CN107354238B - 一种用于检测禽腺病毒iv型的特异性引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测禽腺病毒IV型的引物及应用。是根据禽腺病毒IV型penton基因序列保守区域设计的一对特异性引物，扩增的目的片段498bp。本发明的特异性引物，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏对禽腺病毒IV型进行准确鉴定。最低检测限达2.7×10^‑4ng/ul，而对禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒（IBV H120株）、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡毒霉形体、禽呼肠孤病、鸡马立克病病毒、减蛋综合征病毒、鸡大肠杆菌、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭瘟病毒的检测结果均为阴性。对87份临床样品检测结果显示，检出阳性样品14份，阳性感染率为16.09%。

Description

一种用于检测禽腺病毒IV型的特异性引物及应用

技术领域

本发明属于动物卫生检验技术领域，涉及用于检测禽腺病毒IV型的特异性引物及应用，特别是针对禽腺病毒IV型penton基因的PCR引物及其应用。

背景技术

禽腺病毒（Fowl adenovirus ，FADV）属于禽腺病毒科、禽腺病毒属。根据其抗原性不同可将禽腺病毒分为3个群：Ⅰ群禽腺病毒具有共同的群抗原，其代表株为鸡胚致死孤儿病毒（CELOV），根据中和试验可将其分为12个血清型（FAdV1-12）；Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒主要包括火鸡出血性肠炎病毒（HEV）和减蛋综合征（Egg drop syndrom virus，EDSV）。

禽腺病毒IV型属于Ⅰ群禽腺病毒，主要感染3-5周龄的肉鸡、种鸡及蛋鸡，病程8-15天，死淘率10%-80%，病鸡采食量迅速下降，表现为精神沉郁，拉淡黄绿色稀便，剖检可见心包积液，肝脏肿大，呈现黄色或黄绿色，脾胃与肌胃交界处偶有出血点。临床以心包积液和包涵体肝炎为主要特征。该病毒主要通过鸡胚垂直传播，也可经粪便、气管和鼻腔粘膜水平传播。

五邻体（penton）、六邻体和纤维蛋白是FADV的3个主要结构蛋白，它们共同构成病毒核衣壳。每个五邻体由基底和伸出表面的一根末端有顶球的纤维组成，有助于病毒黏附于细胞表面。该蛋白还可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。此外，五邻体能刺激机体产生抗体，从而中和病毒体，在鸡抗禽腺病毒感染中发挥重要作用。因此 五邻体蛋白在FADV的致病机制、临床诊断和免疫等研究方面均具有重要意义。

目前检测禽腺病毒的方法有病毒分离与鉴定、病毒中和试验等,谢芝勋（2000年）、文艳玲（2008年）等根据hexon基因设计引物, 建立了Ⅰ群FADV的PCR检测方法及SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,唐熠等（2009年）以hexon为靶基因建立了LAMP检测方法，并在该病检测诊断上得到应用。本发明根据GenBank中登录的FADV penton基因序列，并兼顾FADV不同国家毒株间的差异，选择FADV的保守的核苷酸序列作为扩增区域，设计了一对检测禽腺病毒IV型penton基因的PCR引物。对该引物的特异性、敏感性和重复性进行试验，证实此引物可用于快速、方便、高效地检测禽腺病毒IV型，特异性好，灵敏度高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测禽腺病毒IV型penton基因的特异性引物，它具有快速、方便、高效、灵敏度高的特点，其特征在于：

上游引物FADV4-F：5'-ACAGCCGTGCGCACCAACTGCCCGAAC-3'；

下游引物FADV4-R：5'-CTGCAGATCCTCGTAGGTAATAAC-3'

扩增的禽腺病毒IV型penton基因目的片段为498bp。

本发明进一步公开了用于检测禽腺病毒IV型penton基因的特异性引物进行检测的方法如下：

（1）提取病毒DNA；

（2）PCR扩增反应：

扩增反应体系：扩增反应的总体积为20.0μL，其各种成分及终浓度分别为：10×buffer（不含Mg²⁺）2μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2μL，Taq酶（5U/µl）0.5µL，PDCoV-F （10μmol/L）1μL，PDCoV-R（10μmol/L）1μL,Mg²⁺(10μmol/L)1μL，DNA模板4μL,ddH₂O加至20μL；

扩增反应过程：95℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。4℃保存；

（3）扩增产物检测：取扩增产物5μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在凝胶成像系统下观察结果。

