CN110628899A - 用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对及试剂盒 - Google Patents
用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对及试剂盒，所述引物对包括以6个基因作为非小细胞肺癌的甲基化标志物对应的6组引物序列，所述甲基化标志物为分别为：CALCA、DLEC1、HOXA9、TBX5、PITX2、RASSF1a，6组引物序列包括CALCA正向引物、CALCA反向引物、DLEC1正向引物、DLEC1反向引物、HOXA9正向引物、HOXA9反向引物、TBX5正向引物、TBX5反向引物、PITX2正向引物、PITX2反向引物、RASSF1a正向引物、RASSF1a反向引物。所述引物对还包括1个参照标志物β‑ACTIN对应的1组引物序列，具体包括β‑ACTIN正向引物和β‑ACTIN反向引物。本发明能够利用一次PCR反应检测同时检测多个非小细胞肺癌甲基化标志物的存在，提高非小细胞肺癌检测的准确性、特异性和敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及EB病毒检测的技术领域，尤其涉及一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对及试剂盒。
背景技术
DNA甲基化是重要的表观遗传学机制，是抑癌基因失活的关键机制之一，在某些情况下可能是唯一的机制。目前已证实非小细胞肺癌汇总有多个议案一件的甲基化提示非小细胞肺癌显示出CpG岛甲基化表型。作为肿瘤发生的早期事件，抑癌基因DNA异常甲基化检测可在患者出现临床表现或影像学证据前做到分子诊断。
ctDNA(circulating tumor DNA)：人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征(包括突变、缺少、插入、重排，拷贝数异常、甲基化等)来自肿瘤基因组的DNA片段。其在血液中浓度低，且高度碎片化，提取难度高，降低了临床检测的敏感性和特异性。现有技术中，一次甲基化特异性PCR反应只能检测单个基因的甲基化水平，无法准确的预测肺癌发生的可能性。同时，非小细胞肺癌抑癌基因的不确定性及ctDNA的局限性，导致单一非小细胞肺癌甲基化标志物检测无法满足临床需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对及试剂盒，旨在解决现有甲基化特异性PCR反应只能检测单个基因甲基化而无法准确预测肺癌发生的可能性的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对，包括以6个基因作为非小细胞肺癌的甲基化标志物对应的6组引物序列，所述甲基化标志物为分别为：CALCA、DLEC1、HOXA9、TBX5、PITX2、RASSF1a，所述6组引物序列具体表示如下：
CALCA正向引物：5’-CGGAATTTTTTCGATTTATAGC-3’；
CALCA反向引物：5’-AAAACCCTATAAAAACGACGAC-3’；
DLEC1正向引物：5’-GATTAAGCGATGACGGGATTC-3’；
DLEC1反向引物：5’-ACCCGACTAATAACGAAATTAACG-3’；
HOXA9正向引物：5’-GGTTAATGGGGGCGCGGGCGTC-3’；
HOXA9反向引物：5’-TCATATAACAACTTAATAACACCG-3’；
TBX5正向引物：5’-GGGACGCGTAAAATTTAGAATC-3’；
TBX5反向引物：5’-AACACAAAACCGAAAAACGTC-3’；
PITX2正向引物：5’-CGTTATTAGTTGAAGGTAAGGTCG-3’；
PITX2反向引物：5’-AACACCGAAAAATACAATCCG-3’；
RASSF1a正向引物：5’-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3’；
RASSF1a反向引物：5’-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3’。
优选的，所述的用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对还包括1个参照标志物β-ACTIN对应的1组引物序列，具体表示如下：
β-ACTIN正向引物：5’-TTTTTAGGGAGGAGT TGGAAGTAGT-3’；
β-ACTIN反向引物：5’-AAAATATACC CTCCCCCATA CC-3’。
另一方面，本发明还提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对在制备非小细胞肺癌检测试剂中的应用。
另一方面，本发明还提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒，包括所述的引物对以及PCR反应体系，其中：
所述PCR反应体系包括1.8×PCR溶液、5mM的MgCl2、0.3nM的脱氧核糖核苷三磷酸以及2.5个单元的DNA聚合酶；
所述引物对的浓度分别为40nM的CALCA正向引物、40nM的CALCA反向引物、40nM的DLEC1正向引物、40nM的DLEC1反向引物、120nM的HOXA9正向引物、120nM的HOXA9反向引物、20nM的PITX2正向引物、20nM的PITX2反向引物、20nM的TBX5正向引物、20nM的TBX5反向引物、280nM的RASSF1a正向引物、280nM的RASSF1a反向引物。
