CN113637774B - 一种ddPCR检测包虫病的扩增引物及其构建方法、应用 - Google Patents

Abstract

ddPCR检测肝包虫病的引物构建方法、扩增引物及其应用，该方法包括以下步骤：筛选细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同基因片段，基于共同基因片段设计多个第一引物；采用第一引物扩增第一病患组的血浆cfDNA样本，将能够扩增第一病患组的血浆cfDNA样本的第一引物作为第二引物；采用反应体系包括第二引物的ddPCR检测第二病患组的血浆cfDNA样本，筛选出阳性检出率大于预设值的第二引物作为目标扩增引物。本发明得到的扩增引物能够扩增释放进入外周血液中的以血浆游离DNA的形式存在的棘球绦虫的DNA片段，结合ddPCR方法能够通过检测人体血浆诊断是否感染包虫病，实现了细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的超早期诊断，为研发包虫病精准疗法提供了足够灵敏的检测工具。

Description

一种ddPCR检测包虫病的扩增引物及其构建方法、应用

技术领域

本发明涉及包虫病诊断领域，具体涉及一种基于微滴数字PCR检测外周血的肝包虫病的扩增引物的构建方法，以及通过该方法筛选得到的扩增引物及其应用。

背景技术

包虫病，又称棘球蚴病，是因棘球绦虫幼虫寄生于人或动物体内，引起的一种人兽共患的寄生虫病。包虫病的感染可导致肝、肺、脑及骨骼等器官和组织的损害，病人丧失劳动能力，是部分农牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因之一。

中国的包虫病主要包括囊型包虫病(cystic echinococcosis,CE)和泡型包虫病(alveolar echinococcosis,AE)，其中，囊型包虫病由细粒棘球绦虫(Echinococcosisgranulosus,Eg)的幼虫棘球蚴寄生人体组织器官所致，而泡型包虫病由多房棘球绦虫(Echinococcosis multilocularis,Em)的幼虫泡球蚴寄生所致。

为了实现包虫病的可防、可控、可治的目标，需要在传染源、传播途径、疾病早期阶段进行全面布控，积极筛查早期感染病例。但是，棘球蚴因其独特的病理特点、疾病轨迹，早期诊断十分困难，现有诊断方法的精度和准确度难以满足早诊断、早治疗的需求。

传统的包虫病诊断方法中，B超、CT等影像技术以及病理检查因自身限制，容易造成小病灶、非典型病灶的误诊、漏诊和分型困难。血清筛查缺乏有效手段，ELISA，IHA和dot-ELISA等免疫学检测敏感性较低，不适用于人群筛查及随访。专利CN107164479A公开了一种用于检测和鉴定人组织包虫病病原的引物对组合及试剂盒，其基于细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫已知的数个基因型设计多重PCR引物，采用多重PCR方法检测和鉴定三种人包虫病病原；专利CN109762910A提供了一种用于同时检测两型包虫病的引物及试剂盒，能够实现通过单管PCR扩增即可对三个棘球绦虫种单独或混合感染引起的两型包虫病进行诊断和鉴别。

但是，现有的包虫病检测试剂盒的引物主要扩增人体的病灶组织的DNA，这类试剂盒及扩增引物的仅能检测出病灶中的包虫病病原体，无法在包虫对人体造成不可逆的影响前发现病灶，查出的包虫病人均出现了不可逆的器官损伤，故亦无法满足早诊断、早治疗的需求。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基于微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测肝包虫病的扩增引物的构建方法，通过该构建方法得到的扩增引物能够扩增释放进入外周血液中的血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)，之后利用ddPCR检测血浆样本中拷贝数即可判断样本是否为阳性，解决了现有技术中仅能检测病灶组织而造成的无法实现早诊断的问题，实现了细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的超早期诊断，可有效地缩短药物治疗效果段判断期，为研发包虫病精准疗法提供了足够灵敏的检测工具。

