JP2019531061A - エストロゲン受容体ｅｓｒ１変異の検出用のマルチプレックス対立遺伝子特異的ｐｃｒアッセイ - Google Patents

エストロゲン受容体ｅｓｒ１変異の検出用のマルチプレックス対立遺伝子特異的ｐｃｒアッセイ Download PDF

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Abstract

エストロゲン受容体（ESR1）中の変異を検出するための方法と組成物が提供される。【選択図】図４Ａ

Description

乳癌の70％はエストロゲン受容体（ER）陽性であり、乳癌患者の大部分はホルモン療法に初回応答するけれども、その20〜30％が治療不応性になる。最近のデータは、抗エストロゲン治療の間に獲得され、稀に未処置の原発性ER陽性乳癌に認められるエストロゲン受容体遺伝子（ESR1）中の活性型変異が、治療耐性に関連があることを示唆している。ホルモン不応性乳癌検体において同定された、リガンド結合ドメイン中にある活性型ESR1変異の数が増加しており、その最も一般的な変異はK303R、E380Q、V392I、S463P、K531E、V534E、P535H、L536Q/R、Y537S/N/C、D538GおよびR555Cを包含する。作用機序は全ての変異についてまだ十分に解明されていないが、L536Q、Y537S/C/NおよびD538Gの変異が活性コンホメーションでのエストロゲン受容体リガンド結合ドメインを安定化し、それによってリガンドの不在下での転写コアクチベーターの動員を可能にすることが生体外（インビトロ）試験により証明された。エストロゲンに対する過敏性はK303R変異の機序と考えられる。
そのためESR1変異の検出はホルモン耐性を予測し治療に導く可能性がある。次世代シーケンシング（NGS）法は、少量のサンプルで多数の変異を同時検出できるので、そのような変異の検出のための一般的なアプローチである。しかしながら、NGSは非常に労働集約的であり、時間がかかりかつ費用がかかる。デジタルPCR（dPCR）はESR1変異検出に用いられている高感度の方法であるが、多数の欠点を有する：すなわち、dPCRワークフローは冗長であり、特殊な装置を必要とし、現在のdPCR機器において利用可能な光学チャネルの数によってマルチプレックス化（多重化）が制限される。
ESR1遺伝子中の変異を検出するためのキット、アッセイおよび方法、並びにホルモン感受性癌を有する患者の治療方法を提供する。
本発明は１または複数の容器を含むキットであって、該容器の各々は、各々がESR1遺伝子中の異なる配列に特異的な２以上のプライマー対；ESR1遺伝子中の異なる配列に特異的な１または複数のプローブ（各プローブは標識されている）；内在性コントロール配列に特異的なプライマー対；および内在性コントロール配列に特異的なプローブを保有する。ある態様では、各プローブはフルオロフォア（発蛍光団）とクエンチャー（消光剤）により標識される。ある態様では、該キットは1〜10個の容器、例えば2-5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10個またはそれ以上の容器を含む。ある態様では、各容器は２以上のプライマー対（内在性コントロールプライマー対を含む）、例えば3〜16、4〜10または5〜8つのプライマー対を含む。例えば、全てのエクソン８変異、内在性コントロールおよび２以上の別の変異プライマー対を単一のチューブに含めることができる。ある態様では、各容器が３〜４つのプローブ（内在性コントロールプローブを含む）を有する。ある態様では、各容器が耐熱性DNAポリメラーゼを更に保有する。
ある態様では、該キットは陽性対照、例えば既知ESR1変異を有するサンプル、および／または陰性対照、例えばESR1変異を含まないサンプルを更に含む。
ある態様では、ESR1遺伝子の各々異なる配列は、ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hから成る群より選ばれる。ある態様では、該キットはESR1 V422DelVに特異的なプライマー対、ESR1 S463Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Hに特異的なプライマー対、ESR1 L536Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536Rに特異的なプライマー対、ESR1 D538Gに特異的なプライマー対、ESR1 K303Rに特異的なプライマー対、ESR1 E380Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536_D538>Pに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Cに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Nに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Sに特異的なプライマー対、ESR1 S341Lに特異的なプライマー対、ESR1 L429Vに特異的なプライマー対、ESR1 V533Mに特異的なプライマー対、ESR1 V534Eに特異的なプライマー対、およびESR1 P535Hに特異的なプライマー対から成る群より選ばれた少なくとも２つのプライマー対を含む。ある態様では、少なくとも１つのプライマーが修飾された非天然型ヌクレオチドを含む。
ある態様では、該キットはESR1 V422DelVに特異的なプライマー対、ESR1 S463Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Hに特異的なプライマー対、ESR1 L536Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536Rに特異的なプライマー対、ESR1 D538G, ESR1 K303Rに特異的なプライマー対、ESR1 E380Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536_D538>Pに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Cに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Nに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Sに特異的なプライマー対、ESR1 S341Lに特異的なプライマー対、ESR1 L429Vに特異的なプライマー対、ESR1 V533Mに特異的なプライマー対、ESR1 V534Eに特異的なプライマー対、およびESR1 P535Hに特異的なプライマー対を含む。ある態様では、該キットはESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hを特異的に検出するプローブを更に含む。
ある態様では、該キットは、(i) ESR1 V422DelVに特異的なプライマー対、ESR1 S463Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Hに特異的なプライマー対、ESR1 L536Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536Rに特異的なプライマー対、およびESR1 D538Gに特異的なプライマー対を保有する第一容器；(ii) ESR1 K303Rに特異的なプライマー対、ESR1 E380Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536_D538>Pに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Cに特異的なプライマー対、ESR Y537Nに特異的なプライマー対、およびESR1 Y537Sに特異的なプライマー対を保有する第二容器；(iii) ESR1 S341Lに特異的なプライマー対、ESR1 L429Vに特異的なプライマー対、ESR1 V533Mに特異的なプライマー対、ESR1 V534Eに特異的なプライマー対、およびESR1 P535Hに特異的なプライマー対を保有する第三容器を含む。ある態様では、第一容器はESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536RおよびESR1 D538Gに特異的なプローブを更に保有する。ある態様では、単一のプローブが、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536RおよびESR1 D538Gを特異的に検出する。ある態様では、第二容器がESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537Sに特異的なプローブを更に保有する。ある態様では、単一のプローブが、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537Sを特異的に検出する。ある態様では、第三容器がESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hに特異的なプローブを保有する。ある態様では、単一のプローブがESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hを特異的に検出する。
