CN104388587A - 乙型流感病毒一步法检测试剂盒及乙型流感病毒检测方法 - Google Patents

乙型流感病毒一步法检测试剂盒及乙型流感病毒检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乙型流感病毒一步法检测试剂盒及乙型流感病毒检测方法。该乙型流感病毒一步法检测试剂盒包含RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包含彼此被分开的第一反应液、含有酶的第二反应液，所述第一反应液包含用于荧光定量PCR的乙型流感病毒Bv、By亚型基因的引物探针。乙型流感病毒检测方法包括提取待测样本RNA、一步法RT-PCR和将荧光信号检测结果与对照组比较判断等步骤。本发明乙型流感病毒一步法检测试剂盒能将含有乙型流感病毒Bv、By亚型基因的引物探针的第一反应液与含有酶的第二反应液在检测时直接混合进行RT-PCR，能一步法快速的检测乙型流感病毒Bv、By亚型，且能避免污染，灵敏度高。

Description

乙型流感病毒一步法检测试剂盒及乙型流感病毒检测方法
技术领域
本发明属于卫生防预病毒检测技术领域，具体的涉及一种乙型流感病毒一步法检测试剂盒及乙型流感病毒的检测方法。
背景技术
流感病毒(正黏液病毒科)为单链RNA膜病毒，其RNA含有八个片断。流感病毒的基因结构使其有不断交换基因片断进而形成优势变异的条件。根据核蛋白和膜表面蛋白抗原，流感病毒分为甲、乙、丙三型。其中，乙型流感病毒是常见的流感流行病毒,其仅在人类之间转播，乙型流感通常有肌炎及胃肠道症状，在某些年份成为强势株。相比较甲型流感，乙型流感病毒更容易引起较严重的合并症。1983年以来把乙型流感病毒分为2个主要亚型:Victoria型和Yamagata型。
目前经典的乙型流感病毒的细胞培养分离方法步骤如下：
1)75～90％成片细胞的准备：
用40倍光学显微镜镜观察细胞生长状态。选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒的分离；轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸6mLpH7.4-7.6的Hank's液清洗细胞3遍。
2)接种于细胞培养瓶：
用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。用无菌的移液管吸取500μl临床样品置于细胞培养瓶中，温和摇动数次，使之均匀铺于细胞培养瓶底。将步骤2)中的培养瓶放入35℃，5％CO2培养箱中吸附1～2h。从培养箱中取出细胞培养瓶，用10mL的无菌移液管吸取6mL pH7.4-7.6的Hank's液清洗细胞，加入5mL含终浓度2μg/mL TPCK-胰酶的病毒生长液于细胞培养瓶中。放置于35℃5％CO2培养箱培养。每日观察细胞病变情况(细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大成网状，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落)。
3)细胞培养物的收获：
当75％～100％细胞出现病变时进行收获。即使无细胞病变也应该于第7天收获。进行红细胞凝集试验(HA)，用HI方法进行流感病毒的鉴定。
根据上述目前经典的方法，检测样品中乙型流感病毒的周期过长(至少7天以上)、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂繁多等缺点已远远不能满足快速检测的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种乙型流感病毒一步法检测试剂盒和一步法检测乙型流感病毒的方法。旨在解决现有检测乙型流感病毒周期长、灵敏的低等技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种乙型流感病毒一步法检测试剂盒，包含RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包含彼此被分开的第一反应液、含有酶的第二反应液，所述第一反应液包含用于荧光定量PCR的乙型流感病毒Bv、By亚型基因的引物探针。
一种一步法检测乙型流感病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样本RNA；
以所述提取待测样本RNA为模板，采用如上述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒进行RT-PCR反应后收集荧光数据；
将荧光信号检测结果与对照组比较判断。
本发明与现有技术相比，具有以下优异技术效果：