具体地，该目的通过下述技术方案实现：

一种ddPCR检测包虫病的扩增引物的构建方法，该方法具体包括以下步骤：

(A)筛选细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同基因片段，基于所述共同基因片段设计多个第一引物；

(B)采用包含所述第一引物的多重PCR芯片扩增第一病患组的血浆cfDNA样本，将能够扩增第一病患组的血浆cfDNA样本的第一引物作为第二引物；

(C)采用反应体系包括第二引物的ddPCR检测第二病患组的血浆cfDNA样本，筛选出阳性检出率大于预设值的第二引物作为ddPCR检测包虫病的扩增引物。

血浆游离DNA是在循环血液中游离的DNA核酸片段，主要来源于细胞凋亡和细胞裂解，在炎症、肿瘤及寄生虫感染过程中，cfDNA将会大量释放进入外周血液循环。发明人经过前期研究数据证实，棘球绦虫的DNA片段会以cfDNA的形式存在于感染人群的外周血液中。因此，如果能够检测出人体的外周血液中的cfDNA是否具有棘球绦虫的DNA，即可在包虫对人体造成不可逆的器官损伤前诊断出是否感染包虫病，从而能够早于传统的影像技术诊断方法或者针对人体病灶组织的核酸检测方法，真正意义上实现细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的超早期诊断。

因此，本发明提供了一种检测血浆中cfDNA的微滴数字PCR的扩增引物构建方法，以得到能够扩增释放进入外周血液中的血浆游离DNA的引物。

具体地，本技术方案中，首先筛选得到细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同基因片段。在部分实施例中，基于细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫以及其余人类易感且已知全基因组数据的绦虫的全基因组数据，进行BLAST比对、mummer比对，排除了人类基因组、非细粒或多房棘球绦虫基因组的污染影响，筛选出细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同基因片段。

筛选出共同基因片段后，基于所述共同基因片段进行引物设计，构建包含多个第一引物的多重PCR芯片，优选地，所述多重PCR芯片中的第一引物数量大于200个，进一步优选地，所述多重PCR芯片中的第一引物数量大于400个。在一个或多个实施例中，采用多重PCR芯片对囊型和泡型包虫病患者病灶组织的DNA提取物进行检测，检测覆盖度分别可达到89.29％和90.15％。

利用包含多个第一引物的多重PCR芯片对已确诊包虫病的第一病患组的患者血浆中的循环游离DNA样本进行检测，从第一引物中挑选出能够扩增第一病患组的至少一个血浆样本中的cfDNA的第一引物作为待进一步筛选的第二引物。

最后，利用第二引物，结合新提取的第二病患组中确诊包虫病患者的血浆cfDNA样本，通过ddPCR筛选适合通过ddPCR方式检测cfDNA样本的第二引物作为构建目标引物。该目标引物可以在一定数量的样本中获得阳性结果，即阳性检出率应当大于预设值。

通过上述方法构建得到的扩增引物能够扩增释放进入外周血液中的以血浆游离DNA的形式存在的棘球绦虫的DNA片段，结合ddPCR方法能够通过检测人体血浆诊断是否感染包虫病，实现了细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的超早期诊断，可有效地缩短药物治疗效果段判断期，为研发包虫病精准疗法提供了足够灵敏的检测工具，有望在包虫病核酸诊断技术基础上，建立早诊断、早治疗的规范化防治策略。

作为本发明中共同基因片段的一种优选筛选方式，具体包括以下步骤：

(A1)获取基因组数据，获取细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、近亲缘关系绦虫组、以及人类的基因组数据；

(A2)排除人类基因影响，细粒棘球绦虫的基因组、多房棘球绦虫的基因组分别与人类基因组比对，排除细粒棘球绦虫的基因组中与人类基因组相同的基因片段，得到第一细粒棘球绦虫基因片段；排除多房棘球绦虫的基因组中与人类基因组相同的基因片段，得到第一多房棘球绦虫基因片段；

