CN107893130A - 流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法 - Google Patents

流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。该流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒和试剂盒的使用方法可以同时检测甲型流感病毒以及检测乙型流感病毒Yamagata型和Victoria型，通过使用实时荧光PCR扩增技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，可以快速、准确的得到检测结果。并且结合使用人的管家基因GAPDH的mRNA作为内标质控，对其构建蛋白质外壳包裹的内标阳性质控的慢病毒颗粒，通过有无管家基因GAPDH扩增信号，来判断采样、标本处理过程和PCR扩增体系是否正常，在对标本进行检测的同时能监控呼吸道标本的采集和标本中的核酸纯化处理过程，避免出现假阴性，增加了检测结果的可信度。

Description

流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。
背景技术
流行性感冒病毒(Influenza virus)，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒。人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。禽流感(Avian influenza；AI)是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的某种亚型(也称禽流感病毒)引起的传染性疾病。在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，流行性感冒病毒属(Influenza virus)。流感病毒会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。流感病毒最早是在1933年由英国人威尔逊·史密斯(Wilson Smith)发现的，其称之为H1N1，其中，H代表血凝素，N代表神经氨酸酶，数字代表不同亚型。对于甲型流感病毒(Influenza A Virus)，H分为18个亚型，而N分为11个亚型，理论上有198种亚型。乙型流感(Influenza B Virus)可分为Yamagata和Victoria两大谱系。
甲型和乙型流感病毒颗粒呈球形，自外而内可分为外膜、基质蛋白以及核心三部分。外膜主要成分是脂质(双脂质层)，外表面有血凝素和神经氨酸酶两种糖蛋白突起，这些糖蛋白突起是流感病毒抗原结构的主要成分，外膜内表面为一层作为基质的蛋白质(蛋白质母体)，病毒的核心包含了存储病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。甲型和乙型流感病毒的遗传物质是单股负链RNA。其RNA由8个节段组成，其中，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚集酶，第4个节段负责编码血凝素，第5个节段负责编码核蛋白，第6个节段负责编码神经氨酸酶，第7个节段负责编码基质蛋白，第8个节段负责编码一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白。
流行性感冒的临床症状易与普通感冒相混淆，特别是近年来出现急性、烈性的高致病性禽流感病毒(HPAIV)感染人的事件，不但对养禽业带来巨大的经济损失，而且是引起人类死亡的主要原因之一，因此建立一种准确快速的流感病毒检测方法意义重大。在传统的多种检测手段中，一般采取接种鸡胚或狗肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离和鉴定，耗时较长，不利于对疫情快速采取应对措施。ELISA、胶体金检测方法虽然操作简单和耗时短，但在特异性、灵敏度等性能上比较差，应用受到限制。PCR检测技术快速灵敏，但目前普遍采用的是单重PCR的方法检测流感病毒，不能同时检测多种病原体，尤其是一种病原体的不同基因型。
发明内容
基于此，有必要提供一种快速、准确性高、且亚型覆盖广的流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。
一种流感病毒分型检测用的引物和探针，其特征在于，包括甲型流感病毒扩增引物对及对应的检测探针、乙型流感病毒Yamagata型扩增引物对及对应的检测探针、以及乙型流感病毒Victoria型扩增引物对及对应的检测探针；其中，所述甲型流感病毒扩增引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，和/或是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示和/或是SEQ ID NO:3所示序列的相似序列或互补序列；所述乙型流感病毒Yamagata型扩增引物对的序列如SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示，和/或是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示和/或是SEQ ID NO:6所示序列的相似序列或互补序列；所述乙型流感病毒Victoria型扩增引物对的序列：如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，和/或如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:9所示和/或是SEQ ID NO:9所示序列的相似序列或互补序列；各所述检测探针的两端分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且所述甲型流感病毒的检测探针、所述乙型流感病毒Yamagata型的检测探针与所述乙型流感病毒Victoria型的检测探针上标记的荧光基团各不相同。
