CN113215329A - 呼吸道7种亚型流感病毒多重pcr检测的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

呼吸道7种亚型流感病毒多重pcr检测的引物、探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR检测的引物、探针和试剂盒。所述7种亚型的流感病毒为：甲流H1N1(2009)、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9及乙流V型、乙流Y型。本发明所述引物探针和试剂盒可快速、同时对7种亚型流感病毒分型，能够实现对一个临床样本的流感病毒快速分型检测，为流感疫情防控及疫情监测提供了一种有效、快速的检测方法。

Description

呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR检测的引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR检测的引物、探针和试剂盒。
背景技术
流感病毒属于正黏病毒科，正粘病毒属，甲型流感病毒和乙型流感病毒基因组均由8个单股的负链RNA节段组成。甲型流感病毒及乙型流感病毒常在全球范围内存在，以单独或共感的方式引起局部或季节性流感，对儿童、青少年及免疫力低下的老人易感，在儿童及青少年感染的死亡率较高，对全球公共卫生造成了严重的危害。其中，A型流感以血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分不同亚型，在人群中常存在的亚型为H1N1(2009)、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感病毒以B-Yamagata(BY)和B-Victoria(BV)两个分支为主分为B-Y型和B-V型，两个系病毒的HA1核苷酸序列有明显的差异。
根据国家《流行性感冒诊断标准及处理原则》相关法规的内容，病毒的分离与鉴定是流感病毒的金标准。当前流感病毒的检测方法主要有血清学检测、微生物培养及核酸检测等。其中血清型检测需要使用标准血清，通过血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)对抗原进行确认及分型，成本高，耗时久，不适于临床款速分型诊断。微生物培养即病毒的分离与鉴定，是流感病毒临床诊断的金标准。低致病性流感病毒主要通过鸡胚及细胞进行传代培养，而高致病性流感病毒则需要在生物安全三级实验室进行操作培养，对外界环境要求高，风险高且耗时久，不适合临床诊断。这些方法虽然灵敏度高，结果准确，但是耗时久、操作复杂、成本较高，对相关技术和工作条件要求较高，在疾控中心或者相关基层单位，很难在流感病毒大爆发时做出准确、快速的判断，不适合临床快速诊断。而核酸检测仅需要灭活的病毒核酸，操作简便、快捷，适合临床快速检测及流感疫情监控。
目前常用的核酸检测方法主要有琼脂糖凝胶电泳、荧光定量PCR、数字PCR等，Real-time PCR具有较高的特异性和敏感性。但目前仍缺乏能够准确、灵敏地同时检测、区分多种流感病毒亚型的荧光定量PCR试剂盒产品。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR检测的引物、探针和试剂盒，该引物、探针对临床中常见的7种亚型流感病毒H1N1(2009)、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、B-Y和B-V可进行快速、准确分型，为流感疫情监控及疫情防控提供有效的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR检测的引物、探针，其特征在于，包括：
用于检测甲流H1N1(2009)亚型的SEQ ID NO.1～2所示核苷酸序列的引物和SEQID NO.3所示核苷酸序列的探针；
用于检测甲流H1N1亚型的SEQ ID NO.4～5所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的探针；
用于检测甲流H3N2亚型的SEQ ID NO.7～8所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的探针；
用于检测甲流H5N1亚型的SEQ ID NO.10～11所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO.12所示核苷酸序列的探针；
用于检测甲流H7N9亚型的SEQ ID NO.13～14所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO.15所示核苷酸序列的探针；
用于检测乙流V亚型的SEQ ID NO.16～17所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的探针；和
用于检测乙流Y亚型的SEQ ID NO.19～20所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的探针。
本发明中，SEQ ID NO.1～2所示引物扩增的片段如SEQ ID NO.25；
SEQ ID NO.4～5所示引物扩增的片段如SEQ ID NO.26
SEQ ID NO.7～8所示引物扩增的片段如SEQ ID NO.27；