优选的，本发明还提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒，包括所述的引物对以及PCR反应体系，其中：
所述PCR反应体系包括1.8×PCR溶液、5mM的MgCl2、0.3nM的脱氧核糖核苷三磷酸以及2.5个单元的DNA聚合酶；
所述引物对的浓度分别为40nM的CALCA正向引物、40nM的CALCA反向引物、40nM的DLEC1正向引物、40nM的DLEC1反向引物、120nM的HOXA9正向引物、120nM的HOXA9反向引物、20nM的PITX2正向引物、20nM的PITX2反向引物、20nM的TBX5正向引物、20nM的TBX5反向引物、280nM的RASSF1a正向引物、280nM的RASSF1a反向引物、10nM的β-ACTIN正向引物、10nM的β-ACTIN反向引物。
优选的，所述DNA聚合酶为Taq Platinum DNA聚合酶。
另一方面，本发明还提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒在检测非小细胞肺癌多重基因甲基化标志物中的应用。
相较于现有技术，本发明所述用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对及试剂盒采用上述技术方案，取得如下技术效果：能够在一次PCR反应检测同时检测多个非小细胞肺癌甲基化标志物的存在，提高了非小细胞肺癌检测的准确性、特异性和敏感性。使用本发明所述引物对和试剂盒对非小细胞肺癌多重基因甲基化进行检测，能够解决一次甲基化特异性PCR反应只能检测单个基因的甲基化水平而无法准确预测肺癌发生的可能性，以及因非小细胞肺癌抑癌基因的不确定性及ctDNA的局限性导致单一非小细胞肺癌甲基化标志物检测无法满足临床需求的问题。
附图说明
图1是本发明用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对第一优选实施例的示意图；
图2是本发明用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对第二优选实施例的示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
发明提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对，包括以6个基因作为非小细胞肺癌的甲基化标志物对应的6组引物序列，所述甲基化标志物可以用于用血液作为样本检测非小细胞肺癌。作为优选实施例，所述甲基化标志物分别为：CALCA、DLEC1、HOXA9、TBX5、PITX2、RASSF1a。
如图1所示，图1为本发明用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对第一优选实施例的示意图。在第一优选实施例中，所述用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对包括6个甲基化标志物对应的6组引物序列，每一个甲基化标志物对应一个引物对，每一个引物对包括正向引物(MF)和反向引物(MR)，具体表示如下：
(1)、CALCA正向引物：5’-CGGAATTTTTTCGATTTATAGC-3’(SEQ ID NO.1)；
(2)、CALCA反向引物：5’-AAAACCCTATAAAAACGACGAC-3’(SEQ ID NO.2)；
(3)、DLEC1正向引物：5’-GATTAAGCGATGACGGGATTC-3’(SEQ ID NO.3)；
(4)、DLEC1反向引物：5’-ACCCGACTAATAACGAAATTAACG-3’(SEQ ID NO.4)；
(5)、HOXA9正向引物：5’-GGTTAATGGGGGCGCGGGCGTC-3’(SEQ ID NO.5)；
(6)、HOXA9反向引物：5’-TCATATAACAACTTAATAACACCG-3’(SEQ ID NO.6)；
(7)、TBX5正向引物：5’-GGGACGCGTAAAATTTAGAATC-3’(SEQ ID NO.7)；
(8)、TBX5反向引物：5’-AACACAAAACCGAAAAACGTC-3’(SEQ ID NO.8)；
(9)、PITX2正向引物：5’-CGTTATTAGTTGAAGGTAAGGTCG-3’(SEQ ID NO.9)；
(10)、PITX2反向引物：5’-AACACCGAAAAATACAATCCG-3’(SEQ ID NO.10)；
(11)、RASSF1a正向引物：5’-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3’(SEQ ID NO.11)；
(12)、RASSF1a反向引物：5’-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3’(SEQ ID NO.12)。
作为另外一个优选实施方式，为了验证待测血液样品中的ctDNA转化和PCR反应过程的正确性，以确保非小细胞肺癌检测的准确性，本发明将参照标志物β-ACTIN对应的引物对(包括β-ACTIN正向引物和β-ACTIN反向引物)加入至PCR反应体系中。