在其中一个实施例中，所述流感病毒分型检测用的引物和探针还包括内标阳性质控扩增引物对及对应的检测探针，所述内标阳性质控扩增引物对的序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，和/或是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:12所示和/或是SEQ ID NO:12所示序列的相似序列或互补序列，内标阳性质控的检测探针的两端也分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且该荧光基因也不同于所述甲型流感病毒的检测探针、所述乙型流感病毒Yamagata型的检测探针与所述乙型流感病毒Victoria型的检测探针上标记的荧光基团。
在其中一个实施例中，所述甲型流感病毒的检测探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述乙型流感病毒Yamagata型的检测探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述乙型流感病毒Victoria型的检测探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有淬灭基团BHQ2；所述内标阳性质控的检测探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有淬灭基团BHQ2。
一种流感病毒分型检测用的试剂盒，含有上述任一实施例所述的流感病毒分型检测用的引物和探针。
在其中一个实施例中，所述流感病毒分型检测用的试剂盒还包括内标阳性质控的慢病毒颗粒，所述内标阳性质控的慢病毒颗粒包括蛋白质外壳及包裹在所述蛋白质外壳内的内标阳性质控RNA序列片段，所述内标阳性质控RNA序列片段对应的cDNA的序列如SEQ IDNO:13所示。
在其中一个实施例中，所述流感病毒分型检测用的试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照由经过灭活后的甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型和乙型流感病毒Victoria型三种标准毒株混合而成。
在其中一个实施例中，所述流感病毒分型检测用的试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、Mn(OAc)2试剂中的至少一种。
一种流感病毒分型试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
以提取的核酸样本作为模板，加入逆转录反应相关试剂和上述流感病毒分型检测用的引物和探针进行逆转录反应和实时荧光PCR扩增反应；
在实时荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号。
在其中一个实施例中，所述流感病毒分型试剂盒的使用方法还包括将上述内标阳性质控的慢病毒颗粒加入阴性对照中的步骤，后续对所述含有内标阳性质控的慢病毒颗粒的阴性对照与所述待测样本进行同步处理。
在其中一个实施例中，所述流感病毒分型试剂盒的使用方法还包括对上述阳性对照进行核酸提取、逆转录反应和实时荧光PCR扩增反应以及荧光信号的检测的步骤。
上述流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒和试剂盒的使用方法可以同时检测甲型流感病毒以及检测乙型流感病毒Yamagata型和Victoria型，通过使用实时荧光PCR扩增技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，可以快速、准确的得到检测结果。
进一步，上述流感病毒分型检测用的试剂盒和试剂盒的使用方法采用例如人的管家基因GAPDH的mRNA作为内标质控，通过有无管家基因GAPDH扩增信号，来判断采样、标本处理过程和PCR扩增体系是否正常，在对标本进行检测的同时能监控呼吸道标本的采集和标本中的核酸纯化处理过程，避免出现假阴性，增加了检测结果的可信度。对其构建蛋白质外壳包裹的内标阳性质控的慢病毒颗粒，阴性对照采用该慢病毒颗粒作为内标阳性质控，完全模拟正常人的咽拭子标本，真实反映核酸提取、逆转录和扩增过程中的情况。
另外，本发明中的试剂盒的使用方法可基于实时荧光逆转录PCR，把PCR、分子杂交和光化学融为一体，将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。
附图说明
图1为甲型流感阳性标本的检测结果图；
图2为乙型流感病毒Yamagata型阳性标本的检测结果图；
图3为乙型流感病毒Victoria型阳性标本的检测结果图；
图4为特异性检测结果图；
图5为甲型流感病毒灵敏度6.5TCID50/mL检测结果图；
图6为乙型流感病毒Yamagata型灵敏度3.0TCID50/mL检测结果图；
图7为乙型流感病毒Victoria型灵敏度3.0TCID50/mL检测结果图；
图8为干扰物质对检测甲型流感阳性标本的影响的检测结果图(含对照曲线)；
图9为干扰物质对检测乙型流感病毒Yamagata型阳性标本的影响的检测结果图(含对照曲线)；
图10为干扰物质对检测乙型流感病毒Victoria型阳性标本的影响的检测结果图(含对照曲线)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式的流感病毒分型检测用的引物和探针，包括甲型流感病毒扩增引物对及对应的检测探针、乙型流感病毒Yamagata型扩增引物对及对应的检测探针、以及乙型流感病毒Victoria型扩增引物对及对应的检测探针。其中，甲型流感病毒扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，或者序列是如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示和/或是SEQ ID NO:3所示序列的相似序列或互补序列。乙型流感病毒Yamagata型扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，或者序列是如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示和/或是SEQ ID NO:6所示序列的相似序列或互补序列。乙型流感病毒Victoria型扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，或者序列是如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:9所示和/或是SEQ ID NO:9所示序列的相似序列或互补序列。上述引物和探针可以是单链，也可以是双链，当是双链时，在使用时可以先使双链变性，如可以采用加热方法使其变性，得到单链后进行相应的反应。
