CN107365849B - 基于POCKIT Micro荧光PCR平台的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒及应用 - Google Patents

基于POCKIT Micro荧光PCR平台的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒及应用，该试剂盒包含荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；荧光定量PCR反应液包括细粒、多房棘球绦虫上游通用引物，细粒、多房棘球绦虫下游通用引物，细粒、多房棘球绦虫通用探针，Taq酶，预混buffer和去离子水；细粒、多房棘球绦虫上游通用引物、下游通用引物的核苷酸序列和细粒、多房棘球绦虫通用探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本试剂盒设计针对两种包虫的通用引物和探针，一次检测即可确定结果，极大节约了时间，降低了检测成本。

Description

基于POCKIT Micro荧光PCR平台的犬细粒、多房棘球绦虫的试 剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒及应用。
背景技术
细粒、多房棘球蚴病蚴病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，在我国四川、青海、甘肃、宁夏、新疆等地区普遍存在，其中牦牛、羊是细粒棘球绦虫的中间宿主，草原鼠类是多房棘球绦虫的中间宿主，犬、狐均是这两种包虫的终末宿主。牛羊感染细粒棘球蚴后一方面严重影响其生长性能，另一方面感染细粒棘球蚴的牛羊内脏不经处理被犬、狐吞食是造成细粒棘球蚴病病流行的关键环节。草原上鼠类数量众多，是狐的主要食物，也很容易被犬捕食、因此，犬、狐也是是多房棘球绦虫的传染源。人作为两种包虫的不适宜的中间宿主，一旦感染，对健康危害极大，死亡率很高，治愈率极低。因此，对犬、狐粪便中虫卵的检测在包虫病的防控中具有重要意义。
目前基层动物检疫部门对犬、狐包虫病的检测主要用ELISA方法，特异性差，敏感度低，很容易和其它寄生虫造成交叉反应(如多头带绦虫等)，无法准确判定。而专门的实验室检测主要是PCR方法，需要专门的荧光PCR仪，价格昂贵。除此之外，目前这些PCR方法，均是针对多房或者细粒棘球绦虫单独设计的引物和探针，对一个样本，需检测2次，耗时，增大了成本，甚至会由于技术力量薄弱，无法操作。
因此迫切需要建立针对犬、狐粪便中包虫的简便快速的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒及应用，本发明是通过对细粒棘球绦虫G1株385条和多房棘球绦虫68条目的基因序列的比对分析，设计出通用引物和探针，然后基于POCKIT Micro平台的荧光PCR进行检测，操作简单、敏感性高、特异性强，结果易于判读；一次检测即可确定结果，极大节约了时间，降低了检测成本；可以对犬、狐粪便的检测提供科学依据，对保障人畜健康、提高公共卫生安全水平具有重要意义。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的犬细粒、多房棘球绦虫的引物和探针，所述引物和探针包括：细粒、多房棘球绦虫上游通用引物、细粒、多房棘球绦虫下游通用引物和细粒、多房棘球绦虫通用探针，其中，
所述细粒、多房棘球绦虫上游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述细粒、多房棘球绦虫下游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述细粒、多房棘球绦虫通用探针如SEQ ID NO.3所示。
本发明还公开了一种上述的引物和探针在制备犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒方面的应用。
本发明还公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒，该试剂盒包括DNA模板、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；
所述荧光定量PCR反应液包括细粒、多房棘球绦虫上游通用引物3.5μL，细粒、多房棘球绦虫下游通用引物3.5μL，细粒、多房棘球绦虫通用探针1.5μL，Taq酶1.5μL，预混buffer 25μL，去离子水14μL，总量为49μL，DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL；
所述细粒、多房棘球绦虫上游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述细粒、多房棘球绦虫下游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述细粒、多房棘球绦虫通用探针如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，Taq酶的终浓度为6U·μL-1，细粒、多房棘球绦虫上游通用引物和细粒、多房棘球绦虫下游通用引物的终浓度均为600nM，细粒、多房棘球绦虫通用探针的终浓度为400nM。
进一步地，所述阳性对照品为：含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述阴性对照品为：无ND1基因片段的pEASY-T1空载体。
进一步地，含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，由以下方法制备得到：
1)利用细粒、多房棘球绦虫上游通用引物和细粒、多房棘球绦虫下游通用引物，以细粒棘球绦虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因的PCR扩增产物；
2)将PCR扩增产物克隆到pEASY-T1载体上，构建含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒；
3)抽提质粒，定量并稀释至103拷贝/μl，制备得到含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，即为阳性对照品。
本发明还公开了一种上述的试剂盒定性检测犬细粒、多房棘球绦虫的方法，包括以下步骤：
a)采用OMEGA Stool DNA Kit基因组提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为1.5ng/μl，制备得到DNA提取液；
b)以提取得到的DNA作为模板，加入到装有荧光定量PCR反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入等体积的阳性对照模板和阴性对照模板，将PCR管放置到POCKIT Micro荧光PCR仪中进行检测，42分钟以后判读结果。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明提供了一种犬细粒、多房棘球绦虫的荧光PCR检测试剂盒设计针对两种包虫的通用引物和通用探针，一次检测即可确定结果，极大节约了时间，降低了检测成本。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明犬细粒、多房棘球绦虫阳性样本灵敏度检测结果；其中，1：105；2：104；3：103；4：80。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明实施例中通用粪便基因组提取试剂盒采用OMEGA有限公司产品，POCKITMicro仪器(厦门金瑞鸿捷公司)；引物、探针设计与合成均由六合华大公司完成。酶及buffer均购自北京全式金公司。
