download PDF

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KR20120086028A
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Abstract

본 발명은 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단에 관한 것으로, 보다 자세하게는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 각각에 특이적인 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 검출용 조성물 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 실시하는 단계를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 검출 방법에 관한 것이다.
상기한 2종의 바이러스들은 모두 플라비바이러스속에 속하는 유사바이러스로서 사람과 말 등에 일단 감염되면 뇌염과 고열 등의 임상증상이 유사하여 감별진단이 필요하다. 본 발명은 실험실 진단시 단일튜브에서 상기한 2종의 플라비바이러스들을 동시에 검사할 수 있기 때문에 신속한 진단에 활용이 가능하다.

Description

웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단{Differential detection of West nile virus and Japanese encephalitis virus}
본 발명은 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단에 관한 것으로, 보다 자세하게는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 각각에 특이적인 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 검출용 조성물 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 실시하는 단계를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 검출 방법에 관한 것이다.
웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스는 주로 사람, 말 그리고 일부 조류에 감수성이 있다. 이들 질병은 인수 공통 전염병으로 주로 모기에 의해 전염되고, 뇌염과 고열 등으로 진행하는데 감염시 치사율이 매우 높은 질병이다.
웨스트나일바이러스 감염증은 현재 미주대륙, 유럽, 아프리카와 러시아 연해주 지역에서 주로 발생하고 있으나, 미국으로부터의 수입마가 증가하고, 지구 온난화에 의한 매개체 활동 영역 증가 및 국제교류 증가 등에 의하여 질병 유입 위험성이 점차적으로 높아지고 있다. 일본 뇌염은 현재 우리나라, 일본, 중국을 비롯한 아시아 지역에서 발생하고 있으며, 웨스트나일바이러스와 혈청학적으로 교차반응을 하며 유전학적으로도 유사하다.
이들 두 바이러스성 뇌염 질병은 사람에서도 고열과 뇌염 등의 임상증상이 유사하여, 질병 유입 또는 국내 발생시 반드시 감별 진단이 필요하다. 기존의 개별 질병별 유전자 진단법을 적용할 경우에 의심축 발생시 여러 해외 질병에 대한 신속한 방역정책 수행이 어려우며, 기존 유전자 증폭기법은 민감도, 특이도가 질병별 프라이머에 따라 차이가 존재하기 때문에 동시 진단을 적용하기에는 어려움이 있다.
현재까지 개발된 PCR 키트를 이용한 진단방법은 거의 모두 한 종류의 바이러스의 감염 여부만을 판독할 수 있을 뿐, 이들 바이러스를 한꺼번에 듀플렉스 PCR 진단법은 개발되어 있지 않다. 그 이유는 두 가지 바이러스를 한 번의 듀플렉스 PCR 방법으로 검출하기 위해서는 그 PCR 시 각 사이클링 온도, 시간, 완충액의 조건 등이 일치하여야 하나 이러한 특정한 조건을 동시에 충족시키기 어려웠기 때문이다.
현재 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스와 같은 유사 뇌염 전염병에 대한 감별 유전자 진단법이 구축되어 있지 않아 국내 유입 발생을 대비한 진단기법 구축이 필요한 실정이다. 의심축 발생시 여러 해외 질병에 대한 개별적 진단법 적용으로는 신속한 방역정책 수행 및 대응에 어려움이 있으며, 전문 실험실 인력의 개별적인 질병 대상 진단기법 지속 훈련이 필요하기 때문에 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스에 대한 동시 진단기법을 개발하고자 하였다.
