CN109790568A - 用于检测雌激素受体esr1突变的多路等位基因特异性pcr测定 - Google Patents

用于检测雌激素受体esr1突变的多路等位基因特异性pcr测定 Download PDF

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Abstract

本文提供了检测雌激素受体(ESR1)中的突变的方法和组合物。

Description

用于检测雌激素受体ESR1突变的多路等位基因特异性PCR 测定
发明背景
70%的乳腺癌是雌激素受体(ER)阳性的，尽管这些患者的大多数最初对激素疗法有应答，但是大约20-30%将变成疗法难治的。最近的数据提示在雌激素受体基因(ESR1)中活化突变与抗性有关，所述突变在抗雌激素治疗中获得并且在原发性未治疗的ER阳性乳腺癌中很少发现。已经在来自激素难治的乳腺癌的样品中鉴别出越来越多数目的位于配体结合结构域中的活化ESR1突变，最常见的突变包括K303R、E380Q、V392I、S463P、K531E、V534E、P535H、L536Q/R、Y537S/N/C、D538G和R555C。尽管没有完全阐明所有突变的作用机理，但是体外实验已经证实，在L536Q、Y537S/C/N和D538G中的突变会以活性构象稳定雌激素受体配体结合结构域，因而允许在没有配体存在下募集转录共活化剂。对雌激素的超敏反应被视作K303R突变的机制。
因此ESR1突变的检测具有预测激素抗性和指导疗法的潜力。下一代测序(NGS)是这样的检测的常见方案，因为它能够用少量样品同时检测许多突变。但是，NGS是非常费力的、冗长的和昂贵的。数字PCR (dPCR)代表一种非常灵敏的已经被用于ESR1突变检测的方法，但是它具有许多缺点：dPCR工作流是冗长的且需要特殊设备，并且多路化受限于在当前dPCR仪器上可利用的光学通道的数目。
发明概述
本文提供了用于检测ESR1基因中的突变的试剂盒、测定和方法，以及具有激素敏感癌症的个体的治疗方法。
本文提供了包含一个或多个容器的试剂盒，每个容器容纳两种或更多种引物对，每种引物对是对ESR1基因中的不同序列特异性的；一种或多种对ESR1基因中的不同序列特异性的探针，其中每种探针被标记；对内部对照序列特异性的引物对；和对所述内部对照序列特异性的探针。在某些实施方案中，所述每种探针用荧光团和猝灭剂标记。在某些实施方案中，所述试剂盒包含1-10个容器，例如，2-5、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个容器。在某些实施方案中，每个容器容纳两种或更多种引物对(包括内部对照引物对)，例如，3-16、4-10或5-8种。例如，可以将所有外显子8突变、内部对照和两种或更多种其它突变引物对包括在单个试管中。在某些实施方案中，每个容器容纳3-4种探针(包括内部对照探针)。在某些实施方案中，每个容器进一步容纳热稳定的DNA聚合酶。
在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括阳性对照，例如，具有已知ESR1突变的样品，和/或阴性对照，例如，不包括ESR1突变的样品。
在某些实施方案中，ESR1基因的每个不同序列选自：ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。在某些实施方案中，所述试剂盒包括至少两种引物对，其选自：对ESR1 V422DelV特异性的引物对、对ESR1 S463P特异性的引物对、对ESR1 L536H特异性的引物对、对ESR1 L536P特异性的引物对、对ESR1 L536Q特异性的引物对、对ESR1L536R特异性的引物对、对ESR1 D538G特异性的引物对、ESR1 K303R、对ESR1 E380Q特异性的引物对、对ESR1 L536_D538>P特异性的引物对、对ESR1 Y537C特异性的引物对、对ESR1Y537N特异性的引物对、对ESR1 Y537S特异性的引物对、对ESR1 S341L特异性的引物对、对ESR1 L429V特异性的引物对、对ESR1 V533M特异性的引物对、对ESR1 V534E特异性的引物对和对ESR1 P535H特异性的引物对。在某些实施方案中，至少一种引物包括经修饰的非天然存在的核苷酸。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含对ESR1 V422DelV特异性的引物对、对ESR1S463P特异性的引物对、对ESR1 L536H特异性的引物对、对ESR1 L536P特异性的引物对、对ESR1 L536Q特异性的引物对、对ESR1 L536R特异性的引物对、对ESR1 D538G特异性的引物对、ESR1 K303R、对ESR1 E380Q特异性的引物对、对ESR1 L536_D538>P特异性的引物对、对ESR1 Y537C特异性的引物对、对ESR1 Y537N特异性的引物对、对ESR1 Y537S特异性的引物对、对ESR1 S341L特异性的引物对、对ESR1 L429V特异性的引物对、对ESR1 V533M特异性的引物对、对ESR1 V534E特异性的引物对和对ESR1 P535H特异性的引物对。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含特异性地检测ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1V534E和ESR1 P535H的探针。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含(i)第一容器，其容纳对ESR1 V422DelV特异性的引物对、对ESR1 S463P特异性的引物对、对ESR1 L536H特异性的引物对、对ESR1 L536P特异性的引物对、对ESR1 L536Q特异性的引物对、对L536R特异性的引物对和对ESR1 D538G特异性的引物对；(ii)第二容器，其容纳对ESR1 K303R特异性的引物对、对ESR1 E380Q特异性的引物对、对ESR1 L536_D538>P特异性的引物对、对ESR1 Y537C特异性的引物对、对ESR1Y537N特异性的引物对和对ESR1 Y537S特异性的引物对；和(iii)第三容器，其容纳对ESR1S341L特异性的引物对、对ESR1 L429V特异性的引物对、对ESR1 V533M特异性的引物对、对ESR1 V534E特异性的引物对和对ESR1 P535H特异性的引物对。在某些实施方案中，所述第一容器进一步容纳对ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R和ESR1 D538G特异性的探针。在某些实施方案中，单个探针特异性地检测ESR1L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R和ESR1 D538G。在某些实施方案中，所述第二容器进一步容纳对ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 ESR1 Y537C、ESRY537N、ESR1 Y537S特异性的探针。在某些实施方案中，单个探针特异性地检测ESR1 L536_D538>P、ESR1 ESR1 Y537C、ESR Y537N、ESR1 Y537S。在某些实施方案中，所述第三容器容纳对ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H特异性的探针。在某些实施方案中，单个探针特异性地检测ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。
