CN104120178B - 一种基于荧光pcr技术检测esr1基因突变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于荧光PCR快速准确检测ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G四种突变的方法，能够避免假性结果产生、灵敏度高、适应范围广、节省耗材和时间。针对四种突变分别设计的上游引物:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’；设计的一条共通的下游引物:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’设计的一条共通的TaqMan荧光探针：5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’。

Description

一种基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法
技术领域
本发明涉及一种检测ESR1基因突变的方法。
背景技术
人类雌激素受体α(Estrogenreceptoralpha,ESRα)由ESR1(EstrogenReceptor1)基因编码。ESRα与其配体雌激素结合后，可激活细胞内一系列的细胞生物学效应。ESR1基因的突变和异常表达均与乳腺癌等疾病的发生有关。
ESR1基因最为常见的突变类型为Y537S,Y537C,Y537N以及D538G。这些突变使得ESRα的构象改变，其可在不与雌激素结合的情况，表现为持续性激活状态。
目前已报道的应用于检测ESR1突变的方法的为直接测序技术和二代测序技术。其中直接测序技术成本低，准确性高，然而需要PCR后处理步骤，既操作复杂，又容易发生污染，产生假性结果；且该方法灵敏度不足，不能完全适应临床样本的复杂情况。二代测序技术灵敏度高，但其依赖于昂贵的仪器和分析软件，检测成本大大增加，难以作为普适技术。
等位基因特异性PCR(Allele-specificPCR)，也称为ARMS(AmplificationRefractoryMutationSystem)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其核心原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从引物的3′末端开始，而引物3′末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行:若这个碱基与模板正常互补配对(A-T,G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。故将与突变位点对应的碱基放置在引物的3′末端，同时在必要时人为引入其他碱基的错位配对，便可以达到选择性扩增某种等位基因的作用。将ARMS技术与以TaqMan探针为基础的荧光PCR结合起来，便可以达到快速准确检测基因突变的目的。
发明内容
为了克服传统检测技术的缺陷，本发明提供一种基于荧光PCR快速准确检测ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G四种突变的方法，即通过设计等位基因特异性引物，结合TaqMan探针技术，在一个反应中快速准确检测ESR1基因突变。
为实现以上发明目的，本发明的基本技术方案如下：
基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下环节：
(1)引物及荧光探针设计：
针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G这四种突变分别设计等位基因特异性引物，均作为上游引物，序列如下:
Y537S:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’
Y537C:5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’
Y537N:5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’
D538G:5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’
其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性；
针对四种突变设计一条共通的下游引物，序列如下:
Rp:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’
针对四种突变设计一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下:
Probe:5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’
针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列如下:
ALBFp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’
ALBRp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’
ALBProbe(探针):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为BlackHoleQuencher-2；
(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA；
(3)建立荧光实时定量PCR反应体系：
以反应体系总量为20μL计，在同一个反应体系中，分别加入Y537S等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM，以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-250nM、2×RealtimeMastermix10μL、待测样本基因组DNA10-50ng，使用PCR等级的H2O补足体积20μL；
(4)结果判定:将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪器给出的ESR1基因与ALB基因的扩增指标(Ct值)，即FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定。对结果的判断分以下四种情况进行:
第一种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均呈现正常扩增，则该样本携带有ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N或D538G四种突变中的一种或几种；
第二种情况，若样本在FAM通道没有正常扩增，而在HEX通道扩增情况正常，则表明该样本未携带有ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N或D538G四种突变，或该样本的突变比例低于了本设计的检测限。
