CN110499391A

CN110499391A - 用于呼吸道病毒检测的rpa引物、探针组及试剂盒

Info

Publication number: CN110499391A
Application number: CN201910769954.1A
Authority: CN
Inventors: 宋宏彬; 郝荣章; 郭旭东; 戚红卷; 赵荣涛; 张玉玺; 杨益; 张亚萍; 吴枫
Original assignee: Chinese People's Liberation Army Center For Disease Control And Prevention
Current assignee: Chinese People's Liberation Army Center For Disease Control And Prevention
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2019-11-26

Abstract

本发明提供了用于呼吸道病毒检测的RPA引物、探针组以及试剂盒，属于病毒检测技术领域，所述呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒‑7；检测所述呼吸道合胞病毒A型的上游引物序列、下游引物序列和荧光探针的序列如SEQ ID No.1～3所示；检测所述冠状病毒NL63的上游引物序列、下游引物序列和荧光探针的序列如SEQ ID No.4～6所示；检测所述腺病毒‑7的上游引物序列、下游引物序列和荧光探针的序列如SEQ ID No.7～9所示。本发明所述引物、探针组具有特异性好、灵敏度高的优点，能够用于现场快速检测呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63、腺病毒7型。

Description

用于呼吸道病毒检测的RPA引物、探针组及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及用于呼吸道病毒检测的 RPA引物、探针组及试剂盒。

背景技术

呼吸道感染是人类致病和死亡的最主要原因之一。引起呼吸道感染的病原体种类很多，95％的急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由细菌以外的病原引起，其中呼吸道病毒最常见，包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒等。由于呼吸道感染的临床症状和体征很相似，而不同种类病原体引起的感染治疗方法则截然不同。因此，快速、灵敏地检测和鉴别病原微生物有助于临床进行诊断和治疗，并且有助于减少抗生素的滥用。

检测呼吸道病毒的方法有很多，目前诊断的金标准是病毒分离培养法，但是一般需1-2周的时间，不利于疾病的早期诊断和治疗，且部分病毒的分离阳性率很低，并且需要生物安全柜、培养箱等许多实验设备和大量的实验耗材、需要专业人员的操作、时效性差、一些病毒无法或很难在体外培养生长，随着病原体谱的不断扩大，这些问题更加突出，因此，病原体分离培养方法在病原体现场检测的推广应用方面存在很大的障碍。

ELISA通过抗原抗体杂交原理产生可检测的信号，已被广泛应用于医学、病理学、生物技术等领域。ELISA对于常规病原体检测具有许多优势，比如成本效低、稳定、易于操作等。但是在病原体检测方面仍存在一定的缺陷，比如ELISA方法需要获得用于与病原体抗原特异性结合的高质量的抗体，这种抗体的纯化和获取是一个漫长、昂贵的过程，用于病原体检测的抗原很容易发生改变，比如流毒病毒表面的糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；并且ELISA的检测灵敏度相对较低。这些特点使ELISA方法在疫情爆发、生物恐怖袭击等形势中的病原检测方面存在障碍。

随着分子生物学技术的发展，核酸扩增检测技术逐渐发展成熟，如荧光定量PCR，高灵敏和高特异的性能可以检测现有报道的所有引起呼吸道感染的病毒，在收集样本后几小时内得到结果，是现在最具吸引力的检测方法，但是荧光定量PCR需要繁琐的温度循环过程，能耗大，不能做现场快速检测。

RPA(重组酶聚合酶扩增)技术，对硬件设备的要求很低，不需要模板的热变性。因此RPA技术应用于现场检测方面具有很大的优势。RPA体系中含有大肠杆菌重组酶和单链结合蛋白(SSB)两种关键蛋白，可替代PCR中的热变性步骤，一般可在10min之内获得可检出水平的扩增产物。并且RPA能耗低，最佳反应温度在37℃左右。