在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 K303R突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 479、481和484，且在某些实施方案中，所述普通引物和探针序列分别是SEQ IDNO: 476和477。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 S341L突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 239、240、242、245、246、247、253、254、255、256、257、258和259，且在某些实施方案中，所述普通引物和探针序列分别是SEQ ID NO: 235和237。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 E380Q突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 32、34、36、37、38、39、40、41和42，且在某些实施方案中，所述普通引物和探针序列分别是SEQ ID NO:528和31。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 V422DELV突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 287、294、295、296、297、298，且在某些实施方案中，所述普通引物和探针序列分别是SEQ ID NO: 285和286。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 L429V突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 66、68、69、70、72、73、75、76、77、778、79、80和81，且在某些实施方案中，所述普通引物和探针序列分别是SEQ ID NO: 59和60。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 S463P突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 264、265、267、268、269、270、271、272、281、282、283和275，且在某些实施方案中，所述普通引物和探针序列分别是SEQ ID NO: 261和262。
在某些实施方案中，使用普通引物和探针来扩增和检测所述测定中的所有ESR1外显子8突变，例如，分别SEQ ID NO: 314和/或394和407。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 V533M突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 322、329、330、345、346、347、348、349、350、352和353。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 V534E突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 364、365、367、368、370、371、373、378、388、391、392和393。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 P535H突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO:181、188、189、190、191、198、199、200、203、204、205、208、209、212、225、226、228、229和231。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 L536H突变的等位基因特异性的引物选自SEQ IDNO: 96、101、104、105、107、110、111、112、113、114、115、116和117。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 L536P突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 134、135和137。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 L536Q突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO:141、151、154、155、157、158、159和160。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 L536R突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 161、172、174、175、176、177、178、179和180。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 Y537C突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO:397、408、415、416、417、418、419、420和424。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 Y537N突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 426、436、441、445、446、447和448。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 Y537S突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO:449、459、466、467、468、469、470、471和472。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 D538G突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 14、21、22、23、24和25。在某些实施方案中，所述用于检测ESR1 L536_D538>P突变的等位基因特异性的引物选自SEQ ID NO: 84、85、86、87、88、89、90、91、92和93。
在某些实施方案中，所述试剂盒包括具有SEQ ID NO: 24、113、134、158、178、264、261、262、285、286、298、314、394、407、31、42、90、415、447、469、476、477、481、528、59、60、70、231、235、237、245、350和388的序列的寡核苷酸。在某些实施方案中，每个容器包括内部对照，例如，SEQ ID NO: 511、514和517。
进一步提供了用于确定(例如，检测) 来自个体的样品中是否存在两个或更多个ESR1突变的方法，所述方法包括(i)从所述个体得到样品；(ii)进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在两个或更多个ESR1突变。在某些实施方案中，所述样品选自血液、血浆、血清、尿或粘膜组织(例如，来自口腔拭子)。在某些实施方案中，所述个体具有或被诊断出具有激素应答性癌症(例如，雌激素受体和/或黄体酮受体阳性的乳腺癌或卵巢癌)。在某些实施方案中，所述个体正在经历激素疗法。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(i)之前给所述个体提供激素疗法(例如，用SERM、芳香酶抑制剂或LH阻滞剂治疗)。在某些实施方案中，所述方法进一步包括，当在步骤(ii)中确定ESR1突变的存在时，给所述个体提供改变的治疗(例如，另一种激素疗法或标准化学疗法)。
在某些实施方案中，所述方法包括进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在10个或更多个（例如，10-20、11、12、13、14、15、16、17、18或19）ESR1突变。在某些实施方案中，所述两个或更多个ESR1突变选自ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1V534E和ESR1 P535H。在某些实施方案中，所述两个或更多个ESR1突变包括ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。
在某些实施方案中，使用如本文中所述的试剂盒进行所述多路等位基因特异性的PCR，例如，所述试剂盒包含1-10个容器，例如，2-5、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个容器。在某些实施方案中，所述试剂盒包含3个容器。例如，可以在3个容器中进行所述等位基因特异性的多路PCR，使得(i)在第一容器中检测ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1L536P、ESR1 L536Q、L536R和ESR1 D538G；(ii)在第二容器中检测ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N和ESR1 Y537S；和(iii)在第三容器中检测ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。
