CN108300803A - 一种呼吸道感染病原检测用引物组、快速诊断试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种呼吸道感染病原检测用引物组、快速诊断试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种呼吸道感染病原检测用引物组、快速诊断试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域。所述引物组可以一次检测包括A型流行性感冒病毒、B型流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、副流行性感冒病毒1、2、3型、腺病毒、肺炎支原体、嗜肺军团杆菌、肺炎衣原体及鼻病毒在内的9种呼吸道感染病原。本发明采用固相重组酶聚合酶恒温基因扩增法检测呼吸道多重感染病原。采用本发明的引物组检测呼吸道感染病原特异性强、扩增效率高，可有效、快速地对所述9种病原同时进行检测，实现了多重化检测。

Description

一种呼吸道感染病原检测用引物组、快速诊断试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种呼吸道感染病原检测用引物组、快速诊断试剂盒及检测方法。
背景技术
急性呼吸道感染常见的疾病有急性上呼吸道感染、急性气管—支气管炎、支气管肺炎、支气管扩张等，感染人群以儿童多见，是世界范围内低龄儿童(<5岁)死亡的首位原因，每年可造成约5百万儿童死亡。世界卫生组织不久前发布的统计结果显示，世界十大死因中呼吸道感染，以5.9％的发病率，仅次于冠心病和中风，位居第三位，位列第四位的慢性阻塞性肺病(5.4％)的死亡也多与感染有关。引起呼吸道感染的病原体种类繁多，主要包括A型流行性感冒病毒(Influenza A virus,FluA)、B型流行性感冒病毒(Influenza Bvirus,FluB)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)、副流行性感冒病毒1、2、3型(Parainfluenza Virus type I,II,III,PIV)、腺病毒(Adenovirus,AD)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumonia,LP)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP)及鼻病毒(Human Rhinovirus,HRV)等。一种病原体可引起多种临床表现，同一临床表现又可由多种病原体引起。临床中往往很难针对病原体进行治疗，容易造成某些患者长期发热、甚至病情加重以及滥用抗生素。对于儿童患者，在发病初期如果不能立即确诊，往往导致病情突然恶化。因此呼吸道感染的病原体快速检测，对临床及时诊断和疫情报告均有重要意义。
目前检测呼吸道急性感染常用的方法有：病原体的分离培养及组织细胞培养法、血清学、直接检测法(包括电镜法)、间接和直接免疫荧光抗体法(IFA/DFA)、酶免疫测定(EIA)、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标(AP-PAAP)法、荧光定量PCR法等。其中，九项呼吸道感染病原体IgM抗体免疫学检测试剂(间接免疫荧光法)以及荧光定量PCR法为目前较为常用的两种方法。呼吸道感染病原体IgM抗体免疫学检测法具有直观、技术成熟的优点，但费时、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高限制了其在临床上的参考价值。随着现代分子生物学的发展,出现了很多快速特异的方法，如针对核酸的荧光定量PCR技术，具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点。但荧光定量PCR技术动辄30-40万的昂贵仪器以及要求有严格的实验室环境和训练有素的操作人员，都及大地限制了该技术在大型医疗机构之外场所的开展。
基于重组酶-多聚酶的核酸检测技术(Recombinase-polymerase amplification,RPA)模拟了细胞内核酸合成机制，在恒定温度范围内，藉由重组酶、多聚酶及单链结合蛋白使DNA双链解旋，并促使特异性DNA片段扩增，以达到核酸体外扩增的效果。整个过程迅速(10-20分钟)且于低恒温(37-42℃)进行。
然而在多重检测，特别是中通量检测领域，恒温核酸扩增技术包括RPA技术一直发展缓慢。受制于标记用荧光染料的光谱特性和荧光检测通道数量，国内外目前的RPA技术在多重呼吸道感染病原检测方面还无成熟技术。
因此，需要一种能够快速、简易、无须贵重仪器、可同时进行呼吸道感染病原多核酸目标的检测试剂盒及检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种基于固相恒温基因扩增技术的呼吸道感染病原检测用引物组。
本发明的另一目的在于提供一种呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒，可快速、高效、特异性检测呼吸道感染病原。