本发明更进一步公开了用于检测禽腺病毒IV型penton基因的特异性引物在检测禽腺病毒IV型方面的应用。对禽流感病毒（AIV H9亚型）、新城疫病毒（NDV Lasota株）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV H120株）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV B87株）、鸡毒霉形体（支原体MG F36株）、禽呼肠孤病（ARV S1133株cDNA）、鸡马立克病病毒（MDV 814株）、减蛋综合征病毒（EDSV 76株）、鸡大肠杆菌（WW1株）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV K317株）、鸭瘟病毒（DPV CVCC AV1222株）的检测结果均为阴性。但对禽腺病毒IV型的最低检测限达2.7×10^{- 4}ng/ul，说明有很好的特异性。

本发明以禽腺病毒IV型penton基因为靶序列，并兼顾FADV-4不同血清型之间的差异，通过序列对比分析排除二级结构和非特异性序列区间，选择禽腺病毒IV型penton基因的最保守的核苷酸序列作为扩增区域，设计了一对检测禽腺病毒IV型penton基因的PCR引物，扩增产物大小为498bp。

本发明公开的用于检测禽腺病毒IV型的引物应用于禽腺病毒IV型检测与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）禽腺病毒IV型penton基因特异性试验结果表明，该引物能够特异性检测出禽腺病毒IV型，对禽流感病毒（AIV H9亚型）、新城疫病毒（NDV Lasota株）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV H120株）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV B87株）、鸡毒霉形体（支原体MG F36株）、禽呼肠孤病（ARV S1133株cDNA）、鸡马立克病病毒（MDV 814株）、减蛋综合征病毒（EDSV 76株）、鸡大肠杆菌（WW1株）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV K317株）、鸭瘟病毒（DPV CVCCAV1222株）的检测结果均为阴性，证明该引物具有较好的特异性。

（2）禽腺病毒IV型penton基因的敏感性试验结果表明，该引物应用于禽腺病毒IV。

附图说明

图1为禽腺病毒IV型penton基因PCR扩增结果电泳图：自左向右，依次为DL2000DNA marker；样品1-3号；阳性对照；空白对照；

图2为禽腺病毒IV型penton基因的PCR特异性试验结果电泳图：自左向右，依次为DL2000 DNA marker、禽腺病毒IV型，禽流感病毒（AIV H9亚型）、新城疫病毒（NDV Lasota株）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV H120株）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV B87株）、鸡毒霉形体（支原体MG F36株）、禽呼肠孤病（ARV S1133株cDNA）、鸡马立克病病毒（MDV 814株）、减蛋综合征病毒（EDSV 76株）、鸡大肠杆菌（WW1株）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV K317株）、鸭瘟病毒（DPV CVCC AV1222株）、空白对照；

图3为禽腺病毒IV型penton基因的PCR敏感性试验结果电泳图；自左向右，依次为DL2000 DNA marker，1-7号：禽腺病毒IV型DNA模板（浓度分别为2.7×10^-1ng/ul；2.7×10^{- 2}ng/µl；2.7×10^-3ng/µl；2.7×10^-4ng/µl；2.7×10^-5ng/µl；2.7×10^-6ng/µl；2.7×10^-7ng/µl），空白对照。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。其中所用的试剂原料均有市售。本发明所述的禽腺病毒IV型penton基因引物序列见表1。

表1

实施例1

应用PCR方法检测禽腺病毒IV型

1、禽腺病毒IV型DNA的提取，采用天根生物公司的细胞/组织DNA提取试剂盒，方法参考说明书：

（1）取200µL病毒液，加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。在65℃水浴1小时，期间颠倒混合样品2-3次。从水浴锅中取出，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（2）加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（3）加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

（4）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

（5）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（6）向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（7）向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。

（8）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置3分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（9）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE（80℃水浴已预热），室温放置3分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

（10）将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

2、PCR扩增反应

（1）试剂： 宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）生产的Taq酶（5U/µl）；dNTPs（2.5mmol/L）；禽腺病毒IV型扩增penton基因引物，由宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）合成。

（2）扩增反应体系：扩增反应的总体积为20.0μL，其各种成分及终浓度分别为：10×buffer（不含Mg²⁺）2μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2μL，Taq酶（5U/µl）0.5µL，FADV4-F（10μmol/L））1μL，FADV4-R（10μmol/L）1μL,Mg²⁺（10μmol/L）1μL，DNA模板4μL,ddH₂O加至20μL。

（3）扩增反应过程：95℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。4℃保存。

4、扩增产物检测：取扩增产物5μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，应用凝胶成像系统观察结果。结果见图1。