本文进一步提供了给正在经历激素疗法(例如，SERM、芳香酶抑制剂和/或促黄体素阻滞剂)的具有激素应答性癌症(例如，乳腺癌)的个体提供改变的治疗的方法。在某些实施方案中，所述方法包括(i)从所述个体得到样品(例如，血液、血浆、血清、尿、组织、FFPET等)；(ii)进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在两个或更多个ESR1突变；和(iii)如果确定ESR1突变的存在，提供所述个体的改变的治疗。在某些实施方案中，使用如本文中所述的试剂盒进行步骤(ii)。
在某些实施方案中，所述多路等位基因特异性的PCR确定是否存在10个或更多个ESR1突变。在某些实施方案中，所述两个或更多个(或10个或更多个) ESR1突变选自：ESR1V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。在某些实施方案中，确定是否存在ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。
在某些实施方案中，在所述个体开始接受激素疗法以后0.5-5年进行步骤(i)-(iii)。在某些实施方案中，在激素疗法期间进行所述方法超过一次，例如，以监测所述肿瘤对激素疗法的潜在抗性。在某些实施方案中，周期性地（例如，每6个月）进行所述方法，而在某些实施方案中，在所述个体中的临床进展(例如，肿瘤生长、减少的对激素疗法的应答等)后进行所述方法。在某些实施方案中，步骤(iii)包括给所述个体提供另一种激素疗法或标准化学疗法。
另外，本文提供了治疗具有激素应答性癌症(例如，乳腺癌或卵巢癌)的个体的方法。在某些实施方案中，所述方法包括(i)给所述个体提供激素疗法；(ii)从所述个体得到样品；(iii)进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在两个或更多个ESR1突变；和(iv)如果确定ESR1突变的存在，给所述个体提供改变的治疗。在某些实施方案中，所述激素疗法是SERM。
在某些实施方案中，所述多路等位基因特异性的PCR确定是否存在10个或更多个ESR1突变。在某些实施方案中，所述两个或更多个(或10个或更多个) ESR1突变选自：ESR1V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。在某些实施方案中，确定是否存在ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。
在某些实施方案中，在步骤(i)以后(在所述个体开始接受激素疗法以后) 0.5-5年进行步骤(ii)-(iii)。在某些实施方案中，在激素疗法期间进行步骤(ii)-(iii)超过一次。在某些实施方案中，周期性地（例如，每6个月）进行所述方法，而在某些实施方案中，在所述个体中的临床进展(例如，肿瘤生长、减少的对激素疗法的应答等)后进行所述方法。在某些实施方案中，步骤(iv)包括给所述个体提供另一种激素疗法(例如，芳香酶抑制剂和/或促黄体素阻滞剂)或标准化学疗法。
附图简述
图1A、1B和1C对比了用于检测突变体和野生型样品的引物和探针的辨别力。图1A显示了使用被设计成对K303R特异性的引物和探针的结果(扩增生长曲线)，其显示了野生型和突变体之间的差的辨别力。图1B显示了使用被设计成对K303R特异性的引物和探针的结果，其显示了野生型(绿色)和突变体(蓝色；红色)之间的更好的辨别力。图1C显示了使用被设计成对L536_D538>P特异性的引物和探针的结果，其显示了与野生型样品相比检测突变体(蓝色；红色)的良好特异性，其中野生型样品(绿色)没有表现出信号。
图2A、2B和2C也对比了用于检测L536R突变体和野生型样品的引物和探针的辨别力。所述扩增生长曲线在X轴上显示了循环，并在Y轴上显示了信号。图2A显示了使用L536R_RS01等位基因特异性的引物的结果，其显示了野生型和突变体之间的差的辨别力。图2B显示了使用L536R_RS09等位基因特异性的引物的结果，其显示了野生型(绿色)和突变体之间的更好的辨别力。图2C显示了使用L536R_RS04等位基因特异性的引物的结果，其显示了与野生型样品相比检测突变体的良好特异性，其中野生型样品(绿色)基本上没有表现出信号。
图3显示了与其它ESR1突变体样品(所有其它曲线/颜色)相比，被设计成对P535H突变特异性的引物和探针(粉红色；深蓝色)的特异性。
图4A显示了E380Q突变阳性对照(MC，顶/左两条曲线)、E380Q突变阳性样品(IN008，接下来更低的两条曲线)、E380野生型(FFPET_WT，接下来更低的两条曲线)和非模板对照(NTC，扁平的底线)的扩增生长曲线。
图4B显示了没有E380Q突变阳性对照曲线的相同扩增生长曲线。
图5显示了D538G突变阳性对照(MC，顶/左曲线)、3个D538G突变阳性样品(D538G，接下来更低的三条曲线)、D538野生型(接下来更低的48条曲线)和非模板对照(NTC，扁平的底线)的扩增生长曲线。
发明详述
I. 简介
本文提供了用于检测人雌激素受体(ESR1)中的突变的存在的多路PCR测定。这些突变与具有激素应答性癌症(ESR1阳性的和/或黄体酮受体阳性的)的癌症患者中对激素疗法的抗性有关，所述癌症对最初施用的激素疗法敏感。可以用非侵袭性样品(例如，血液、血浆、血清、尿等)进行所述测定，使得可以在不进行多次组织活检的情况下在患者中进行对激素疗法的重复测试。
本文描述的测定依赖于经证实的广泛采用的技术，并提供准确的、可再现的和快速的结果。
II. 定义
术语“雌激素受体”、“ER”和“ESR1”在本文中可互换地使用，除非另外指出。ESR1还可以用于表示编码ER蛋白的基因。
术语“多路”表示在其中检测超过一种靶标的测定。
术语“贮器”、“容器”、“试管”、“孔”、“室”、“微室”等表示可以容纳试剂或测定的容器。如果贮器是在试剂盒中且容纳试剂或被用于扩增反应，可以将它封闭或密封以避免污染或蒸发。如果贮器被用于测定，它可以是开放的或可接近的（至少在所述测定的装配期间）。
关于标志基因或标志基因产物的术语“单独地检测”或“单独检测”指示，检测多路反应中的每种标志物。也就是说，每种标志物与不同标记(用不同地标记的探针检测)结合。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”表示核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物，且包括天然存在的(腺苷、胍、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)、非天然存在的和经修饰的核酸。该术语不受聚合物的长度(例如，单体的数目)限制。核酸可以是单链的或双链的，且通常含有5’-3’磷酸二酯键，尽管在某些情况下，核苷酸类似物可能具有其它键。单体通常被称作核苷酸。术语“非天然的核苷酸”或“修饰的核苷酸”表示这样的核苷酸：其含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸酯基团，或在其结构中掺入非天然的部分。非天然的核苷酸的例子包括二脱氧核苷酸、生物素化的、胺化的、脱氨的、烷基化的、苄基化的和荧光体-标记的核苷酸。
术语“引物”表示在合适的条件下充当通过核酸聚合酶实现的多核苷酸链合成起始点的短核酸（寡核苷酸）。多核苷酸合成和扩增反应通常包括适当的缓冲液、dNTP和/或rNTP和一种或多种任选的辅因子，并且在合适的温度进行。引物通常包括至少一个靶标杂交的区域，其与靶序列至少基本上互补(例如，具有0、1、2或3个错配)。该区域通常具有约8至约40个核苷酸的长度，例如，12-25个核苷酸。“引物对”表示这样的正向和反向引物：其相对于靶序列以相反方向朝向，且其在扩增条件下产生扩增产物。在某些实施方案中，多种引物对依赖于单个普通正向或反向引物。例如，多个等位基因特异性的正向引物可以被视作含有相同的普通反向引物的引物对的部分，例如，如果多个等位基因彼此紧密靠近。
本文中使用的“探针”是指能够选择性地结合特别预期的靶生物分子（例如，与探针杂交的目标核酸序列）的任何分子。所述探针用至少一个非核苷酸部分可检测地标记。在某些实施方案中，所述探针用荧光团和猝灭剂标记。
词语“互补的”或“互补性”表示一种多核苷酸中的一个核酸与第二种多核苷酸中的另一个核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T（对于RNA，A-G-U）与序列T-C-A（对于RNA，U-C-A）互补。互补性可以是部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或可以是完全的，其中所有核酸都根据碱基配对匹配。如果探针或引物与靶序列至少部分地互补，那么所述探针或引物被视为对靶序列“特异性的”。取决于条件，与靶序列的互补性程度通常对于较短核酸如引物而言高于（例如，大于80%、90%、95%或更高）较长序列。在某些实施方案中，术语“每种引物对是对ESR1基因中的不同序列特异性的”指示，每种引物对特异性地扩增ESR1基因的不同序列，例如，不同的等位基因或突变。