이에, 본 발명자들은 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 각각에 특이적이면서도 동일한 PCR 조건에서 증폭 가능한 프라이머 세트를 제작하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 실제로 RT-PCR을 실시한 결과, PCR 생성물의 크기 차이를 통해 상기 바이러스들을 감별 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 한 관점은,
(1) 서열번호: 1의 센스 프라이머(WF1), 서열번호: 2의 센스 프라이머(WF2), 서열번호: 3의 센스 프라이머(WF3) 및 서열번호: 4의 센스 프라이머(WF4)와
(2) 서열번호: 5의 안티센스 프라이머(WR1), 서열번호: 6의 안티센스 프라이머(WR2), 서열번호: 7의 안티센스 프라이머(WR3), 서열번호: 8의 안티센스 프라이머(WR4) 및 서열번호: 9의 안티센스 프라이머(WR5)로 구성된 웨스트나일바이러스 특이적 프라이머 세트 그리고
(a) 서열번호: 10의 센스 프라이머(JF1) 및 서열번호: 11의 센스 프라이머(JF2)와
(b) 서열번호: 12의 안티센스 프라이머(JR1) 및 서열번호: 13의 안티센스 프라이머(JR2)로 구성된 일본뇌염바이러스 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은, 상기 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 프라이머 세트를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은, (1) 상기 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 실시하는 단계와 (2) 상기 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스와 같은 2종의 플라비바이러스속의 바이러스를 동시에 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 임상증상에 커다란 차이가 없는 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스와 같은 2종의 플라비바이러스들을 조기에 검출함으로써 보다 신속하고 효율적인 바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 방법은 RT와 PCR을 동시에 수행함으로 시간을 단축할 뿐만 아니라 RT 과정 후 PCR 혼합액에 샘플을 다시 넣을 필요가 없으므로 실험자에 의한 DNA 오염을 방지할 수 있어 고도로 숙련되지 않은 실험실에서도 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스와 같은 2종의 플라비바이러스들을 감별 진단할 수 있다.
도 1은 여러 바이러스를 대상으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 수행한 후 PCR 생성물에 대한 전기영동 결과를 나타낸 것이다(M 열, 100bp DNA 마커; WN열, 웨스트나일바이러스 NY385-99주 유전자 증폭산물; WB열, 웨스트나일바이러스 B956주 유전자 증폭산물; J열, 일본뇌염바이러스 안양주 유전자 증폭산물; K열: 말허피스바이러스 켄터키주 유전자 증폭산물, 4열: 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스 2종의 동시검출결과에 따른 유전자 증폭산물, 각 바이러스별 증폭산물의 크기: 웨스트나일바이러스, 482bp; 일본뇌염바이러스, 241bp).
도 2의 (a)는 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 일본뇌염바이러스에 대한 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 검출한계를 조사한 결과이고, (b)는 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 웨스트나일바이러스 NY385-99주에 대한 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 검출한계를 조사한 결과이며, (c)는 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 웨스트나일바이러스 B956주에 대한 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 검출한계를 조사한 결과이다.
본 발명의 한 관점은, 웨스트나일바이러스 특이적 프라이머 세트와 일본뇌염바이러스 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다(표 1).
구체적으로, 상기 웨스트나일바이러스 특이적 프라이머 세트는
(1) 서열번호: 1의 센스 프라이머(WF1), 서열번호: 2의 센스 프라이머(WF2), 서열번호: 3의 센스 프라이머(WF3) 및 서열번호: 4의 센스 프라이머(WF4)와
(2) 서열번호: 5의 안티센스 프라이머(WR1), 서열번호: 6의 안티센스 프라이머(WR2), 서열번호: 7의 안티센스 프라이머(WR3), 서열번호: 8의 안티센스 프라이머(WR4) 및 서열번호: 9의 안티센스 프라이머(WR5)로 구성되고,
상기 일본뇌염바이러스 특이적 프라이머 세트는
(a) 서열번호: 10의 센스 프라이머(JF1) 및 서열번호: 11의 센스 프라이머(JF2)와
(b) 서열번호: 12의 안티센스 프라이머(JR1) 및 서열번호: 13의 안티센스 프라이머(JR2)로 구성된다.
Figure pat00001
일반적으로, 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명의 프라이머 WF1, WF2, WF3 및 WF4는 웨스트나일바이러스 게놈 1,428 염기에 특이적이고, 프라이머 WR1, WR2, WR3, WR4 및 WF5는 웨스트나일바이러스 게놈 1,910 염기에 특이적이어서 PCR 증폭을 통해 482bp의 산물이 생성될 수 있다.
본 발명의 프라이머 JF1 및 JF2는 일본뇌염바이러스 게놈의 1,439 염기에 특이적이고, 프라이머 JR1 및 JR2는 일본뇌염바이러스 게놈의 1,680 염기에 특이적이어서 PCR 증폭을 통해 241bp의 산물이 생성될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지는, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학그룹 및 형광성 분자를 예로 들 수 있다.
본 발명의 다른 관점은, 상기 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 프라이머 세트를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 감별 검출용 조성물은 당분야에서 널리 사용되는 다른 구성 성분 또는 장치를 추가로 포함하여 키트로 응용, 제작될 수 있다.