上述乙型流感病毒一步法检测试剂盒能将含有乙型流感病毒Bv、By亚型基因的引物探针的第一反应液与含有酶的第二反应液在检测时直接混合进行RT-PCR，能一步法快速的检测乙型流感病毒Bv、By亚型，且能避免污染，灵敏度高，有效避免了传统检测乙型流感病毒的周期长，易污染且灵敏度低的不足。
上述一步法检测乙型流感病毒的方法利用上述乙型流感病毒一步法检测试剂盒采用一步法进行RT-PCR反应，显著缩短了乙型流感病毒检测的时间和检测质量，克服了目前传统经典乙型流感病毒检测方法存在的不足，弥补了目前应急应对预防和控制流感病毒感染症候病因学确认等领域存在的缺陷和不足，具有重要的实用价值和现实推广意义。
附图说明
图1为本发明实施例使用的Ct值的示意性说明，其中所述的阈值线对应于特定探针；
图2为使用本发明实施例一步法检测乙型流感病毒的方法流程图；
图3为本发明实施例乙型流感病毒一步法检测试剂盒中阳性对照PCR扩增图；
图4为本发明实施例乙型流感病毒一步法检测试剂盒中阴性对照PCR扩增图；
图5为本发明实施例2中对20份样品采用本发明实施例乙型流感病毒一步法检测试剂盒进行的PCR扩增图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
与本发明相关关键词的解释：
Tris：三异丙基乙磺酰
EDTA：ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸
dNTP：deoxy-ribonucleoside triphosphate,脱氧核糖核苷三磷酸
FAM：Carboxyfluorescein,羧基荧光素
HEX：hexachloro-fluorescein,六氯-6-甲基荧光素。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
逆转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)：是反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增目的片段。RT-PCR包括两步：1、mRNA逆转录为cDNA；2、以cDNA为模版进行PCR。将这两个步骤合二为一个反应管进行即为一步法，将两个步骤分开两管反应为两步法。一步法更方便快捷。
实时荧光PCR法：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。
Ct值：cycle threshold，每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，参见图1。
荧光定量PCR技术在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，见图1，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。
Bv亚型乙型流感病毒：Victoria型；By亚型乙型流感病毒：Yamagata型；Bv、By亚型为乙型流感病毒的2个主要亚型。
另外，本说明书中使用的术语“浓度”，如非特别说明，均指初始浓度，即与其它液体混合之前的浓度。
根据乙型流感病毒的上述特性，本发明实施例针对Bv、By亚型的基因设计特异性引物和Taqman探针，提供了一种乙型流感病毒一步法检测试剂盒。该乙型流感病毒一步法检测试剂盒包含RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包含彼此被分开的第一反应液、含有酶的第二反应液。
其中，所述第一反应液包含用于荧光定量PCR的乙型流感病毒Bv、By亚型基因的引物探针。针对该Bv、By亚型靶基因特性，在一实施例中，所述乙型流感病毒Bv、By亚型基因的引物探针为：
乙型流感病毒Bv亚型基因的引物：
BvF：5’-CGCTACCAGTAGAAGCGGATT-3’(SEQ ID NO:1)；
BvR：5’-GTGGATTCGTTGCTGTTTTGT-3’(SEQ ID NO:2)；
乙型流感病毒Bv亚型基因的探针：
BvA：5’-(X)-TCGCAACAATGGCTTGGGCTGTCCCA-(Y)-3’(SEQ ID NO:3)；其中，所述探针中X选用FAM、HEX、JOE、ROX、CY5或CY3荧光基团，Y选用BHQ、TAMAR或DABCYL荧光淬灭基团。
乙型流感病毒By亚型基因的引物：
ByF：5’-AACGGATTTTTCGCAACAATG-3’(SEQ ID NO:4)；
ByR：5’-CAAATGTATGGTACTTCTACTYTT-3’(SEQ ID NO:5)；
乙型流感病毒By亚型基因的探针：
ByH：5’-(N)-CGACAACAACAAAACAGCAACAAATTCA(M)-3’(SEQ IDNO:6)。其中，所述探针中N选用FAM、HEX、JOE、ROX、CY5或CY3荧光基团，且N优选与上述X所选用的荧光基团不同；M为相同或不同的选用BHQ、TAMAR或DABCYL荧光淬灭基团。
