CN110396536A - 一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，首先以外泌体特异性适配体为连接探针，设计了相应的挂锁探针和第二引物，在适配体和外泌体重悬液孵育后，利用滤膜去除游离的适配体，与外泌体结合的适配体则通过高温加热的方法分离，适配体作为连接探针启动滚环扩增后形成大量重复的核酸双链结构，以SYBR Green Ⅰ为染料能产生强烈的荧光信号，且信号强弱与外泌体浓度呈正相关。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，属于涉及生化检测和分子诊断领域。
背景技术
外泌体是细胞分泌的直径在30-100nm的双层膜包裹的微型囊泡，外泌体中含有蛋白质、脂质和核酸等多种生物活性组分。几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，其所携带和传递的信号分子形成了一种全新的细胞间信息传递系统，在细胞的生理状态并与多种疾病(如糖尿病、各类肿瘤以及心血管疾病等)的发生和发展中扮演着重要的角色。此外，外泌体还与免疫逃逸、抗药性产生等机制密切相关。由于外泌体的特征部分能反映其来源细胞的特性，而且许多人体体液，包括外周血，唾液，尿液，等中均可有效检测到外泌体，因此外泌体作为疾病相关的生物标志物在液体活检中受到了广泛关注。而且与液体活检的另外两种标志物(循环肿瘤细胞、循环DNA)相比，外泌体在体液中的含量更高、提供的信息更全面。
滚环扩增是一种恒温核酸扩增法，可以实现对靶核酸的信号放大，指数型扩增的特性使得滚环扩增的灵敏度达到了一个拷贝的核酸分子。分支滚环扩增则是在线性滚环扩增的基础上加入第二引物，以此形成大量重复的双链结构，利用核酸双链染料可产生强烈的荧光信号。基于上述原理构建出的外泌体荧光传感器对于辅助疾病的诊断和治疗有着重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，以解决现有技术中存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，所述制备步骤如下：
1)以外泌体特异性适配体为连接探针，设计相应的挂锁探针和第二引物；
2)将PBS缓冲液稀释的外泌体与适配体孵育，通过20nm孔径滤膜将未结合的适配体去除，外泌体用超纯水重悬；
3)用高温加热的方法将结合在外泌体表面的适配体分离，加入挂锁探针、连接酶缓冲液、T4连接酶和超纯水，制备环状模板；
4)向环状模板中加入第二引物、聚合酶缓冲液、聚合酶、dNTPs、SYBR GreenⅠ染料以及超纯水，37℃反应的同时用荧光定量PCR实时检测荧光信号。
作为本发明的一种改进，所述步骤1)中挂锁探针两端存在与适配体互补的序列，第二引物与挂锁探针部分序列相同。
作为本发明的一种改进，所述步骤2)中外泌体尺寸大于滤膜孔径，适配体长度小于滤膜孔径，因此可以将游离的适配体通过滤过去除。
作为本发明的一种改进，所述步骤3)中高温加热后外泌体破碎，外泌体从失活的蛋白表面脱离，和挂锁探针在T4连接酶的作用下杂交形成环状模板。
作为本发明的一种改进，所述步骤4)以结合在环状模板上的适配体为第一引物，启动滚环扩增后形成与环状模板互补的重复单元，第二引物与重复单元杂交后启动分支扩增，形成双链结合，SYBR GreenⅠ嵌合双链结构后产生强烈的荧光信号，信号强弱与外泌体浓度呈正相关。
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
本发明应用荧光法构建出基于外泌体特异性的适配体为连接探针启动分支滚环扩增，利用SYBR GreenⅠ为染料产生荧光信号的外泌体传感器，分支滚环扩增指数型扩增的特点使得信号得到了放大，提高了外泌体检测的灵敏度。
附图说明
图1为一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器流程示意图；
图2为适配体作为连接探针启动滚环扩增的验证，M：Maker，1：超纯水，2：随机核酸文库，3：适配体；
图3为不同浓度的外泌体对应的荧光信号。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，首先以适配体为连接探针设计挂锁探针和第二引物，利用滤膜法去除未与外泌体结合的游离适配体，靶适配体则和挂锁探针在T4连接酶的作用下杂交形成环状模板，以结合在环状模板上的适配体为第一引物，启动滚环扩增后形成大量与环状模板互补的重复单元，第二引物与重复单元杂交后启动分支扩增，形成大量双链结合，SYBR GreenⅠ嵌合双链结构后产生强烈的荧光信号，信号强弱与外泌体浓度呈正相关。
其步骤如下：
1.适配体与不同浓度的外泌体孵育：将100nM适配体与PBS重悬的不同浓度的外泌体溶液在37℃孵育1小时；
2.适配体分离：(1)上述混合液通过20nm孔径滤膜，用PBS反复洗涤5次以上；(2)用200μL超纯水重悬滤膜表面的液体，95℃加热破碎外泌体，使表面膜蛋白失活，释放出结合的适配体。
3.环状模板制备：(1)磷酸基团修饰的挂锁探针(100μM)和8μL超纯水重悬的适配体在T4连接酶缓冲液中杂交；(2)加入60U T4DNA连接酶，并将该混合物在37℃孵育1h。