但是由于RPA引物的设计和筛选目前没有很好的软件分析，筛选出特异性好，灵敏度高的RPA引物相对比较困难，限制了RPA技术的实际推广应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供用于呼吸道病毒检测的RPA 引物、探针组及试剂盒，所述引物组和探针组具有特异性好、灵敏度高的优点，能够用于现场快速检测呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒 NL63、腺病毒7型。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了用于呼吸道病毒检测的RPA引物、探针组，所述呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7；

检测所述呼吸道合胞病毒A型的上游引物的序列如SEQ ID No. 1所示，检测所述呼吸道合胞病毒A型的下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，检测所述呼吸道合胞病毒A型的荧光探针的序列如SE Q ID No.3所示；

检测所述冠状病毒NL63的上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，检测所述冠状病毒NL63的下游引物的序列如SEQ ID No.5所示，检测所述冠状病毒NL63的荧光探针的序列如SEQ ID No.6所示；

检测所述腺病毒-7的上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，检测所述腺病毒-7的下游引物的序列如SEQ ID No.8所示，检测所述腺病毒-7的荧光探针的序列如SEQ ID No.9所示。

优选的，检测所述呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的荧光探针的3’端分别修饰C3-Spacer。

优选的，检测所述呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的荧光探针上分别设计修饰碱基的dT-荧光基团和dT-淬灭剂基团；检测所述呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的荧光探针上设计四氢呋喃残基以及四氢呋喃残基。

优选的，所述四氢呋喃残基位于dT-荧光基团修饰的碱基和dT- 淬灭剂基团修饰的碱基之间。

优选的，所述荧光基团为FAM基团，所述淬灭基团为BHQ1。

本发明提供了一种用于呼吸道病毒检测的试剂盒，包括所述的引物、探针组和检测试剂。

优选的，所述检测试剂包括RPA缓冲液、dNTP、重组酶、聚合酶、醋酸镁和水。

优选的，所述上游引物、下游引物和荧光探针的使用浓度独立为 8～12μmol/L。

优选的，所述醋酸镁的使用浓度为270～290mmol/L。

本发明的有益效果：本发明提供的引物、探针组，通过选择呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7特定的保守区域，根据本发明设定的引物、探针设计方法设计获得的引物，特异性好，灵敏度高；根据实施例的记载，对于合胞病毒A型(RSVA)检测灵敏度为6copies/μL、冠状病毒NL63的检测灵敏度为6copies/μL、腺病毒 -7(ADV)的检测灵敏度比荧光定量PCR方法高100倍。本发明提供的引物、探针组与五种其他病毒相互交叉检测无干扰信号产生，表现出良好的特异性。

附图说明

图1为本发明所述引物、探针组对呼吸道合胞病毒A型(RSVA) 检测的灵敏度和特异性结果，其中a为灵敏度检测结果，b为特异性检测结果；

图2为本发明所述引物、探针组对冠状病毒NL63检测的灵敏度和特异性结果；其中a为灵敏度检测结果，b为特异性检测结果；

图3为本发明所述引物、探针组对腺病毒-7检测的灵敏度和特异性结果；其中，其中a为RPA方法的灵敏度检测，b为特异性检测， c为荧光定量PCR方法对腺病毒-7的灵敏度结果。

具体实施方式

本发明提供了用于呼吸道病毒检测的RPA引物、探针组，所述呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7；检测所述呼吸道合胞病毒A型的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，检测所述呼吸道合胞病毒A型的下游引物的序列如SEQ ID No. 2所示，检测所述呼吸道合胞病毒A型的荧光探针的序列如SEQ ID No.3所示；检测所述冠状病毒NL63的上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，检测所述冠状病毒NL63的下游引物的序列如SEQ ID No.5所示，检测所述冠状病毒NL63的荧光探针的序列如SEQ ID No.6所示；检测所述腺病毒-7的上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，检测所述腺病毒-7的下游引物的序列如SEQ ID No.8所示，检测所述腺病毒-7的荧光探针的序列如SEQ ID No.9所示。