上述各引物和分子信标探针如下表1所示：
表1 引物与探针列
理所当然的是，上述各引物均是分别针对Bv、By亚型乙型流感病毒的靶基因片段进行设计的。
上述各分子信标探针碱基序列5’端连接的X、N所示的荧光基团荧光波长相差较大，而且两两荧光信号强度相近，以保证两两荧光信号之间无相互干扰，以提高上述试剂盒的灵敏度和准确度。
为了RT-PCR反应更加简化，在一实施例中，上述第一反应液还包括不含镁离子的10×buffer、MgCl2、dNTPs、灭菌超纯水，且该第一反应液各组分体积份数为：
其中，上述各组分的体积单位可以是微升，当然还可以是其他体积单位，另外，上述各组分的含量可以按照上述体积份数比例进行扩大或缩小。
上述第二反应液所含的酶应该是RT-PCR反应过程所需的常用酶，在一实施例中，结合Bv、By亚型乙型流感病毒基因特性，第二反应液所含的酶包括DNA聚合酶、逆转录酶，因此，在一些实施例中，该第二反应液包括DNA聚合酶、逆转录酶、显色液和灭菌超纯水。在一些具体实施例中，该第二反应液中的DNA聚合酶选自浓度为5U/μl的Taq酶，逆转录酶选自浓度为50U/μl的M-MLV逆转录酶，显色液为溴酚蓝，且所述DNA聚合酶、逆转录酶、显色液和灭菌超纯水的体积份数为：
其中，上述各组分的体积单位也可以是微升，当然还可以是其他体积单位，另外，上述各组分的含量可以按照上述体积份数比例进行扩大或缩小。
上述第一反应液和所述第二反应液彼此被分开的方式可以是多种的，如可以是将第一反应液与所述第二反应液分别盛装在两个容器中，或将第一反应液与所述第二反应液装设于同一容器中，但两者是被隔开的。在一实施例中，该所述第一反应液与所述第二反应液装设于同一容器中，且通过石蜡将所述第一反应液和所述第二反应液彼此隔开。这样，在RT-PCR反应之前，两者彼此隔开，能够保证该RT-PCR反应液的稳定性能，当进行RT-PCR反应时，该石蜡能够熔融，使得该第一反应液和所述第二反应液直接混合进行RT-PCR反应，从而有效保证RT-PCR反应液的活性和简化RT-PCR反应的程序，缩短乙型流感病毒检测的时间。
在一实施例中，用于分隔第一反应液和所述第二反应液的石蜡选用200910190112.7中国专利中所述的混合石蜡，该混合石蜡能有效延长RT-PCR反应液保存的稳定性，以及能够在RT-PCR反应过程中如温度在95℃左右熔融使得第一反应液与所述第二反应液混合，RT-PCR反应得以进行。在一具体实施例中，该RT-PCR反应液存放于普通离心管中，且第一反应液位于上端，石蜡位于中间，该第二反应液位于石蜡下面。
基于上述对第一反应液与所述第二反应液的阐述，在一些具体实施例中，上述RT-PCR反应液所包含的组分以及含量可以是如下表2所述：
表2 RT-PCR反应液所包含的组分以及含量
组分 用量/管 用量/盒
灭菌超纯水 5-11.5微升 244.8-581.4微升
10×buffer(不含镁离子) 2-4微升 102-204微升
MgCl2(25mM) 2-4微升 102-204微升
dNTPs 2-4微升 102-204微升
引物BvF(50uM) 0.1-0.2微升 5.1-10.2微升
引物BvR(50uM) 0.1-0.2微升 5.1-10.2微升
探针BvA(50uM) 0.1-0.2微升 5.1-10.2微升
引物ByF(50uM) 0.1-0.2微升 5.1-10.2微升
引物ByR(50uM) 0.1-0.2微升 5.1-10.2微升
探针ByH(50uM) 0.1-0.2微升 5.1-10.2微升
合计 18.0微升 918微升
石蜡 20微升 1020微升
Taq酶(5U/μl) 0.15-0.3微升 7.65-15.3微升
M-MLV逆转录酶(50U/μl) 0.1-0.3微升 5.1-15.3微升
灭菌超纯水 补足至2微升 补足至102微升
溴酚兰 0.01-0.02微升 0.51-1.02微升
合计 2微升 102微升
上述RT-PCR反应液各组分的含量调整其目的是为了提高RT-PCR反应效率，缩短乙型流感病毒的检测时间，并提高其检测的灵敏度。其中，还可以按照表2中各组分的比例可以根据试剂的检测需要按照比例进行扩大或缩小。另外，Taq酶和M-MLV逆转录酶还可以是其他浓度，只要是按照表2中的比例进行扩大或缩小均在本发明所公开的范围。
为了更加快速得出检测结果，满足防疫急应的要求，在一实施例中，该试剂盒还包括不含有乙型流感病毒Bv、By亚型的RNA阴性对照液和含有乙型流感病毒Bv、By亚型的RNA阳性对照液，以方便将待检测物的检测结果及时与对照液的检测结果进行比对，快速得出检测结论。
在另一实施例中，该试剂盒还包括用于提取测待样本RNA的溶剂：Trizol试剂、氯仿与异戊醇的混合溶剂和DEPC-H2O。以方便对测待样本RNA的提取，避免另外配制测待样本RNA的溶剂，以进一步缩短乙型流感病毒的时间。