如图2所示，图2为本发明用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对第二优选实施例的示意图。在第二实施例中，本发明所述用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对不仅包括上述6个甲基化标志物对应的6组引物序列，还包括1个参照标志物对应的1组引物序列。其中，1个参照标志物对应的1组引物序列包括：
(13)、β-ACTIN正向引物：5’-TTTTTAGGGAGGAGT TGGAAGTAGT-3’(SEQ ID NO.13)；
(14)、β-ACTIN的反向引物：5’-AAAATATACC CTCCCCCATA CC-3’(SEQ ID NO.14)。
本发明还提供所述的用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对在制备非小细胞肺癌检测试剂中的应用，例如制备一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒，该非小细胞肺癌检测试剂可以用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化水平，提高肺癌检测的准确性、特异性和敏感性。
本发明还提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒，可以应用于检测非小细胞肺癌特异性多重甲基化标志物。作为本发明一个优选的实施例，所述试剂盒包括上述6个非小细胞肺癌相关的基因作为甲基化标志物对应的6个引物以及PCR反应体系，其中：所述PCR反应体系包括1.8×PCR溶液、5mM的MgCl2、0.3nM的脱氧核糖核苷三磷酸以及2.5个单元的DNA聚合酶，例如优选为Taq Platinum DNA聚合酶；所述引物对的浓度分别为40nM的CALCA正向引物、40nM的CALCA反向引物、40nM的DLEC1正向引物、40nM的DLEC1反向引物、120nM的HOXA9正向引物、120nM的HOXA9反向引物、20nM的PITX2正向引物、20nM的PITX2反向引物、20nM的TBX5正向引物、20nM的TBX5反向引物、280nM的RASSF1a正向引物、280nM的RASSF1a反向引物。
作为本发明另一个优选的实施例，所述试剂盒包括所述的甲基化标志物对应的6组引物对、1个参照标志物对应的1组引物对以及PCR反应体系，其中：所述PCR反应体系包括1.8×PCR溶液、5mM的MgCl2、0.3nM的脱氧核糖核苷三磷酸以及2.5个单元的DNADNA聚合酶，例如优选为Taq Platinum DNA聚合酶；所述引物对的浓度分别为40nM的CALCA正向引物、40nM的CALCA反向引物、40nM的DLEC1正向引物、40nM的DLEC1反向引物、120nM的HOXA9正向引物、120nM的HOXA9反向引物、20nM的PITX2正向引物、20nM的PITX2反向引物、20nM的TBX5正向引物、20nM的TBX5反向引物、280nM的RASSF1a正向引物、280nM的RASSF1a反向引物、10nM的β-ACTIN正向引物、10nM的β-ACTIN反向引物。
在本实施例中，本发明还提供一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒在检测非小细胞肺癌特异性多重甲基化标志物中的应用。即：能够使用本发明所述试剂盒检测非小细胞肺癌多重基因甲基化标志物，方便用户对非小细胞肺癌进行检测，能够在一次PCR反应检测同时检测是否存在多个非小细胞肺癌甲基化标志物，提高肺癌检测的准确性、特异性和敏感性。
以下阐述利用本发明所述引物对及试剂盒检测非小细胞肺癌多重基因甲基化标志物的方法，具体包括如下步骤：
步骤1：选取6个基因作为非小细胞肺癌的甲基化标志物以及1个基因作为参照标志物；具体地，基于肺癌前期研究和已有的研究成果，选取6个基因作为非小细胞肺癌的甲基化标志物，其分别为：CALCA、DLEC1、HOXA9、TBX5、PITX2、RASSF1a，此外，作为参照标志物的基因与甲基化标志物的基因不同，所述参照标志物为β-ACTIN。
步骤2：分别构造6个甲基化标志物对应的6个引物对以及1个参照标志物对应的1个引物对；在本实施例中，每一个甲基化标志物对应一个引物对，每一个引物对包括正向引物(MF)和反向引物(MR)。在本实施例中，参照标志物β-ACTIN的正向引物为阳性对照品，β-ACTIN正向引物序列为：5’-TTTTTAGGGAGGAGT TGGAAGTAGT-3’，该参照标志物的反向引物为阴性对照品，β-ACTIN反向引物序列为：5’-AAAATATACC CTCCCCCATA CC-3’。如图2所示，图2列出了7组引物序列，包括6个甲基化标志物对应的6组引物序列以及1个参照标志物对应的1组引物序列。
步骤3：提取待测血液样品中的游离ctDNA，在本实施例中，考虑血液样品的血清中ctDNA浓度为血浆中的3-24倍，但凝血过程容易被杂质污染，因而优选从血液样品的血浆中提取ctDNA，并对ctDNA进行纯化和转化处理。在本实施例中，ctDNA易被血液中的DNA酶分解，ctDNA的纯化需要尽快进行，纯化方法可以使用业界通用的磁珠法或者离心柱法提取待测血液样品中的游离ctDNA，以去除杂质对ctDNA进行纯化，所述转换处理所采用的试剂可以为亚硫酸盐或重亚硫酸盐，即对ctDNA进行亚硫酸盐或重亚硫酸盐转化处理。