(A3)排除近亲缘关系绦虫基因影响，第一细粒棘球绦虫基因片段、第一多房棘球绦虫基因片段分别与近亲缘关系绦虫组的基因组比对，排除第一细粒棘球绦虫基因片段中与近亲缘关系绦虫组的基因组相同的基因片段，得到第二细粒棘球绦虫基因片段，排除第一多房棘球绦虫基因片段中与近亲缘关系绦虫组的基因组相同的基因片段，得到第二多房棘球绦虫基因片段；

(A4)筛选共同基因片段，比对第二细粒棘球绦虫基因片段和第二多房棘球绦虫基因片段，筛选出相同的基因片段作为所述共同基因片段。

本技术方案中，基于细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫以及其余人类易感且已知全基因组数据的绦虫的全基因组数据，进行BLAST比对、mummer比对，排除了人类基因组、非细粒或多房棘球绦虫基因组的污染影响，筛选出细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同基因片段来构建具有多个第一引物的多重PCR芯片。

现有技术中，例如专利CN107164479A、专利CN109762910A等主要基于数个基因型或者线粒体基因进行设计，虽然能够具备较强的特异性和较高的灵敏度，但是这些引物在推广到临床包虫病患者肝脏感染病灶时，容易出现假阴性或假阳性的结果，造成误诊。

发明人发现，现有技术中的引物对存在上述问题的主要原因在于未对基因片段进行筛选，这些基因片段可能与人类基因组或近亲缘关系绦虫的基因组重叠，导致基于这类基因片段的引物在扩增人类组织时更容易出现假阳性，造成误诊；同时，引物在设计时所针对的待检测DNA主要为绦虫虫体DNA样本，在临床中还容易出现假阴性的结果。因此，本技术方案中，改变了现有技术中直接获取已公开的绦虫特定基因片段的基因获取思路，从细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的全基因组数据出发，进行人类基因组排除、近亲缘关系绦虫组基因组排除两次筛选，得到具有高度特异性的共同基因片段，再基于共同基因片段设计第一引物，从而得到特异性更强的第一引物，确保在临床样本检测中具有更强的特异性和更高的灵敏度。

具体地，本技术方案中，首先获取基因组数据。可以在Genbank等公开数据库中下载到细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、近亲缘关系绦虫组、以及人类的基因组序列。优选地，所采用的基因组序列为全基因组序列。

之后，排除人类基因影响。运用超算平台进行比对计算，将细粒棘球绦虫的基因组与人类基因组进行BLAST比对分析，比较细粒棘球绦虫的基因组与人类基因组之间的共同片段和差异片段，排除共同片段后的差异片段即为第一细粒棘球绦虫基因片段。同理，比对多房棘球绦虫的基因组和人类基因组，筛选得到的多房棘球绦虫的基因组与人类基因组之间的差异片段即为第一多房棘球绦虫基因片段。优选地，所述基因片段的长度相同。进一步优选地，所述基因片段的长度为15bp。在一个或多个实施例中，近亲缘关系绦虫组中的各个与细粒棘球绦虫或多房棘球绦虫亲缘关系较近的绦虫基因组分别与人类基因组进行BLAST比对分析，筛选得到的差异片段再与第一细粒棘球绦虫基因片段、第一多房棘球绦虫基因片段比对。

接下来，排除近亲缘关系绦虫基因影响。第一细粒棘球绦虫基因片段与近亲缘关系绦虫组的基因组进行mummer比对，比对后排除第一细粒棘球绦虫基因片段、第一多房棘球绦虫基因片段中与近亲缘关系绦虫组的基因组相同的基因片段，筛选得到的差异片段即为第二细粒棘球绦虫基因片段和第二多房棘球绦虫基因片段。此时，第二细粒棘球绦虫基因片段和第二多房棘球绦虫基因片段均已排除人类基因和近亲缘关系绦虫基因的影响。