各检测探针的两端分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且甲型流感病毒的检测探针、乙型流感病毒Yamagata型的检测探针与乙型流感病毒Victoria型的检测探针上标记的荧光基团各不相同。
上述流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒和试剂盒的使用方法可以同时检测甲型流感病毒以及检测乙型流感病毒Yamagata型和Victoria型，通过使用实时荧光PCR扩增技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，可以快速、准确的得到检测结果。
进一步，在一个实施例中，流感病毒分型检测用的引物和探针还包括内标阳性质控扩增引物对及对应的检测探针。内标阳性质控扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQID NO:10和SEQ ID NO:11所示，或者序列是如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:12所示和/或是SEQ ID NO:12所示序列的相似序列或互补序列，引物和探针可以是单链也可以是双链。内标阳性质控的检测探针的两端也分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且该荧光基因也不同于甲型流感病毒的检测探针、乙型流感病毒Yamagata型的检测探针与乙型流感病毒Victoria型的检测探针上标记的荧光基团。
该内标阳性质控扩增引物对及检测探针主要用于扩增人的GAPDH管家基因目的片段。后续检测过程中，可以直接以人的基因组DNA为模板以检测样本在实时荧光PCR过程中是否正常，以避免出现假阴性的结果。在以非人源性样本(如环境样本、禽畜样本)可以使用含有相应目的片段的mRNA为核心，采用蛋白质包括的形式构成慢病毒颗粒，再将该慢病毒颗粒加入待测样本中，与待测样本一起同步进行核酸提取、逆转录及实时荧光PCR扩增等步骤，以从采样、到样本处理、直至后续的逆转录、实时荧光PCR扩增等都进行同步检测，即可以在对标本进行检测的同时能监控标本的采集和标本中的核酸纯化处理过程，避免出现假阴性，以增加检测结果的可信度。
在一个具体地实施例中，甲型流感病毒的检测探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；乙型流感病毒Yamagata型的检测探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1；乙型流感病毒Victoria型的检测探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有淬灭基团BHQ2；内标阳性质控的检测探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有淬灭基团BHQ2。可理解，在其他实施例中，各检测探针两端标记的荧光基团或淬灭基团不限于上面，只要各检测探针的荧光基团不同，并且各检测探针的荧光基团与淬灭基团能够发生荧光能量共振转移即可。
本实施方式还提供了一种流感病毒分型检测用的试剂盒，其含有上述任一实施例的流感病毒分型检测用的引物和探针。
在一个实施例中，流感病毒分型检测用的试剂盒还包括内标阳性质控的慢病毒颗粒，内标阳性质控的慢病毒颗粒包括蛋白质外壳及包裹在蛋白质外壳内的内标阳性质控RNA序列片段，内标阳性质控RNA序列片段对应的cDNA的序列如SEQ ID NO:13所示。
具体地，该内标阳性质控的慢病毒颗粒可以采用但不限于下述方法构建得到：将只包含有HIV-1外壳骨架蛋白基因(删除了全部HIV-1的编码基因，没有任何HIV-1蛋白的表达)的序列以及如SEQ ID NO:13所示序列克隆到表达载体中，这一载体能够将外源的基质蛋白基因片段转录成RNA，并利用载体上HIV-1的外壳蛋白基因合成的外壳蛋白将其装配成球状RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体，制备内标阳性质控的慢病毒颗粒，其具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性。
通过采用人的管家基因GAPDH的mRNA作为内标质控，通过有无管家基因GAPDH扩增信号，来判断采样、标本处理过程和PCR扩增体系是否正常，在对标本进行检测的同时能监控呼吸道标本的采集和标本中的核酸纯化处理过程，避免出现假阴性，增加了检测结果的可信度。对其构建蛋白质外壳包裹的内标阳性质控的慢病毒颗粒，阴性对照采用该慢病毒颗粒作为内标阳性质控，完全模拟正常人的咽拭子标本，真实反映核酸提取、逆转录和扩增过程中的情况。
进一步，在一个可选地实施例中，流感病毒分型检测用的试剂盒还包括阳性对照，阳性对照由经过灭活后的甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型和乙型流感病毒Victoria型三种标准毒株混合而成。
更进一步，在一个可选地实施例中，流感病毒分型检测用的试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、Mn(OAc)2试剂中的至少一种。PCR扩增缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成，如在一个实施例中，5×PCR扩增缓冲液由0.25mol/L的N,N-二羟乙基甘氨酸/氢氧化钾(Bicine/KOH)、pH 8.2，575mmol/L的乙酸钾(Potassium acetate)和40％(v/v)甘油(glycerol)组成。DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶等。Mn(OAc)2试剂用于催化DNA聚合酶反应。