在本发明中，检测所述呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的引物优选的通过以下方法设计获得：1) 用软件分别比对数据库中呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的DNA序列，确定保守区域；2)根据保守区域设计获得引物序列。

在本发明中，所述数据库包括但不限于NCBI数据库，本发明中，比对的每一种病毒编码同一个蛋白的DNA序列优选的≥40种；所述比对的DNA序列优选的来源于近5年的，不同地区的测序数据。在本发明中，所述比对用的软件优选为DNAman，在本发明具体实施过程中，所述确定的保守区域的序列优选的如下：所述呼吸道合胞病毒 A型的保守区域序列如SEQ ID No.10所示，所述冠状病毒NL63的保守区域序列如SEQ ID No.11所示；所述腺病毒-7的保守区域序列如SEQ ID No.12所示。

本发明在获得确切的保守区域序列后，根据所述保守区域序列设计引物。在本发明中，所述引物的设计规则优选的如下：(1)从保守区域序列的单链上选择连续的32～35个碱基作为上、下游引物；(2) 分别与上游引物和下游引物互补的序列在保守区域之间的间隔长度在200～400bp之间；(3)所述上游引物和下游引物的5’端的dNTP不为鸟嘌呤；(4)所述上游引物和下游引物的GC含量在30％～70％之间；(5)所述上游引物与下游引物之间不存在三个以上连续互补配对的碱基；(6)上游引物和下游引物之间不形成发卡结构或其他二级结构(使用OLIGO软件进行分析)。使用本发明所述的方法设计获得的引物灵敏度更高。

在本发明中，检测所述呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的荧光探针优选的通过以下方法设计获得：(1)选择长度为48bp的与上述3种病毒链互补的DNA链，在核酸链之中设计一个四氢呋喃残基；(2)在所述四氢呋喃残基两侧间隔一个或两个碱基修饰上dT-荧光基团和dT-淬灭剂基团，所述荧光基团优选为FAM，所述淬灭基团优选为BHQ1；(3)所述四氢呋喃残基的3’端碱基长度大于30个碱基，5’端碱基长度大于15个碱基； (4)所述荧光探针的3’端修饰C3-Spacer。使用本发明所述的方法设计获得的探针特异性更强。

本发明提供了一种用于呼吸道病毒检测的试剂盒，包括所述的引物、探针组和检测试剂。在本发明中，所述检测试剂优选的包括RP A缓冲液、dNTP、重组酶、聚合酶、醋酸镁和水。在本发明中，所述上游引物、下游引物和荧光探针的使用浓度独立优选为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L；所述醋酸镁的使用浓度优选为270～290mmo l/L，更优选为280mmol/L。在本发明中，所述RPA缓冲液、dNTP、重组酶、聚合酶优选的来源于Twist公司的RPA-exo试剂盒。

在本发明中，利用所述试剂盒进行呼吸道病毒检测的方法，包括以下步骤：S1)将RPA缓冲液、dNTP、重组酶、聚合酶、上游引物、下游引物、模板、水和醋酸镁混合，震荡并短暂离心；S2)将离心后的溶液体系置于恒温荧光检测仪中，39℃，预热3min后，再次震荡并短暂离心；S3)将所述再次离心后的溶液体系置于恒温荧光检测仪中，39℃反应20min；S4)记录荧光数据并分析结果。在本发明中，步骤S2)中预热是为了实现最佳扩增和荧光信号生成，低拷贝的扩增可能导致局部试剂耗尽，在预热3min后再次震荡离心使更多靶标均匀分散在体系中，达到更好的扩增效果。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