在一具体实施例中，上述阴性对照液、阳性对照液、Trizol试剂、氯仿与异戊醇的混合溶剂和DEPC-H2O等试剂与上述RT-PCR反应液可以按照表3中的量进行配置：
表3
其中，表3中的1-7试剂的量还可以根据试剂的检测需要按照比例进行扩大或缩小。
上述乙型流感病毒一步法检测试剂盒能将第一反应液与第二反应液在检测时直接混合进行RT-PCR，能一步法快速的检测乙型流感病毒Bv、By亚型，操作简单，且能避免污染，灵敏度高。
相应地，基于上述乙型流感病毒一步法检测试剂盒设置的技术原理和技术方法，本发明实施例还提供了一种一步法检测乙型流感病毒的方法。该一步法检测乙型流感病毒的方法流程如图2所示，其包括如下步骤：
S01：提取待测样本RNA；
S02：以所述提取待测样本RNA为模板，采用如上述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒进行RT-PCR反应后收集荧光数据；
S03：将荧光信号检测结果与对照组比较判断。
具体地，上述步骤S01中测样本RNA提取的来源可以是脱离人体物，如血清、粪便、尿液离体等，还可以是食用原料、食品，还可以设计公共卫生安全的使用物品等。也即是说，该步骤S01中测样本RNA提取的来源还可以是为卫生安全为目的样品为来源，即非仅仅以疾病判断为目标的来源。提取方式可以按照下文实施例2的步骤S21中待测样本RNA提取方法提取。
上述步骤S02所述RT-PCR反应的反应体系包括必要的组分，如上文试剂盒中所述RT-PCR反应液。在RT-PCR反应之前，将步骤S01中提取的待测样本RNA加入RT-PCR反应液中后开始RT-PCR反应。
该步骤S02中，含有上述组分的RT-PCR反应体系PCR的程序如下：
42-50℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；共40个循环。
上述步骤S03中，将步骤S02中测得的结果分别与阳性和阴性对照物结果进行比对，快速得出检测结论。
因此，上述一步法检测乙型流感病毒的方法利用上述乙型流感病毒一步法检测试剂盒采用一步法进行RT-PCR反应，显著缩短了乙型流感病毒检测的时间和检测质量，克服了目前传统经典乙型流感病毒检测方法的不足，弥补了目前应急应对预防和控制流感病毒感染症候病因学确认等领域存在的缺陷和不足。
另外，由上述阐述可知，上述乙型流感病毒一步法检测试剂盒以及一步法检测乙型流感病毒的方法可以用于同时检测Bv、By亚型乙型流感病毒，也可以用于单独检测Bv、By亚型乙型流感病毒的任意一种。
以下结合具体实施例对上述乙型流感病毒一步法检测试剂盒及一步法检测乙型流感病毒的方法进行详细说明。
实施例1
提供包含上文表1-3所述试剂的乙型流感病毒一步法检测试剂盒。
实施例2
一步法检测乙型流感病毒的方法，该方法包括如下步骤：
S21.待测样本RNA的提取：
a.取100μL全血或者血清于1.5mL离心管中，加入500μL Trizol试剂，室温剧烈震荡15秒，静置5分钟，再加入120μL氯仿/异戊醇(24:1)，用手剧烈震荡15秒，室温静置5分钟；
b.12000rpm 4℃离心15分钟，取上清置于另一新离心管中(切忌吸出中间白色层)；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟；
c.12000rpm 4℃离心10分钟，弃上清，用75％的冰乙醇洗涤沉淀，12000rpm 4℃离心5分钟，弃乙醇；
d.沉淀室温干燥除去乙醇，用20～50μL DEPC-H2O溶解沉淀待检。
分别按照上述步骤a-d提取如下文表4中的20份待测样品。
S22.RT-PCR一步法检测：
a.待测样品组：提供实施例1中的乙型流感病毒一步法检测试剂盒，并取5μL待检样本RNA，加入试剂盒中的Bv&By RT-PCR反应液中，上机检测。
b.阴性对照组：取乙型流感病毒一步法检测试剂盒阴性对照液5μl，加入至试剂盒中的Bv&By RT-PCR反应液中，上机检测；
c.阳性对照组：取乙型流感病毒一步法检测试剂盒阳性对照液5μl，加入至试剂盒中的Bv&By RT-PCR反应液中，上机检测；
其中，该步骤a-c上机检测的荧光定量PCR仪：ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon 2)、Stratagene MX系列、Roche LightCycler、CepheidSmartCycler、Corbett Rotor-Gene、杭州博日系列。
PCR反应条件：42-50℃：10-15min；
             92-95℃：2-3min；
             92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；(40循环)。
对比实施例1
按照说明书背景技术部分中的经典的乙型流感病毒的细胞培养法检测乙型流感病毒，其中，本对比实施例中的待测样品为实施例2中的20份待测样品相同。