术语“特异性地扩增”指示，引物集合以统计上显著的水平扩增除了非靶序列以外的靶序列。术语“特异性地检测”指示，探针将以统计上显著的水平检测除了非靶序列以外的靶序列。如本领域中将理解的，使用阴性对照（例如，这样的样品，其包括与测试样品相同的核酸，但是不包括靶序列或缺乏核酸的样品），可以确定特异性扩增和检测。例如，特异性地扩增和检测靶序列的引物和探针产生可容易地与背景(非靶序列)辨别的Ct，例如，比背景小至少2、3、4、5、5-10、10-20或10-30个循环的Ct。术语“等位基因特异性的”PCR表示使用特异性地扩增靶序列的特定等位基因变体的引物来扩增所述靶序列。通常，所述正向或反向引物包括在该位置处的等位基因变体的精确互补物。
在两种或更多种核酸、或两种或更多种多肽的背景下，术语“等同的”或“同一性百分比”表示两个或更多个序列或子序列是相同的，或具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸（例如，当在对比窗或指定区域上关于最大对应性进行对比和比对时，在特定区域上的约60%同一性，例如，至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性中的任一种），如使用BLAST或BLAST 2.0序列对比算法（用默认参数）测量的，或通过手工比对和目检测量的。参见例如，在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的NCBI网站。这样的序列然后被说成是“基本上等同的”。通常在最佳比对的序列上确定同一性百分比，使得所述定义适用于具有缺失和/或添加的序列以及具有置换的序列。在本领域中通常使用的算法会处理缺口等。通常，同一性存在于包含至少约8-25个氨基酸或核苷酸长度的序列的区域上，或者50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或者参照序列的整个长度上。
术语“试剂盒”表示包括至少一种试剂（诸如核酸探针或探针库等）的任何制造品（例如，包装或容器），所述试剂如本文中所述用于特异性地扩增、捕获、标记/转换或检测RNA或DNA。
术语“扩增条件”表示核酸扩增反应(例如，PCR扩增)中的条件，其允许引物的杂交和模板依赖性延伸。术语“扩增子”或“扩增产物”表示这样的核酸分子：其含有靶核酸序列的全部或片段，并且其通过任意合适的扩增方法形成为体外扩增产物。技术人员会理解，正向和反向引物(引物对)限定扩增产物的边界。当应用于引物时，术语“产生扩增产物”指示，所述引物在适当的条件下(例如，在有核苷酸聚合酶和NTP存在下)将产生限定的扩增产物。各种PCR条件描述在PCR Strategies (Innis等人, 1995, Academic Press, San Diego,CA)第14章; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innis等人,Academic Press, NY, 1990)中。
术语“扩增产物”表示扩增反应的产物。所述扩增产物包括用于开始每轮多核苷酸合成的引物。“扩增子”是被靶向用于扩增的序列，且该术语也可以用于表示扩增产物。扩增子的5’和3’边界由正向引物和反向引物限定。
术语“个体”、“主体”和“患者”在本文中可互换地使用。所述个体可以是在诊断前、诊断后但是疗法前、正在接受疗法或疗法后。在本公开内容的上下文中，所述个体通常正在寻求医疗护理。
术语“样品”或“生物样品”表示含有或假定含有核酸的任何组合物。该术语包括纯化的或分离的细胞、组织或血液的组分，例如，DNA、RNA、蛋白、无细胞部分或细胞裂解物。所述样品可以是FFPET，例如，来自肿瘤或转移病灶。所述样品还可以来自冷冻的或新鲜的组织，或来自液体样品，例如，血液或血液组分(血浆或血清)、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、泪液、淋巴液、脑脊液、口腔/喉冲洗液、支气管肺泡灌洗液、从拭子洗下的物质等。样品也可以包括从个体得到的细胞的体外培养物（包括细胞系）的成分和组分。还可以从直接得自个体的样品（例如，细胞裂解物或除去了红血细胞的血液）部分地处理样品。
术语“从个体得到样品”是指，将来自个体的生物样品提供用于测试。得到可以是直接来自个体，或来自从个体直接得到样品的第三方。
术语“给个体提供疗法”是指，将所述疗法开处方、推荐或使得可被所述个体得到。所述疗法可以实际上由第三方（例如，住院患者注射）施用给所述个体或由所述个体自己施用。
“对照”样品或值表示这样的值：其充当参照，通常是已知的参照，用于与测试样品或测试条件对比。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，疑似具有癌症的个体，并且与来自已知条件（例如，来自无癌个体（阴性对照）或来自已知具有癌症的个体（阳性对照））的样品进行对比。在本公开内容的上下文中，测试样品通常来自乳腺癌患者。对照还可以代表从许多测试或结果收集的平均值或范围。还可以为反应条件制备对照。例如，关于核酸的存在、特性和/或量的对照（例如，内部对照）可以包括将检测已知存在于样品中的序列(例如，持家基因诸如β肌动蛋白、β珠蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白L37和L38、PPIase、EIF3、真核翻译延伸因子2 (eEF2)、DHFR或琥珀酸脱氢酶)的引物或探针。在某些实施方案中，所述内部对照可以是来自相同基因的一个区域的序列，其不是通常变体(例如，在不同的外显子中)。还可以加入一种已知的添加的多核苷酸，例如，具有指定的长度。阴性对照的一个例子是不含核酸的对照，或包括对不存在于样品中的序列（例如，来自不同物种）特异性的引物或探针的对照。技术人员会理解，对照的选择将取决于具体的测定，例如，使得所述对照是细胞类型和生物适当的。本领域技术人员会认识到，可以设计对照用于评估任意数目的参数。例如，可以设计对照以基于药理学数据（例如，半衰期）或治疗性措施（例如，益处和/或副作用的对比）来对比治疗益处。可以设计对照用于体外应用。本领域技术人员会理解哪些对照在给定的情形下是有价值的，且能够基于与对照值的对比来分析数据。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中宽泛地变化，测试样品中的变化不会被视作显著的。
术语“标记”、“标签”、“可检测的部分”等术语表示通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其它物理方式可检测的组合物。例如，有用的标记包括荧光染料(荧光团)、发光试剂、放射性同位素(例如，32P、3H)、电子致密试剂或基于亲和力的部分，例如，聚腺苷酸(与聚胸苷酸相互作用)或聚胸苷酸标签(与聚腺苷酸相互作用)，His标签(与Ni相互作用)，或抗生蛋白链菌素标签(可用生物素分离)。技术人员会理解，与核酸缀合的可检测标记物不是天然存在的。
除非另外定义，否则在本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见，例如，Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULARBIOLOGY, Elsevier (第4版2007); Sambrook等人, MOLECULAR CLONING, A LABORATORYMANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。术语“一个”或“一种”意图指“一个/种或多个/种”。当在步骤或要素的列举前面时，术语“包含”、“包括”和“含有”意图指其它步骤或要素的添加是任选的且不被排除。
III. 核酸样品
用于核酸扩增的样品可以得自疑似含有核酸的任何来源。样品可以取自福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)、组织活检或培养的细胞(例如，得自患者，或代表对照)。在某些实施方案中，所述样品以非侵袭性方式得到，例如，来自尿、皮肤、拭子、唾液、血液或血液级分。
在包括细胞的样品中，可以将细胞分离出去(例如，使用基于大小的过滤或离心)，由此剩下无细胞的核酸(cfNA)，包括在外核体、微囊泡、病毒颗粒中的核酸，或自由循环的那些核酸。可替换地，在有磁性玻璃颗粒(MGP)存在下或在将细胞裂解物添加给MGP之前，可以裂解细胞以得到细胞核酸。
用于从生物样品分离核酸的方法是已知的，例如，如在Sambrook中所述，且几种试剂盒是商购可得的(例如，高纯RNA分离试剂盒、高纯病毒核酸试剂盒和MagNA纯LC总核酸分离试剂盒、用于细胞和组织的DNA分离试剂盒、用于哺乳动物血液的DNA分离试剂盒、高纯FFPET DNA分离试剂盒，可得自Roche)。在本文公开的方法的上下文中，收集RNA，尽管在某些实施方案中，可以将分类器用在先前制备的cDNA上。