ある態様では、ESR1 K303R変異を検出するための対立遺伝子（アレル）特異的プライマーが、配列番号479、481および484から成る群より選ばれ、そしてある態様では、コモンプライマーとプローブ配列がそれぞれ配列番号476と477である。ある態様では、ESR1 S341L変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが、配列番号239, 240, 242, 245，246, 247, 253, 254, 255, 256, 257, 258および259から成る群より選ばれ、そしてある態様では、コモンプライマーとプローブ配列がそれぞれ配列番号235と237である。ある態様では、ESR1 E380Q変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号32, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41および42から成る群より選ばれ、そしてある態様では、コモンプライマーとプローブ配列がそれぞれ配列番号528と31である。ある態様では、ESR1 V422DELV変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号287、294、295、296、297、298から成る群より選択され、そしてある場合には、コモンプライマーとプローブ配列がそれぞれ配列番号285と286である。ある態様では、ESR1 L429V変異を検出するための対立遺伝子プライマーが配列番号66, 68, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 79, 80および81から成る群より選択され、そしてある場合には、コモンプライマーとプローブ配列がそれぞれ配列番号59と60である。ある態様では、ESR1 S463P変異を検出するための対立遺伝子プライマーが配列番号264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 281, 282, 283および275から成る群より選択され、そしてある態様では、コモンプライマーとプローブ配列がそれぞれ配列番号261と262である。
ある態様では、コモンプライマーとプローブ、例えばそれぞれ配列番号314および／または394と配列番号407が、該アッセイにおいて全てのESR1エクソン８変異を増幅し検出するために用いられる。ある態様では、ESR1 V533M変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号322, 329, 330, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 352および353から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 V534E変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号364, 365, 367, 368, 370, 371, 373, 378, 388, 391, 392および393から成る群より選択される。ある場合には、ESR1 P535H変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号181, 188, 189, 190, 191, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 208, 209, 212, 225, 226, 228, 229および231から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 L536H変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号96, 101, 104, 105, 107, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116および117から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 L536P変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号134、135および137から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 L536Q変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号141, 151, 154, 155, 157, 158, 159および160から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 L536R変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号161, 172, 174, 175, 176, 177, 178, 179および180から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 Y537C変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号397, 408, 415, 416, 417, 418, 419, 420および424から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 Y537N変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号426, 436, 441, 445, 446, 447および448から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 Y537S変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号449, 459, 466, 467, 468, 469, 470, 471および472から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 D538G変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号14, 21, 22, 23, 24および25から成る群より選択される。ある態様では、ESR1 L536_D538>P変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーが配列番号84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92および93から成る群より選択される。
ある態様では、該キットは、配列番号24, 113, 134, 158, 178, 264, 261, 262, 285, 286, 298, 314, 394, 407, 31, 42, 90, 415, 447, 469, 476, 477, 481, 528, 59, 60, 70, 231, 235, 237, 245, 350および388の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。ある態様では、各容器は内在性コントロール、例えば配列番号511, 514および517を含む。
本発明は更に、個体からのサンプル中の２以上のESR1変異の存否を決定する（例えば検出する）方法であって、(i) 該個体からサンプルを採取し；そして(ii) マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施して２以上のESR1変異の存否を決定することを含む方法を提供する。ある態様では、前記サンプルが血液、血漿、血清、尿または粘膜組織（例えば頬ぬぐい液）から選ばれる。ある態様では、個体がホルモン応答性癌（例えばエストロゲン受容体および／またはプロゲステロン受容体陽性乳癌または卵巣癌）を有するか、または有すると診断された個体である。ある態様では、前記個体がホルモン療法を受けている。ある態様では、前記方法が、工程(i)の前に個体にホルモン療法（例えばSERM、アロマターゼ阻害剤、またはLH遮断薬での処置）を施すことを更に含む。ある態様では、前記方法が更に、工程(ii)においてESR1変異の存在が決定された場合に、個体に改変治療（例えば追加のホルモン療法または標準的化学療法）を施すことを含む。
ある態様では、本方法はマルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを使って10以上のESR1変異、例えば10〜20, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18または19個のESR1変異の存否を決定することを含む。ある態様では、２以上のESR1変異がESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hから選ばれる。ある態様では、２以上のESR1変異がESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hを含む。
ある態様では、マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRが本明細書中に記載のキット、例えば１〜10個の容器、例えば2〜5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10またはそれ以上の容器を含むキットを使って実施される。ある態様では、該キットが３容器を含む。例えば、(i) ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q, L536R、およびESR1 D538Gが第一容器中で検出され；(ii) ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537NおよびESR1 Y537Sが第二容器中で検出され；そして(iii) ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hが第三容器中で検出されるように、マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを３容器中で実施することができる。