本发明PCR特异性检测中所用的细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、肝片吸虫、前后盘吸虫、多头绦虫、犬蛔虫、贾地鞭毛虫、隐孢子虫、羊泡状带绦虫和日本血吸虫基因组DNA均由本实验室保存。
实施例1基于POCKIT Micro荧光PCR的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒
一种检测犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒，包括以下组分：
(1)DNA模板：采用OMEGA Stool DNA Kit基因组提取试剂盒从待检测的标本中提取的DNA；
(2)荧光定量PCR反应液：细粒、多房棘球绦虫上游通用引物3.5μL(终浓度600nM)，细粒、多房棘球绦虫下游通用引物3.5μL(终浓度600nM)，细粒、多房棘球绦虫通用探针1.5μL(终浓度400nM)，Taq酶1.5μL(终浓度5U·μL-1)，预混buffer 25μL，去离子水14μL，总量为49μL，DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL；
细粒、多房棘球绦虫上游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述细粒、多房棘球绦虫下游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述细粒、多房棘球绦虫通用探针如SEQ ID NO.3所示，具体的核苷酸序列如表1所示。
(3)阳性对照品：含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
阳性对照品通过以下方式制备得到：采用细粒、多房棘球绦虫上游通用引物和细粒、多房棘球绦虫下游通用引物PCR扩增细粒棘球绦虫DNA，扩增出的ND1基因部分序列(SEQID NO.4)克隆到pEASY-T1(全式金公司)，转化后进行菌落PCR鉴定，阳性菌落培养后提取质粒进行测序。测序结果正确质粒采用NanoDrop2000精确定量，然后根据质粒分子量进行计算摩尔量，制备出103拷贝/μl的标准品用作为阳性对照品。
(4)阴性对照品：无ND1基因片段的pEASY-T1空载体，制备方法阳性对照品，制备出103拷贝/μl的无目的基因的pEASY-T1作为阴性对照品。
表1检测犬细粒、多房棘球绦虫的上下游引物和探针
Figure BDA0001375135360000051
实施例2用实施例1的方法定性检测犬细粒、多房棘球绦虫，具体方法为：
1)采用OMEGA Stool DNA Kit基因组提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为1.5ng/μl。
2)取1μL待检样本DNA作为模板加入到装有49μL荧光定量PCR反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入等体积的阳性对照品模板和阴性对照品模板，加样时注意避光操作。将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5s，避免出现气泡。
3)将PCR管放置到置于POCKIT Micro荧光PCR仪内，按运行键，即开始反应。
4)检测结果判定：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
实施例3基于POCKIT Micro荧光PCR仪的细粒棘球蚴标准品的制备和灵敏性检测
按照实施例1的方法制备阳性对照品；采用NanoDrop2000精确定量，然后根据质粒分子量进行计算摩尔量，制备出105、104、103和80拷贝/μl的阳性标准品用于灵敏性检测。
选择犬细粒、多房棘球绦虫上下游引物各3.5μL(终浓度600nM)、细粒、多房棘球绦虫通用探针1.5μL(终浓度400nM)、Taq酶1.5μL(5U·μL-1)、预混buffer 25μL、细粒棘球绦虫阳性对照品模板1μL(105拷贝/50μl)、ddH2O 14μL，共50μL，装入PCR反应管中，对照管中分别加入等体积的104拷贝/50μl细粒棘球绦虫阳性对照品模板、103拷贝/50μl细粒棘球绦虫阳性对照品模板和80拷贝/50μl细粒棘球绦虫阳性对照品模板；进行扩增反应，各反应管放入POCKIT Micro反应孔，按“运行键”即可，42分钟后反应结束，结果如图1所示：其中，1：105；2：104；3：103；4：80；说明本方法灵敏性最高为80个拷贝。由于检测的样本不同，引物和探针的设计难度也有很大不同，例如，有些检测的样本是脏器，例如：牛羊检测的样本，样本简单，涉及到的病原较少，引物和探针设计比较容易；本发明检测的样本是犬粪，样本复杂，除了排除无关的寄生虫，还需要排除粪便中的细菌，食物残渣等成分；引物和探针设计难度大。
实施例4基于POCKIT Micro荧光PCR仪的细粒棘球蚴特异性检测
按照实施例2的方法进行细粒棘球蚴特异性检测，模板分别为细粒棘球绦虫G1株、多房棘球绦虫、肝片吸虫、前后盘吸虫、多头绦虫、犬蛔虫、贾地鞭毛虫、隐孢子虫、羊泡状带绦虫DNA，针对每个虫体配制2个反应体系，分别采用本发明POCKIT Micro和ABI 7300型PCR仪进行检测，其中，ABI 7300型PCR仪进行的是Real time PCR反应，实验结果如表2所示。
表2基于POCKIT Micro荧光PCR仪的细粒棘球蚴特异性检测
Figure BDA0001375135360000071
从表2可以看出，相对于ABI 7300型PCR仪的检测方法而言，本方法特异性强，只能检出细粒、多房棘球绦虫，其它无关寄生虫均无法检出。
实施例5基于POCKIT Micro荧光PCR仪的临床样本检测
1.临床样本DNA提取
临床样本：200份包虫病流行疫区采集的犬粪，样本采用OMEGA Stool DNA Kit基因组提取试剂盒提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为1.5ng/μl,提取的DNA用于ABI7300型PCR仪和POCKIT Micro荧光PCR仪。
2.样本检测
将提取的DNA作为模板，采用实施例2中的检测方法进行检测，同时采用ABI 7300型PCR仪和和POCKIT Micro荧光PCR仪对提取的DNA进行检测，DNA模板的用量以及其余的试剂盒用量均相同。
3.检测结果
表3 200个临床样本检测结果
Figure BDA0001375135360000081
检测结果如表3所示，阳性代表感染细粒或多房棘球绦虫，本方法和采用Realtime PCR检测结果完全一致，效力相当。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南民族大学
<120> 基于POCKIT Micro荧光PCR平台的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒及应用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtactggtt ggggtggtta caa 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcctcaaacc taacagatcc aaaa 24
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacatcgaac agacctt 17
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> 细粒棘球绦虫ND1基因
<400> 4
tgtactggtt ggggtggtta caacaattat tcatttttaa ggtcggttcg atgtgctttt 60
ggatctgtta ggtttgaggc 80