SEQ ID NO.10～11所示引物扩增的片段如SEQ ID NO.28；
SEQ ID NO.13～14所示引物扩增的片段如SEQ ID NO.29；
SEQ ID NO.16～17所示引物扩增的片段如SEQ ID NO.30；
SEQ ID NO.19～20所示引物扩增的片段如SEQ ID NO.31；
本发明中，SEQ ID NO.22～23为所示的人内标基因18s RNA的检测引物，所示引物扩增的片段如SEQ ID NO.32。
本发明中，所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接淬灭基团。
本发明还提供了呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR荧光检测的试剂盒，包括本发明述的引物、探针。
一些实施方案中，本发明试剂盒中所述引物的浓度为100uM，探针浓度为100uM。
一些实施方案种，所述试剂盒还包括检测内标基因β-action的引物、探针；
所述检测内标基因β-action的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:22～23所示；
所述检测内标基因β-action的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
本发明所述的引物探针组合在制备检测流感病毒分型的试剂盒中的应用。
本发明提供的引物和探针能够在一批反应体系中，在两管中同时检测7种流感病毒亚型，实验表明，本发明提供的引物探针具有良好的准确性、特异性和灵敏度。
在一些具体实施例中，本发明将所述引物和探针分为引物探针A组和引物探针B组，引物探针A组中的四条探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，引物探针A组中的三条探针的5’端分别连接不同的荧光报告基团，在两管中同时检测7种流感病毒亚型，可以对未知样本中的流感病毒进行快速分型检测，为临床诊断、疫情防控及疫情监控提供可靠的实验依据。
一些实施方案中，本发明试剂盒还包括PCR反应液；
所述PCR反应液包括无菌水、缓冲液Buffer 1、反转录酶、Taq酶、UDG酶、dNTPs、缓冲液Buffer2；
所述缓冲液Buffer 1由以下组分组成：1M Tricine、10M KOAc、Tween20、甘油、DMSO、5M甜菜碱、10％NaN3。缓冲液Buffer 1以甘油、Tween20和DMSO为溶媒，其中含有1MTricine、10M KOAc、5M甜菜碱和质量分数为10％的NaN3。
所述缓冲液Buffer2为7mM Mg(OAc)。
一些实施方案中，本发明试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为无菌水，所述阳性质控品为人工合成的靶标序列按照等比例混合的混合物。
本发明还提供了一种同时检测呼吸道7种亚型流感病毒的方法，以本发明试剂盒对待测样品核酸进行实时荧光定量PCR检测，产生S型扩增曲线且扩增曲线Ct值≤36则为阳性。
一些实施方案中，检测呼吸道7种亚型流感病毒的方法包括以下步骤：
取待测核酸样本，分别加入反应管A和反应管B中，反应管A和B体系为80ul，配制如下：
反应管A：
体系A：20ul
体系C：10ul
核酸：50ul
反应管B：
体系B：20ul
体系C：10ul
核酸：50ul。
其中，体系A配制如下：
缓冲液1：11.692ul，
反转录酶2ul；
Taq酶：2ul；
UDG：0.2ul；
dNTPs：1ul
引物：终浓度为0.3uM；
探针：终浓度为0.15uM；
超纯水补至20ul。
体系B配制如下：
缓冲液1：11.692ul；
反转录酶：2ul；
Taq酶：2ul；
UDG：0.2ul；
dNTPs：1ul
引物：终浓度为0.3uM；
探针：终浓度为0.15uM；
超纯水补至20ul；
体系C配制如下：
缓冲液Buffer2：7mMMg(OAc)2ul
超纯水补至20ul。
一些实施方案中，所述实时荧光定量PCR反应程序包括：
Figure BDA0003138589720000051
与现有技术相比，本发明提供的呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR检测的引物、探针和试剂盒仅需要一轮实验即能够快速对临床样本进行流感分型鉴定，具有良好的准确性、特异性和灵敏度。本发明检测方法具有便于操作，具有快速、简便、特异等特点，为临床流感患者及流感疾病有效监控提供了一种高效的检测方法。
附图说明
图1为本试剂盒结构示意组成图；
图2为本试剂盒组成图中反应管A和反应管B示意图；
图3为本发明检测试剂盒反应管A中4组临床阳性样本的结果；
图4为本发明检测试剂盒反应管B中3组临床阳性样本的检测结果。
具体实施方式
本发明提供具体的实施方案，进一步阐述本发明的技术方案，此处所述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。特别需要指出的是，所有类似的变更组合、替换和改动菌视为本发明。
本发明的耗材、仪器均为市场上普通售品。
本发明提供了用于检测流感病毒分型的的引物、探7种亚型包括：H1N1(2009)、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、乙流Y型和乙流V型。
实施例1本发明引物、探针