更に、本発明はホルモン療法（例えばSERM、アロマターゼ阻害剤、および／または黄体形成ホルモン遮断薬）を受けているホルモン応答性癌（例えば乳癌）患者の改変治療を提供する方法を提供する。ある態様では、本方法が(i) 個体からサンプルを採取し（例えば血液、血漿、血清、尿、組織、FFPET等）；(ii) マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施し、２以上のESR1変異の存否を決定し；そして(iii) ESR1変異の存在が決定されたらその個体に改変治療を提供することを含む。ある態様では、工程(ii)が本明細書中に記載のキットを用いて実施される。
ある態様では、マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRが10以上のESR1変異の存否を決定する。ある態様では、２以上（または10以上）のESR1変異がESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hから成る群より選ばれる。ある態様では、ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hの存否が決定される。
ある態様では、工程(i)〜(iii)が、個体がホルモン療法を開始してから0.5〜５年後に実施される。ある態様では、当該方法が例えばホルモン療法に対する腫瘍の潜在的耐性をモニターするために、ホルモン療法中に２回以上実施される。ある態様では、該方法が定期的に、例えば６か月ごとに実施され、また別の態様では、該方法が個体の臨床的進行（例えば腫瘍成長、ホルモン療法に対する応答の減少など）がみられた時に実施される。ある態様では、工程(iii)が追加のホルモン療法または標準的化学療法を個体に提供することを含む。
加えて、ホルモン応答性癌（例えば乳癌または卵巣癌）を有する個体を治療する方法が提供される。ある態様では、該方法が、(i) 該個体にホルモン療法を施し；(ii) 該個体からサンプルを採取し；(iii) マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施して２以上のESR1変異の存否を決定し；そして(iv) ESR1変異の存在が決定されたら該個体に改変治療を提供することを含む。ある態様では、前記ホルモン療法がSERMである。
ある態様では、マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRが10以上のESR1変異の存否を決定する。ある態様では、２以上（または10以上）のESR1変異がESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hから成る群より選ばれる。ある態様では、ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hの存否が決定される。
ある態様では、工程(ii)〜(iii)が工程(i)後（個体がホルモン療法を開始した後）の0.5〜5年後に実施される。ある態様では、工程(ii)〜(iii)がホルモン療法の最中に２回以上実施される。ある態様では、該方法が定期的に、例えば６か月ごとに実施され、またある態様では、該方法が個体に臨床的進行（例えば腫瘍成長、ホルモン療法に対する応答の減少など）が認められた時に実施される。ある態様では、工程(iv)が追加のホルモン療法（例えばアロマターゼ阻害剤および／または黄体形成ホルモン遮断薬）または標準的化学療法を個体に提供することを含む。
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、変異型と野生型サンプルを検出するためのプライマーとプローブの識別能を比較する。図１Ａは、野生型と変異型の間の識別が弱小である、K303Rに特異的であるように設計されたプライマーとプローブを使った結果（増幅成長曲線）を示す。図１Ｂは、野生型（緑）と変異型（青；赤）の間の識別がより良好である、K303Rに特異的であるように設計されたプライマーとプローブを使った結果を示す。図１Ｃは、野生型サンプルに比較して変異型（青；赤）を検出する優れた特異性を示す、L536R_D538>Pに特異的であるように設計されたプライマーとプローブを使った結果を示し、ここで野生型サンプル（緑）は全くシグナルを示さない。 図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃも同様、L536R変異型と野生型サンプルを検出するためのプライマーとプローブの識別能を比較する。増幅成長曲線は、Ｘ軸に増幅サイクル数をＹ軸上にシグナルを示す。図２Ａは、野生型と変異型の間の識別が貧弱である、L536R_RS01対立遺伝子特異的プライマーを使った結果を示す。図２Ｂは、野生型（緑）と変異型の間の識別が良好である、L536R_RS09対立遺伝子特異的プライマーを使った結果を示す。図２Ｃは、野生型サンプルに比較して変異型を検出する特異性がより優れている、L536R_RS04対立遺伝子特異的プライマーを使った結果を示し、ここで野生型サンプル（緑）は本質的に全くシグナルを示さない。 図３は、別のESR1変異型サンプル（全て別の曲線／色）と比較したP535H変異（ピンク；紺青）に特異的であるように設計されたプライマーとプローブの特異性を示す。 図４Ａは、E380Q変異陽性対照（MC、一番上／左の２本の曲線）、E380Q変異陽性サンプル（IN008、次の下２本の曲線）、E380野生型（FFPET_WT、次の下２本の曲線）、および非鋳型対照（NTC、一番下の水平線）についての増幅成長曲線を示す。図４Ｂは、E380Q変異陽性対照曲線のない同一増幅成長曲線を示す。 図５は、D538G変異陽性対照（MC、一番上／左の曲線）、３つのD538G変異陽性サンプル（D538G、次の下３本の曲線）、D538野生型（次の下48本の曲線）および非鋳型対照（NTC、一番下の水平線）についての増幅成長曲線を示す。
発明の詳細な説明
I.序論
ヒトエストロゲン受容体（ESR1）中の変異の存在を検出するためのマルチプレックスPCRアッセイが提供される。それらの変異は、初回投与された時にはホルモン療法に感受性であったホルモン応答性癌（ESR1陽性および／またはプロゲステロン受容体陽性）を有する癌患者における、ホルモン療法に対する耐性に関連付けられている。これらのアッセイは、非侵襲性のサンプル（例えば血液、血漿、血清、尿等）を使って実施することが可能であり、そのため多数の組織生検を採取することなくホルモン療法中の患者に反復試験を実施することができる。
本明細書に記載のアッセイは、信頼性のある、広く受け入れられる技術に依拠しており、正確で、再現性のある、迅速な結果を提供する。
II.定義
用語「エストロゲン受容体」、「ER」および「ESR1」は、本明細書中異なって指摘されない限り相互交換可能に用いられる。ESR1はERタンパク質をコードする遺伝子を指すためにも用いることができる。
用語「マルチプレックス」は、複数の標的が検出されるアッセイを指す。
用語「容器」、「器」、「チューブ」、「ウェル」、「チャンバー」、「マイクロチャンバー」等は、アッセイを実施または試薬を保有できる容器を指す。容器がキット内にありかつ試薬を保有している時、または増幅反応に使用する予定である時、それは汚染や蒸発を避けるために密閉または密封することができる。容器をアッセイに使用しようとする時、それは少なくともアッセイの準備の間、開封するまたは利用可能にすることができる。
マーカー遺伝子またはマーカー遺伝子産物に関する用語「個別に検出される」または「個別検出」は、マルチプレックス反応において各マーカーが検出されることを示す。すなわち、各マーカーが異なる標識に関連付けられる（異なるように標識されたプローブによって検出される）。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はヌクレオチド（例えばリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）のポリマーを指し、天然型核酸（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシルおよびチミジン）、非天然型核酸および修飾核酸を包含する。この用語はポリマーの長さ（例えばモノマーの数）により制限されない。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよく、一般に５′−３′ホスホジエステル結合を含むだろうが、ある場合には、ヌクレオチド類似体が別の結合を含むことがある。モノマーとは典型的にはヌクレオチドを言う。用語「非天然型ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」とは、修飾された窒素含有塩基、糖またはリン酸基を含むヌクレオチド、またはその構造中に非天然成分を含むヌクレオチドを指す。非天然型ヌクレオチドの例としては、ジデオシキシヌクレオチド、ビオチン化、アミノ化、脱アミノ化、アルキル化、ベンジル化およびフルオロフォア標識ヌクレオチドが挙げられる。
用語「プライマー」は、適当な条件下での核酸ポリメラーゼによるポリヌクレオチド鎖合成の開始点として働く短鎖核酸（オリゴヌクレオチド）を指す。ポリヌクレオチド合成および増幅反応は、典型的には、適当な緩衝液、dNTPsおよび／またはrNTPs、並びに１以上の随意の補因子（コファクター）を含み、そして適当な温度で実施される。プライマーは典型的には、標的配列に対して少なくとも実質的に相補的である（例えば0,1,2または3つのミスマッチを有する）少なくとも１つの標的ハイブリダイズ領域を含む。この領域は、典型的には長さが約８〜約40ヌクレオチドであり、例えば12〜25ヌクレオチドである。「プライマー対」とは、標的配列に関して反対の方向で配向され、かつ増幅条件下で増幅産物を産生する正(foward)および逆(reverse)プライマーのことを言う。ある態様では、マルチプレックスプライマー対は単一のコモン（common）正または逆プライマーに基づく。例えば、マルチプレックス対立遺伝子特異的正プライマーは、例えば、マルチプレックス対立遺伝子が互いに近接して存在する場合には、同じコモン逆プライマーとのプライマー対の一部と考えることができる。