Claims (3)

1.一种基于POCKIT Micro荧光PCR的犬细粒、多房棘球绦虫的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括DNA模板、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；
所述荧光定量PCR反应液包括细粒、多房棘球绦虫上游通用引物3.5μL，细粒、多房棘球绦虫下游通用引物3.5μL，细粒、多房棘球绦虫通用探针1.5μL，Taq酶1.5μL，预混buffer 25μL，去离子水14μL，总量为49μL，DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL；
所述细粒、多房棘球绦虫上游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述细粒、多房棘球绦虫下游通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述细粒、多房棘球绦虫通用探针如SEQ ID NO.3所示；
Taq酶的终浓度为6U•μL-1，细粒、多房棘球绦虫上游通用引物和细粒、多房棘球绦虫下游通用引物的终浓度均为600nM，细粒、多房棘球绦虫通用探针的终浓度为400nM；
所述阳性对照品为：含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述阴性对照品为：无ND1基因片段的pEASY-T1空载体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，由以下方法制备得到：
1）利用细粒、多房棘球绦虫上游通用引物和细粒、多房棘球绦虫下游通用引物，以细粒棘球绦虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因的PCR扩增产物；
2）将PCR扩增产物克隆到pEASY-T1载体上，构建含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒；
3）抽提质粒，定量并稀释至103拷贝/μl，制备得到含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，即为阳性对照品。
3.权利要求1所述的试剂盒定性检测犬细粒、多房棘球绦虫的方法，其特征在于，所述方法为非疾病的诊断和治疗目的；包括以下步骤：
a）采用OMEGA Stool DNA Kit 基因组提取试剂盒从待检测的标本中提取 DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为1.5ng/μl，制备得到DNA 提取液；
b）以提取得到的DNA作为模板，加入到装有荧光定量PCR反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入等体积的阳性对照模板和阴性对照模板，将PCR管放置到POCKIT Micro荧光PCR仪中进行检测，42分钟以后判读结果。
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