从NCBI基因库下载涵盖国内外近10年各个型别的流感病毒HA基因的多条基因序列，通过MEGA6.0进行序列比对，删除相同序列，对所有亚型的序列分别进行同源性比对，确定保守区域，使用Primer Express 3.0软件在其保守区域设计高度特异性的引物与Taqman探针，设计好的引物探针均通过Blast验证，具有较好的特异性。引物探针委托擎科生物公司合成。设计多组引物探针，最终筛选的引物探针如下：
将本发明所述引物、探针分为引物探针A和引物探针B组，其中引物探针A组包括：
用于检测甲流H1N1(2009)亚型的引物探针：
H1-2009-F(SEQ ID NO.1)：CAGACACTGTAGACACAGTACT
H1-2009-R(SEQ ID NO.2)：ATGTAGGACCATGAGCTTGCTG
H1-2009-P(SEQ ID NO.3)：FAM-5’-CATTGCTGGCTGGATCYTGGGAAATCCA-3’-BHQ1。
用于检测甲流H1N1亚型基因的引物探针：
H1-F(SEQ ID NO.4)：CGACACTGTTGACACAGTACT
H1-R(SEQ ID NO.5)：GTAGGACCATGACTCCTTGG
H1-P(SEQ ID NO.6)：ROX-5’-TTGCCGGGTGGATCTTAGGAAACCC-3’-BHQ2。
用于检测甲流H3N2亚型基因的引物探针：
H3-F(SEQ ID NO.7)：TGAGGACACHAAAATAGATCTCTG；
H3-R(SEQ ID NO.8)：GGCATTGTCACATTTGTGGT；
H3-P(SEQ ID NO.9)：CY5-5’-ACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCT-3’；-BHQ2。
用于检测甲流H5N1亚型的引物探针：
H5-F(SEQ ID NO.10)：CTAGATGTCTGGACTTAYAATGC
H5-R(SEQ ID NO.11)：ATGCAAATYCTGCACTGTAACGA
H5-P(SEQ ID NO.12)：HEX-5’-ATCATGATGGCTGGTCTATCTTTATGGATGTGT-3’-BHQ1。
引物探针B组包括：
用于检测甲流H7N9亚型的引物探针：
H7-F(SEQ ID NO.13)：CTGGTATTCGCTCTGATTGCG
H7-R(SEQ ID NO.14)：ATTCTAGGAATTGGTCACATTGAG
H7-P(SEQ ID NO.15)：CY5-5’-CCTCGGACAYCATGCCGTGTCAAA-3’-BHQ2。
用于检测乙流V亚型的引物探针：
BV-F(SEQ ID NO.16)：ACAGATTGGTGGCTTCCCAAAT
BV-R(SEQ ID NO.17)：CTTCTCCAATTAAAGGCAAGGATC
BV-P(SEQ ID NO.18)：FAM-5’-TGCGCAAGTGGCAGGAGCAAGGT-3’-BHQ1。
用于检测乙流Y亚型的引物探针：
BY-F(SEQ ID NO.19)：AAAACAGGAACAATTGTCTATCAAAG
BY-R(SEQ ID NO.20)：CAATTTCCTATGGCTTTTGCATGT
BY-P(SEQ ID NO.21)：ROX-5’-AAGGGTCATTGCCYTTAATTGGTGAAGC-3’-BHQ1。
内标引物探针组合：
β-action-F(SEQ ID NO.22)：CCGTCGTAGTTCCGACCATA
β-action-R(SEQ ID NO.23)：TCAGCTTTGCAACCATACTCC
β-action-P(SEQ ID NO.24)：HEX-5’-ATGCCGACCGGCGATGCGGC-3’-BHQ2。
以上引物序列均为5′→3′。
实施例2本发明试剂盒的检测过程
本发明的检测方法为Real time RT-PCR，Real Time RT-PCR反应过程为
(1)反转录。温度升高过程，体系内发生酶的消化过程，主要用于PCR产物的气溶胶污染，排除假阳性。一般酶的消化温度为37℃～50℃，消化时间为2～10min；
(2)预变性：预变性目的是使双链核酸大开为单链。预变性时间和温度主要取决于靶核酸序列长度及碱基组成，温度一般为90℃～105℃，时间一般为2～10min；
(3)变性：循环过程的第一步，变性使双链打开为单链，变性温度一般为90℃～105℃，时间为10s～35s；
(4)退火：退火过程使探针结合到靶序列上。温度一般为40℃～60℃，时间一般为10s～60s；
(5)延伸：延伸过程使引物与靶序列结合，合成新的DNA双链。温度一般为60℃～时间一般为10s～1min。
本发明荧光检测通道选择如下：
(1)体系A中，选择FAM通道检测甲流H1N1(2009)亚型；选择ROX通道检测甲流H1N1亚型；选择CY5通道检测甲流H3N2亚型；选择HEX通道检测甲流H5N1亚型。
(2)体系B中，选择FAM通道检测乙流B-V型；选择HEX通道检测乙流B-Y型，选择CY5通道检测甲流H7N9亚型；选择HEX通道检测内标基因。
具体测试结果判断如下：
阈值设置为3，反应管A中：
(1)SEQ ID NO.3所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO.6、9、12、15、18、21所示探针通道的CT值＞36，且反应管B中SEQ ID NO.24所示探针通道CT值≤35，报告为甲流H1N1(2009)亚型；