本发明的另一目的在于提供上述诊断试剂盒的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种呼吸道感染病原检测用引物组，所述引物组包括由如SEQ ID NO:1和SED IDNO:2所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:3和SED ID NO:4所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:5和SED ID NO:6所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:7和SED ID NO:8所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:8和SED ID NO:10所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:11和SED ID NO:12所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:13和SED ID NO:14所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:15和SED IDNO:16所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:17和SED ID NO:18所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:19和SED ID NO:20所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ IDNO:21和SED ID NO:22所示的DNA序列组成的引物对、以及由如SEQ ID NO:23和SED ID NO:24所示的DNA序列组成的引物对；所述呼吸道感染病原包括A型流行性感冒病毒、B型流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、副流行性感冒病毒1、2、3型、腺病毒、肺炎支原体、嗜肺军团杆菌、肺炎衣原体及鼻病毒。
作为本发明所述的呼吸道感染病原检测用引物组的优选实施方式，所述引物对的反向引物的5’端修饰有60个T碱基，正向引物的5’端修饰有生物素。
本发明提供的引物组在适宜的引物浓度条件下，可以互不影响的在一次扩增中同时检测多重呼吸道感染病原，所述呼吸道感染病原包括A型流行性感冒病毒、B型流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、副流行性感冒病毒1、2、3型、腺病毒、肺炎支原体、嗜肺军团杆菌、肺炎衣原体及鼻病毒。
本发明的引物是发明人参考NCBI基因数据库的病原基因序列，及TwistDxinstruction manual和Primer-BLAST引物设计原则，设计和合成了多条引物。在设计过程中，不仅考虑到了要避免引物二聚体、发卡结构的形成，还考虑到了不同目标基因在一个反应体系中共扩增地问题。引物筛选实验表明，本发明的引物特异性强、扩增效率高，可有效、快速地检测多重呼吸道感染病原。
本发明还提供了一种呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
作为本发明所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括阳性内质控、具有固化引物的96微孔盘、重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白、反转录酶、ddH2O和缓冲溶液。
作为本发明所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒的优选实施方式，所述阳性内质控含有由如SEQ ID NO:23和SED ID NO:24所示的DNA序列组成的引物对。
作为本发明所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒的优选实施方式，所述具有固化引物的96微孔盘为将反向引物溶于固化液中，以自动点片机点置于96微孔盘中。
所述具有固化引物的96微孔盘为反向引物溶于固化液中，以自动点片机点置于96微孔盘中于室温放置过夜。隔天采用UV进行胶连，再以封闭液在室温下反应1小时，以清洗液清洗三次后晾干；所述固化液为:2.5％BSA和中性红染色剂；所述清洗液为TBST:100mMTris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl,and 1mL/L Tween 20；所述封闭液为2.5wt％BSA。
作为本发明所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒的优选实施方式，所述重组酶为T4uvsX/uvsY,所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4gp32,所述反转录酶为Transcriptor；所述缓冲溶液含有下述组分:Tris-HCl缓冲液、乙酸钾、乙酸镁、二硫苏糖醇、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、Carbowax20M。
作为本发明所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒的优选实施方式，所述缓冲溶液含有下述浓度的组分:Tris-HCl缓冲液50mM、乙酸钾100mM、乙酸镁14mM、二硫苏糖醇2mM、dNTPs 200μM、ATP 3mM、磷酸肌酸50mM、肌酸激酶100ng/μL、Carbowax20M 5wt％；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.9。
本发明还提供了一种采用上述快速诊断试剂盒检测呼吸道感染病原的方法，所述方法为固项重组酶聚合酶扩增法，其包括以下步骤:
(1)提取呼吸道感染病原的核酸；
(2)将反向引物固化于96微孔盘中；
(3)配置反应体系；
(4)震荡混匀步骤(3)制得的反应体系后，转移至具有固化反向引物的96微孔盘中，于37～42℃恒温反应，进行重组酶聚合酶扩增；
(5)在步骤(3)所得的重组酶聚合酶扩增产物中加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，40℃恒温反应5分钟；PBST清洗三次，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺呈色剂，室温反应1分钟；