结果说明：从电泳图可知，使用本发明的引物可以检测出禽腺病毒IV型。

实施例2

扩增禽腺病毒IV型penton基因的特异性试验：

1、 对照毒株包括：

2、病毒DNA提取：采用天根生物公司的细胞/组织DNA提取试剂盒，方法参考说明书。

3、病毒RNA提取：

（1）取200µL病毒液，加入0.6mL TRIZOL Reagent，漩涡震荡30s，室温静止5min。

（2）加入0.2mL的氯仿，漩涡震荡30s，室温静止5min。

（3）12000rpm 4℃离心10min，取上层液体，置于新的离心管中，加入800µL100%异丙醇（含0.01%DEPC），室温静止15min。

（4）12000rpm 4℃离心10min，弃去上清，沉淀为提取的RNA，吸水纸吸取余留的液体。

（5）病毒反转录为cDNA：

（6）反转录程序：30℃ 10min，42℃ 1h，99℃ 5min，4℃保存。

4、PCR扩增反应：

（1）试剂： 宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）生产的Taq酶（5U/µl）；dNTPs（2.5mmol/L）；禽腺病毒IV型扩增penton基因引物，由宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）合成。

（2）扩增反应体系：扩增反应的总体积为20.0μL，其各种成分及终浓度分别为：10×buffer（不含Mg²⁺）2μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2μL，Taq酶（5U/µl）0.5µL，FADV4-F（10μmol/L））1μL，FADV4-R（10μmol/L）1μL,Mg²⁺（10μmol/L）1μL，cDNA/DNA模板4μL,ddH₂O加至20μL。

（3）扩增反应过程：95℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。4℃保存。

5、扩增产物检测：取扩增产物5μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在凝胶成像系统下观察，结果见图2。

结果说明：从电泳图可知，本发明的引物能够特异性检测出禽腺病毒IV型，不能从禽流感病毒（AIV H9亚型）、新城疫病毒（NDV Lasota株）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV H120株）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV B87株）、鸡毒霉形体（支原体MG F36株）、禽呼肠孤病（ARV S1133株cDNA）、鸡马立克病病毒（MDV 814株）、减蛋综合征病毒（EDSV 76株）、鸡大肠杆菌（WW1株）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV K317株）、鸭瘟病毒（DPV CVCC AV1222株）的核酸中扩增出相应目的片段，再次证明该引物具有较好的特异性。

实施例3

扩增禽腺病毒IV型penton基因的敏感性试验：

1、按实例1的方法提取病毒DNA，用NanoDrop2000测定DNA浓度，然后用ddH₂O做10倍梯度稀释，每个稀释度的模板按照实例1进行PCR反应，以验证本方法的敏感性。

2、PCR扩增反应：

（1）试剂： 宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）生产的Taq酶（5U/µl）；dNTPs（2.5mmol/L）；禽腺病毒IV 型扩增penton基因引物，由宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）合成。

（2）扩增反应体系：扩增反应的总体积为20.0μL，其各种成分及终浓度分别为：10×buffer（不含Mg²⁺）2μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2μL，Taq酶（5U/µl）0.5µL，FADV4-F（10μmol/L））1μL，FADV4-R（10μmol/L）1μL,Mg²⁺（10μmol/L）1μL，DNA模板4μL,ddH₂O加至20μL.

（3）扩增反应过程：95℃预变性 5min；30个循环：94℃变性 30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min，4℃保存。

3、扩增产物检测：取扩增产物5μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在凝胶成像系统下观察。结果见图3。

结果说明：从电泳图可知，本发明的引物最低检测限为2.7×10^-4ng/µl。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市畜牧兽医研究所

<120> 一种用于检测禽腺病毒IV型的特异性引物及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 禽腺病毒IV型penton基因

<400> 1

acagccgtgc gcaccaactg cccgaac 27

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 禽腺病毒IV型penton基因

<400> 2

ctgcagatcc tcgtaggtaa taac 24

Claims (3)

1.一种用于检测禽腺病毒IV型penton基因的特异性引物，其特征在于：

上游引物FADV4-F：5'-ACAGCCGTGCGCACCAACTGCCCGAAC-3'；

下游引物FADV4-R：5'-CTGCAGATCCTCGTAGGTAATAAC-3'

扩增的禽腺病毒IV型penton基因目的片段为498bp。

2.采用权利要求1所述的用于检测禽腺病毒IV型penton基因的特异性引物进行非疾病诊断目的检测方法如下：

（1）提取病毒DNA；

（2）PCR扩增反应：

扩增反应体系：扩增反应的总体积为20.0μL，其各种成分及终浓度分别为：不含Mg²⁺10×buffer 2μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，5U/µl Taq酶 0.5µL，10μmol/L FADV4-F 1μL，10μmol/L FADV4-R 1μL, 10μmol/L Mg²⁺ 1μL，DNA模板4μL,ddH₂O加至20μL；

扩增反应过程：95℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min，4℃保存；

（3）扩增产物检测：取扩增产物5μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在凝胶成像系统下观察结果。

3.权利要求 1所述用于检测禽腺病毒IV型penton基因的特异性引物在制备检测禽腺病毒IV型penton基因的试剂中的应用。

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