最后，筛选共同基因片段。得到的第二细粒棘球绦虫基因片段和第二多房棘球绦虫基因片段，通过mummer比对两者的相同的基因片段，将相同的基因片段作为共同基因片段。

通过上述筛选方法，共同基因片段排除了人类基因组和近亲缘关系绦虫基因组的影响，相较于现有技术中直接采用数个特定基因型的方式，从根源上避免了由于待检测组织DNA中存在的人类基因或近亲缘关系绦虫基因所导致的假阳性，特异性引物的准确率更高、特异性更强，显著增强了引物对和试剂盒的临床应用效果。

进一步地，筛选能够扩增第一病患组中多个不同的血浆cfDNA样本的第二引物作为第三引物，并采用反应体系包括第三引物的ddPCR检测第二病患组的血浆cfDNA样本，筛选出阳性检出率大于预设值的第三引物作为ddPCR检测包虫病的扩增引物。本技术方案中，在从第一引物中挑选出能够扩增第一病患组的至少一个血浆cfDNA样本的第一引物作为待进一步筛选的第二引物后，从第二引物中挑选出可重复性较高的引物作为第三引物。此处的可重复性较高是指，能够扩增第一病患组中至少两个血浆cfDNA样本的引物，在部分实施例中，可重复性较高是指能够扩增第一病患组中至少五个血浆cfDNA样本的引物。筛选得到的第三引物代替第二引物应用于ddPCR的反应体系进行目标引物筛选。

本发明还提供基于前述任一种构建方法得到的用于ddPCR检测包虫病的扩增引物。ddPCR技术结合了液滴微流控芯片与数字PCR技术，随着微滴式数字PCR仪的问世，相关研究手段和检测方法实现了巨大的跨越，ddPCR技术在微生物检测、转基因检测、疾病检测以及质检领域中已凸显优势。ddPCR检测的主要步骤包括提取待测样品的DNA，配制包含上述扩增引物的反应体系，将反应体系置于微滴生成仪中进行微滴生成，对生成的微滴进行PCR扩增，对扩增产物进行微滴读数，判断是否为阳性微滴。本技术方案利用ddPCR检测血浆cfDNA样本，具有高度灵敏、绝对定量、高效方便的优点。

本发明还提供所述扩增引物在制备包虫病的检测试剂中的应用，例如试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种基于ddPCR检测肝包虫病的扩增引物，该扩增引物中的两组引物对联合用于ddPCR检测血浆样本中的cfDNA时，特异性为100％，灵敏度可高达90.63％，达到比目前临床使用的ELISA法更好的检测效果。

具体地，该目的通过下述技术方案实现：

所述扩增引物包括第五引物对和第六引物对，其中，所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

本发明还提供上述扩增引物在ddPCR检测包虫病中的应用，两组引物对在应用时联合采用，若所述第五引物对或所述第六引物对的血浆样本检测结果为阳性，也即两组引物对中至少一组引物对的血浆cfDNA样本检测结果为阳性，则所述血浆样本的检测结果为阳性。

进一步地，确定第五引物对和第六引物对在进行ddPCR时的分界线。具体地，建立阴性对照组和实验组，其中阴性对照组为正常人的血浆样本，实验组为确诊包虫病患者的血浆样本。采用第五引物对的ddPCR将各阴性对照组的血浆样本中拷贝数的最大值设置为分界线，拷贝数小于或等于分界线的为阴性，拷贝数大于分界线的为阳性；同理地，采用第六引物对的ddPCR将各阴性对照组的血浆样本中拷贝数的最大值设置为分界线，拷贝数小于或等于分界线的为阴性，拷贝数大于分界线的为阳性。优选地，通过筛选，确定所述第五引物对的ddPCR的拷贝数分界线为0.23，当血浆样本中拷贝数大于0.23时检测结果为阳性，血浆样本中拷贝数小于或等于0.23时检测结果为阴性；采用所述第六引物对的ddPCR的拷贝数分界线为0.16，当血浆样本中拷贝数大于0.16时检测结果为阳性，血浆样本中拷贝数小于或等于0.16时检测结果为阴性。

