CN109652597A - 一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的rpa引物、rpa探针、试剂盒及核酸检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物、RPA探针、试剂盒及核酸检测方法，其中RPA引物包括正向引物为PVRPAF，其序列为：CCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAAC，反向引物为PVRPAB，其序列为：Bio‑CTCAAAA GAATAATATGGTGCACTATAACCAAC，基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为PVRPAP，其序列为：FAM‑CTCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTAGAAATGGTGGHAAGCCCAATGCTC‑C3s pacer。本发明将样品简易处理、重组酶扩增技术和侧流层析技术相结合，在发病现场不需要任何设备就可进行检测，1小时内可得到检测结果，能第一时间采取措施进行治疗处理，非常适于现场使用。

Description

一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物、RPA探针、 试剂盒及核酸检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测生物技术领域，具体涉及一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物、RPA探针、试剂盒及核酸检测方法。

背景技术

犬、猫、貂细小病毒可分别引起相应宿主发生严重的病毒性腹泻，具有很高的致死性和传染性。

猫细小病毒(FPV)引起的猫泛白细胞减少症以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征。在自然条件下感染猫科和鼬科多种动物，如虎、豹、狮子和浣熊，但以体型较小的猫科动物，包括水貂最为易感。FPV是目前本属病毒中感染范围最宽，致病性最强的一种。因此也是本属中的主要病毒之一。猫泛白细胞减少症是一种主要侵害幼猫的高度接触性传染病，潜伏期2～9天，平均4天。本病的临床表现甚为多样，分为特急性型、急性型、亚急性型和不显型。特急性型不待发现临床症状即突然死亡，畜主往往怀疑为中毒，急性型可于24小时内死亡，亚急性型可持续数日到一周，呈双相热，第一期发热时病畜体温升高40℃左右，持续约一天，发热平息后数天第二次发热，体温40℃以上，同时出现厌食、呕吐、沉郁、出血性肠炎和脱水等症状，病猫多于5～6天死亡，死亡率一般为60％～70％。

犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)主要感染犬，其他犬科动物，如郊狼、丛林犬、食蟹狐和鬣狗等也可以感染。随着病毒抗原漂移，病毒已经可以感染猫、小熊、貉等动物。该病潜伏期3-5天，多数呈现肠炎综合症，少数呈现心肌炎综合症。肠炎病犬初期精神沉郁，厌食，偶见发热，软便或轻微呕吐，随后发展成为频繁呕吐和剧烈腹泻。起初粪便呈灰色，黄色或乳白色，带果冻状粘液，其后排出恶臭的酱油样或番茄汁样血便。病犬迅速脱水，消瘦，眼窝深陷，被毛凌乱，皮肤无弹性，耳鼻，四肢发凉，精神高度沉郁，休克，死亡。从病初症状轻微到严重一般不超过2天，整个病程一般不超过一周。

貂细小病毒引起水貂病毒性肠炎，以出血和坏死急剧下痢，白细胞高度减少为特征。胃肠症状明显，呕吐黄绿色水样或粥样物，腹泻，排出稀软到水样或脓样粪便，继之便中带血、粘膜脱落物和未消化饲料、粘液及大量气泡，有的混有血丝或血凝块。幼龄水貂有较高的发病率和死亡率，多数病貂转归死亡，造成巨大损失。这是世界公认的危害水貂养业较严重的传染病之一。水貂，不同品种、年龄、性别的水貂都易感，以幼貂，特别是刚断乳的仔貂最易感，发病率和死亡率都较成年水貂高。MEV虽能使猫、犬、貉发病。

这些疾病在病毒血症期间，病畜的粪、尿和各种分泌液均含有病毒。本病毒对外界环境有较强的抵抗力，被污染的食物、器具和衣服等均可引起疾病传播，以经口为主，也能经飞沫传染。因此，进行病原的早期检测以及环境中病原的检测，对于预防或治疗该病具有重要的意义。然而，当前对这三种病原的检测需借助实验室检测方法，需要昂贵的实验室条件、仪器设备和专业技术，并且需要较长的时间，难以满足现场或田间条件下的检测需要。

RPA技术近年新出现的很有临床应用潜力的等温核酸检测技术。RPA技术依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换聚合酶的共同作用在常温下就可以进行核酸的扩增，可以在非常短的时间内使目的基因以指数级增长，配合标记探针和侧流层析技术便可实现对扩增产物的现场实时监测，不需任何专业的仪器设备，并且简便快速，非常适于现场或田间使用，可以在家庭、宠物门诊或养殖场内进行病原的检测，对于疾病的诊断和防控具有重大的临床应用价值，具有广阔的应用前景。