(2)SEQ ID NO.6所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO.3、9、12、15、18、21所示探针通道的CT值＞36，且反应管B中SEQ ID NO.24所示探针通道CT值≤35，报告为甲流H1N1亚型；
(3)SEQ ID NO.9所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO.3、6、12、15、18、21所示探针通道的CT值＞36，且反应管B中SEQ ID NO.24所示探针通道CT值≤35，报告为甲流H3N2亚型；
(4)SEQ ID NO.12所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO.3、6、9、15、18、21所示探针通道的CT值＞36，且反应管B中SEQ ID NO.24所示探针通道CT值≤35，报告为甲流H5N1亚型；
反应管B中：
(1)SEQ ID NO.15所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO.3、6、9、12、18、21所示探针通道的CT值＞36，且反应管B中SEQ ID NO.24所示探针通道CT值≤35，报告为甲流H7N9亚型；
(2)SEQ ID NO.18所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO.3、6、9、12、15、21所示探针通道的CT值＞36，且反应管B中SEQ ID NO.24所示探针通道CT值≤35，报告为乙流B-V型；
(3)SEQ ID NO.21所示探针通道的CT值≤36，但SEQ ID NO.3、6、9、12、15、18所示探针通道的CT值＞36，且反应管B中SEQ ID NO.24所示探针通道CT值≤35，报告为乙流B-V型；
(4)当SEQ ID NO.24所示探针通道CT值＞36，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，并重复试验。
以上结果空白对照、阳性对照及阴性对照结果均成立，否则视为实验无效。
实施例3本发明试剂盒的可行性试验
与其它疾病的交叉反应情况。
(1)本发明试剂盒由实施例1方法完成配制。
(2)利用实施例1的试剂盒对7个临床阳性样本进行检测，结果显示，各亚型临床阳性样本均为阳性，结果见图3～4。
(3)利用实施例1的试剂盒对脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型的阳性核酸进行检测，结果显示均无交叉反应，结果见表1。
表1交叉反应试验
Figure BDA0003138589720000101
结果显示，本发明试剂盒对流感病毒7种常见的亚型有较好的特异性，能够特异性地检出H1N1(2009)、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、乙流Y型和乙流V型共7个流感常见型别，且与其它疾病间无交叉反应。
实施例4本发明试剂盒的检测灵敏度、准确度和特异性
(1)本发明试剂盒的检测灵敏度
针对各亚型毒株，分别设置7组不同浓度各亚型样本通过该检测试剂盒使用荧光定量RT-PCR的方法进行核酸扩增。
提取各亚型RNA，测定RNA模板浓度，并按照比例稀释至1ng/ul，作为初始浓度，进行10倍倍比稀释，最终获得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5及10-67个浓度梯度，以这些样本作为反应模板，按照该试剂盒加样方法进行荧光PCR核酸扩增。
结果显示本发明设计的引物探针组合，具有较强的灵敏度。甲流H1N1(2009)引物探针的检测灵敏度达到10-5ng/ul，H1N1、H3N2、H5N1、H7N9引物探针的检测灵敏度达到10- 6ng/ul；乙流V型和Y型引物探针组合的检测灵敏度为RNA终浓度为10-6ng/ul。
(2)本发明试剂盒的检测准确度及特异性
使用本发明试剂盒，检测18株各亚型灭活流感病毒，其中包括1株H1N1(2009)、3株H1N1、6株H3N2、1株H5N1、1株H7N9、3株V型、3株Y型以及16株其他病毒，包括3株流感嗜血杆菌、5株金黄色葡萄球菌、1株肺炎链球菌、1株呼吸道腺病毒(3型)、1株呼吸道腺病毒(7型)、3株呼吸道合胞病毒B型、2株副流感病毒2型。
提取各毒株核酸备用，使用该荧光PCR检测试剂盒反应体系，加入待检样本的核酸模板，使用该检测试剂盒建议反应程序，进行检测。
结果显示，18株各亚型流感病毒毒株，在各自对应的荧光通道出值，根据荧光检测结果显示，其中H1N1(2009)流感病毒1株、H1N1流感病毒3株、H3N2流感病毒6株、H5N1流感病毒1株、H7N9流感病毒1株、V型流感病毒3株、Y型流感病毒3株。流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、呼吸道腺病毒(3型)、呼吸道腺病毒(7型)、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒2型及阴性对照的通道均未出现扩增曲线及荧光信号。
以上结果表明，通过该检测试剂盒，能够高度灵敏特异性地检出流感病毒，各毒株之间不发生交叉反应，可以有效地同时检测出7种亚型流感病毒，能够对样本进行准确快速分型。
实施例5阴阳性临床样本符合率验证