此外，本实施方式还提供了一种流感病毒分型试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：
提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
以提取的核酸样本作为模板，加入逆转录反应相关试剂和上述流感病毒分型检测用的引物和探针进行逆转录反应和实时荧光PCR扩增反应；
在实时荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号。
在其中一个实施例中，流感病毒分型试剂盒的使用方法还包括将上述内标阳性质控的慢病毒颗粒加入阴性对照中的步骤，后续对含有内标阳性质控的慢病毒颗粒的阴性对照与待测样本进行同步处理。
在其中一个实施例中，流感病毒分型试剂盒的使用方法还包括对上述阳性对照进行核酸提取、逆转录反应和实时荧光PCR扩增反应以及荧光信号的检测的步骤。
在一个可选的实施例中，单个PCR反应管中总体积为20～200μl，PCR扩增缓冲液中加入合适浓度的DNA聚合酶、dNTPs、金属阳离子等组份，其中引物和/或探针的使用浓度可以为0.05μM～5μM不等。如在一个实施例中，优选方案为：
组份 每一个反应中的体积/浓度
5×PCR扩增缓冲液 10μl
dNTPs(100mM) 1.5μl
Tth酶(5U/μl) 1.0μl
H-Taq酶(5U/μl) 1.0μl
Mn(OAc)2(150mM) 1.0μl
SEQ ID NO:1 0.5μM
SEQ ID NO:2 0.5μM
SEQ ID NO:3 0.25μM
SEQ ID NO:4 0.5μM
SEQ ID NO:5 0.5μM
SEQ ID NO:6 0.25μM
SEQ ID NO:7 0.5μM
SEQ ID NO:8 0.5μM
SEQ ID NO:9 0.25μM
SEQ ID NO:10 0.25μM
SEQ ID NO:11 0.25μM
SEQ ID NO:12 0.1μM
灭菌纯化水 加至总体积为40μl
PCR反应过程包括：1)加热变性，变性加热的条件取决于缓冲液盐离子浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成，范围为90℃～105℃，变性的时间取决于反应特征和核酸长度，一般进行30秒～4分钟；2)退火，使各引物退火至流感病毒或内标阳性质控核酸的靶序列上，退火的温度通常为35℃～65℃(如40℃～60℃)，退火的时间可以是10秒～1分钟(如30秒～40秒)；3)延伸，即足以由退火引物延伸产生与模板核酸互补的产物的温度，但在该温度下，延伸产物与互补模板不变性(延伸温度一般为40℃～80℃，延伸时间可以是约10秒～5分钟不等)。在一个实施例中，优选的方案如下：
上述试剂盒的使用方法基于实时荧光逆转录PCR，把PCR、分子杂交和光化学融为一体，将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。
以下为具体实施例部分。
一、样本采集及核酸样本提取
1、样本采集
本实施例检测样本来源可以是咽拭子。
此外，内标阳性质控组(阴性对照组)：慢病毒颗粒，包括蛋白质外壳及包裹在蛋白质外壳内的RNA序列片段，该RNA序列片段对应的cDNA的序列如SEQ ID NO:13所示。将内标阳性质控组与咽拭子标本分别同步进行后续处理。
阳性对照组：由经过灭活后的甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型和乙型流感病毒Victoria型三种标准毒株混合而成。阳性对照组咽拭子标本同步进行后续处理。
2、样本核酸提取
采用磁珠法进行样本核酸的提取，具体步骤如下：
1.1、取适量1.5mL灭菌离心管，分别标记阴性对照、阳性对照及待测样本，每管加入600μl DNA提取溶液1(SuperAll超级提取试剂盒，货号S1006，湖南圣湘生物科技有限公司)；
1.2、每管加入200μl待测样本或阴性对照，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，95℃加热10分钟，瞬时离心；
1.3、每管加入100μl DNA提取溶液2和50μl磁珠溶液(SuperAll超级提取试剂盒，货号S1006，湖南圣湘生物科技有限公司)，震荡混匀10秒钟，室温静置20分钟；
1.4、瞬时离心后将离心管置于分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出，注意不要碰到吸附于管壁的棕色物；
1.5、每管加入600μl DNA提取溶液3(SuperAll超级提取试剂盒，货号S1006，湖南圣湘生物科技有限公司)和200μl DNA提取溶液4(SuperAll超级提取试剂盒，货号S1006，湖南圣湘生物科技有限公司)，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
1.6、约3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃。
1.7加入30～50μl洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置10分钟后将离心管再次置于磁性分离器上3分钟，然后将洗脱下来的核酸放于新的1.5mL离心管中。
二、实时荧光PCR扩增
1.反应体系，见下表
组份 每一个反应中的体积/浓度
上述洗脱液 10μl
5×PCR扩增缓冲液 10μl
dNTPs(100mM) 1.5μl
Tth酶(5U/μl) 1.0μl
H-Taq酶(5U/μl) 1.0μl
Mn(OAc)2(150mM) 1.0μl
SEQ ID NO:1 0.5μM
SEQ ID NO:2 0.5μM
SEQ ID NO:3 0.25μM
SEQ ID NO:4 0.5μM
SEQ ID NO:5 0.5μM