구체적인 예로서, 상기 프라이머 세트 및, 추가적으로 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse 억제제, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함하여 RT-PCR용 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA 칩용 키트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은, (1) 상기 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 실시하는 단계와 (2) 상기 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 '시료'는 바이러스 호발 부위 시료 (예, 혈액, 조직, 객담, 뇨, 분변 등), 세포배양을 통해 증식된 시료 및 자연계의 시료를 모두 포함하는 용어이다. 상기 시료는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 채취한 시료는 균질화(homogenation) 및 계단 희석(serial dilution) 과정을 거치는 것이 바람직하다.
상기 단계 (1)에서 RT-PCR은 40 ~ 45℃에서 30분 ~ 90분 1회 역전사 반응을 실시하고 92 ~ 96℃에서 2 ~ 4분간 사전변성 (predenaturation)시킨 후, 92 ~ 96℃에서 25 ~ 35초간 변성(denaturation), 50 ~ 60℃에서 25 ~ 35초간 어닐링 (annealing), 및 70 ~ 75℃에서 50 ~ 70초간 확장 (extension) 시키는 과정을 30 ~ 40회 반복 실시한 후 70 ~ 75℃에서 5 ~ 20분 동안 추가 반응을 실시하는 것이 바람직하다.
상기 (2) 단계에서는 이전 단계의 PCR을 통해서 수득한 PCR 산물을 바람직하게는 전기영동을 이용하여 검출한다. '전기영동'은 전기장에서 특정 물질을 크기 및 전하에 따라 분리하는 방법을 의미하는 것으로, 통상적으로 특정 물질을 음극에 로딩하고 전기장을 적용시켜서 상기 물질이 양극으로 이동하면서 분리되도록 유도한다. 뉴클레오타이드로 이루어진 물질의 전기영동에는 일반적으로 아가로스, 아가로스-아크릴아미드 또는 폴리아크릴아미드 겔 등이 이용될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 전기영동에 이용되는 겔의 제조 및 염색방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어서 에티듐 브로마이드(Ethidium Bromide)를 이용한 아가로스 겔의 염색방법은 Boerwinkle et al. PNAS, 1989, vol.86, pp.212-216에 개시되어 있다. 또한, 은을 이용한 폴리아크릴아미드 겔의 염색방법은 (1) Goldman et al. Electrophoresis, 1982, vol.3, pp.24-26; (2) Marshall, Electrophoresis, 1983, vol.4, pp.269-272; (3) Tegelstrom, Electrophoresis, vol.7, pp.226-229 및 (4) Allen et al. Bio Technique, 1989, vol.7, pp.736-744 등에 개시되어 있다.
한 양태로서, 본 발명의 감별 검출용 조성물은 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트에 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스 RNA 또는 cDNA를 첨가하여 수행한 결과는, 상기 2가지 유형의 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있음을 제시한다.
웨스트나일바이러스가 시료에 존재할 경우 PCR 생성물은 482 bp 크기 염기서열의 증폭 산물을 지니고, 일본뇌염바이러스가 시료에 존재할 경우 PCR 생성물은 241 bp 크기 염기서열의 증폭 산물을 지니게 된다.
본 발명에서, 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 유용성은 웨스트나일바이러스 NY385-99주, B956주와 일본뇌염 Anyang300주를 사용하여 확인하였다. 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR을 수행한 결과는 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스에 대해 각기 482 bp, 241 bp의 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 나타낸다. 각각의 PCR 결과물의 염기서열을 분석하고 그 결과를 종래 알려진 각 바이러스별 타깃부위의 염기서열과 비교하면, 각 유형의 해당 부위 염기서열과 일치함을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트의 바이러스 종에 따른 특이성을 확인하기 위해 유사한 증상으로 감별이 필요한 다른 종의 바이러스와의 교차반응성을 검토하였다. 교차반응 실험에서, 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스와 같이 여러 축종의 동물에서 뇌신경조직에 친화성이 높은 말비강폐렴바이러스(말허피스바이러스), 아까바네바이러스, 아이노바이러스, 뇌심근염바이러스, 블루텅바이러스, 베링거잉겔하임사의 말뇌염4종 백신에서 추출한 동부말뇌염, 베네쥬엘라말뇌염, 서부말뇌염바이러스 유전자를 음성대조군으로 사용하였다. 양성대조군으로 웨스트나일바이러스 NY385-99주, B956주 및 일본뇌염 Anyang주를 양성대조군으로 이용하였다. 교차반응성에 대한 실험 결과는 본 발명의 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR이 상기 다른 종의 바이러스에 대해 전혀 반응성을 나타내지 않음을 보여주었다.