采用质检合格的本试剂盒，对采集的临床样本进行验证。对20例H1N1亚型、H3N2亚型、乙流Y型和乙流V型临床阳性样本核酸及20例流感阴性样本进行验证，为保证试剂盒检测结果可信，设置阴阳性质控品对照，结果表明，临床样本阴阳性符合率100％。试剂盒检测结果如下：
表2临床阴阳性符合率试验
Figure BDA0003138589720000111
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州安图莫比分子诊断技术有限公司
<120> 呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR检测的引物、探针和试剂盒
<130> MP2032487
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagacactgt agacacagta ct 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtaggacc atgagcttgc tg 22
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cattgctggc tggatcytgg gaaatcca 28
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgacactgtt gacacagtac t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaggaccat gactccttgg 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgccgggtg gatcttagga aaccc 25
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgaggacach aaaatagatc tctg 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcattgtca catttgtggt 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acaacgcgga gcttcttgtt gccct 25
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctagatgtct ggacttayaa tgc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgcaaatyc tgcactgtaa cga 23
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcatgatgg ctggtctatc tttatggatg tgt 33
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctggtattcg ctctgattgc g 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attctaggaa ttggtcacat tgag 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctcggacay catgccgtgt caaa 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acagattggt ggcttcccaa at 22
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cttctccaat taaaggcaag gatc 24
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgcgcaagtg gcaggagcaa ggt 23
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaacaggaa caattgtcta tcaaag 26
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caatttccta tggcttttgc atgt 24
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aagggtcatt gccyttaatt ggtgaagc 28
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccgtcgtagt tccgaccata 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcagctttgc aaccatactc c 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgccgaccg gcgatgcggc 20
<210> 25
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgaacaattc aacagacact gtagacacag tactagaaaa gaatgtaaca gtaacacact 60