步骤4：取4ul(27ng)经过转化处理的ctDNA加入到25ul PCR反应体系中；在本实施例中，所述PCR反应体系包括：1.8×PCR溶液、5mM MgCl2、0.3nM脱氧核糖核苷三磷酸、6个甲基化标志物对应的6个引物(DLEC1的正向引物和反向引物各40nM、PITX2的正向引物和反向引物各20nM、TBX5的正向引物和反向引物各20nM、CALCA的正向引物和反向引物各40nM、RASSF1a的正向引物和反向引物各280nM、HOXA9的正向引物和反向引物各120nM)、1个参照标志物β-ACTIN对应的1个引物(β-ACTIN的正向引物和反向引物各10nM)以及2.5个单元的DNA聚合酶，例如优选为Taq Platinum DNA聚合酶)。
步骤5：将PCR反应体系放入PCR仪中，并按照设定的PCR反应程序对PCR反应体系做PCR扩增反应得到PCR反应产物。在本实施例中，所述PCR反应程序包括如下步骤：(1)、在95℃温度下持续3分钟；(2)、在94℃温度下持续1分钟、在60℃温度下持续30秒、在65℃温度下持续45秒，该步骤共执行4个循环；(3)、在94℃温度下持续1分钟、在56℃温度下持续1分钟、在65℃温度下持续45秒，该步骤共执行36个扩增循环；(4)、在65℃温度下持续4分钟，作为延伸反应；(5)、在4℃温度下中止PCR反应，并在4℃温度下保存PCR反应产物。
步骤6：对PCR反应产物进行凝胶电泳；具体地，对PCR反应后的产物进行凝胶电泳，在本实施例中，所述凝胶电泳可以为琼脂糖凝胶电泳，可选取浓度为：琼脂糖凝胶中琼脂糖浓度为2.5％)、或者为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
步骤7：，利用染色剂对电泳后的凝胶进行染色，并使用凝胶成像仪对染色后的凝胶进行荧光分析；具体地，利用染色剂对电泳后的凝胶进行染色，作为优选的实施方式，所述染色剂可选择如溴化乙锭(EB)、SYBR Green I、GelRed或GoldView染色剂，并使用凝胶成像仪对染色后的凝胶进行荧光分析，并通过凝胶成像仪读取染色凝胶中的荧光色带。
步骤8：，判断凝胶中是否出现3条或3条以上的荧光色带；在本实施例中，凝胶成像仪是否从染色凝胶读取到3条或3条以上的荧光色带，其中，1条荧光色带为参照标志物β-ACTIN的PCR反应条带，其它荧光色带为突变基因标志物的PCR反应条带。
步骤9：如果凝胶中出现3条或3条以上的荧光色带，凝胶成像仪则判定待测血液样品中包含非小细胞肺癌的基因突变DNA片段。
步骤10：如果凝胶中出现2条或者1条荧光色带，凝胶成像仪则判定待测血液样品中没有包含非小细胞肺癌的基因突变DNA片段。
步骤11：如果凝胶中没有出现任何荧光色带，凝胶成像仪则判定肺癌特性甲基化检测过程中ctDNA转化和PCR反应失效，不能够验证待测血液样品中是否包含非小细胞肺癌的基因突变DNA片段。因此，本实施例将参照标志物β-ACTIN正向引物和反向引物加入至PCR反应体系中，主要是为了验证ctDNA转化和PCR反应过程是否正确，以确保非小细胞肺癌检测的准确性。
使用本发明所述的引物对和试剂盒能够在一次PCR反应检测同时检测多个非小细胞肺癌甲基化标志物的存在，提高了肺癌检测的准确性、特异性和敏感性。使用本发明所述的引物对和试剂盒广泛应用于检测非小细胞肺癌基因甲基化情况，解决了一次甲基化特异性PCR反应只能检测单个基因的甲基化水平而无法准确预测肺癌发生的可能性，以及因非小细胞肺癌抑癌基因的不确定性及ctDNA的局限性，导致单一非小细胞肺癌甲基化标志物检测无法满足临床需求的问题。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 深圳市圣必智科技开发有限公司
<120> 用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对及试剂盒
<130> 2018
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
cggaattttt tcgatttata gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
aaaaccctat aaaaacgacg ac 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
gattaagcga tgacgggatt c 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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acccgactaa taacgaaatt aacg 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
ggttaatggg ggcgcgggcg tc 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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tcatataaca acttaataac accg 24
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<400> 7
gggacgcgta aaatttagaa tc 22
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<212> DNA
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<400> 9
cgttattagt tgaaggtaag gtcg 24