(6)检测重组酶聚合酶扩增后的产物。
作为本发明所述的检测呼吸道感染病原的方法的优选实施方式，所述步骤(6)中，采用肉眼判读或读点机进行数据采集检测RPA扩增后的产物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明将RPA恒温基因技术与固相呈现技术相结合，省去荧光检测等复杂探测设备，甚至用肉眼即可观测并判读结果，适用于即时快速诊断，可推广至基层医疗单位。
(2)本发明实现了在同一反应空间同时获得9个目标基因检测结果，实现了多重化，在恒温检测技术领域为国内外首创。
(3)本发明运用的96微孔盘可以在同一反应平台大量样本的同时鉴定，降低了成本。
附图说明
图1为采用本发明所述试剂盒进行固项重组酶聚合酶扩增检测呼吸道感染病原的结果图。图中，M表示Marker,P表示:Positive Internal Control,N表示Negativecontrol,1表示A型流行性感冒病毒(Influenza A virus,FluA),2表示:B型流行性感冒病毒(Influenza B virus,FluB),3表示呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV),4表示副流行性感冒病毒1型(Parainfluenza Virus type I,PIV),5表示副流行性感冒病毒2型(Parainfluenza Virus type II，PIV),6表示副流行性感冒病毒3型(Parainfluenza Virus type III,PIV),7表示腺病毒(Adenovirus,AD),8表示肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)、9表示嗜肺军团杆菌(Legionella pneumonia,LP),10表示肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,CP),11表示鼻病毒(Human Rhinovirus,HRV)。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1:引物与试剂盒
1.引物设计:
根据NCBI基因数据库的呼吸道感染病原基因序列，参考TwistDx instructionmanual和Primer-BLAST引物设计原则，设计引物。引物长度约为30-35nt，由于目前没有针对RPA的引物设计软件，本发明前期工作过程中设计合成了大量引物，从中筛选出灵敏度高且特异性好的引物用于本发明(表1)。
2.引物合成:
按照表1所示的引物序列，进行序列合成。正向引物(forward primer)的5’端，修饰加入Biotin生物素；反向引物(reverse primer)的5’端，加入60个T碱基。
表1
3.试剂盒
本实施例所述用于多重呼吸道感染病原快速诊断的试剂盒(九合一)包括上述上游引物和下游引物，所述试剂盒还包括具有固化引物的96微孔盘、重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白、反转录酶和缓冲溶液；所述重组酶为T4uvsX/uvsY,所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4gp32,所述反转录酶为Transcriptor(Roche)；所述缓冲溶液含有下述组分:50mM Tris-HCl缓冲液、100mM乙酸钾、14mM乙酸镁、2mM二硫苏糖醇、200μM dNTPs、3mMATP、50mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶、5wt％Carbowax20M；其中,Tris-HCl缓冲液的pH值为7.9。
进一步地，所述具有固化引物的96微孔盘为反向引物溶于固化液中，以自动点片机点置于96微孔盘中于室温放置过夜。隔天采用UV进行胶连，再以封闭液在室温下反应1小时，以清洗液清洗三次后晾干；所述固化液为:2.5％BSA和中性红染色剂；所述清洗液为TBST:100mM Tris-HCl(pH 7.5),150mM NaCl,and 1mL/L Tween 20；所述封闭液为2.5wt％BSA。
实施例2:检测多重呼吸道感染病原
本实施例采用实施例1所述试剂盒检测多重呼吸道感染病原，检测采用的方法为固相重组酶聚合酶恒温基因扩增法，具体步骤如下:
1.临床样本准备
收集呼吸道(咽喉拭子、鼻咽拭子等)常规检查后的剩余样本，收集条件为:经实验室检查(培养法或分子生物学检查法)后确认为具有呼吸道病原感染的阳性临床样本，及经检查后确认为无呼吸道病原感染的阴性临床样本。所收集之剩余样本将先以95℃加热10分钟去活性，以避免运送过程有传染疑虑。临床样本置于-80℃保存。
2.样本的核酸提取
本实施例采用Viral Nucleic Acid提取试剂盒或自动化样本核酸提取仪，进行临床样本的核酸提取。
3.反应体系配置
按如下比例配置反应体系:
样本核酸 2ug
正向引物 各1μL
缓冲溶液 25μL
T4uvsX/uvsY,120ng/μL 1μL
Bsu DNA聚合酶，30ng/μL 1μL
T4gp32,900ng/μL 1μL
Transcriptor反转录酶,10U 0.5μL
ddH2O 补足至50μL
4.震荡混匀步骤4制得的反应体系后,转移至实施例1所述试剂盒中的具有固化反向引物的96微孔盘中。
5.样本于42℃恒温反应20分钟，进行RPA扩增。
6.上述所得的RPA扩增产物中加入HRP-Streptavidin，40℃恒温反应5分钟；PBST清洗三次，加入TMB呈色剂，室温反应1分钟。
7.结果判读