本发明的又一个目的在于提供一种基于前述构建方法得到的扩增引物的试剂盒。该试剂盒能够同时检测出血浆中是否含有细粒棘球绦虫或多房棘球绦虫，提高了检测效率，同时能够实现包虫的超早期诊断，此外，引物的高特异性使得检测结果准确、可靠，降低了假阳性或假阴性结果的误诊概率，避免重复检测。

进一步地，所述试剂盒包括PCR扩增体系。

进一步地，所述PCR扩增体系包括DNA聚合酶和无核酸酶水。

本发明提供上述任一种试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

提取待检测的血浆cfDNA样本；

配制包含第一引物和第二引物的反应体系；

将所述反应体系置于微滴生成仪中进行微滴生成；

对生成的微滴进行PCR扩增；

对扩增产物进行微滴读数，判断是否为阳性微滴。

两组引物对中至少一组引物对的血浆cfDNA样本检测结果为阳性，则所述血浆样本的检测结果为阳性。

本技术方案中，试剂盒的使用方法既可用于诊断是否感染细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫，也可用于进行直接目的为非获得诊断结果或健康状况的检测。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明构建得到的扩增引物能够扩增释放进入外周血液中的以血浆游离DNA的形式存在的棘球绦虫的DNA片段，结合ddPCR方法能够通过检测人体血浆诊断是否感染包虫病，实现了细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的超早期诊断，可有效地缩短药物治疗效果段判断期，为研发包虫病精准疗法提供了足够灵敏的检测工具，有望在包虫病核酸诊断技术基础上，建立早诊断、早治疗的规范化防治策略；

2、本发明提供的共同基因片段筛选方法排除了人类基因组和近亲缘关系绦虫基因组的影响，相较于现有技术中直接采用数个特定基因型的方式，从根源上避免了由于待检测组织DNA中存在的人类基因或近亲缘关系绦虫基因所导致的假阳性，特异性引物的准确率更高、特异性更强，显著增强了引物对和试剂盒的临床应用效果；

3、本发明提供的一种基于ddPCR检测肝包虫病的扩增引物，该扩增引物中的两组引物对联合用于ddPCR检测血浆样本中的cfDNA时，特异性为100％，灵敏度可高达90.63％，达到比目前临床使用的ELISA法更好的检测效果；

4、本发明基于扩增引物得到试剂盒能够同时检测出血浆中是否含有细粒棘球绦虫或多房棘球绦虫，提高了检测效率，同时能够实现包虫的超早期诊断，此外，引物的高特异性使得检测结果准确、可靠，降低了假阳性或假阴性结果的误诊概率，避免重复检测。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本发明的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明具体实施例中扩增引物构建方法的流程框图；

图2示出了本发明具体实施例中采用第五引物对(primer No.351)的ddPCR检测10例阴性对照组NC1～NC10和32例确诊包虫病患者(T1～T32)的血浆cfDNA样本的拷贝数结果；

图3示出了本发明具体实施例中采用第六引物对(primer No.361)的ddPCR检测10例阴性对照组NC1～NC10和32例确诊包虫病患者(T1～T32)的血浆cfDNA样本的拷贝数结果；

图4示出了对比例中采用ELISA试剂盒检测10例阴性对照组NC1～NC10和32例确诊包虫病患者(T1～T32)的血浆cfDNA样本的S/CO值；

图5为本发明具体实施例中第五引物对和第六引物对联用时的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明所涉及的技术为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。

本发明所使用的“第一”、“第二”等(例如第一引物、第二引物，第五引物对、第六引物对等)只是为了描述清楚起见而进行区别，不旨在限制任何次序或者强调重要性等。

【实施例1】

如图1所示的一种ddPCR检测包虫病的扩增引物的构建方法，具体包括以下步骤：

(A)筛选细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同基因片段，基于所述共同基因片段设计多个第一引物；