用于呼吸道病毒检测的RPA引物、探针组的制备

1.保守序列的比对、构建克隆载体

(1)从NCBI基因库中下载3种病毒的编码同一蛋白的cDNA 或DNA序列(每个病毒至少下载40个近5年、不同地区的测序序列)；

(2)用DNAman软件进行序列比对，找出相对保守的序列并进行引物和探针的设计及优化。

确定的保守序列如下：

2.引物、探针的设计

RPA引物设计方法：

(1)从比对的病毒保守序列单链选择32-35个碱基作为上、下游引物。

(2)控制两个引物之间的碱基长度在200-400bp之间。

(3)5’端的dNTP避免鸟嘌呤。

(4)控制GC含量在30％到70％之间。

(5)引物与引物之间不超过三个以上连续互补配对碱基。

(6)使用OLIGO软件进行分析，分析上游引物和下游引物，避免上游引物和下游引物形成发卡结构或其他二级结构；

探针的设计方法：

(1)选择长度为48bp的与病毒链互补的DNA链，在核酸链之中设计一个四氢呋喃残基。

(2)在四氢呋喃两侧间隔一个碱基修饰上dT-荧光团和dT-淬灭剂基团，荧光基团用-FAM，淬灭基团用-BHQ1。

(3)探针的3’端修饰C3-Spacer。

(4)四氢呋喃残基3’端大于30个碱基，5’端大于15个碱基。

获得的引物和探针序列如下：

呼吸道合胞病毒A型：

上游引物：tcactgaagaattttatcaatcaacatgcag(SEQ ID No.1)；

下游引物：attaattttaccttagcgtctgtaccattac(SEQ ID No.2)；

荧光探针：aaggctatcttagtgctctaagaactgg[FAM-dT]t[THF]g[BHQ-d T]atactagtgttat[C3-spacer](SEQ ID No.3)。

冠状病毒NL63：

上游引物：ttcagatcttgttgctgctgttactttggct(SEQ ID No.4)；

下游引物：acgaggaccaaagcactgaataacattttcc(SEQ ID No.5)

荧光探针：cttctggtacttccactcctaagaaacctaa[FAM-dT]aa[THF]cc[BH Q-dT]ctttctcaaccc[C3-spacer](SEQ ID No.6)。

腺病毒-7：

上游引物：cttccacgaagggagacaatattactaagg(SEQ ID No.7)

下游引物：ccatcaatatcagtccatgattcttctcca(SEQ ID No.8)；

荧光探针：aaagacattactgcagacaacaagccca[FAM-DT]t[THF]a[BHQ- DT]gccgataaaacat[C3-spacer](SEQ ID No.9)。

实施例2

用于呼吸道病毒检测的试剂盒的组成

包括实施例1中的引物、探针组和检测试剂。

检测试剂优选的包括RPA缓冲液、dNTP、重组酶、聚合酶、醋酸镁和水，其中RPA缓冲液、dNTP、重组酶、聚合酶来源于Twist 公司的RPA-exo试剂盒。

所述试剂盒的使用方法：

(1)用RPA缓冲液溶解含有dNTP、重组酶、聚合酶干粉的冻干管。

(2)加入RPA扩增的上游引物、下游引物、模板和水，每份样本总体积为47.5μL。加样试剂和体积如表1所示。

(3)加入2.5μL醋酸镁溶液后扩增启动，震荡并短暂离心。

(4)将离心后的溶液体系加入恒温荧光检测仪(GEN3-02-P1) 中，设置温度为39℃，预热3min后再次震荡离心后，置于恒温荧光检测仪(GEN3-02-P1)中39℃反应20min。

(5)记录荧光数据并分析结果。

表1本实施例RPA反应的体系

3.引物、探针的灵敏度特异性的验证

制备质粒，将呼吸道合胞病毒A型(RSVA)和冠状病毒NL63 的保守区域序列分别合成到市售的PUC57克隆质粒中获得质粒模板；

腺病毒-7(ADV)病毒模板来自细胞培养的实际样本经核酸提取获得。

灵敏度验证

(1)把质粒按照：10^-2ng/μL、10^-3ng/μL、10^-4ng/μL、10^-5ng/μL、 10^-6ng/μL、10^-7ng/μL进行梯度稀释。