IV. 雌激素受体突变的癌症和疗法
激素敏感的肿瘤通常用激素疗法治疗。激素不敏感的肿瘤通常不会对激素疗法做出应答。术语“激素疗法”适用于多种阻断激素（其影响肿瘤的生长）的效果的治疗。但是，在某些情况下，诸如某些子宫和肾癌，开出黄体酮或其合成形式的处方。
乳腺癌经常是激素敏感的，并测试诊断出乳腺癌的患者以确定所述肿瘤是否是雌激素受体(ESR1)和/或黄体酮受体阳性的。可以用干扰这些激素的产生的药物治疗受体阳性的肿瘤。使用外科手术或辐射可以进行卵巢切除以除去卵巢。外科手术之后经常是另外的化学疗法。阻断雌激素对ESR的影响的选择性雌激素受体调节剂(SERMS)包括他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬和氟维司群。另外的治疗包括芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑、依西美坦、来曲唑)和促黄体素(LH)阻滞剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林)。这些疗法可以组合使用，例如，对于绝经后患者，SERM与芳香酶抑制剂组合，或对于绝经前患者，SERM与LH阻滞剂组合。类似的疗法被认为对受体阳性的卵巢癌有效，而前列腺癌可以用促黄体素阻滞剂、抗雄激素类和/或促性腺激素释放激素阻滞剂治疗。
另外，患者可以受益于标准化学疗法。这可以包括CHOP (环磷酰胺；多柔比星；长春新碱；和泼尼松龙)或R-CHOP，后者还包括利妥昔单抗和/或依托泊苷。可以定期施用混合液设定的时间段，或直到检测到肿瘤大小和/或征状的减小。例如，可以每2或3周施用CHOP或R-CHOP。
不论选择哪种治疗，通常开始于低剂量，使得可以确定副作用，且增加剂量例如直到副作用出现或在患者的耐受性内或直到观察到临床益处。
开始治疗以后，患者可以变得耐受激素疗法。认为对激素疗法的抗性至少部分地归因于雌激素受体中的突变。这些突变中的许多是在配体结合结构域中，使得所述受体在没有雌激素释放存在下是有活性的。例子包括K303R、E380Q、V392I、S463P、K531E、V534E、P535H、L536Q/R、Y537S/C/N、D538G和R555C。测试雌激素受体中的突变允许给予患者更有效的治疗决策。所述测试可以是在激素疗法期间定期的，例如，在观察到抗性之前、过程中或之后。例如，可以将接受SERM疗法的患者转换至不同的激素疗法或它们的组合，或转换至标准化学疗法。
V. 扩增和检测
核酸样品可以用于检测和定量，例如，使用核酸扩增，例如，使用任何引物依赖性的方法。在某些实施方案中，进行初步的反转录步骤(也被称作RT-PCR，不与实时PCR混淆)。参 见，例如，Hierro等人(2006) 72:7148。本文中使用的术语“qRT-PCR”表示反转录和定量PCR。可以在单个试管中没有间断（例如，以加入试剂）地进行两个反应。例如，可以使用聚胸苷酸引物逆转录样品中所有具有聚腺苷酸尾巴的mRNA，可以使用随机寡核苷酸，或可以设计对将逆转录成cDNA的特定靶转录物特异性的引物。所述cDNA或来自样品的DNA可以形成要用于定量扩增(实时或定量PCR，即，RTPCR或qPCR)的最初模板。qPCR允许可靠地检测和测量在PCR过程的每个循环中产生的产物。这样的技术是本领域众所周知的，且试剂盒和试剂是商购可得的，例如，来自Roche Molecular Systems, Life Technologies, Bio-Rad,等。参见，例如，Pfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qPCR第50卷。
可以使用单独的逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶，例如，在两步(反转录，随后加入DNA聚合酶并扩增)或组合反应(一次性加入两种酶)中。在某些实施方案中，用具有逆转录酶活性和DNA模板依赖性活性的热稳定聚合酶扩增所述靶核酸。示例性的酶包括Tth DNA聚合酶、C. therm聚合酶系统和在US20140170730和US20140051126中公开的那些。
用于如本文中所述的用途的探针可以用荧光团和猝灭剂(例如，TaqMan、LightCycler、Molecular Beacon、Scorpion或Dual Labeled探针)标记。适当的荧光团包括FAM、JOE、TET、Cal Fluor Gold 540、HEX、VIC、Cal Fluor Orang 560、TAMRA、花青3、Quasar570、Cal Fluor Red 590、Rox、德克萨斯红、花青5、Quasar 670和花青5.5。适当的猝灭剂包括TAMRA (用于FAM、JOE和TET)、DABCYL和BHQ1-3。
检测装置是本领域已知的，且可以选择为对于选定的标记适当的。适合于定量PCR的检测装置包括cobas®和Light Cycler®系统(Roche)、PRISM 7000和7300实时PCR系统(Applied Biosystems)等。可在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)和Rotorgene Q(Qiagen)上得到6-通道检测，从而允许更高程度的多路化。
可以以阈值循环(缩写为Ct，且在某些情况下Cq或Cp)的方式表达结果。较低的Ct值反映了预定的阈值水平的快速达到，例如，因为更高的靶核酸浓度或更有效的扩增。较高的Ct值可能反映较低的靶核酸浓度，或无效的或受抑制的扩增。通常将阈值循环选择成在给定靶标的扩增的线性范围内。在某些实施方案中，将Ct设定为生长信号超过预定义的阈值线（例如，与基线有关）时的循环，或通过确定生长曲线的二阶导数的最大值。Ct的确定是本领域已知的，且描述在例如美国专利号7363168中。
VI. 试剂盒
本文提供了用于进行多路等位基因特异性的PCR以检测ESR1突变的试剂盒。所述试剂盒包括用于特异性地检测如本文中所述的特定ESR1突变的引物和探针。
用于检测ESR1 V422DelV的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 284或287-300、反向引物序列SEQ ID NO: 285或302-311和探针序列SEQ ID NO: 286或301。用于检测ESR1 S463P的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 260或263-272、反向引物序列SEQ ID NO: 261或274-283和探针序列SEQ ID NO: 262或273。用于检测ESR1L536H的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 96-105、反向引物序列SEQ IDNO: 106-120和探针序列SEQ ID NO: 94或95。用于检测ESR1 L536P的引物对可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 121-130和反向引物序列SEQ ID NO: 131-140。用于检测ESR1 L536Q的引物对可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 141-150和反向引物序列SEQ ID NO: 151-160。用于检测ESR1 L536R的引物对可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 161-170和反向引物序列SEQ ID NO: 171-180。用于检测ESR1 D538G的引物对可以选自正向引物序列SEQ IDNO: 4-13和反向引物序列SEQ ID NO: 14-27或550。用于检测ESR1 K303R的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 473、474或478-487、反向引物序列SEQ ID NO: 477、489-498或576和探针序列SEQ ID NO: 477或488。用于检测ESR1 E380Q的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 28或32-42、反向引物序列SEQ ID NO: 29、30或44-53和探针序列SEQ ID NO: 43或54。用于检测ESR1 L536_D538>P的引物可以选自反向引物序列SEQ ID NO: 84-93。用于检测ESR1 Y537C的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ IDNO: 394或397-406、反向引物序列SEQ ID NO: 395、408-425或574和探针序列SEQ ID NO:396或407。