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aacaccgaaa aatacaatcc g 21
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<212> DNA
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gtgttaacgc gttgcgtatc 20
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tttttaggga ggagttggaa gtagt 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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aaaatatacc ctcccccata cc 22
Claims (8)
1.一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对，其特征在于，包括以6个基因作为非小细胞肺癌的甲基化标志物对应的6组引物序列，所述甲基化标志物为分别为：CALCA、DLEC1、HOXA9、TBX5、PITX2、RASSF1a，所述6组引物序列具体表示如下：
CALCA正向引物：5’-CGGAATTTTTTCGATTTATAGC-3’；
CALCA反向引物：5’-AAAACCCTATAAAAACGACGAC-3’；
DLEC1正向引物：5’-GATTAAGCGATGACGGGATTC-3’；
DLEC1反向引物：5’-ACCCGACTAATAACGAAATTAACG-3’；
HOXA9正向引物：5’-GGTTAATGGGGGCGCGGGCGTC-3’；
HOXA9反向引物：5’-TCATATAACAACTTAATAACACCG-3’；
TBX5正向引物：5’-GGGACGCGTAAAATTTAGAATC-3’；
TBX5反向引物：5’-AACACAAAACCGAAAAACGTC-3’；
PITX2正向引物：5’-CGTTATTAGTTGAAGGTAAGGTCG-3’；
PITX2反向引物：5’-AACACCGAAAAATACAATCCG-3’；
RASSF1a正向引物：5’-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3’；
RASSF1a反向引物：5’-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3’。
2.如权利要求1所述的用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对，其特征在于，还包括1个参照标志物β-ACTIN对应的1组引物序列，具体表示如下：
β-ACTIN正向引物：5’-TTTTTAGGGAGGAGT TGGAAGTAGT-3’；
β-ACTIN反向引物：5’-AAAATATACC CTCCCCCATA CC-3’。
3.权利要求1或2所述的用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的引物对在制备非小细胞肺癌检测试剂中的应用。
4.一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的引物对以及PCR反应体系，其中：
所述PCR反应体系包括1.8×PCR溶液、5mM的MgCl2、0.3nM的脱氧核糖核苷三磷酸以及2.5个单元的DNA聚合酶；
所述引物对的浓度分别为40nM的CALCA正向引物、40nM的CALCA反向引物、40nM的DLEC1正向引物、40nM的DLEC1反向引物、120nM的HOXA9正向引物、120nM的HOXA9反向引物、20nM的PITX2正向引物、20nM的PITX2反向引物、20nM的TBX5正向引物、20nM的TBX5反向引物、280nM的RASSF1a正向引物、280nM的RASSF1a反向引物。
5.如权利要求4所述的用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq Platinum DNA聚合酶。
6.一种用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求2所述的引物对以及PCR反应体系，其中：
所述PCR反应体系包括1.8×PCR溶液、5mM的MgCl2、0.3nM的脱氧核糖核苷三磷酸以及2.5个单元的DNADNA聚合酶；
所述引物对的浓度分别为40nM的CALCA正向引物、40nM的CALCA反向引物、40nM的DLEC1正向引物、40nM的DLEC1反向引物、120nM的HOXA9正向引物、120nM的HOXA9反向引物、20nM的PITX2正向引物、20nM的PITX2反向引物、20nM的TBX5正向引物、20nM的TBX5反向引物、280nM的RASSF1a正向引物、280nM的RASSF1a反向引物、10nM的β-ACTIN正向引物、10nM的β-ACTIN反向引物。
7.如权利要求6所述的用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq Platinum DNA聚合酶。
8.权利要求4至7任一项所述的用于检测非小细胞肺癌多重基因甲基化的试剂盒在检测非小细胞肺癌多重基因甲基化标志物中的应用。
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