本明細書中で用いるとき「プローブ」とは、特別に対象とする標的生体分子に選択的に、例えば該プローブにハイブリダイズする着目の核酸配列に選択的に結合することができる分子を意味する。プローブは、少なくとも１つの非ヌクレオチド成分により検出可能に標識される。ある態様では、プローブはフルオロフォア（発蛍光団）とクエンチャー（消光剤）で標識される。
「相補的」または「相補性」という語は、あるポリヌクレオチド中の核酸が第二のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成できる能力を指す。例えば、配列A-G-T（RNAの場合はA-G-U）は配列T-C-A（RNAの場合はU-C-A）に相補的である。相補性は、核酸の一部のみが塩基対合に従って一致する部分的相補性であるか、または核酸の全部が塩基対合に従って一致する完全相補性であることができる。プローブまたはプライマーは、それが標的配列に対し少なくとも部分的に相補的であるならば、標的配列に「特異的である」と見なされる。条件に依存して、標的配列に対する相補性の程度は、典型的には、プライマーのような短い核酸の方が長鎖の配列よりも高い（例えば80％、90％、95％またはそれ以上の高い相補性）。ある態様では、用語「ESR1遺伝子中の異なる配列に特異的な各プライマー対」とは、各々のプライマー対がESR1遺伝子の異なる配列、例えば異なる対立遺伝子または変異を特異的に増幅することを示す。
用語「特異的に増幅する」は、プライマーセットが統計的に有意なレベルで非標的配列よりも標的配列を多く増幅することを示す。用語「特異的に検出する」は、プローブが統計的に有意なレベルで非標的配列よりも標的配列を多く検出することを指す。当業者に理解されるように、特異的な増幅と検出は、陰性対照（ネガティブコントロール）、例えば試験サンプルと同じ核酸を含むが標的配列を含まないサンプルまたは核酸を欠いているサンプルを使って測定することができる。例えば、標的配列を特異的に増幅し検出するプライマーとプローブは、バックグラウンド（非標的配列）から容易に識別可能であるCt値、例えばバックグラウンドよりも少なくとも2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20, または10-30サイクル数だけ少ないCtをもたらす。用語「対立遺伝子特異的」PCRとは、標的配列の特定の対立遺伝子変異体を特異的に増幅するプライマーを使用した標的配列の増幅のことを言う。典型的には、正または逆プライマーは、その位置に対立遺伝子変異体の正確な相補体を含む。
２以上の核酸または２以上のポリペプチドに関連する用語「同一」または「同一性％」とは、BLASTまたはBLAST 2.0配列比較演算法を使ってデフォルトパラメーターを用いて測定した時、または手動の整列と目視検査により測定した時、同一である（例えば、比較窓を通して比較し最大の同一性（一致）となるよう整列した時の特定の領域に渡ってまたは指定した領域に渡って、例えば約60％一致、例えば少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い一致を有する）ヌクレオチドまたはアミノ酸の特定の割合を有する、２以上の配列または部分配列を指す。例えばNCBIウエブサイト ncbi.nlm.nih.gov/BLASTを参照のこと。そのような配列は次いで「実質的に同一」と呼ばれる。同一性％は、典型的には最適に整列（アラインメント）された配列において決定され、そのため欠失および／または付加を有する配列並びに置換を有するものにもその定義を適用する。当業界で一般に用いられる演算法はgap（ギャップ）等を形成する。典型的には、同一性は、長さ少なくとも約8〜25アミノ酸またはヌクレオチドである配列を含む領域に渡って、または長さ50〜100アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域に渡って、または参照配列の全長に渡って存在する。
用語「キット」は、本明細書に記載されるようなRNAまたはDNAを特異的に増幅し、捕捉し、タグ付け／変換しまたは検出するための、少なくとも１つの試薬、例えば核酸プローブまたはプローブプール等を含む任意の製品（例えばパッケージまたは容器）を指す。
用語「増幅条件」とは、プライマーのハイブリダイゼーションと鋳型依存性伸長を可能にする核酸増幅反応（例えばPCR増幅）の条件を指す。用語「アンプリコン」または「増幅産物」は、標的核酸配列の全体または断片を含む核酸分子であり、任意の適当な増幅方法による試験管内（in vitro）増幅の産物として形成される核酸分子を指す。当業者は、正および逆プライマー（プライマー対）が増幅産物の境界を限定することを理解するだろう。プライマーに用いるときの用語「増幅産物を産生する」とは、適当な条件下で（例えばヌクレオチドポリメラーゼとNTPsの存在下で）、該プライマーが限定された増幅産物を産生することを示す。様々なPCR条件がPCR Strategies（Innis他、1995, Academic Press, San Diego, CA）の第14章；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis他、Academic Press, NY, 1990)中に記載されている。
用語「増幅産物」は、増幅反応の生産物を指す。増幅産物は、ポリヌクレオチド合成の各ラウンドを開始するのに使われるプライマーを含む。「アンプリコン」は、増幅のための標的とされる配列であり、該用語は増幅産物を指すためにも用いることができる。アンプリコンの5′および3′境界は、正と逆プライマーにより限定される。
用語「個体」、「被験者」および「患者」は、本明細書中では互いに交換可能に用いられる。個体は診断前、診断後で治療前、治療中、または治療後であることができる。本開示の状況下では、個体は典型的には医療を求めている。
用語「サンプル」または「生物学的試料」は、核酸を含むかまたは含むと推測される任意の組成物を言う。該用語は、細胞、組織または血液の精製または分離された成分、例えばDNA、RNA、タンパク質、無細胞画分、または細胞溶解物を包含する。サンプルは例えば腫瘍または転移病巣からのFFPETであることができる。サンプルは凍結もしくは新鮮組織から、または液体サンプルから、例えば血液もしくは血液成分（血漿もしくは血清）、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、涙液、リンパ、脳脊髄液、口／喉うがい液、気管支肺胞洗浄液、スワブからの洗浄材料などであることができる。サンプルは個体から採取された細胞（細胞系を含む）の試験管内（in vitro）培養物の構成成分および成分を含んでもよい。サンプルは、個体から直接採取されたサンプルから部分的に加工処理することもでき、例えば細胞溶解物または赤血球枯渇血であることもできる。
用語「個体からサンプルを採取する」とは、個体からの生物学的試料を試験用に準備することを意味する。採取は個体から直接であることもでき、あるいは個体からサンプルを直接得た第三者からのものであることができる。
用語「個体に治療を施す」は、治療が処方されるか、推奨されるか、個体に利用可能にされることを意味する。治療は第三者により個体に実際に施されてもよく（例えば入院患者への注射）、または個体自身により施されてもよい。
「対照」サンプルまたは値は、試験サンプルまたは試験条件に対する比較のためのリファレンス（基準）として、通常は既知リファレンスとして働く値を指す。例えば、試験サンプルは試験条件から取ることができ、例えば癌を有する疑いのある個体から採取し、そして既知条件から、例えば癌のない個体（陰性対照）から、または癌を有する患者（陽性対照）からのサンプルと比較することができる。本開示のもとでは、試験サンプルは典型的には乳癌患者からのものである。対照は、試験もしくは結果の平均値または試験もしくは結果から集積された範囲を表すこともできる。対照は反応条件に合わせて調製することもできる。例えば、核酸の存在、質および／または量の対照（例えば内在性コントロール）としては、サンプル中に存在することが知られている配列（例えばハウスキーピング遺伝子、例えばβアクチン、βグロビン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、リボソームプロテインL37とL38、PPIアーゼ、EIF3、真核翻訳伸長因子２（eEF2）、DHFR、またはコハク酸デヒドロゲナーゼ）を検出するであろうプライマーとプローブを挙げることができる。ある態様では、内在性コントロールは、普通は変異体でない（例えば異なるエクソン中の）同一遺伝子の領域からの配列であることができる。例えば指定された長さを有する既知の追加のポリヌクレオチドを追加することもできる。陰性対照の例は、核酸を持たないもの、またはサンプル中に存在しないと思われる配列に特異的なプライマーまたはプローブを含むもの、例えば異なる種からのものである。当業者は、対照の選択が、例えば対照が細胞型と生物体に適当となるように、特定のアッセイに依存すること理解するだろう。当業者は、任意の数のパラメーターの評価のために対照を設計できることを理解するだろう。例えば、薬理学的データ（例えば半減期）または治療的尺度（例えば効用および／または副作用の比較）に基づいた治療効果を比較するために対照を考案することができる。対照を試験管内用途のために設計することができる。当業者は、対照が特定の状況下で有益でありかつ対照値に対する比較に基づいてデータを分析できることを理解するだろう。対照はデータの有意性を決定するのにも有益である。例えば、ある一定のパラメーターの値が対照サンプルで幅広く変動的であるならば、試験サンプルでの変動は有意とは見なされないだろう。