(B)采用所述第一引物扩增第一病患组的血浆cfDNA样本，将能够扩增第一病患组的血浆cfDNA样本的第一引物作为第二引物；

(C)采用反应体系包括第二引物的ddPCR检测第二病患组的血浆cfDNA样本，筛选出阳性检出率大于预设值的第二引物作为ddPCR检测包虫病的扩增引物。

在部分实施例中，所述预设值为90％，在一个或多个实施例中，所构建的目标引物必须在所有血浆cfDNA样本中获得阳性检测结果。

通过上述方法构建得到的扩增引物能够扩增释放进入外周血液中的以血浆游离DNA的形式存在的棘球绦虫的DNA片段，结合ddPCR方法能够通过检测人体血浆诊断是否感染包虫病，实现了细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的超早期诊断，可有效地缩短药物治疗效果段判断期，为研发包虫病精准疗法提供了足够灵敏的检测工具，有望在包虫病核酸诊断技术基础上，建立早诊断、早治疗的规范化防治策略。

在部分实施例中，共同基因片段的筛选方式具体包括以下步骤：

(A1)获取基因组数据，获取细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、近亲缘关系绦虫组、以及人类的基因组数据；

(A2)排除人类基因影响，细粒棘球绦虫的基因组、多房棘球绦虫的基因组分别与人类基因组比对，排除细粒棘球绦虫的基因组中与人类基因组相同的基因片段，得到第一细粒棘球绦虫基因片段；排除多房棘球绦虫的基因组中与人类基因组相同的基因片段，得到第一多房棘球绦虫基因片段；

(A3)排除近亲缘关系绦虫基因影响，第一细粒棘球绦虫基因片段、第一多房棘球绦虫基因片段分别与近亲缘关系绦虫组的基因组比对，排除第一细粒棘球绦虫基因片段中与近亲缘关系绦虫组的基因组相同的基因片段，得到第二细粒棘球绦虫基因片段，排除第一多房棘球绦虫基因片段中与近亲缘关系绦虫组的基因组相同的基因片段，得到第二多房棘球绦虫基因片段；

(A4)筛选共同基因片段，比对第二细粒棘球绦虫基因片段和第二多房棘球绦虫基因片段，筛选出相同的基因片段作为所述共同基因片段。

在部分实施例中，近亲缘关系绦虫组包括微口膜壳绦虫、链状带绦虫、锯齿状绦虫、石渠棘球绦虫中的至少一种。在部分实施例中，近亲缘关系绦虫组也可包括其他已知全基因组数据且人类易感染的绦虫类型。

在一个或多个实施例中，所述共同基因片段均满足以下条件：0.4≤GC％≤0.7，发卡dG＝0，二聚体分值≤4，以及1个错配。其中，GC％指基因序列中的GC含量，发卡dG＝0是指绦虫基因片段和共同基因片段比对时，所形成的发卡结构中，其最小自由能为0，也即没有发卡结构，通过限定二聚体的分值使得发生二聚体的可能性很小，1个错配系指所需的基因片段顶多具有一个错配。上述条件设置得到绦虫基因组特异的区域，在人类基因组上没有相似的基因片段。基于特异的基因片段设计的引物只会扩增共同基因片段，不会扩增人类基因组，从根源上避免了给检测带来假阳性。

在一个或多个实施例中，筛选条件还包括：比对到人类基因与绦虫的基因组上时取唯一，即取只能比对到绦虫上，不能比对到人基因组上的序列；以及比对到人类基因与绦虫的基因组上时取三个错配以下的比对情况，即在人类基因组上没有与绦虫基因组特异区域相似的片段，此处的相似是指大于三个错配以上的比对。

通过上述筛选方法，共同基因片段排除了人类基因组和近亲缘关系绦虫基因组的影响，相较于现有技术中直接采用数个特定基因型的方式，从根源上避免了由于待检测组织DNA中存在的人类基因或近亲缘关系绦虫基因所导致的假阳性，特异性引物的准确率更高、特异性更强，显著增强了引物对和试剂盒的临床应用效果。