(2)按照RPA扩增步骤进行反应，加样试剂和体积如表1所示，加入上述不同模板浓度质粒，震荡离心。

(3)预热3min后短暂震荡离心，将离心后的溶液体系加入GE N3-02-P1仪器中，设置温度为39℃，反应时长为20min。

特异性验证

(1)配置浓度均为10^-4ng/μL的不同模板溶液。

(2)按照RPA扩增步骤进行反应，加样试剂和体积如表1所示，加入上述不同模板类型质粒，震荡离心。

(3)将离心后的溶液体系加入GEN3-02-P1仪器中，设置温度为39℃，反应时长为20min。

(4)记录荧光数据并分析结果。

检测结果如图1～3所示；图1为呼吸道合胞病毒A型(RSVA) 的灵敏度和特异性检测结果，其中a灵敏度检测，b为特异性检测；灵敏度检测结果如a所示：用7个浓度梯度的RSVA靶标进行灵敏度验证，随着RSVA浓度的降低，荧光信号在同一时间点(如15min 时刻)不断减弱，可得到其检测下限为10^-6ng/μL(6copies/μl)。特异性检测结果如b所示，只有RSVA出现了阳性的荧光曲线，其他靶标均不出现阳性荧光信号。此结果表明该引物和探针能够达到良好的特异性。

图2为冠状病毒NL63灵敏度和特异性检测结果，其中a灵敏度检测，b为特异性检测。如a所示，用不同浓度梯度的NL63靶标进行灵敏度检测，随着NL63浓度的降低，荧光信号在15min时刻不断减弱，得到其检测下限为10^-6ng/μL(6copies/μl)。5种病毒交叉验证其检测的特异性，如b所示，只有NL63靶标出现了阳性的荧光曲线，此结果表明该引物和探针能够达到良好的检测特异性。

图3为腺病毒7型(ADV-7)灵敏度和特异性检测结果以及荧光定量PCR方法对腺病毒-7型的灵敏度检测，其中a为RPA方法的灵敏度检测，b为特异性检测，c为荧光定量PCR方法对腺病毒-7型的灵敏度检测。ADV病毒模板来自细胞培养的实际样本经核酸提取获得。用不同稀释倍数的ADV靶标进行灵敏度检测如a所示，从图中可以看到，随着靶标浓度的降低，荧光信号在15min时刻不断减弱，模板稀释10⁶倍仍然能获得扩增的荧光信号。特异性如b所示，只有 ADV靶标出现了阳性的荧光曲线，此结果表明该引物和探针能够达到良好的检测特异性。

由上述实验可知，本发明提供的引物、探针组对于合胞病毒A 型(RSVA)检测灵敏度为：6copies/μL、冠状病毒NL63的检测灵敏度为6copies/μL。本发明提供的引物、探针组对于其他五种病毒相互交叉检测无干扰信号产生，表现出良好的特异性。

实施例3

本发明提供的引物、探针组和试剂盒对于呼吸道病毒的检测结果与荧光定量PCR方法检测结果的比较。

以腺病毒ADV为例，同一样本分别荧光定量PCR和本发明提供的试剂盒方法检测，进行结果比较。

荧光定量PCR检测腺病毒ADV：

荧光定量PCR检测的上游引物：gaggagccagatattgatatggaatt(SE Q ID No.13)；

下游引物：aattgacattttccgtgtaaagca(SEQ ID No.14)；

荧光探针：FAM-aagctgctgacgctttttcgcctga-BHQ1(SEQ ID No.15) 进行检测。

本发明提供的试剂盒检测腺病毒ADV方法步骤参见实施例2。

结果可以看出，通过循环数的不断增加，荧光定量PCR的检测灵敏度能够到达ADV稀释10³倍，且至少需要35个循环数，大约1. 5h；而RPA检测方法能够在20min内检测到模板稀释10⁶倍。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心

<120> 用于呼吸道病毒检测的RPA引物、探针组及试剂盒

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcactgaaga attttatcaa tcaacatgca g 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attaatttta ccttagcgtc tgtaccatta c 31

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n(20)=THF;