用于检测ESR1 Y537N的引物对可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 426-435和反向引物序列SEQ ID NO: 436-448或575-577。用于检测ESR1 Y537S的引物对可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 449-458和反向引物序列SEQ ID NO: 459-472或578。用于检测ESR1S341L的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 232、233或238-247、反向引物序列SEQ ID NO: 234、235或250-259和探针序列SEQ ID NO: 248或249。用于检测ESR1 L429V的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 58或61-70、反向引物序列SEQ ID NO:59或72-81和探针序列SEQ ID NO: 60或71。用于检测ESR1 V533M的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 312-318、322-333、355或356、反向引物序列SEQ ID NO: 319、320或336354和探针序列SEQ ID NO: 321、334或335。用于检测ESR1 V534E的引物对和探针可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 357或363-373、反向引物序列SEQ ID NO: 358-362或378-393和探针序列SEQ ID NO: 363或374-377。用于检测ESR1 P535H的引物对可以选自正向引物序列SEQ ID NO: 181-190和反向引物序列SEQ ID NO: 191-231。
另外，对于外显子8中的突变，可以使用常见的正向引物或常见的反向引物来扩增每种扩增产物，且可以使用常见的探针来检测每种扩增产物。技术人员会理解，可以对所述序列做出轻微变化，例如，1-3个核苷酸的添加或缺失。
在所述试剂盒中可以包括选自在表5中为每种突变公开的那些的等位基因特异性的引物，以及与该突变对应的常见引物和探针。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含1-18份包含等位基因特异性的引物对和探针的储备溶液。所述储备溶液可以任选地包括DNA聚合酶，且任选地包括引物对和探针以检测内部对照。在某些实施方案中，所述试剂盒包括2-5份这样的储备溶液，例如，2、3、4或5份储备溶液。
在某些实施方案中，所述储备溶液混合物进一步包含缓冲液、dNTP以及适合用于反转录和扩增的其它要素(例如，辅因子或适体)。通常，将所述混合物浓缩，使得与样品(例如，DNA)、酶和/或水一起，将等分试样加入最终的反应体积中。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含逆转录酶(或具有逆转录酶活性的酶)和/或DNA聚合酶(例如，热稳定的DNA聚合酶诸如Taq、ZO5及其衍生物)。
在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于从样品（例如，非侵袭性样品或组织样品）纯化DNA或RNA的组分。例如，所述试剂盒可以包括来自MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒、用于细胞和组织的DNA分离试剂盒、用于哺乳动物血液的DNA分离试剂盒、高纯FFPET DNA分离试剂盒、高纯或MagNA Pure RNA分离试剂盒(Roche)、DNeasy或RNeasy试剂盒(Qiagen)、PureLink DNA或RNA分离试剂盒(Thermo Fisher)等的组分。
在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括至少一个对照样品，例如，来自非癌样品(或合并的样品)或来自已知的ESR1突变的样品(或合并的样品)的核酸。在某些实施方案中，所述试剂盒包括阴性对照，例如，缺乏核酸，或缺乏突变的ESR1核酸。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括消耗品，例如，用于核酸制备的平板或试管、用于样品收集的试管等。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括使用说明书、参考网址或软件。
VII. 实施例
测定设计
设计了多路等位基因特异性的PCR测定来检测ESR1基因中的18个突变。检测到的突变显示在表1中。
表1. ESR1突变
。
为测定产生的引物和探针显示在表2中。技术人员会理解，所述列表不是穷尽性的，并且可以从显示的那些轻微修改引物和/或探针序列，例如，添加或减去一个或几个核苷酸，转移修饰的核苷酸的位置，或在给定的位点使用不同的修饰的核苷酸(例如，N4_Et_dC替代t_BB_dC)。在引物/探针名称中指出了检测的突变。FS#和RS# 分别表示正向特异性引物和反向特异性引物。CF#和CR# 分别表示普通正向引物和普通反向引物。F_P#和R_P#表示正向和反向探针。当将外显子8中的探针针对特定突变标记时，它们可以用于检测任何外显子8突变；通过等位基因特异性的引物来确定该测定的等位基因特异性。作为一个例子，为了检测D538G突变，任何ESR1_D538G_FS# 引物可以与任何ESR1_[Exon8mut]_CR# 引物和任何ESR1_[Exon8mut]_F_P# 探针一起使用，且任何ESR1_D538G_RS# 引物可以与任何ESR1_[Exon8mut]_CF# 引物和任何ESR1_[Exon8mut]_R_P# 探针一起使用。
修饰包括t_BB_[dNTP] = N6-叔丁基-苄基[dNTP]; N4_Et_[dNTP] = N4-乙基[dNTP]; N4_Bz_[dNTP] = N4-苄基[dNTP]; N6_Me_[dNTP] = N6-甲基[dNTP]; pdU = 5-丙炔基-脱氧尿嘧啶; 7_Dz_dG = 7-脱氮dG; LNA-[dNTP] = 锁核酸[dNTP]。
表2. 引物和探针序列
。
用于突变体的高灵敏度和特异性检测的寡核苷酸选择
选择引物以确保与野生型相比灵敏地和特异性地检测到突变体信号。使用被设计成对ESR1 K303R突变和对L536_D538>P突变特异性的引物对和探针来检测以1:1600 (100个突变体DNA拷贝在160,000个野生型拷贝中)的比例添加至野生型DNA和在单独野生型DNA中的突变体模板。在cobas z 480上进行等位基因特异性的扩增和检测。在描绘扩增周期相对于荧光信号(指示扩增产物的检测)的Ct曲线中表达数据。
图1A显示了对K303R特异性的反应，没有辨别力。选择的引物和探针以基本上相同的水平扩增和检测来自突变体和野生型样品的信号。图1B显示了对K303R特异性的反应，具有更好的辨别力。两种野生型样品的Ct向右转移至少两个周期。图1C显示了L536_D538>P的更加特异性的反应，其也是足够灵敏以检测至少1:1600的比例的突变体DNA。根本没有检测到野生型样品，而突变体样品具有约35-38的Ct。
类似的对比显示在图2A、2B和2C中，其中引物和探针被设计成对L536R突变特异性的。图2A显示了使用L536R_RS01等位基因特异性的引物的没有辨别力的反应。在与突变体基本上相同的水平扩增了野生型。图2B显示了使用L536R_RS09等位基因特异性的引物的更好的辨别力的反应，其中野生型具有与突变体相比延迟了至少5个周期的Ct。图2C显示了使用L536R_RS04等位基因特异性的引物的良好辨别力的反应。野生型具有超过50个周期的Ct，与刚好在约35的可检测范围内的突变体Ct相比，被认为没有检测到。
多路突变检测的特异性
以多路方式测试了引物对和探针集合以确定特异性并确保它们不会检测其它ESR1突变。为在表1中列出的18种突变体中的每一种制备单独的样品混合物，其中突变体DNA与野生型以1:1添加(各5000个拷贝)。加入对所有18个突变特异性的引物对和探针。图3显示了一个示例性的Ct曲线，其对ESR1 P535H具有高特异性。最左侧的具有约25-30的Ct的两个曲线代表存在于样品中的ESR1 P535H突变的特异性检测(用浅色箭头指示)。其它引物对和探针集合的Ct具有延迟更多的Ct (在两个黑色箭头之间指示)。
测定线性
也针对每个突变跨模板浓度范围检测了检测的线性。作为一个例子，使用对ESR1S341L特异性的引物对和探针在10,000个野生型拷贝的背景下扩增5-5000个拷贝突变体模板。结果显示在表3中，并表明所述测定是高度线性的。