在部分实施例中，筛选能够扩增第一病患组中多个不同的血浆cfDNA样本的第二引物作为第三引物，并采用反应体系包括第三引物的ddPCR检测第二病患组的血浆cfDNA样本，筛选出阳性检出率大于预设值的第三引物作为ddPCR检测包虫病的扩增引物。

【实施例2】

在实施例1的基础上，采用该构建方法筛选扩增引物，包括以下步骤：

基于细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫以及其余人类易感且已知全基因组数据的绦虫的全基因组数据，进行BLAST比对、mummer比对，排除了人类基因组、非细粒或多房棘球绦虫基因组的污染影响，筛选出细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫共同的基因片段；

基于这些共同的基因片段，构建了一种包含了462对引物的多重PCR芯片，通过该芯片对囊型和泡型包虫病患者病灶组织的DNA提取物进行检测，其检测覆盖度分别可达到89.29％和90.15％；

利用该芯片对第一病患组中41例确诊包虫病患者血浆中的循环游离DNA样本进行检测，从芯片中筛选出78对能够对cfDNA样本进行扩增的第一引物。从78对第一引物中，进一步筛选出13对具有较高可重复性的第三引物，所述13对第三引物能够在至少两例血浆cfDNA样本中检出。在一个或多个实施例中，所述第三引物能够在至少五例血浆cfDNA样本中检出。

上述13对第三引物为候选引物，结合第二病患组中21例确诊包虫病患者(不同于第一病患组中的41例患者)的血浆cfDNA样本，通过ddPCR筛选适合通过ddPCR方式检测血浆cfDNA样本的第三引物，发现第五引物对和第六引物对可以在所有21例样本中获得阳性结果。

基于上述构建方法，得到ddPCR检测包虫病的扩增引物，所述扩增引物包括第五引物对和第六引物对，其中，

第五引物对：

上游引物：5'-GCAAAATAGTTGTACACGTGTGATATGTT-3'(SEQ ID NO.1)

下游引物：5'-CAAGTACTATGCCTTCTTTCATCTCCTTC-3'(SEQ ID NO.2)

第六引物对：

上游引物：5'-GTGAGGGTTTTCGTGAGTTGTTCACG-3'(SEQ ID NO.3)

下游引物：5'-TATCATCGTACGACGGTGTAATGAC-3'(SEQ ID NO.4)

若所述第五引物对或所述第六引物对的血浆样本检测结果为阳性，则所述血浆样本的检测结果为阳性。

进一步地，采用所述第五引物对的ddPCR的拷贝数分界线为0.23，当血浆样本中拷贝数大于0.23时检测结果为阳性，血浆样本中拷贝数小于或等于0.23时检测结果为阴性；采用所述第六引物对的ddPCR的拷贝数分界线为0.16，当血浆样本中拷贝数大于0.16时检测结果为阳性，血浆样本中拷贝数小于或等于0.16时检测结果为阴性。

为对比两对引物联用时与现有技术中成熟应用的ELISA的检测灵敏度，进行以下对比实验，实验体系、条件及方法如下：

1.血清样本中DNA的提取(QIAGEN循环DNA提取试剂盒)

