CN106244689A - 一种基于pcr技术进行鹌鹑性别鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法，属于生物检测鉴定技术领域。本发明的PCR鉴定用的两对PCR引物，包括一对微卫星引物和一对内参基因（β‑actin）引物，PCR鉴定方法为：以待测雏鹌鹑的血样基因组DNA为模板，采用鹌鹑性别鉴定用PCR引物进行PCR扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物只出现259 bp的特异性扩增条带时判定为公鹌鹑，当扩增产物出现259 bp的特异性扩增条带和114 bp的特异性扩增条带时判定为母鹌鹑。该方法具有操作简单方便，能够在出雏时进行性别鉴别、鉴别快速、结果准确等优点，避免了采用传统方法耗时长、饲养成本高、易出错等缺点。
Description
技术领域
本发明属于生物检测鉴定技术领域，具体涉及一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法，该方法可应用于对雏鹌鹑进行早期性别鉴定。
背景技术
鹌鹑是特种经济禽类，也是最小的家禽品种，具有极高的食用价值和食疗功效。鹌鹑蛋营养丰富，蛋白质含量高，胆固醇含量低，由此可见，蛋用鹌鹑的养殖具有较好的市场前景。由于蛋用鹌鹑出雏时体重仅有7克左右，通常商品代蛋用鹌鹑通过羽色进行公母区分；而父母代的鹌鹑由于毛色相同，出雏时不能区分公母，一般要等鹌鹑长到30日龄左右才能通过体型外貌区分公母，这在很大程度上增加了鹌鹑育种企业的养殖成本。随着我国鹌鹑养殖业的发展，快速、及时、准确的鉴别出雏鹌鹑的性别，成为一个亟待解决的问题。
近年来，分子生物技术的发展，为这一难题的解决提供了另一种思路。鸟类的性别是由染色体决定的，其性别决定方式为ZW型，雄鸟有一对Z染色体，而雌鸟则是一个Z染色体和一个W染色体。CHD基因在Z染色体和W染色体上的序列具有一定差异，可以利用该基因在Z染色体和W染色体上的差异鉴别绝大多数的禽类，具有很大的通用性。自1995年开始，CHD基因被广泛应用于鸟类性别的分子鉴定，CHD基因已经成为鸟类性别鉴定最重要的分子标记。由于不论雌鸟还是雄鸟都会有CHD-Z基因，因此是否检测到CHD-Z扩增产物可以作为扩增反应是否正常进行的参照，避免了将实验失败的结果误判为雄性；而CHD-W基因是雌性专有的，只有雌性才可能检测到CHD-W扩增。这种方法的优点是成本较低，在现有鉴定条件下被广泛地采用，缺点是操作繁琐、时间长，易造成污染。近年来，有学者重新设计引物，利用CHD-W和CHD-Z扩增产物的熔解温度不同来区分ZW条带，但CHD-Z和CHD-W扩增反应是分别在两个PCR反应管中进行的，这样既增加了经济成本，实用性较低，另一方面又可能发生误判；另有报道显示在同一管内用相同的引物扩增CHD-W和CHD-Z，利用扩增片段中Z和W具有3个SNP、其扩增产物的熔解温度不同进行区分，该方法由于只采用了一对引物，且所产生的片段序列和大小非常接近,无法用凝胶电泳区分；其缺点是没有熔解曲线分析仪的用户无法采用，缺乏简单有效的方法验证结果。
因此，需要开发出一种简单方便，能够在鹌鹑出雏后快速、准确进行鹌鹑性别鉴定的方法。
发明内容
本发明的目的在于根据禽类公母性染色体的特征，提供一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法，从而实现出雏时鉴别鹌鹑性别的目的。
本发明通过以下技术方案实现：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于鉴定雏鹌鹑性别的微卫星引物对，该微卫星引物对的特点是只有母鹌鹑可以扩增出条带，而在公鹌鹑上不能扩增出条带，其核苷酸序列具体如下所示（114bp）：
上游引物：5'-cttctgcgagctgctcatctg-3'；
下游引物：5'-cagcggctgttgtcagtgtg-3'；
为了避免由于模板问题出现的未扩增出条带的个体会造成结果的误判，本发明在进行PCR扩增时设计了一对内参引物作为对照，其核苷酸序列如下（259bp）：
β-actin-F1:5’-CCCTGTATGCCTCTGGTC-3’；
β-actin-R1:5’-ATCTCCTGCTCGAAATCC-3。
一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的制备方法,包括如下步骤：
根据鹌鹑Z和W染色体序列的特征，筛选出仅在W染色体上具有的微卫星位点设计相应的引物，进行鹌鹑W染色体上特有微卫星位点的扩增；同时，为了避免由于检测个体DNA模板问题造成的误判，本发明以β-actin基因作为内参基因，设计一对引物与该微卫星引物同时进行PCR扩增；随后利用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测，当扩增产物只出现259 bp的特异性扩增条带时判定为公鹌鹑，当扩增产物出现259 bp的特异性扩增条带和114 bp的特异性扩增条带时判定为母鹌鹑。
上述的方法，所述的PCR扩增的反应体系由以下成分组成：模板DNA30-50ng，2×PCR扩增缓冲液7.5 μL，10 pmol/μL上游引物0.3 μL，10 pmol/μL下游引物0.3 μL，10pmol/μL β-actin-F1引物0.3 μL、10 pmol/μLβ-actin-R1引物0.3 μL，加水至15 μL。
上述方法，所述的PCR扩增的反应程序为：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，53℃复性30s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
所述的基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法可以应用于雏鹌鹑早期的性别鉴定中。