用語「標識」、「タグ」、「検出可能成分」等は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の物理的手段により検出可能な成分を指す。例えば、有用な標識としては、フルオロフォア（発蛍光団）、発光性物質、放射性同位体（例えば32P、3H）、高電子密度試薬、または親和性に基づく成分、例えばポリA（ポリTと相互作用する）、ポリTタグ（ポリAと相互作用する）、Hisタグ（Niと相互作用する）、またはストレプトアビジンタグ（ビオチンで分離可能）が挙げられる。当業者は、核酸に結合された検出可能標識が天然に存在しないことを理解するだろう。
異なって定義されない限り、本明細書中で用いる技術用語と科学用語は、当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier（第４版、2007）；Sambrook他、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)参照。用語「１つの（a, an）」は「１または複数の」を意味するものである。工程または要素の言及の後に続く用語「含む」、「含んでなる」および「含んでいる」とは、更なる工程または要素の追加が随意であって排他的でないことを意味するつもりである。
III.核酸サンプル
核酸増幅用のサンプルは、核酸を含む疑いのある任意源から得ることができる。サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）、組織生検または培養細胞（例えば患者から得られるかまたは対照を表すもの）から採取することができる。ある態様では、サンプルは非侵襲性の方法で、例えば尿、皮膚、スワブ、唾液、血液または血液画分から得られる。
細胞を含むサンプルでは、細胞を分離する（例えばサイズに基づいたろ過または遠心を使って）ことができ、それにより無細胞核酸（cfNA）、例えばエキソソーム、微小胞、ウイルス粒子または自由に循環している前記のものの中の核酸を残すことができる。あるいは、磁気ガラス粒子（MGP）の存在下において細胞を溶解させるか、または細胞性溶解物をMGPに添加する前に、細胞を溶解させて細胞性核酸を得ることができる。
生物学的サンプルから核酸を単離する方法は、例えばSambrook中に記載されているように既知であり、いくつかのキットが市販されている〔例えば、Roche社から入手可能である、高純度RNA単離キット（High Pure RNA Isolation Kit）、高純度ウイルス核酸キット（High Pure Viral Nucleic Acid Kit）、MagNA Pure LC全核酸単離キット（MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit）、細胞・組織用DNA単離キット（DNA Isolation Kit for Cells and Tissues）、哺乳類血液用DNA単離キット（DNA Isolation Kit for Mammalian Blood）、高純度FFPET DNA単離キット（High Pure FFPET DNA Isolation Kit）〕。本明細書に開示される方法に関しては、RNAが回収されるが、ある態様では、前もって調製されたcDNAに分類子を用いることができる。
IV.エストロゲン受容体変異癌および治療
ホルモン感受性腫瘍は一般にホルモン療法で処置される。ホルモン非感受性腫瘍は典型的にはホルモン療法に応答しない。用語「ホルモン療法」は、腫瘍の成長に影響を及ぼすホルモンの作用を阻止する様々な治療法に適用する。しかしながら、ある種の子宮癌と腎臓癌のような症例には、プロゲステロンまたはそれの合成種が処方される。
乳癌はしばしばホルモン感受性であり、乳癌と診断された患者は、腫瘍がエストロゲン受容体（ESR1）および／またはプロゲステロン受容体陽性であるかどうかを決定するために試験される。受容体陽性腫瘍は、それらのホルモンの産生を阻害する剤で治療することができる。外科手術または放射線を用いて卵巣を除去する卵巣切除を実施することができる。外科手術はしばしば追加の化学療法の後に続いて行われる。ESRに対するエストロゲンの作用を遮断する選択的エストロゲン受容体モジュレーター（SERMS）としては、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、およびフルベストラントが挙げられる。追加の治療としては、アロマターゼ阻害薬（例えばアナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール）および黄体形成ホルモン（LH）遮断薬（例えばゴセレリン、ロイプロリド）が挙げられる。それらの療法は併用でき、例えば、閉経後の患者にはSERMをアロマターゼ阻害薬と併用して、または閉経前患者にはSERMをLH遮断薬と併用することができる。同様な療法が受容体陽性卵巣癌に有効と考えられるが、前立腺癌は黄体形成ホルモン遮断薬、抗アンドロゲン、および／またはゴナドトロピン放出ホルモン遮断薬で処理することができる。
その上、患者は標準化学療法から恩恵を受けることができる。該療法は、CHOP（シクロホスファミド；ドキソルビシン；ビンクリスチン；およびプレドニソロン）またはリツキシマブおよび／またはエトポシドを更に含むR-CHOPを包含する。このカクテルは、一定期間の間定期的に、または腫瘍サイズおよび／または症状の低減が認められるまで投与することができる。例えば、CHOPまたはR-CHOPは２〜３週間ごとに投与することができる。
どの処置が選択されるかにかかわらず、典型的には副作用を測定できるように低用量で始まり、そして副作用が出現するまでまたは患者の耐容の範囲内で、あるいは臨床的効果が観察されるまで、用量が増加される。
初回治療の後、患者はホルモン療法に耐性になり得る。ホルモン療法に対する耐性は、少なくとも一部は、エストロゲン受容体中の突然変異のためであると考えられる。それらの変異の多くはリガンド結合ドメイン中に存し、そのため該受容体はエストロゲン放出の欠損下で活性となる。その変異の例としては、K303R、E380Q、V392I、S463P、K531E、V534E、P535H、L536Q/R、Y537S/C/N、D538G、およびR555Cが挙げられる。エステロゲン受容体中の変異についての試験は、患者に対しより効果的な治療決定を可能にする。試験はホルモン療法の最中に定期的であることができ、例えば耐性の所見の前、最中、または後であることができる。例えば、SERM療法を受けている患者は、別のホルモン療法もしくはそれの併用療法に、または標準化学療法にスイッチすることができる。
V.増幅と検出
核酸サンプルは、例えば核酸増幅を使った、例えば任意のプライマー依存性増幅法を使った、検出と定量に用いることができる。ある態様では、予備的な逆転写工程が実施される（RT-PCRとも呼ばれるが、リアルタイムPCRと混同してはならない）。例えばHierro他（2006）72:7148を参照のこと。本明細書中で用いる用語「qRT-PCR」は、逆転写と定量的PCRを指す。この両反応は中断を伴わずに、例えば試薬を添加するための中断を伴わずに、単一のチューブ中で実施できる。例えば、ポリＴプライマーを使って、ポリＡテールを有するサンプル中の全mRNAを逆転写することができ、ランダムオリゴヌクレオチドを使用することができ、またはcDNAに逆転写される特定の標的転写物に特異的であるプライマーを設計することができる。cDNAまたはサンプル由来DNAは、定量的増幅（リアルタイムまたは定量的PCR、すなわちRT-PCRまたはqPCR）用に意図される最初の鋳型を成すことができる。qPCRは、PCR工程の各サイクルの間に生成される生成物の信頼できる検出と測定を可能にする。そのような技術は当業界で周知であり、キットと試薬は例えばRoche Molecular Systems社、Life Technologies社、Bio-Rad社等から市販されており、例えばPfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qPCR、第50巻を参照のこと。別々の逆転写酵素と耐熱性DNAポリメラーゼを、例えば二段階反応（逆転写の後にDNAポリメラーゼの添加と増幅を行う）または組み合わせ反応（両酵素を一度に添加する）で使用することができる。ある態様では、逆転写酵素活性とDNA鋳型依存性活性の両方を有する耐熱性ポリメラーゼを用いて標的核酸が増幅される。典型的な酵素としては、Tth DNAポリメラーゼ、C.thermポリメラーゼ系、およびUS 20140170730とUS 20140051126に開示されたものが挙げられる。
本明細書中に記載されるような使用のためのプローブは、フルオロフォアとクエンチャーで標識することができる（例えばTaqMan, LightCycler, Molecular Beacon, Scorpion, またはDual Labeledプローブ）。適当なフルオロフォアとしてはFAM, JOE, TET, Cal Fluor Gold 540, HEX, VIC, Cal Fluor Orang 560, TAMRA, Cyanine 3, Quasar 570, Cal Fluor Red 590, Rox, Texas Red, Cyanine 5, Quasar 670, およびCyanine 5.5が挙げられる。適当なクエンチャーとしてはTAMRA（FAM,JOEおよびTET用）, DABCYLおよびBHQ1-3が挙げられる。
検出装置は従来既知であり、選択される標識に合わせて適当に選択される。定量的PCRに適当な検出装置としては、cobas（登録商標）およびLight Cycler（登録商標）システム（Roche社）、PRISM 7000および7300リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems社）等が挙げられる。６チャネル検出がCFX96リアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad社）およびRotorgene Q (Qiagen社)上で利用可能であり、より高度のマルチプレックス化を可能にする。