이와 같이, 본 발명에 따르면 역전사 과정과 PCR 과정을 하나의 튜브에서 수행하고, 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스를 동시에 진단하므로, 뇌염이 발생하여 감별진단이 필요한 의심축의 검체로부터 RNA를 직접 검출하여 한번의 반응으로 두가지 바이러스를 동시에 진단할 수 있게 때문에 국내유입시 경제적 파급효과가 상당한 웨스트나일열과, 이와 감별히 필요한 일본뇌염과 같은 주요 바이러스성 전염병의 정확하고 신속한 진단을 효과적으로 수행할 수 있다. 특히, 본 발명의 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트는 고도로 숙련되지 않은 실험자라도 용이하게 수행할 수 있으며, PCR에서 문제가 되는 오염을 최소화 할 수 있다는 이점이 있어 바이러스 진단에 매우 효율적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 국내 유입가능한 중요한 모기매개 뇌염바이러스에 대한 분자생물학적 성상 연구에 이용될 수 있다.
이하, 실시 예에 기초하여 본 발명을 상세히 설명한다. 아래 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스의 RNA 분리
웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스의 RNA는 웨스트나일바이러스 NY385-99주, B956주와 일본뇌염 Anyang300주 배양 상층액으로부터 QIAamp viral RNA 키트 (Qiagen, Germany)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 분리하였다.
실시예 2: 듀플렉스 RT-PCR 프라이머 제작
웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스에 대하여 특이적 증폭이 가능하고 PCR 산물을 아가로즈 젤 전기영동 수행 후 각각의 바이러스를 PCR 결과물의 크기에 따라 분류할 수 있도록 각 바이러스의 유전자를 분석하여 프라이머를 제작하고 각각의 프라이머를 다음과 같이 명명하였다. 웨스트나일바이러스 유전자에 기초하여 웨스트나일바이러스 유전자 증폭을 위한 WF1, WF2, WF3, WF4, WR1, WR2, WR3, WR4, WR5 프라이머, 일본뇌염바이러스 유전자에 기초하여 일본뇌염바이러스 유전자증폭을 위한 JF1, JF2, JR1, JR2 프라이머를 각각 제작하였다.
실시예 3: 개별튜브 RT-PCR 및 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR
말과 사람에서 뇌염을 일으키는 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스 감염으로 의심되는 동물의 검체로부터 분리한 RNA를 사용하여 cDNA 합성과정이 없이 역전사 반응과 PCR 반응을 동시에 수행하기 위한 개별튜브 및 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 키트를 제작하였다. 먼저, 역전사 효소와 Taq 폴리머라아제를 동시에 첨가한 프리믹스 키트 (premix kit)를 제작하였다. 개별튜브 RT-PCR을 위해서는 각각의 바이러스를 검출하는 프라이머 1종씩만을 넣어 반응성을 개별적으로 평가하였다. 개별튜브 RT-PCR을 위해서는 42℃에서 1시간 1회 역전사 반응을 실시하고 94℃에서 3분간 사전변성 (predenaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 55℃에서 30초간 어닐링 (annealing), 및 72℃에서 60초간 확장 (extension) 시키는 과정을 35회 반복 실시한 후 72℃에서 10분 동안 추가 반응을 실시하였다. PCR 반응 후 증폭된 DNA를 EtBr을 함유하는 1% 아가로즈 젤을 이용하여 전기영동을 실시하고 UV 하에서 관찰하였다.
동시진단을 위한 RT-PCR 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 프리믹스는 웨스트나일바이러스 유전자 증폭을 위한 WF1, WF2, WF3, WF4, WR1, WR2, WR3, WR4, WR5 프라이머, 일본뇌염바이러스 유전자증폭을 위한 JF1, JF2, JR1, JR2 프라이머를 포함하였다. 그 결과, 도 1에서 확인되는 바와 같이, 각 바이러스마다 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 제시하였다. 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스에 대해 각기 482bp, 241bp의 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 나타냈다 (도 1 참조).
따라서, 단 한 번의 PCR 반응으로 고열과 뇌염 등으로 임상 증상이 유사한 웨스트나일바이러스, 일본뇌염바이러스를 특이적으로 진단하고 구분할 수 있다.