ctgttaacct tctagaagac aagcataacg ggaaactatg caaactaaga ggggtagccc 120
cattgcattt gggtaaatgt aacattgctg gctggatcct gggaaatcca gagtgtgaat 180
cactctccac agcaagctca tggtcctaca tgg 213
<210> 26
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
actcaaccga cactgttgac acagtacttg aaaagaatgt gacagtgaca cactctgtca 60
acctgcttga ggacaaccac aatggaaaac tatgtctatt aaaaggaaaa gccccattac 120
aattgggtaa ctgcagcgtt gccgggtgga tcttaggaaa cccagaatgc ggattactga 180
tttccaagga gtcatggtcc tacatt 206
<210> 27
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atatgttgag gacactaaaa tagatctctg gtcatacaac gcggagcttc ttgttgccct 60
ggagaaccaa catacaattg atctaactga ctcagaaatg aacaaactgt ttgaaaaaac 120
aaagaagcaa ctgagggaaa atgctgagga tatgggaaat ggttgtttca aaatatacca 180
caaatgtgac aatgcctgca tagg 204
<210> 28
<211> 407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttcctagatg tctggactta taatgctgaa cttctggttc tcatggagaa tgagagaact 60
ctagacttcc atgactcaaa tgtcaagaac ctttatgata aggtccgact acagcttaag 120
gataatgcaa aagaactggg aaatggttgt ttcgagttct atcacaaatg taataatgaa 180
tgtatggaaa gtgtaagaaa cgggacgtat gactacccgc agtattcaga agaagcaaga 240
ttaaaaagag aggaaataag tggagtaaaa ttggaatcaa taggaatcta ccaaatactg 300
tcaatttatt caacagtggc gagttcccta gtgctggcaa tcatgatggc tggtctatct 360
ttatggatgt gttccaacgg gtcgttacag tgcagaattt gcattta 407
<210> 29
<211> 260
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aatcctggta ttcgctctga ttgcgatcat tccaacaaat gcagataaaa tatgcctcgg 60
acaccatgcc gtgtcaaacg ggaccaaagt aaacacatta actgaaagag gagtggaagt 120
cgtcaatgca actgaaacag tggaacgaac aaacatccct aggatctgct caaaagggaa 180
acggacagtt gacctcggtc aatgtggact cctggggaca atcactggac cacctcaatg 240
tgaccaattc ctagaatttt 260
<210> 30
<211> 206
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tttcacagat tggtggcttc ccaaatcaaa cagaagacgg aggactacca caaagtggta 60
gaattgttgt tgactacatg gtgcaaaaat ctgggaaaac aggaacaatt acctatcaaa 120
gaggtatttt attgcctcaa aaggtgtggt gcgcaagtgg caggagcaag gtaataaaag 180
gatccttgcc tttaattgga gaagca 206
<210> 31
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cctgggaaaa caggaacaat tgtctatcaa agaggtgttt tgttgcctca aaaggtgtgg 60
tgcgcgagtg gcaggagcaa agtaataaaa gggtcattgc ctttgattgg tgaagcagat 120
tgccttcatg aagaatacgg tggattaaac aaaagcaagc cttactacac aggaaaacat 180
caaaagccat aggaaattgc cca 203
<210> 32