4.启动分支滚环扩增：加入1μL phi29DNA聚合酶缓冲液，0.5μL 10mMdNTPs，10Uphi29DNA聚合酶，1μL SYBR GreenⅠ染料，0.5μL第二引物(2μM)以及超纯水补足10μL，与环状模板在37℃孵育，同时用荧光定量PCR平台实时检测荧光信号。
以下结合具体实施例对本发明作进一步描述：
一、以适配体为连接探针启动滚环扩增。
1.磷酸基团修饰的挂锁探针(100μM)和1mL适配体(100μM)在T4连接酶缓冲液中杂交，对照组为超纯水和随机核酸文库；加入60U T4DNA连接酶，并将该混合物在37℃孵育1h。
其中适配体以与胃癌外泌体特异性结合的适配体为例，挂锁探针和第二引物的序列如SEQ ID NO:1～2所示：
适配体：5’-TACTGCATGCACACCACTTCAACTA-3’
挂锁探针：5’-phosphate-TGTGCATGCAGTATTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTTAGTTGAAGTGG-3’
第二引物：5’-TAGTTGTGCATGCAGTATTTGC-3’
2.将第一步制备所得的环状模板稀释100倍后加入1μL phi29DNA聚合酶缓冲液，0.5μL10mMdNTPs，10U phi29DNA聚合酶，1μL 2μM第二引物，在37℃孵育2小时。
3.电泳结果表明，与超纯水(条带1)和随机核酸文库(条带2)相比，只有适配体(条带3)能成功启动滚环扩增，滚环扩增产物由于长度过长，在电泳图中位于15Kbp之后。
二、利用该体系检测不同浓度的外泌体。
1.将100nM适配体与PBS重悬的不同浓度的外泌体溶液在37℃孵育1小时。
2.上述混合液通过20nm孔径滤膜，用PBS反复洗涤5次以上。
3.用200μL超纯水重悬滤膜表面的液体，95℃加热破碎外泌体，使表面膜蛋白失活，释放出结合的适配体。
4.磷酸基团修饰的挂锁探针(100μM)和8μL超纯水重悬的适配体在T4连接酶缓冲液中杂交，加入60U T4DNA连接酶，并将该混合物在37℃孵育1h。
5.加入1μL phi29DNA聚合酶缓冲液，0.5μL 10mMdNTPs，10U phi29DNA聚合酶，1μLSYBR GreenⅠ染料，0.5μL第二引物(2μM)以及超纯水补足10μL，在37℃孵育，同时用荧光定量PCR平台实时检测荧光信号。
6.结果表明产物荧光信号强弱与外泌体浓度呈正相关。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtgcatgca gtatttgcat ttcagtttac ggtttagcat ttcgcaattt ttagttgaag 60
tgg 63
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagttgtgca tgcagtattt gc 22
Claims (6)
1.一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，其特征在于，所述制备步骤如下：
1)以外泌体特异性适配体为连接探针，设计相应的挂锁探针和第二引物；
2)将PBS缓冲液稀释的外泌体与适配体孵育，通过滤膜将未结合的适配体去除，外泌体用超纯水重悬；
3)用高温加热的方法将结合在外泌体表面的适配体分离，加入挂锁探针、连接酶缓冲液、T4连接酶和超纯水，制备环状模板；
4)向环状模板中加入第二引物、聚合酶缓冲液、聚合酶、dNTPs、SYBR Green Ⅰ染料以及超纯水，37℃反应的同时用荧光定量PCR实时检测荧光信号。
2.根据权利要求1所述的一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，其特征在于：所述步骤1)中挂锁探针两端存在与适配体互补的序列，第二引物与挂锁探针部分序列相同。
3.根据权利要求1所述的一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，其特征在于：所述步骤2)中外泌体尺寸大于滤膜孔径，适配体长度小于滤膜孔径。
4.根据权利要求3所述的一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，其特征在于：所述滤膜孔径为20nm。
5.根据权利要求1所述的一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，其特征在于：所述步骤3)中高温加热后外泌体破碎，外泌体从失活的蛋白表面脱离，和挂锁探针在T4连接酶的作用下杂交形成环状模板。
6.根据权利要求1所述的一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，其特征在于：所述步骤4)以结合在环状模板上的适配体为第一引物，启动滚环扩增后形成与环状模板互补的重复单元，第二引物与重复单元杂交后启动分支扩增，形成双链结合，SYBR GreenⅠ嵌合双链结构后产生强烈的荧光信号，信号强弱与外泌体浓度呈正相关。
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