結果は閾値サイクル（Ctと略記され、場合によりCqまたはCpとも略記される）の形で表すことができる。低いCt値は、例えばより高い標的核酸濃度またはより効率的な増幅のために得られる、予め決められた閾値レベルへの迅速な達成を示す。高いCt値は、より低い標的核酸濃度、または非効率的なもしくは阻害された増幅を反映しうる。ある態様では、Ctは、例えばベースラインに関して、または成長曲線の二次導関数の最大値を求めることにより、予め定められた閾値ラインを超えるサイクル数として設定される。Ctの測定は当業界で公知であり、例えば米国特許第7363168号明細書中に記載されている。
VI.キット
本発明は、ESR1変異を検出するためのマルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施するためのキットを提供する。該キットは、本明細書に記載される特定のESR1変異を特異的に検出するためのプライマーとプローブを含有する。
ESR1 V422DelVを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号284または287〜300の正プライマー配列、配列番号285または302〜311の逆プライマー配列、および配列番号286または301のプローブ配列から選択することができる。ESR1 S463Pを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号260または263〜272の正プライマー配列、配列番号261または274〜283の逆プライマー配列、および配列番号262または273のプローブ配列から選択することができる。ESR1 L536Hを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号96〜105の正プライマー配列、配列番号106〜120の逆プライマー配列、および配列番号94または95のプローブ配列から選択することができる。ESR1 L536Pを検出するためのプライマー対は、配列番号121〜130の正プライマー配列および配列番号131〜140の逆プライマー配列から選択することができる。ESR1 L536Qを検出するためのプライマー対は、配列番号141〜150の正プライマー配列および配列番号151〜160の逆プライマー配列から選択することができる。ESR1 L536Rを検出するためのプライマー対は、配列番号161〜170の正プライマー配列および配列番号171〜180の逆プライマー配列から選択することができる。ESR1 D538Gを検出するためのプライマー対は、配列番号4〜13の正プライマー配列および配列番号14〜27または550の逆プライマー配列から選択することができる。ESR1 K303Rを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号473、474または478〜487の正プライマー配列、配列番号477、489〜498または576の逆プライマー配列、および配列番号477または488のプローブ配列から選択することができる。ESR1 E380Qを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号28または32〜42の正プライマー配列、配列番号29、30または44〜53の逆プライマー配列、および配列番号43または54のプローブ配列から選択することができる。ESR1 L536_D538>Pを検出するためのプライマーは、配列番号84〜93の逆プライマー配列から選択することができる。ESR1 Y537Cを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号394または397〜406の正プライマー配列、配列番号395、408〜425または574の逆プライマー配列、および配列番号396または407のプローブ配列から選択することができる。ESR1 Y537Nを検出するためのプライマー対は、配列番号426〜435の正プライマー配列および配列番号436〜448または575〜577の逆プライマー配列から選択することができる。ESR1 Y537Sを検出するためのプライマー対は、配列番号449〜458の正プライマー配列および配列番号459〜472または578の逆プライマー配列から選択することができる。ESR1 S341Lを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号232、233、または238〜247の正プライマー配列、配列番号234、235、または250〜259の逆プライマー配列、および配列番号248または249のプローブ配列から選択することができる。ESR1 L429Vを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号58または61〜70の正プライマー配列、配列番号59または72〜81の逆プライマー配列、および配列番号60または71のプローブ配列から選択することができる。ESR1 V533Mを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号312〜318、322〜333、335または356の正プライマー配列、配列番号319、320または336354の逆プライマー配列、および配列番号321、334または335のプローブ配列から選択することができる。ESR1 V534Eを検出するためのプライマー対とプローブは、配列番号357または363〜373の正プライマー配列、配列番号358〜362または378〜393の逆プライマー配列、および配列番号363または374〜377のプローブ配列から選択することができる。ESR1 P535Hを検出するためのプライマー対は、配列番号181〜190の正プライマー配列および配列番号191〜231の逆プライマー配列から選択することができる。
その上、エクソン８中の変異については、コモン（またはユニバーサル）正プライマーまたはコモン逆プライマーを用いて各増幅産物を増幅させることができ、そしてコモンプローブを用いて各増幅産物を検出することができる。当業者は、配列にわずかな変更を加えることができ、例えば１〜３個のヌクレオチドの付加または削除を行うことができる。
各変異について表５に開示されたものから選ばれた対立遺伝子特異的プライマーを、その変異に相当するコモンプライマーおよびプローブと一緒に、該キットに含めることができる。
ある態様では、該キットは、対立遺伝子特異的プライマーとプローブを含む１〜18個の原液を含む。この原液は、随意にDNAポリメラーゼを含むことができ、そして随意に内在性コントロールを検出するためのプライマーとプローブを含むことができる。ある場合には、該キットは２〜５個の前記原液、例えば2，3，4，または5個の原液を含む。
ある態様では、前記原液混合物は、緩衝液、dNTPs、および逆転写と増幅に適当な他の要素（例えば補因子またはアプタマー）を更に含む。典型的には、該混合物は、そのアリコートをサンプル（例えばDNA）、酵素および／または水と一緒に最終反応容量へと添加されるように濃縮された形である。ある態様では、該キットは逆転写酵素（または逆転写活性を有する酵素）および／またはDNAポリメラーゼ（例えば耐熱性DNAポリメラーゼ、例えばTaq、ZO5およびその誘導体）を更に含む。
ある態様では、該キットはサンプル、例えば非侵襲性サンプルまたは組織サンプルからのDNAまたはRNA精製用の成分を更に含む。例えば、該キットは、MagNA Pure LC全核酸単離キット（MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit）、細胞と組織用DNA単離キット（DNA Isolation Kit for Cells and Tissues）、哺乳類血液用DNA単離キット（DNA Isolation Kit for Mammalian Blood）、高純度FFPET DNA単離キット（High Pure FFPET DNA Isolation Kit）、高純度またはMagNA Pure RNA単離キット（High Pure or MagNA Pure RNA Isolation Kits） (以上Roche社)、DNeasyまたはRNeasy Kit (Quiagen社)、PureLink DNAまたはRNA単離キット（PureLink DNA or RNA Isolation Kits） (Thermo Fischer社)等からの成分を含むことができる。
ある態様では、該キットは少なくとも１つの対照サンプル、例えば癌でないサンプル（またはプールしたサンプル）からの核酸、または既知のESR1変異型サンプル（またはプールしたサンプル）からの核酸を更に含む。ある態様では、該キットは陰性対照、例えば核酸を持たないもの、または変異型ESR1核酸を持たないものを含む。ある態様では、該キットは消耗品、例えば調製用プレートまたはチューブ、サンプル収集用チューブ等を更に含む。ある態様では、該キットは使用説明書、ウエブサイトへのリファレンス、またはソフトウェアを更に含む。
VII.実施例
アッセイ設計
ESR1遺伝子中の18種の変異を検出するためのマルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを設計した。検出される変異を表１に示す。
表１．ESR1変異