目前国内外还没有利用RPA技术和侧流层析技术对犬、猫、貂细小病毒进行检测。

发明内容

为了解决现有的检测犬、猫、貂细小病毒核酸的技术中，PCR技术操作繁琐，专业技术要求高，需要昂贵的实验室条件、仪器设备和专业技术，并且需要较长的时间，难以满足现场条件下的检测需要；其它一些发展的恒温扩增技术如依赖核酸序列的扩增(NASBA)和环介导等温扩增(LAMP)都需要特定温度的恒温装置，在检测时需要特殊配备，不便于推广应用，本发明提供一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物、RPA探针、试剂盒及核酸检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物和RPA探针，其特征在于，所述的RPA引物包括正向引物为PVRPAF，其序列为：CCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAAC，

反向引物为PVRPAB，其序列为：

Bio-CTCAAAAGAATAATATGGTGCACTATAACCAAC，

其中基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为PVRPAP，其序列为：

FAM-CTCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTAGAAATGGTGGHAAGCCCAATGCTC-C3spacer。

本发明还提供一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的RPA试剂盒，其包括上述的RPA引物和RPA探针，具体地，还包括：(1)样品处理液：0.2M KOH溶液；(2)检测反应液：50mM pH7.9的Tris-HCl；100mM的乙酸钾；2mM的二硫苏糖醇；3mM的腺嘌呤核苷三磷酸；20mM的磷酸肌酸；5μg的肌酸激酶；5％质量分数的聚乙二醇，200μM的脱氧核糖核苷三磷酸，RPA引物，14mM的醋酸镁；(3)干粉管：3.75μg冻干的重组酶uvsX、750ng冻干的重组酶uvsY、30μg的单链结合蛋白、900ng链置换聚合酶；(4)侧流试纸条；(5)阳性对照反应液：含有犬、猫、貂细小病毒VP2基因片段；10mM pH8.0的TE缓冲液；(6)阴性对照反应液：10mM pH8.0的TE缓冲液；(7)上样处理液：0.01M pH为7.3的PBST缓冲液；(8)吸管；(9)无菌注射器，上述物质的浓度为在各试剂中的终浓度。

本发明还提供一种犬、猫、貂细小病毒的核酸检测方法，包括以下操作步骤：

(1)样品处理：用棉签采取待检动物粪便、呕吐物或分泌物，在1ml样品处理液中搅拌混匀，然后静置处理；

(2)扩增：在干粉管中滴加0.05ml检测反应液，然后加入用微量吸管吸取的上层样品处理液5ul，同时设立阳性及阴性对照，混匀，将干粉管置于操作者腰带下反应20分钟，得到反应液；

(3)判定：反应完成后用吸管吸取0.01ml的反应液加入到2ml上样处理液中混匀，然后将侧流试纸条放入上样处理液中进行结果测定，5分钟后观察判定结果：如阴性对照样品中的侧流试纸条只在C的位置上出现条带，阳性对照样品中的侧流试纸条在C和T的位置上都出现条带，表明试验成立，检测样品中的侧流试纸条的条带和阳性对照样品一样出现两个条带为阳性，表明待检动物中含有细小病毒；和阴性对照样品一样出现一个条带为阴性，表明待检动物中不含有细小病毒。

由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

本发明将样品简易处理、重组酶扩增技术和侧流层析技术相结合，在发病现场不需要任何设备就可进行检测，1小时内可得到检测结果，能第一时间采取措施进行治疗处理，非常适于现场使用，可以在家庭、宠物门诊或养殖场内进行犬、猫、貂细小病毒的检测和诊断，对于该病的诊断和防控具有重大的临床应用价值，拥有广阔的市场前景。操作简便，普通人员都可以进行检测，降低了检测的技术门槛，养殖户、养殖场和基层兽医门诊医生都可以检测，极大便利了应用和推广。

附图说明

图1和图2为试验中试验样品的检测结果，其中图1为病犬粪便样品的阳性检测结果，图2为为病猫粪便样品的阴性检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验条件。

实施例1

一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物和RPA探针，其特征在于，所述的RPA引物包括正向引物为PVRPAF，其序列为：CCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAAC，

反向引物为PVRPAB，其序列为：

Bio-CTCAAAAGAATAATATGGTGCACTATAACCAAC，

其中基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为PVRPAP，其序列为：

FAM-CTCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTAGAAATGGTGGHAAGCCCAATGCTC-C3spacer。

本发明还提供一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的RPA试剂盒，其包括上述的RPA引物和RPA探针，具体地，还包括：(1)样品处理液：0.2M KOH溶液；(2)检测反应液：50mM pH7.9的Tris-HCl；100mM的乙酸钾；2mM的二硫苏糖醇；3mM的腺嘌呤核苷三磷酸；20mM的磷酸肌酸；5μg的肌酸激酶；5％质量分数的聚乙二醇，200μM的脱氧核糖核苷三磷酸，RPA引物，14mM的醋酸镁；(3)干粉管：3.75μg冻干的重组酶uvsX、750ng冻干的重组酶uvsY、30μg的单链结合蛋白、900ng链置换聚合酶；(4)侧流试纸条；(5)阳性对照反应液：含有犬、猫、貂细小病毒VP2基因片段；10mM pH8.0的TE缓冲液；(6)阴性对照反应液：10mM pH8.0的TE缓冲液；(7)上样处理液：0.01M pH为7.3的PBST缓冲液；(8)吸管；(9)无菌注射器，上述物质的浓度为在各试剂中的终浓度。