表3
突变体拷贝数 Ct
5 33.04
50 29.32
500 26.23
5000 22.89
斜率 -3.36
R<sup>2</sup> 0.9987
设计的血浆样品中的ESR1突变的检测
在血浆背景中测试了所述测定以确定血浆组分是否会干扰。将突变体DNA以1000个拷贝加入2 ml正常(野生型)血浆中。用cobas®DNA样品制备试剂盒提取DNA。将与来自0.5 ml血浆的DNA等同的DNA加入每个PCR反应中。加入与每个突变对应的引物对和探针集合。示例性的结果显示在表4中。数据表明，突变体DNA可以在野生型血浆背景中灵敏地检测到。
表4
突变 含有加入的突变体的平均突变体Ct 在仅血浆样品中的平均突变体Ct
L536Q 28.62 45.20
V422delV 28.55 ND
L536R 28.55 45.20
L536H 28.40 45.20
Y537S 28.41 ND
E380Q 28.28 ND
L536P 29.41 45.20
选择的寡核苷酸
基于以上标准，选择表现出对突变体序列的良好特异性的等位基因特异性的引物。这些与引物名称和SEQ ID NO（在括号中）一起显示在下面的表5中。加粗的条目指示在下面表6的测定构型中表现出选择性和特异性的引物，尽管其它组合也良好地执行了。
表5：选择的等位基因特异性的引物
。
在外显子8 RS引物的情况下，可以使用任何外显子8 CF引物，例如，V533M_CF03(SEQ ID NO: 314)或Y537C_CF01 (SEQ ID NO: 394)。可以使用任何外显子8探针，例如Y537C_R_P01 (SEQ ID NO: 407)。一般而言，对于任何FS等位基因特异性的引物，可以使用任何对应的CR引物和F探针。类似地，对于任何RS等位基因特异性的引物，可以使用任何对应的CF引物和R探针。具体的例子包括：K303R_CR02 (SEQ ID NO: 476)和K303R_F_P01(SEQ ID NO: 477)；S341L_CR02 (SEQ ID NO: 235)和S341L_F_P02 (SEQ ID NO: 237)；E380QCRP3 (SEQ ID NO: 528)和E380Q_F_P01 (SEQ ID NO: 31)；V422delV_CR01 (SEQ IDNO: 285)和V422delV_F_P01 (SEQ ID NO: 286)；L429V_CR01 (SEQ ID NO: 59)和L429_F_P01 (SEQ ID NO: 60)；和S463P_CR01 (SEQ ID NO: 261)和S463P_F_P01 (SEQ ID NO:262)。
实施例测定配置
我们试图设计高度多路化的测定来在最小数目的反应容器中检测最大数目的突变。三容器测定的例子显示在下面表6和7中。将外显子8突变集合在一起以允许普通正向引物和探针的使用。如果需要的话，技术人员会理解如何鉴别产生突变阳性信号的确切外显子8突变，例如，使用使用突变特异性探针的测序或PCR。
表6: 用于等位基因特异性的多路ESR1突变的示例性测定配置
。
表7: 用于等位基因特异性的多路ESR1突变的示例性测定配置
。
技术人员会理解，可以进行不同的配置，取决于目标突变和荧光通道的可用性。例如，可以增加试管的数目以允许单个地检测外显子8突变。随着荧光通道的数目增加，在单个试管中可以包括的突变的数目将增加。
在多路反应中检测来自FFPET样品的E380Q突变
使用cobas®DNA样品制备试剂盒从142个来自癌症患者的FFPET样品(乳房、淋巴结、肺、骨)提取DNA。通过如本文中所述的多路等位基因特异性的PCR (一式两份地执行)，针对ESR1突变来分析DNA (50 ng/反应)。结果显示在图4A和4B中。发现1个样品(IN008)是E380Q突变阳性的，且具有与E380Q突变阳性对照(MC)类似的扩增生长曲线(参见图4A)。图4B显示了没有E380Q突变阳性对照的相同数据。使用ddPCR证实了结果。
E380Q突变阳性样品显示出与E380野生型和非模板对照可明显辨别的概况。结果也表明，本文描述的多路测定可有效地用于检测来自FFPET临床样品的DNA中的特异性突变。
在多路反应中检测来自血浆样品的D538G突变
从103位绝经后的转移性乳腺癌患者得到临床血浆样品(2 ml血浆)，所述患者在用芳香酶抑制剂治疗期间或在停药以后12个月内复发。使用cobas®cfDNA样品制备试剂盒提取DNA，并通过如本文中所述的多路等位基因特异性的PCR分析ESR1突变。3个样品测试D538G阳性的，如在图5中所示。图5显示了51个样品的结果，3个为D538G阳性和48个D538野生型。也显示了D538G突变阳性的和非模板对照，且D538G阳性的样品表现出可明显辨别的概况。使用ddPCR证实了结果。
结果表明，本文描述的多路测定可有效地用于检测来自非侵袭性的(血浆)临床样品的DNA中的特异性突变。

Claims (29)

1.一种试剂盒，其包含一个或多个容器，每个容器容纳两种或更多种引物对，每种引物对是对ESR1基因中的不同序列特异性的；
两种或更多种对ESR1基因中的不同序列特异性的探针，其中每种探针被荧光团和猝灭剂标记；
对内部对照序列特异性的引物对；和
对所述内部对照序列特异性的且用荧光团和猝灭剂标记的探针。
2.根据权利要求1的试剂盒，所述试剂盒包含3个容器。
3.根据权利要求1或2的试剂盒，其中每个容器容纳5-16种引物对。
4.根据权利要求1、2或3的试剂盒，其中每个容器容纳3-4种探针。
5.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，所述试剂盒包含对ESR1 V422DelV特异性的引物对、对ESR1 S463P特异性的引物对、对ESR1 L536H特异性的引物对、对ESR1 L536P特异性的引物对、对ESR1 L536Q特异性的引物对、对ESR1 L536R特异性的引物对、对ESR1 D538G特异性的引物对、ESR1 K303R、对ESR1 E380Q特异性的引物对、对ESR1 L536_D538>P特异性的引物对、对ESR1 Y537C特异性的引物对、对ESR1 Y537N特异性的引物对、对ESR1 Y537S特异性的引物对、对ESR1 S341L特异性的引物对、对ESR1 L429V特异性的引物对、对ESR1V533M特异性的引物对、对ESR1 V534E特异性的引物对和对ESR1 P535H特异性的引物对。
6.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i) 第一容器，其容纳对ESR1 V422DelV特异性的引物对、对ESR1 S463P特异性的引物对、对ESR1 L536H特异性的引物对、对ESR1 L536P特异性的引物对、对ESR1 L536Q特异性的引物对、对L536R特异性的引物对和对ESR1 D538G特异性的引物对；
(ii) 第二容器，其容纳对ESR1 K303R特异性的引物对、对ESR1 E380Q特异性的引物对、对ESR1 L536_D538>P特异性的引物对、对ESR1 Y537C特异性的引物对、对ESR1 Y537N特异性的引物对和对ESR1 Y537S特异性的引物对；和
(iii) 第三容器，其容纳对ESR1 S341L特异性的引物对、对ESR1 L429V特异性的引物对、对ESR1 V533M特异性的引物对、对ESR1 V534E特异性的引物对和对ESR1 P535H特异性的引物对。
7.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，其中所述两种或更多种引物对中的至少一种引物包括经修饰的非天然存在的核苷酸。
8.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，所述试剂盒包含具有SEQ ID NO: 24、113、134、158、178、264、261、262、285、286、298、314、394、407、31、42、90、415、447、469、476、477、481、528、59、60、70、231、235、237、245、350和388的序列的寡核苷酸。
9.根据前述权利要求中任一项的试剂盒，其中每个容器进一步容纳热稳定的DNA聚合酶。
10.一种用于确定来自个体的样品中是否存在两个或更多个ESR1突变的方法，所述方法包括：
(i) 从所述个体得到样品；
(ii) 进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在两个或更多个ESR1突变。
11.根据权利要求10的方法，其中所述个体具有乳腺癌且正在接受激素疗法。
12.根据权利要求10或11的方法，所述方法包括进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在10个或更多个ESR1突变。