アッセイ用に作製したプライマーとプローブを表２に示す。当業者は、この一覧表が排他的なものでないこと、そしてプライマーおよび／またはプローブ配列が表示のものから僅かに変更できること、例えば１または数個のヌクレオチドを追加または削減するか、修飾ヌクレオチドの位置を移動するか、または所定の位置において異なる修飾ヌクレオチド（例えばt_BB_dCの代わりにN4_Et_dC）を用いることができることを理解するだろう。検出される変異はプライマー／プローブ名で示される。FS#およびRS#は、それぞれ正(forward)の特異的プライマーと逆(reverse)の特異的プライマーを指す。CE#およびCR#は、それぞれコモン(common)正プライマーとコモン逆プライマーを指す。F_P#およびR_P#は、正および逆プローブを指す。エクソン８中のプローブは特定の変異に対して標識され、それらは任意のエクソン８変異を検出するために用いることができる。このアッセイの対立遺伝子特異性は、対立遺伝子特異的プライマーによって決定される。一例として、D538G変異を検出するためには、任意のESR1_D538G_FS#プライマーを、任意のESR1_[Exon8mut]_CR#プライマーと任意のESR1_[Exon8mut]_F_P#プローブとともに使用でき、任意のESR1_D538G_RS#プライマーを、任意のESR1_[Exon8mut]_CF#プライマーと任意のESR1_[Exon8mut]_R_P#プローブとともに使用できる。
変異には、t_BB_[dNTP]＝N6-tert-ブチル-ベンジル[dNTP]；N4_Et_[dNTP]＝N4-エチル[dNTP]；N4_Bz_[dNTP]＝N4-ベンジル[dNTP]；N6_Me_[dNTP]＝N6-メチル[dNTP]；pdU＝5-プロピニル-デオキシウラシル；7_Dz_dG＝7-デアザdG；LNA-[dNTP]＝ロックド核酸[dNTP]が含まれる。
表２．プライマーとプローブ配列
変異体の高感度で高特異性の検出のためのオリゴヌクレオチド選択
変異体シグナルが野生型に比較して確実に高感度でかつ特異的に検出できるようにするプライマーを選択した。ESR1 K303R変異およびL536_D538>P変異に特異的であるように設計したプライマー対とプローブを用いて、野生型DNAに対し1：1600の比（野生型160,000コピー中変異型DNA100コピー）で添加された変異型鋳型を検出し、または野生型DNAのみで検出した。対立遺伝子特異的増幅と検出はコバスz（cobas z）（登録商標）480上で実施した。データは増幅サイクル数対蛍光シグナルをプロットしたCt曲線により表示した（増幅産物の検出を示す）。
図１Ａは、全く識別のないK303Rに特異的な反応を示す。選ばれたプライマーとプローブは、本質的に同じレベルで変異型サンプルと野生型サンプルからのシグナルを増幅し検出する。図１Ｂはより良好な識別を有するK303Rに特異的な反応を示す。2つの野生型サンプルのCtは、少なくとも２サイクル数だけ右側にシフトする。図１Ｃは、少なくとも1：1600の比で変異型DNAを検出するのに十分なほど感受性である、L536_D538>Pについてのはるかに高特異的な反応を示す。野生型サンプルは全く検出されず、それに対し変異型サンプルは35〜38あたりにCtを有する。
L536R変異に特異的であるように設計されたプライマーとプローブを用いた同様な比較を図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。図２Ａは、L536R_RS09対立遺伝子特異的プライマーを使った良好な識別を有する反応を示す。野生型は変異型と本質的に同じレベルで増幅される。図２Ｂは、L536R_RS09対立遺伝子特異的プライマーを使った良好な識別を有する反応を示し、ここでは野生型が変異型に比較して少なくとも５サイクル数だけ遅延したCtを有した。図２ＣはL536R_RS04対立遺伝子特異的プライマーを使った良好な識別を有する反応を示す。野生型は50サイクル以上のCtを有し、非検出と見なされたが、それに比較して変異型のCtは35あたりの十分検出可能範囲の中にあった。
マルチプレックス変異検出の特異性
プライマー対とプローブセットを、特異性を決定するためおよび別のESR1変異を検出しないことを保証するために多重形式（マルチプレックス）で試験した。個々のサンプル混合物を表１に列挙する18種の変異体の各々に対して調製し、該混合物は変異型DNAを野生型に対して１：１の比で添加して調製した（各々5000コピー）。18種の変異すべてに特異的であるプライマー対とプローブを添加した。図３は、ESR1 P535Hに対して高特異性を有する典型的Ct曲線を示す。25〜30辺りにCtを有する最も左側２本の曲線は、サンプル中に存在するESR1 P535H変異の特異的検出を表す（薄い矢印で示される）。その他のプライマー対とプローブのCtは、はるかに遅延したCtを有する（２つの黒矢印の間に示される）。
アッセイの直線性
各変異に対して一定範囲の鋳型濃度に渡って、検出の直線性も認められた。一例として、ESR1 S341Lに特異的なプライマー対とプローブを用いて、10,000コピーの野生型バックグラウンド中５〜5000コピーの変異体鋳型を増幅させた。その結果を表３に示す。それは当該アッセイが高度に直線性を持つことを示す。
人為的血漿サンプルにおけるESR1変異の検出
血漿成分が干渉するかどうかを調べるために血漿バックグラウンド中で該アッセイを試験した。変異型DNAを1000コピー数において2 mL正常（野生型）血漿に添加した。DNAをcobas（登録商標）DNAサンプル調製キットを使って抽出した。0.5 mL血漿からのものに相当するDNAを各PCR反応に加えた。プライマー対とプローブセットを各変異に対応して添加した。典型的な結果を表４に示す。このデータは、変異型DNAが野生型血漿バックグラウンド中で高感度で検出できることを示す。
選択されるオリゴヌクレオチド
変異型配列に対して優れた特異性を示す対立遺伝子特異的プライマーを、上記基準に基づいて選択した。それらのデータを表５に示し、表中にプライマー名とカッコ内に配列番号を示す。ボールド体は、下記の表６のアッセイ構成において選択性と特異性を示したプライマーを指摘するが、その他の組み合わせも上手く機能する。
表５：選択される対立遺伝子特異的プライマー
エクソン８RSプライマーの場合、どのエクソン８CFプライマーでも使用でき、例えばV533M_CF03（配列番号314）またはY537C_CF01（配列番号394）を使用できる。任意のエクソン８プローブ、例えばY537C_R_P01（配列番号407）が使用できる。一般に、どのFS対立遺伝子特異的プライマーについても、任意の対応するCRプライマーとFプローブを使用することができる。同様にどのRS対立遺伝子特異的プライマーについても、任意の対応するCFプライマーとRプローブを使用することができる。
特定の例としては、K303R_CR02（配列番号476）とK303R_F_P01（配列番号477）；S341L_CR02（配列番号235）とS341L_F_P02（配列番号237）；E380QCRP3（配列番号528）とE380Q_F_P01（配列番号31）；V422delV_CR01（配列番号285）とV422delV_F_P01（配列番号286）；L429V_CR01（配列番号59）とL429_F_P01（配列番号60）；およびS436P_CR01（配列番号261）とS463P_F_P01（配列番号262）が挙げられる。
アッセイ構成の例
最小数の反応容器中で最大数の変異を検出するために高度に多重化されたアッセイを設計しようと試みた。３容器アッセイの例を下表６と７に示す。エクソン８変異を、コモン正プライマーとプローブの使用を可能にするために一緒にグループ化した。当業者は、所望であれば、例えばシーケンシングを使ってまたは変異特異的プローブを用いるPCRを使って、変異陽性シグナルを生じる正確なエクソン８変異を同定する方法を知っているだろう。
表６：対立遺伝子特異的マルチプレックスESR1変異のための典型的アッセイ構成
表７：対立遺伝子特異的マルチプレックスESR1変異のための典型的アッセイ構成
当業者は、着目の変異と蛍光チャネルの利用可能性に依存して、異なるアッセイ構成を構築できることがわかるだろう。例えば、チューブの数は、エクソン８変異の個別検出ができるように増やすことができる。蛍光チャネルの数が増加するにつれ、単一チューブ中に含めることができる変異の数が増加するだろう。
マルチプレックス反応によるFFPETサンプル中のE380Q変異の検出
癌患者からの142本のFFPETサンプル（乳癌、リンパ節、肺、骨）からcobas（登録商標）DNAサンプル調製キットを使ってDNAを抽出した。DNA（50 ng/反応）を、本明細書に記載の通りにマルチプレックス対立遺伝子特異的PCR（二通りに実施）によりESR1変異について分析した。結果を図４Ａと４Ｂに示す。１サンプル（IN008）がE380Q変異に関して陽性であると認められ、これはE380Q変異陽性対照（MC）と類似した増幅成長曲線を示した（図４Ａ参照）。図４Ｂは、E380Q変異陽性対照のない同一データを示す。ddPCRを使って結果を確認した。
E380Q変異陽性サンプルは、E380野生型および非鋳型対照から明確に識別できるプロファイルを示す。この結果は、本明細書に記載のマルチプレックスアッセイが、FFPET臨床サンプルからのDNA中の特異的変異を検出するのに有効であることを示す。
マルチプレックス反応による血漿サンプル中のD538G変異の検出
臨床血漿サンプル（2 mL血漿）を、アロマターゼ阻害剤での治療中に再発したまたは断薬後12か月以内に再発した103名の閉経後転移乳癌患者から採取した。cobas（登録商標）cfDNAサンプル調製キットを使ってDNAを抽出し、本明細書に記載のマルチプレックス対立遺伝子特異的PCRによりESR1変異について分析した。図５に示されるように、試験した３サンプルがD538G陽性であった。図５は、51本のサンプルのうち、3本がD538G陽性であり、48本がD538野生型であることを示した。D538G変異陽性対照と非鋳型対照も図示されており、D538G陽性サンプルは明確に識別可能であるプロファイルを示した。ddPCRを使って結果を確認した。
これらの結果は、本明細書に記載のマルチプレックスアッセイが非侵襲性（血漿）臨床サンプルからのDNA中の特異的変異を検出するのに有効であることを示す。