(1)加入100μL蛋白酶K到5mL离心管中；

(2)加入1mL血清到5mL离心管中；

(3)加入0.8mL ACL，涡旋混匀30s(ACL加入10μg的carrier RNA)；

(4)60℃加热30min；

(5)加入1.8mL ACB到5mL离心管中，涡旋混匀15-30s；

(6)冰上放置5min；

(7)将液体转移到过滤柱中，13000rpm离心1min，弃废液；

(8)加入ACW1 600μL，13000rpm离心1min，弃废液；

(9)加入750μL ACW2，13000rpm离心1min，弃废液；

(10)加入750μL无水乙醇，13000rpm离心1min，弃废液；

(11)13000rpm离心2min；

(12)打开收集管的盖子，56℃加热10min；

(13)加入50μL AVE，室温放置3min，13000rpm离心1min，收集离心下来的DNA样本。

2.扩增体系

表1 ddPCR扩增体系

3.反应条件

温度升降速度为2℃/s。

4.反应步骤

(1)将扩增体系与70μL微滴生成油在微滴生成器中混合；

(2)将40μL水-油混合微滴转入96孔ddPCR板中；

(3)将96孔ddPCR板用锡箔纸热封，放入热循环仪中扩增；

(4)将扩增后的PCR产物放到微滴读取器上检测荧光信号，对目的DNA拷贝数进行定量。

5.特异性、灵敏度对比试验

基于上述实验体系、条件及方法，通过对32例确诊包虫病患者(T1～T32)和10例阴性对照(NC1～NC10)血浆样本中的cfDNA进行检测。

图2示出了采用第五引物对的ddPCR检测阴性对照组和确诊包虫病患者的血浆cfDNA样本的拷贝数结果。如图所示，将血浆样本中拷贝数的最大值0.23设置为分界线，拷贝数≤0.23copies/μL为阴性，拷贝数>0.23copies/μL为阳性。根据检测结果，实验组中32例确诊包虫病患者的血浆样本中有21例为阳性，11例为阴性；同时，通过将分界线设置为0.23，确保了阴性对照组的10例患者的检测结果均为阴性，特异性为100％(10/10)。

图3示出了采用第六引物对的ddPCR检测阴性对照组和确诊包虫病患者的血浆cfDNA样本的拷贝数结果。如图所示，将血浆样本中拷贝数的最大值0.16设置为分界线，拷贝数≤0.16copies/μL为阴性，拷贝数>0.16copies/μL为阳性。根据检测结果，实验组中32例确诊包虫病患者的血浆样本中有24例为阳性，8例为阴性；同时，通过将分界线设置为0.16，确保了阴性对照组的10例患者的检测结果均为阴性，特异性为100％(10/10)。

图4示出了对比例中采用ELISA试剂盒检测阴性对照组和确诊包虫病患者的血浆cfDNA样本的S/CO值。根据ELISA试剂盒的说明书，S/CO值≥1.1为阳性，0.9<S/CO值<1.1为可疑，S/CO值≤0.9为阴性。根据检测结果，实验组中32例确诊包虫病患者的血浆样本中有27例为阳性，5例为阴性。经计算可知，ELISA试剂盒针对血浆样本的包虫检测灵敏度为84.38％(27/32)，特异性为100％(10/10)。

如图5所示，将第五对引物和第六对引物的ddPCR结果联合分析发现，第五对引物和第六对引物联用时，若任意一对引物检测为阳性即判定该样本为阳性，使得实验组的32例确诊包虫病患者的血浆样本中有29例为阳性，3例为阴性，且阴性对照组的10例患者的检测结果均为阴性。经过计算，ddPCR(第五对引物/第六对引物)针对血浆样本的包虫检测灵敏度为90.63％(29/32)，特异性为100％(10/10)，优于目前临床上采用的ELISA法的检测效果。由此可见，利用ddPCR法检测血浆cfDNA不仅能够实现细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的超早期诊断，在包虫对人体造成不可逆的器官损伤前诊断出是否感染包虫病，而且采用了第五引物对和第六引物对的ddPCR检测血浆，具有比现有技术中更好的灵敏度，具有广泛的推广应用价值。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> ddPCR检测肝包虫病的引物构建方法、扩增引物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaaaatagt tgtacacgtg tgatatgtt 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagtactat gccttctttc atctccttc 29

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgagggttt tcgtgagttg ttcacg 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatcatcgta cgacggtgta atgac 25

Claims (4)

1.一种用于ddPCR检测包虫病的扩增引物，所述扩增引物包括第五引物对和第六引物对，其中，所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的扩增引物在制备包虫病的检测试剂中的应用。

3.用于检测人体血浆的包虫病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的扩增引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和无核酸酶水。