실시예 4: 개별튜브 RT-PCR 및 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 검출한계 확인
각각의 바이러스에 대한 개별튜브 RT-PCR 및 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR법을 적용하였을 때의 민감도를 확인하였다. 웨스트나일바이러스 NY385-99주, B956주, 일본뇌염바이러스가 포함되어 있는 가검물에서 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR법을 적용하였을 때에 웨스트나일바이러스의 경우 102.2 내지 101.8 PFU/ml, 일본뇌염바이러스의 경우 102.4 PFU/ml의 바이러스 함량까지 검출 가능한 것으로 확인하였다(도 2 참조).
실시예 5: 교차반응 (Cross reactivity)을 통한 듀플렉스 RT-PCR의 특이성 확인
본 발명에 따른 프라이머를 사용한 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR의 바이러스 종에 따른 특이성을 확인하기 위해 뇌신경조직에 친화성이 높은 바이러스들에 대해 교차반응성을 검토하였다. 교차반응 실험에서, 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스와 같이 여러 축종의 동물에서 뇌신경조직에 친화성이 높은 말비강폐렴바이러스(말허피스바이러스), 아까바네바이러스, 아이노바이러스, 뇌심근염바이러스, 블루텅바이러스, 베링거잉겔하임사의 말뇌염4종 백신에서 추출한 동부말뇌염, 베네쥬엘라말뇌염, 서부말뇌염바이러스 유전자를 음성대조군으로 사용하였다. 양성대조군으로 웨스트나일바이러스 NY385-99주, B956주 및 일본뇌염 Anyang주를 양성대조군으로 이용하였다. 각각의 바이러스의 RNA는 Qiamp viral RNA kit (Qiagen, Germany)로 분리하여 실험에 사용하였다. 교차반응성에 대한 실험 결과는 본 발명의 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR이 상기 다른 종의 바이러스에 대해 전혀 반응성을 나타내지 않음을 보여준다. 이는 본 발명에 따른 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR이 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 지지한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> Differential detection of West nile virus and Japanese encephalitis virus <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctactccaca caggytggag ccactc 26 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctacyccaca cagattgggg cc 22 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttattcaaca cagatagggg ccacccag 28 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tttgtccgcc caggatgcag c 21 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtttgagaat ctgaatgcct ttgcacacac 30 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 caakaaactt gaargccttt gaacagac 28 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 yccaagaaac ttraaagcct ttgaacagac 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agtgtttgag aatctgaatg cctttgcaca tac 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agtcccaaca aatttgaacg cttttgaaca tac 33 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttactcagcg caagtaggag cgtctcaag 29 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttactcagcg caagttgggg cgtc 24 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atgccgtgct tgagggggac g 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 caygctgtgc tcgaagggga cg 22

Claims (7)

  1. (1) 서열번호: 1의 센스 프라이머, 서열번호: 2의 센스 프라이머, 서열번호: 3의 센스 프라이머 및 서열번호: 4의 센스 프라이머와
    (2) 서열번호: 5의 안티센스 프라이머, 서열번호: 6의 안티센스 프라이머, 서열번호: 7의 안티센스 프라이머, 서열번호: 8의 안티센스 프라이머 및 서열번호: 9의 안티센스 프라이머로 구성된 웨스트나일바이러스 특이적 프라이머 세트 그리고
    (a) 서열번호: 10의 센스 프라이머 및 서열번호: 11의 센스 프라이머와
    (b) 서열번호: 12의 안티센스 프라이머 및 서열번호: 13의 안티센스 프라이머로 구성된 일본뇌염바이러스 특이적 프라이머 세트를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    RT-PCR용 키트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. (1) 제 1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 실시하는 단계와 (2) 상기 PCR 산물의 크기를 확인하는 단계를 포함하는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스 감별 검출 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 RT-PCR은 단일튜브-듀플렉스 RT-PCR 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 RT-PCR은 40 ~ 45℃에서 30분 ~ 90분 1회 역전사 반응을 실시하고 92 ~ 96℃에서 2 ~ 4분간 사전변성 (predenaturation)시킨 후, 92 ~ 96℃에서 25 ~ 35초간 변성(denaturation), 50 ~ 60℃에서 25 ~ 35초간 어닐링 (annealing), 및 70 ~ 75℃에서 50 ~ 70초간 확장 (extension) 시키는 과정을 30 ~ 40회 반복 실시한 후 70 ~ 75℃에서 5 ~ 20분 동안 추가 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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