检测结果：
实施例2阳性对照组扩增图谱如图3所示，阴性对照组扩增图谱如图4所示；其中：
阳性结果：扩增曲线图Ct值≤34，并有明显指数增长。
阴性结果：扩增曲线图Ct值＞34或无Ct值。
将实施例2和对比实施例1中的20份待测样品分别按照各自的方法进行检测后，检测结果如下述表4所述和图5所示。
从该表4中可以看出，本发明实施例一步法检测乙型流感病毒的方法能明显缩短检测时间，而且检测结果与对比实施例1的方法接侧结果一致。从以上结果可以看出，利用本发明实施例乙型流感病毒一步法检测试剂盒采用一步法检测乙型流感病毒的方法与传统的培养法相比，在乙型流感病毒检测方面具有快速、灵敏、安全等优点。
表4
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乙型流感病毒一步法检测试剂盒，包含RT-PCR反应液，其特征在于，所述RT-PCR反应液包含彼此被分开的第一反应液、含有酶的第二反应液，所述第一反应液包含用于荧光定量PCR的乙型流感病毒Bv、By亚型基因的引物探针。
2.根据权利要求1所述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒，其特征在于，
所述乙型流感病毒Bv、By亚型基因的引物探针为：
乙型流感病毒Bv亚型基因的引物：
BvF：5’-CGCTACCAGTAGAAGCGGATT-3’(SEQ ID NO:1)；
BvR：5’-GTGGATTCGTTGCTGTTTTGT-3’(SEQ ID NO:2)；
乙型流感病毒Bv亚型基因的探针：
BvA：5’-(X)-TCGCAACAATGGCTTGGGCTGTCCCA-(Y)-3’(SEQ ID NO:3)；
乙型流感病毒By亚型基因的引物：
ByF：5’-AACGGATTTTTCGCAACAATG-3’(SEQ ID NO:4)；
ByR：5’-CAAATGTATGGTACTTCTACTYTT-3’(SEQ ID NO:5)；
乙型流感病毒By亚型基因的探针：
ByH：5’-(N)-CGACAACAACAAAACAGCAACAAATTCA-(M)-3’(SEQ IDNO:6)
其中，所述探针中X、N不同的选用FAM、HEX、JOE、ROX、CY5或CY3荧光基团，Y、M为相同或不同的选用BHQ、TAMAR或DABCYL荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液还包括不含镁离子的10×buffer、MgCl2、dNTPs、灭菌超纯水，所述第一反应液各组分体积份数为：
4.根据权利要求1-3任一所述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液包括DNA聚合酶、逆转录酶、显色液和灭菌超纯水。
5.根据权利要求4所述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶选自浓度为5U/μl的Taq酶，所述逆转录酶选自浓度为50U/μl的M-MLV逆转录酶，所述显色液为溴酚蓝，且所述DNA聚合酶、逆转录酶、显色液和灭菌超纯水的体积份数为：
6.根据权利要求1-3、5任一所述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液和所述第二反应液装设于同一容器中，且通过石蜡将所述第一反应液和所述第二反应液彼此隔开。
7.根据权利要求1-3、5任一所述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒，其特征在于，还包括不含有乙型流感病毒Bv、By亚型的RNA阴性对照液和含有乙型流感病毒Bv、By亚型的RNA阳性对照液。
8.根据权利要求1-3、5任一所述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒，其特征在于，还包括用于提取待测样本RNA的溶剂：Trizol试剂、氯仿与异戊醇的混合溶剂和DEPC-H2O。
9.一种一步法检测乙型流感病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样本RNA；
以所述提取待测样本RNA为模板，采用如权利要求1-8任一所述的乙型流感病毒一步法检测试剂盒进行RT-PCR反应后收集荧光数据；
将荧光信号检测结果与对照组比较判断。
10.根据权利要求9所述的一步法检测乙型流感病毒的方法，其特征在于：所述RT-PCR反应的反应条件为：
42-50℃：10-15min；
92-95℃：2-3min；
92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；共40个循环。
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