SEQ ID NO:6 0.25μM
SEQ ID NO:7 0.5μM
SEQ ID NO:8 0.5μM
SEQ ID NO:9 0.25μM
SEQ ID NO:10 0.25μM
SEQ ID NO:11 0.25μM
SEQ ID NO:12 0.1μM
灭菌纯化水 加至总体积为50μl
其中，5×PCR扩增缓冲液由0.25mol/L的N,N-二羟乙基甘氨酸/氢氧化钾(Bicine/KOH)、pH 8.2，575mmol/L的乙酸钾(Potassium acetate)和40％(v/v)甘油(glycerol)组成。
2.反应条件，见下表
三、检测结果及分析
1.分析流程
1)目的检测信号为FAM、HEX、CY5和ROX。
2)Baseline的设置：Baseline一般设置为3～15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1～2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，一般取扩增斜率1/3～1/2处。
3)先分析阳性对照和阴性对照(内标阳性对照)，阳性对照须满足FAM、HEX、CY5通道均有明显S型扩增曲线，且检测Ct值≤40，ROX通道无扩增曲线(No Ct)或Ct值＞40；阴性对照的ROX通道须满足有检测到扩增曲线，且Ct≤40，其余FAM、HEX、CY5通道无扩增曲线(NoCt)或Ct值＞40；表示从核酸提取到逆转录和实时荧光PCR扩增过程无误，说明本次结果有效，可继续进行后续分析：
A)若FAM通道检测到扩增曲线，且Ct≤40，表示甲型流感病毒检测结果为阳性；
B)若HEX通道检测到扩增曲线，且Ct≤40，表示乙型流感病毒Yamagata型检测结果为阳性；
C)若CY5通道检测到扩增曲线，且Ct≤40，表示乙型流感病毒Victoria型检测结果为阳性。
4)若内标阳性对照的ROX通道没有检测到扩增曲线，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。
2.样本检测结果
通过在荧光定量PCR仪器(型号：ABI7500)上进行多重PCR检测，结果如图1～图3所示。研究共检测标本95例，其中甲型流感阳性检出43例，乙型流感病毒Yamagata型检出12例，乙型流感病毒Victoria型检出35例，阴性标本检测5例，无混合感染标本检出，整体结果与疾病预防控制中心鉴定结果一致。
3.特异性实验
如图4所示，结果表明，使用本实施例的试剂盒的使用方法对常见呼吸道病原体，如大肠杆菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、淋球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核杆菌、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、人副流感病毒、偏肺病毒以及百日咳杆菌等无交叉反应。
4.灵敏度实验
如图5、图6和图7所示，灵敏度研究表明，使用本实施例的方法对甲型流感病毒检出的检测灵敏度为6.5TCID50/mL，对乙型流感病毒Yamagata型检出的检测灵敏度为3.0TCID50/mL，对乙型流感病毒Victoria型检出的检测灵敏度为3.0TCID50/mL。
5.药物影响实验
如图8、图9和图10所示，在样本中分别加入一定比例的治疗药物，如常见抗感冒药物、糖皮质激素、抗生素等，通过使用本实施例的试剂盒的使用方法，检测结果无影响，并且对含有盐酸羟甲唑啉(100μg/mL)、地塞米松(50μg/mL)、盐酸头孢甲肟(50μg/mL)、薄荷醇(50μg/mL)、扎那米韦(100μg/mL)、利巴韦林(100μg/mL)、阿奇霉素(100μg/mL)的标本分别进行检测，结果也无影响。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖南圣湘生物科技有限公司
<120> 流感病毒分型检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctaaagacaa gaccaattct gtca 24
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtccccatt cccattta 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggatgcct tttgttgatt 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgctttccta taatgcacga cagaa 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaagatcct gaggttccaa g 21
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaatcttct cagaggatat gaaaagatca g 31
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgctttcct ataatgcacg aca 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcaagaccc tgaggttcca 20
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgcctaacc ttctccgagg atacgaaca 29
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caacggattt ggtcgtatt 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccagggctgc ttttaactct ggtaaagt 28
<210> 13
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggagtcaac ggatttggtc gtattgggcg cctggtcacc agggctgctt ttaactctgg 60