<211> 199
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caagaacgaa agtcggaggt tcgaagacga tcagataccg tcgtagttcc gaccataaac 60
gatgccgacc ggcgatgcgg cggcgttatt cccatgaccc gccgggcagc ttccgggaaa 120
ccaaagtctt tgggttccgg ggggagtatg gttgcaaagc tgaaacttaa aggaattgac 180
ggaagggcac caccaggag 199

Claims (10)

1.呼吸道7种亚型流感病毒多重PCR检测的引物、探针，其特征在于，包括：
用于检测甲流H1N1(2009)亚型的SEQ ID NO.1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ IDNO.3所示核苷酸序列的探针；
用于检测甲流H1N1亚型的SEQ ID NO.4～5所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的探针；
用于检测甲流H3N2亚型的SEQ ID NO.7～8所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的探针；
用于检测甲流H5N1亚型的SEQ ID NO.10～11所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的探针；
用于检测甲流H7N9亚型的SEQ ID NO.13～14所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的探针；
用于检测乙流V亚型的SEQ ID NO.16～17所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的探针；和
用于检测乙流Y亚型的SEQ ID NO.19～20所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的探针。
2.根据权利要求1所述的引物、探针，其特征在于，所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端淬灭基团连接。
3.权利要求1或2所述的引物、探针在制备检测流感病毒分型的试剂盒中的应用。
4.流感病毒分型的多重PCR荧光检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物、探针。
5.根据权利要求4所述的多重PCR荧光检测试剂盒，其特征在于，还包括检测内标基因β-action的引物、探针；
所述检测内标基因β-action的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:22～23所示；
所述检测内标基因β-action的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
6.根据权利要求4所述的多重PCR荧光检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液；
所述PCR反应液包括无菌水、缓冲液Buffer1、反转录酶、Taq酶、UDG酶、dNTPs、缓冲液Buffer2；
所述缓冲液Buffer1由以下组分组成：1MTricine、10MKOAc、Tween20、甘油、DMSO、5M甜菜碱、10％NaN3；
所述缓冲液Buffer2为7mMMg(OAc)。
7.根据权利要求4所述的多重PCR荧光检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为无菌水，所述阳性质控品为人工合成的靶标序列按照等比例混合的混合物。
8.一种同时检测呼吸道7种亚型流感病毒的方法，以权利要求4～7任一项所述的试剂盒，对待测样品核酸进行实时荧光定量PCR检测，扩增曲线Ct值≤36且有典型S型扩增曲线，为阳性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取待测核酸样本，分别加入反应管A和反应管B中，反应管A和B体系为80ul，配制如下：
反应管A：
体系A：20ul
体系C：10ul
核酸：50ul
反应管B：
体系B：20ul
体系C：10ul
核酸：50ul；
其中，体系A配制如下：
缓冲液1：11.692ul，
反转录酶2ul；
Taq酶：2ul；
UDG：0.2ul；
dNTPs：1ul
引物：终浓度为0.3uM；
探针：终浓度为0.15uM；
超纯水补至20ul；
体系B配制如下：
缓冲液1：11.692ul；
反转录酶：2ul；
Taq酶：2ul；
UDG：0.2ul；
dNTPs：1ul
引物：终浓度为0.3uM；
探针：终浓度为0.15uM；
超纯水补至20ul；
体系C配制如下：
缓冲液Buffer2：7mMMg(OAc)2ul
超纯水补至20ul。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应程序包括：
Figure FDA0003138589710000031
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