Claims (29)

  1. １または複数の容器を含むキットであって、該容器の各々が
    ESR1遺伝子中の異なる配列に特異的な２以上のプライマー対；
    ESR1遺伝子中の異なる配列に特異的な２以上のプローブであって、各々がフルオロフォアとクエンチャーで標識されているプローブ；
    内在性コントロール配列に特異的なプライマー対；および
    内在性コントロール配列に特異的であり且つフルオロフォアとクエンチャーで標識されているプローブ
    を保有することを特徴とするキット。
  2. ３つの容器を含む、請求項１記載のキット。
  3. 前記容器の各々が５〜16個のプライマー対を保有する、請求項１または２記載のキット。
  4. 前記容器の各々が３〜４個のプローブを保有する、請求項１，２または３記載のキット。
  5. 下記：
    ESR1 V422DelVに特異的なプライマー対、ESR1 S463Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Hに特異的なプライマー対、ESR1 L536Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536Rに特異的なプライマー対、ESR1 D538G, ESR1 K303Rに特異的なプライマー対、ESR1 E380Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536_D538>Pに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Cに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Nに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Sに特異的なプライマー対、ESR1 S341Lに特異的なプライマー対、ESR1 L429Vに特異的なプライマー対、ESR1 V533Mに特異的なプライマー対、ESR1 V534Eに特異的なプライマー対、およびESR1 P535Hに特異的なプライマー対
    を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載のキット。
  6. 下記：
    (i) ESR1 V422DelVに特異的なプライマー対、ESR1 S463Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Hに特異的なプライマー対、ESR1 L536Pに特異的なプライマー対、ESR1 L536Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536Rに特異的なプライマー対、およびESR1 D538Gに特異的なプライマー対を保有する第一容器；
    (ii) ESR1 K303Rに特異的なプライマー対、ESR1 E380Qに特異的なプライマー対、ESR1 L536_D538>Pに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Cに特異的なプライマー対、ESR1 Y537Nに特異的なプライマー対、およびESR1 Y537Sに特異的なプライマー対を保有する第二容器；および
    (iii) ESR1 S341Lに特異的なプライマー対、ESR1 L429Vに特異的なプライマー対、ESR1 V533Mに特異的なプライマー対、ESR1 V534Eに特異的なプライマー対、およびESR1 P535Hに特異的なプライマー対を保有する第三容器
    を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載のキット。
  7. 前記２以上のプライマー対のうちの少なくとも１つのプライマーが、修飾された非天然のヌクレオチドを含有する、請求項１〜６のいずれか一項記載のキット。
  8. 配列番号24, 113, 134, 158, 178, 264, 261, 262, 285, 286, 298, 314, 394, 407, 31, 42, 90, 415, 447, 469, 476, 477, 481, 528, 59, 60, 70, 231, 235, 237, 245, 350および388の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のキット。
  9. 各容器が耐熱性DNAポリメラーゼを更に保有する、請求項１〜８のいずれか一項記載のキット。
  10. 個体からのサンプル中の２以上のESR1変異の存否を決定する方法であって、
    (i) 該個体からサンプルを採取し；そして
    (ii) マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施して２以上のESR1変異の存否を決定する
    ことを含む方法。
  11. 前記個体が乳癌を有し且つホルモン療法を受けている、請求項１０記載の方法。
  12. マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施して10以上のESR1変異の存否を決定することを含む、請求項１０または１１記載の方法。
  13. 前記２以上のESR1変異が、ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hを包含する、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の方法。
  14. ESR1変異の存在が決定された場合に個体に改変治療を施すことを更に含む、請求項１０〜１３のいずれか一項記載の方法。
  15. 前記マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRが３容器中で実施される、請求項１０〜１４のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記ESR1変異の存否が
    (i) 第一容器中でESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、およびESR1 D538G；
    (ii) 第二容器中でESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、およびESR1 Y537S；
    (iii) 第三容器中でESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hのように３容器中で決定される、請求項１５記載の方法。
  17. ホルモン療法を実施中である乳癌を有する個体に改変治療を提供する方法であって、
    (i) 前記個体からサンプルを採取し；
    (ii)マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施して２以上のESR1変異の存否を決定し；
    (iii)ESR1変異の存在が決定された場合に前記個体に改変治療を施すことを含む方法。
  18. マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施して10以上のESR1変異の存否を決定することを含む、請求項１７記載の方法。
  19. 前記２以上のESR1変異がESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hを包含する、請求項１７または１８記載の方法。
  20. 前記工程（i）-(ii)がホルモン療法の開始0.5〜５年後に実施される、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の方法。
  21. 前記方法がホルモン療法中２回以上実施される、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記工程(iii)が前記個体に追加のホルモン療法または標準化学療法を提供することを含む、請求項１７〜２１のいずれか一項記載の方法。
  23. 乳癌を有する個体を治療する方法であって、
    (i) 前記個体にホルモン療法を施し；
    (ii) 前記個体からサンプルを採取し；
    (iii) マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施して２以上のESR1変異の存否を決定し；
    (iv) ESR1変異の存在が決定された場合に前記個体に改変治療を施す
    ことを含む方法。
  24. 前記ホルモン療法が選択的エストロゲン受容体モジュレーター（SERM）である、請求項２３記載の方法。
  25. マルチプレックス対立遺伝子特異的PCRを実施して10以上のESR1変異の存否を決定することを含む、請求項２３または２４記載の方法。
  26. 前記２以上のESR1変異がESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538>P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1 V533M、ESR1 V534EおよびESR1 P535Hを含む、請求項２３から２５のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記工程(ii)-(iii)がホルモン療法の開始0.5〜５年後に実施される、請求項２３〜２６のいずれか一項記載の方法。
  28. 前記工程(ii)-(iii)がホルモン療法中に２回以上実施される、請求項２３〜２７のいずれか一項記載の方法。
  29. 前記工程(iv)が前記個体に追加のホルモン療法または標準化学療法を施すことを含む、請求項２３〜２８のいずれか一項記載の方法。
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