taaagtggat attgttgcca tcaatgaccc cttcattgac ctcaactaca tggtttacat 120
gttccaatat gattccaccc atggcaaatt ccatggcacc gtcaaggctg agaacgggaa 180
gcttgtcatc aatggaaatc ccatcaccat cttccaggag 220

Claims (10)

1.一种流感病毒分型检测用的引物和探针，其特征在于，包括甲型流感病毒扩增引物对及对应的检测探针、乙型流感病毒Yamagata型扩增引物对及对应的检测探针、以及乙型流感病毒Victoria型扩增引物对及对应的检测探针；其中，所述甲型流感病毒扩增引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，和/或是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示和/或是SEQ ID NO:3所示序列的相似序列或互补序列；所述乙型流感病毒Yamagata型扩增引物对的序列如SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示，和/或是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示和/或是SEQ ID NO:6所示序列的相似序列或互补序列；所述乙型流感病毒Victoria型扩增引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示，和/或是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:9所示和/或是SEQ ID NO:9所示序列的相似序列或互补序列；各所述检测探针的两端分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且所述甲型流感病毒的检测探针、所述乙型流感病毒Yamagata型的检测探针与所述乙型流感病毒Victoria型的检测探针上标记的荧光基团各不相同。
2.如权利要求1所述的流感病毒分型检测用的引物和探针，其特征在于，还包括内标阳性质控扩增引物对及对应的检测探针，所述内标阳性质控扩增引物对的序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，和/或是SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示序列的相似序列或互补序列，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:12所示和/或是SEQ ID NO:12所示序列的相似序列或互补序列，内标阳性质控的检测探针的两端也分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且该荧光基因也不同于所述甲型流感病毒的检测探针、所述乙型流感病毒Yamagata型的检测探针与所述乙型流感病毒Victoria型的检测探针上标记的荧光基团。
3.如权利要求2所述的流感病毒分型检测用的引物和探针，其特征在于，所述甲型流感病毒的检测探针的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述乙型流感病毒Yamagata型的检测探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述乙型流感病毒Victoria型的检测探针的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有淬灭基团BHQ2；所述内标阳性质控的检测探针的5’端标记有荧光基团ROX，3’端标记有淬灭基团BHQ2。
4.一种流感病毒分型检测用的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1～3中任一项所述的流感病毒分型检测用的引物和探针。
5.如权利要求4所述的流感病毒分型检测用的试剂盒，其特征在于，还包括内标阳性质控的慢病毒颗粒，所述内标阳性质控的慢病毒颗粒包括蛋白质外壳及包裹在所述蛋白质外壳内的内标阳性质控RNA序列片段，所述内标阳性质控RNA序列片段对应的cDNA的序列如SEQ ID NO:13所示。
6.如权利要求5所述的流感病毒分型检测用的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照由经过灭活后的甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型和乙型流感病毒Victoria型三种标准毒株混合而成。
7.如权利要求4～6中任一项所述的流感病毒分型检测用的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、Mn(OAc)2试剂中的至少一种。
8.一种流感病毒分型试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
以提取的核酸样本作为模板，加入逆转录反应相关试剂和权利要求4中所述的流感病毒分型检测用的引物和探针进行逆转录反应和实时荧光PCR扩增反应；
在实时荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号。
9.如权利要求8所述的流感病毒分型试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括将权利要求5所述的内标阳性质控的慢病毒颗粒加入阴性对照中的步骤，后续对所述含有内标阳性质控的慢病毒颗粒的阴性对照与所述待测样本进行同步处理。
10.如权利要求8或9所述的流感病毒分型试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括对权利要求6所述的阳性对照进行核酸提取、逆转录反应和实时荧光PCR扩增反应以及荧光信号的检测的步骤。
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