13.根据权利要求10-12中任一项的方法，其中所述两个或更多个ESR1突变包括ESR1V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。
14.根据权利要求10-13中任一项的方法，所述方法进一步包括，当确定ESR1突变的存在时，给所述个体提供改变的治疗。
15.根据权利要求10-14中任一项的方法，其中在3个容器中进行所述多路等位基因特异性的PCR。
16.根据权利要求15的方法，其中如下在3个容器中确定是否存在ESR1突变：
(i) 在第一容器中ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1L536Q、L536R和ESR1 D538G；
(ii) 在第二容器中ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1Y537N和ESR1 Y537S；
(iii) 在第三容器中ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1P535H。
17.一种提供正在接受激素疗法的、具有乳腺癌的个体的改变的治疗的方法，所述方法包括：
(i) 从所述个体得到样品；
(ii) 进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在两个或更多个ESR1突变；
(iii) 如果确定ESR1突变的存在，提供所述个体的改变的治疗。
18.根据权利要求17的方法，所述方法包括进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在10个或更多个ESR1突变。
19.根据权利要求17或18的方法，其中所述两个或更多个ESR1突变包括ESR1V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。
20.根据权利要求17-19中任一项的方法，其中在开始激素疗法以后0.5-5年进行步骤(i)-(ii)。
21.根据权利要求17-20中任一项的方法，其中在激素疗法期间进行所述方法超过一次。
22.根据权利要求17-21中任一项的方法，其中所述步骤(iii)包括给所述个体提供另一种激素疗法或标准化学疗法。
23.一种治疗具有乳腺癌的个体的方法，所述方法包括：
(i) 给所述个体提供激素疗法；
(ii) 从所述个体得到样品；
(iii) 进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在两个或更多个ESR1突变；
(iv) 如果确定ESR1突变的存在，给所述个体提供改变的治疗。
24.根据权利要求23的方法，其中所述激素疗法是选择性雌激素受体调节剂(SERM)。
25.根据权利要求23或24的方法，所述方法包括进行多路等位基因特异性的PCR以确定是否存在10个或更多个ESR1突变。
26.根据权利要求23-25中任一项的方法，其中所述两个或更多个ESR1突变包括ESR1V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。
27.根据权利要求23-26中任一项的方法，其中在开始激素疗法以后0.5-5年进行步骤(ii)-(iii)。
28.根据权利要求23-27中任一项的方法，其中在激素疗法期间进行步骤(ii)-(iii)超过一次。
29.根据权利要求23-28中任一项的方法，其中所述步骤(iv)包括给所述个体提供另一种激素疗法或标准化学疗法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110452988A (zh) * 2019-08-27 2019-11-15 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 检测esr1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110709522A (zh) * 2017-04-04 2020-01-17 建喾立嗣股份公司 生物样本核酸质量的测定方法
WO2022131803A1 (ko) * 2020-12-15 2022-06-23 주식회사 제노픽스 유방암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물
WO2023086970A2 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 Arna Genomics Us Incorporated Methods and compositions for analyzing nucleic acids and nucleases in a body fluid as indicators of disease

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120178A (zh) * 2014-07-03 2014-10-29 陕西佰美基因股份有限公司 一种基于荧光pcr技术检测esr1基因突变的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7363168B2 (en) 2001-10-02 2008-04-22 Stratagene California Adaptive baseline algorithm for quantitative PCR
WO2013056178A2 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Foundation Medicine, Inc. Novel estrogen receptor mutations and uses thereof
WO2013083264A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with improved activity
WO2014090836A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with improved activity
US20160319367A1 (en) * 2013-12-17 2016-11-03 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut-Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Means and methods for typing a breast cancer patient and assigning therapy based on the typing
EP3116496A1 (en) * 2014-03-13 2017-01-18 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and compositions for modulating estrogen receptor mutants

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120178A (zh) * 2014-07-03 2014-10-29 陕西佰美基因股份有限公司 一种基于荧光pcr技术检测esr1基因突变的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAXIN NIU ET AL: "Incidence and clinical significance of ESR1 mutations in heavily pretreated metastatic breast cancer patients", 《ONCOTARGETS AND THERAPY》 *
RINATH JESELSOHN ET AL: "ESR1 mutations as a mechanism for acquired endocrine resistance in breast cancer", 《NATURE REVIEWS CLINICAL ONCOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110452988A (zh) * 2019-08-27 2019-11-15 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 检测esr1基因突变的引物组、试剂、试剂盒和方法

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