本发明具有如下优点和显著的进步：（1）本发明筛选出仅在W染色体上具有的微卫星位点设计相应的引物，进行鹌鹑W染色体上特有微卫星位点的扩增；同时，为了避免检测个体DNA模板问题造成的误判，本发明以β-actin基因作为内参基因，设计一对引物与该微卫星引物同时进行PCR扩增，使用该发明可在鹌鹑刚出壳时进行其性别鉴定，减少了公鹌鹑的养殖量，降低育种企业的养殖成本，实现了在早期进行鹌鹑性别鉴定育种，丰富了现有技术。
附图说明
图1：本发明微卫星引物与内参基因同时进行PCR扩增以后的电泳检测结果图。其中：M为DNA分子量标准（DSTM2000），1、2、6、11为公，3、4、5、7、8、9、10、12为母。此检测结果与实际性别完全相符。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
利用仅存在于鹌鹑性染色体W染色体上的微卫星片段设计一对微卫星引物对，所述引物的序列为：
上游引物：5'-CTTCTGCGAGCTGCTCATCTG-3'
下游引物：5'-CAGCGGCTGTTGTCAGTGTG-3'
为了避免由于模板问题出现的未扩增出条带的个体会造成结果的误判，本发明在进行PCR扩增时设计了一对内参引物作为对照，其核苷酸序列如下（259bp）：
β-actin-F1:5’-CCCTGTATGCCTCTGGTC-3’
β-actin-R1:5’-ATCTCCTGCTCGAAATCC-3
实施例2
（1）试剂盒法提取鹌鹑血液基因组DNA
取10 μL鹌鹑抗凝血液加入蛋白酶K 20 μL、500 μLBB3，涡旋15 s充分混匀样品，室温孵育10 min；短暂离心，将全部溶液转移入离心柱中，12000×g离心1 min，弃滤液；加入500μL溶液CB3，12000×g离心30 s，弃滤液；加入500 μL溶液WB3，12000×g离心30 s，弃滤液，重复该步骤一次；12000×g离心2 min，彻底去除残留的WB3；将离心柱转移入一干净的离心管中，在柱中央加入50-200 μL的预热去离子水（PH>7），室温静置1 min，12000×g离心1min，收集洗脱的DNA，4 ℃保存备用。
（2）PCR扩增条件
PCR反应总体积15 μL，其中2×PCR mix 7.5 μL，10 μmol/L微卫星上、下游引物各0.3μL，10 μmol/L β-actin上、下游引物各0.3 μL，鹌鹑基因组DNA模板1.0 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR扩增程序是: 94 ℃ 5 min，然后再循环30次94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃ 延伸10 min。PCR反应产物用2% 琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。
（3）琼脂糖检测PCR扩增产物
取6 μL PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶120 V电压电泳20 min，用凝胶成像系统拍照、对PCR产物进行鉴定。根据带型即可判断鹌鹑的性别：仅一条带（259bp）为公鹌鹑，两条带（259bp和114bp）为母鹌鹑。图1为未知性别鹌鹑的PCR扩增产物的部分电泳图，共检测100个个体，根据本发明专利方法检测的结果与30日龄时（已经可以通过体型外貌区分公母）的性别结果一致。
<110> 湖北省农业科学研究院畜牧兽医研究所
<120> 一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttctgcgag ctgctcatct g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagcggctgt tgtcagtgtg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccctgtatgc ctctggtc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atctcctgct cgaaatcc 18
Claims (4)
1.一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法，其特征在于：PCR反应中的引物包括以W染色体上特有微卫星位点设计的微卫星引物和以β-actin基因作为内参基因设计的内参引物；
所述的微卫星引物为：
上游引物：5'-cttctgcgagctgctcatctg-3';
下游引物：5'-cagcggctgttgtcagtgtg-3';
所述的内参引物为：
β-actin-F1:5’-CCCTGTATGCCTCTGGTC-3’;
β-actin-R1:5’-ATCTCCTGCTCGAAATCC-3。
2.如权利要求1所述的一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法，其特征在于：PCR反应体系由以下成分组成：2×PCR mix 7.5 μL，10 μmol/L微卫星上、下游引物各0.3 μL，10μmol/L β-actin上、下游引物各0.3 μL，鹌鹑基因组DNA模板1.0 μL，加水至15 μL。
3.如权利要求1所述的一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法，其特征在于：PCR扩增的反应程序为：94℃ 5 min，然后再循环30次94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，最后72℃ 延伸10 min。
4.一种基于PCR技术进行鹌鹑性别鉴定的方法，其特征在于：同时使用微卫星引物和内参引物，以鹌鹑血液基因组DNA为模板进行 PCR 扩增，随后采用2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物只出现259 bp的特异性扩增条带时判定为公鹌鹑，当扩增产物出现259 bp的特异性扩增条带和114 bp的特异性扩增条带时判定为母鹌鹑。
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