本发明还提供一种犬、猫、貂细小病毒的核酸检测方法，包括以下操作步骤：

(1)样品处理：用棉签采取待检动物粪便、呕吐物或分泌物，在1ml样品处理液中搅拌混匀，然后静置处理；

(2)扩增：在干粉管中滴加0.05ml检测反应液，然后加入用微量吸管吸取的上层样品处理液5ul，同时设立阳性及阴性对照，混匀，将干粉管置于操作者腰带下反应20分钟，得到反应液；

(3)判定：反应完成后用吸管吸取0.01ml的反应液加入到2ml上样处理液中混匀，然后将侧流试纸条放入上样处理液中进行结果测定，5分钟后观察判定结果：如阴性对照样品中的侧流试纸条只在C的位置上出现条带，阳性对照样品中的侧流试纸条在C和T的位置上都出现条带，表明试验成立，检测样品中的侧流试纸条的条带和阳性对照样品一样出现两个条带为阳性，表明待检动物中含有细小病毒；和阴性对照样品一样出现一个条带为阴性，表明待检动物中不含有细小病毒。

试验：

用棉签分别采取疑似犬细小病毒感染的病犬、疑似猫细小病毒感染的病猫的粪便各一份，在盛有1ml样品处理液的处理管中反复搅拌混匀，静置1分钟，然后用微量吸管吸取5ul上层的样品处理液，和检测反应液一起加入干粉管，混匀，将干粉管置于操作者腰带下反应20分钟，得到反应液；扩增完成后取一滴反应液放入到上样处理液中混匀，将侧流层析试纸条插入上样处理液中，5分钟后观察结果。结果阴性和阳性对照都成立，在检测的病犬粪便样品的试纸上出现了两条检测线，表明其感染了犬细小病毒。该样品经常规基因提取、PCR和电泳检测结果也为阳性。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改变、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物和RPA探针，其特征在于，所述的RPA引物包括正向引物为PVRPAF，其序列为：CCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAAC，

反向引物为PVRPAB，其序列为：

Bio-CTCAAAAGAATAATATGGTGCACTATAACCAAC，

其中基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为PVRPAP，其序列为：

FAM-CTCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTAGAAATGGTGGHAAGCCCAATGCTC-C3spacer。

2.一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的RPA试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的RPA引物和RPA探针。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的RPA试剂盒，其特征在于，还包括：(1)样品处理液：0.2M KOH溶液；(2)检测反应液：50mM pH7.9的Tris-HCl；100mM的乙酸钾；2mM的二硫苏糖醇；3mM的腺嘌呤核苷三磷酸；20mM的磷酸肌酸；5μg的肌酸激酶；5％质量分数的聚乙二醇，200μM的脱氧核糖核苷三磷酸，RPA引物，14mM的醋酸镁；(3)干粉管：3.75μg冻干的重组酶uvsX、750ng冻干的重组酶uvsY、30μg的单链结合蛋白、900ng链置换聚合酶；(4)侧流试纸条；(5)阳性对照反应液：含有犬、猫、貂细小病毒VP2基因片段；10mMpH8.0的TE缓冲液；(6)阴性对照反应液：10mM pH8.0的TE缓冲液；(7)上样处理液：0.01M pH为7.3的PBST缓冲液；(8)吸管；(9)无菌注射器，上述物质的浓度为在各试剂中的终浓度。

4.一种犬、猫、貂细小病毒的核酸检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)样品处理：用棉签采取待检动物粪便、呕吐物或分泌物，在1ml样品处理液中搅拌混匀，然后静置处理；

(2)扩增：在干粉管中滴加0.05ml检测反应液，然后加入用微量吸管吸取的上层样品处理液5ul，同时设立阳性及阴性对照，混匀，将干粉管置于操作者腰带下反应20分钟，得到反应液；

(3)判定：反应完成后用吸管吸取0.01ml的反应液加入到2ml上样处理液中混匀，然后将侧流试纸条放入上样处理液中进行结果测定，5分钟后观察判定结果：如阴性对照样品中的侧流试纸条只在C的位置上出现条带，阳性对照样品中的侧流试纸条在C和T的位置上都出现条带，表明试验成立，检测样品中的侧流试纸条的条带和阳性对照样品一样出现两个条带为阳性，表明待检动物中含有细小病毒；和阴性对照样品一样出现一个条带为阴性，表明待检动物中不含有细小病毒。