<400> 2

aaggctatct tagtgctcta agaactggtn gatactagtg ttat 44

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcagatctt gttgctgctg ttactttggc t 31

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgaggacca aagcactgaa taacattttc c 31

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n(33)=THF;

<400> 6

cttctggtac ttccactcct aagaaaccta aanacccttt ctcaaccc 48

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttccacgaa gggagacaat attactaagg 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatcaatat cagtccatga ttcttctcca 30

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n（30）=THF；

<400> 7

aaagacatta ctgcagacaa caagcccatn agccgataaa acat 44

<210> 10

<211> 468

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

attaccacaa tccttgctgc agtcacactc tgtttcgctt ccagtcaaaa catcactgaa 60

gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt agcaaaggct atcttagtgc tctaagaact 120

ggttggtata ctagtgttat aactatagaa ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat 180

ggtacagacg ctaaggtaaa attaataaaa caagaattag ataaatataa aaatgctgta 240

acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca ccagcagcca acagtcgagc cagaagagaa 300

ctaccaagat ttatgaatta tacactcaac aataccaaaa acaccaatgt aacattaagt 360

aaaaaaagaa aaagaagatt tcttggattt ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt 420

ggcattgccg tatccaaggt cctgcaccta gaaggggaag tgaacaaa 468

<210> 11

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagtttgagg atcgctctaa taactcatct cgtgctagca gtcgttcttc aactcgtaac 60

aactcacgag actcttctcg tagcacttca agacaacagt ctcgcactcg ttctgattct 120

aaccagtctt cttcagatct tgttgctgct gttactttgg ctttaaagaa cttaggtttt 180

gataaccagt cgaagtcacc tagttcttct ggtacttcca ctcctaagaa acctaataag 240

cctctttctc aacccagggc tgataagcct tctcagttga agaaacctcg ttggaagcgt 300

gttcctacca gagaggaaaa tgttattcag tgctttggtc ctcgtgattt taatcacaat 360

atgggggatt ca 372

<210> 12

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagtggatag ttacaacggg agaagacaat gccaccacat acacatttgg cattgcttcc 60

acgaagggag acaatattac taaggaaggt ttagaaattg ggaaagacat tactgcagac 120

aacaagccca tttatgccga taaaacatat cagccagagc ctcaagttgg agaagaatca 180

tggactgata ttgatggaac aaatgaaaaa tttggaggta gagctcttaa accagctact 240

aaaatgaagc 250

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaggagccag atattgatat ggaatt 26

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aattgacatt ttccgtgtaa agca 24

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagctgctga cgctttttcg cctga 25

Claims

1.用于呼吸道病毒检测的RPA引物、探针组，其特征在于，所述呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7；

检测所述呼吸道合胞病毒A型的上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，检测所述呼吸道合胞病毒A型的下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，检测所述呼吸道合胞病毒A型的荧光探针的序列如SEQ ID No.3所示；

2.根据权利要求1所述的引物、探针组，其特征在于，检测所述呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的荧光探针的3’端分别修饰C3-Spacer。

3.根据权利要求1或2所述的引物、探针组，其特征在于，检测所述呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的荧光探针上分别设计修饰碱基的dT-荧光基团和dT-淬灭剂基团；检测所述呼吸道合胞病毒A型、冠状病毒NL63和腺病毒-7的荧光探针上设计四氢呋喃残基。

4.根据权利要求3所述的引物、探针组，其特征在于，所述四氢呋喃残基位于dT-荧光基团修饰的碱基和dT-淬灭剂基团修饰的碱基之间。

5.根据权利要求4所述的引物、探针组，其特征在于，所述荧光基团为FAM基团，所述淬灭基团为BHQ1。

6.一种用于呼吸道病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述的引物、探针组和检测试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括RPA缓冲液、dNTP、重组酶、聚合酶、醋酸镁和水。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物和荧光探针的使用浓度独立为8～12μmol/L。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述醋酸镁的使用浓度为270～290mmol/L。