采用肉眼判读或读点机进行中通量数据采集等方法检测RPA扩增后的产物。用本发明所设计的引物组进行快速检测，所有经实验室鉴定的阳性呼吸道样本在96微孔盘上均得到明显的显色点，所有阴性呼吸道样本均无法得到显色点(图1)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种呼吸道感染病原检测用引物组，其特征在于，所述引物组包括由如SEQ ID NO:1和SED ID NO:2所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:3和SED ID NO:4所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:5和SED ID NO:6所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:7和SED ID NO:8所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:8和SED ID NO:10所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:11和SED ID NO:12所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:13和SED ID NO:14所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:15和SED ID NO:16所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:17和SED ID NO:18所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:19和SED ID NO:20所示的DNA序列组成的引物对、由如SEQ ID NO:21和SED ID NO:22所示的DNA序列组成的引物对、以及由如SEQ ID NO:23和SED ID NO:24所示的DNA序列组成的引物对；所述呼吸道感染病原包括A型流行性感冒病毒、B型流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒、副流行性感冒病毒1、2、3型、腺病毒、肺炎支原体、嗜肺军团杆菌、肺炎衣原体及鼻病毒。
2.根据权利要求1所述的呼吸道感染病原检测用引物组，其特征在于，所述引物对的反向引物的5’端修饰有60个T碱基，正向引物的5’端修饰有生物素。
3.一种呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～2任一项所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性内质控、具有固化引物的96微孔盘、重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白、反转录酶、ddH2O和缓冲溶液。
5.根据权利要求4所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述阳性内质控含有由如SEQ ID NO:23和SED ID NO:24所示的DNA序列组成的引物对。
6.根据权利要求4所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述具有固化引物的96微孔盘为将反向引物溶于固化液中，以自动点片机点置于96微孔盘中。
7.根据权利要求4所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述重组酶为T4 uvsX/uvsY,所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4 gp32,所述反转录酶为Transcriptor；所述缓冲溶液含有下述组分:Tris-HCl缓冲液、乙酸钾、乙酸镁、二硫苏糖醇、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、Carbowax20M。
8.根据权利要求4所述的呼吸道感染病原的快速诊断试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液含有下述浓度的组分:Tris-HCl缓冲液50mM、乙酸钾100mM、乙酸镁14mM、二硫苏糖醇2mM、dNTPs 200μM、ATP 3mM、磷酸肌酸50mM、肌酸激酶100ng/μL、Carbowax20M 5wt％；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.9。
9.一种采用权利要求3～8任一项所述快速诊断试剂盒检测呼吸道感染病原的方法，其特征在于，所述方法为固相重组酶聚合酶扩增法，其包括以下步骤:
(1)提取呼吸道感染病原的核酸；
(2)将反向引物固化于96微孔盘中；
(3)配置反应体系；
(4)震荡混匀步骤(3)制得的反应体系后，转移至具有固化反向引物的96微孔盘中，于37～42℃恒温反应，进行重组酶聚合酶扩增；
(5)在步骤(3)所得的重组酶聚合酶扩增产物中加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，40℃恒温反应5分钟；PBST清洗三次，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺呈色剂，室温反应1分钟；
(6)检测重组酶聚合酶扩增后的产物。
10.根据权利要求9所述的检测呼吸道感染病原的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，采用肉眼判读或读点机进行数据采集检测RPA扩增后的产物。
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