第三种情况，若样本表现为在FAM通道呈现正常扩增，而在HEX通道没有正常扩增，则是由于ESR1基因的扩增抑制了ALB基因的扩增，表明该样本携带有ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N或D538G四种突变中的一种或几种，同第一种情况。
第四种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均没有正常扩增，则表明该样本DNA质量过差或加入的DNA样本量不足，需要重新进行检测。
上述荧光实时定量PCR反应的最佳扩增参数为：
95℃，2～15min，不循环；
95℃，5～15sec；60℃，40-60sec；共计40个循环。
相应的，本发明还提供一种用于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的试剂盒，其特点是：包括上述针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G这四种突变分别设计的上游引物、共通的下游引物、共通的TaqMan荧光探针以及作为内质控体系的另一特异性引物探针组合。当然，通常还有2×RealtimeMastermix10μL、PCR等级的H2O。
这里，作为内质控体系的另一特异性引物探针组合并不局限于上述针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，本发明将其视为较佳的内质控体系。
具体以试剂盒中的试剂总量20μL计，各试剂的较佳用量分别为：Y537S等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM，以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-250nM，2×RealtimeMastermix10μL、PCR等级的H2O补足体积。
本发明具有以下优点：
1.避免假性结果产生。在本发明中，针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G四种突变设计的特异性引物具有很高的位点特异性；同时没有PCR后操作，避免了交叉污染，二者共同保证了检测的准确性，避免了假性结果的产生。
2.灵敏度高。在本发明中，只需20ng基因组DNA便可以进行准确的ESR1基因突变检测，相比于传统的技术，大大提高了检测的灵敏度。
3.适应范围广。基于本设计中PCR反应的特点，本发明可以适用于新鲜活检组织，石蜡包埋组织等不同类型样本的检测。
4.节省耗材和时间。基于本实验中设计和PCR反应的特点，使得该方法可以很大程度上节省实验时间和耗材，样本可以在一个反应中完成检测，PCR过程只需要60min，整个实验也可以在4小时内全部完成。
附图说明
图1为本发明所设计的ESR1基因四种突变特异性及探针的示意图。
图2为本发明一个实施例的实验结果图。
图3为本发明另一个实施例的实验结果图。
具体实施方式
对一个特点的突变类型而言，根据碱基变化的形式、是否引入人为的错配碱基以及引入错配碱基的位置和数量的不同，可设计的等位基因特异性引物达十余种之多，且目前缺少可靠的资料来正确指导对这些潜在引物进行理论上的优选。所以，为了达到检测反应最佳的灵敏度和特异性，则需将所有可设计的等位基因特异性引物进行逐一尝试。因此，仅建立一个特定突变的反应体系便需要反复的设计和尝试，且难以参考其他的成功例子。对于ESR1基因的四种类型突变而言，若分别建立四个单独的反应体系，则至少需要进行数十次设计和尝试才可以达到最佳的设计。然而，若想在一个反应体系中同时完成对四种突变的检测，情况则更为复杂。首先，由于四种突变的在碱基序列上相邻，造成了引物之间的相互干扰，故不能简单的将单独检测体系中最佳引物加以混合，而是开始就应在一个整体的理念下进行设计，这种情况下可设计引物组合便多达上千种；其次，引物对及荧光探针是一个不可分割整体，为了协调扩增片段大小、扩增效率以及扩增特异性等因素，则需要更多不同的尝试。因此，在一个单独的反应中同时对ESR1基因的四种突变进行高灵敏高特异的检测需要非常精确的设计。
最终，本发明提出以下设计方案:
(1)引物及荧光探针设计:
针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G四种突变分别设计等位基因特异性引物，均作为上游引物，序列如下:
Y537S:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’
Y537C:5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’
Y537N:5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’
D538G:5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’
其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，旨在增强检测的特异性。
针对四种突变设计一条共通的下游引物，序列如下:
Rp:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’
针对四种突变设计一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下:
Probe:5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’
引物及TaqMan探针的位置如图1所示。
同时针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列信息如下:
ALBFp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’
ALBRp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’
ALBProbe(TaqMan荧光探针):
5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为BlackHoleQuencher-2
(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA；
(3)实时定量PCR:针对步骤(1)中的所设计的引物及TaqMan荧光探针，建立待测样本的检测体系:每个被测样本的反应体系为20μL，在一个反应体系中，分别加入Y537S等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM，以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-250nM、2×RealtimeMastermix10μL、被测样本基因组DNA约10-50ng，使用PCR等级的H2O补足体积20μL；
(4)结果判定:将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，扩增过程参数为：95℃，2～15min，不循环；95℃，5～15sec，60℃，40-60sec，共计40个循环。根据仪器给出的ESR1基因与ALB基因的扩增指标(Ct值)，即FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定。对结果的判断分以下四种情况进行:
第一种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均呈现正常扩增，则该样本携带有ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N或D538G四种突变中的一种或几种；
第二种情况，若样本在FAM通道没有正常扩增，而在HEX通道扩增情况正常，则表明该样本未携带有ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N或D538G四种突变，或该样本的突变比例低于了本设计的检测限。
第三种情况，若样本表现为在FAM通道呈现正常扩增，而在HEX通道没有正常扩增，则是由于ESR1基因的扩增抑制了ALB基因的扩增，表明该样本携带有ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N或D538G四种突变中的一种或几种，同第一种情况。
第四种情况，若样本在FAM通道和HEX通道均没有正常扩增，则表明该样本DNA质量过差或加入的DNA样本量不足，需要重新进行检测。
下面以制备的人胚肾HEK-293细胞系基因组DNA和4种突变型ESR1基因克隆质粒(作为样本)，按照本发明的突变检测方法，进行实验说明，以体现本发明的技术效果。
将ESR1基因为野生型的人胚肾HEK-293细胞系基因组DNA(野生型模板)及四种突变型ESR1基因克隆质粒(突变型模板)分别进行提取，并使用Nanodrop核酸定量仪定量。使用TE缓冲液对DNA模板进行稀释，将HEK-293细胞系基因组DNA稀释至20ng/μL，将所有质粒模板稀释至浓度为0.00001ng/μL(该浓度质粒的ESR1基因拷贝数非常接近于20ng基因组DNA中ESR1基因的拷贝数)。取部分稀释好的HEK-293细胞系基因组DNA和4种突变型ESR1基因克隆质粒，分别按照一定梯度比例混合制备得到混合型模板(该梯度比例将直接体现本技术的检测灵敏度)，将稀释好的4种突变型质粒分别与HEK-293细胞系基因组DNA按ESR1基因拷贝数1:9(10％)，1:19(5％)，1:99(1％)混合制备混合型模板。以Y537S突变为例，将10μL浓度为0.00001ng/μL的Y537S突变突变型质粒溶液加入到90μL浓度为20ng/μL的HEK-293细胞系基因组DNA溶液中，便制备成Y537S突变比例为10％的混合型模板；然后将该混合型模板继续按一定比例与HEK-293细胞系基因组DNA混合，便可以制备成Y537S突变比例为5％及1％的混合型模板。其他三种突变类型的混合型模板的制备情况与次相同。
同时配制多个反应体系，在每一个反应体系中，分别加入Y537S等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM；体系中同时加入ALB基因特异性上游引物250nM-500nM，下游引物250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM，以及2×RealtimeMastermix10μL；在各反应体系中分别加入20ng的HEK-293细胞系基因组DNA，0.00001ng的四种突变型质粒，以及所制备的各混合型模板，以及PCR等级的H2O(作为无模板对照)。上述扩增过程的最佳扩增参数为：95℃，2～15min，不循环；95℃，5～15sec，60℃，40-60sec，共计40个循环。
将配制好的各反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪器给出的ESR1基因与ALB基因的扩增指标(Ct值)，即FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定。实验结果如图2所示。
请参阅图2所示,使用本发明所设计的技术体系，在FAM通道中，所有含有突变型ESR1基因的模板(质粒和各混合型模板)均呈现出正常扩增，而ESR1基因为野生型的HEK-293细胞系基因组DNA则没有扩增；同时在HEX通道中，ESR1基因为野生型的HEK-293细胞系基因组DNA则呈现出正常扩增情况。按本设计的结果判定标准，所有含有突变型ESR1基因的模板均判断为携带本发明所覆盖的ESR1基因突变(第一或第三种情况)，而HEK-293细胞系基因组DNA则判断为本未携带有ESR1基因突变(第二种情况)。图中每一条曲线指代一个PCR反应，呈现明显“S”型的曲线表明有正常扩增，而未呈现“S”型的曲线(水平方向的直线)则表明没有扩增。综合分析可以得出，对于ESR1基因的四种类型突变，本发明技术体系的检测灵敏度均可达1％。
下面再以10例复发性乳腺癌DNA样本作为检测对象，按照本发明的突变检测方法，进行实验说明，以体现本发明的技术效果。
按上述参数配置多个反应体系，分别加入各乳腺癌DNA样本20ng进行实验。结果如图3所示。
请参阅图1所示,本发明所设计的ESR1基因四种突变(Y537S,Y537C,Y537N和D538G)的等位基因特异性引物及TaqMan荧光探针。本发明基于引物3’末端序列决定其延伸效率的原理，设计出一套可以高特异性扩增ESR1基因四种突变的引物探针组合。箭头指示引物的位置，横线指示TaqMan荧光探针的位置。
请参阅图3所示,使用本发明所设计的技术体系，对10例复发性乳腺癌DNA样本进行检测。按本技术结果判定标准可以得出，共有3例样本携带有ESR1突变，而7例为ESR1野生型。
所有样本由本发明的得到检测结果与之前得到的测序结果完全一致。

Claims (4)

1.一种基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下环节：
(1)引物及荧光探针设计：
针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G这四种突变分别设计等位基因特异性引物，均作为上游引物，序列如下:
Y537S:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’
Y537C:5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’
Y537N:5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’
D538G:5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’
其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性；
针对四种突变设计一条共通的下游引物，序列如下:
Rp:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’
针对四种突变设计一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下:
Probe:5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’
针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列如下:
ALBFp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’
ALBRp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’
ALBProbe(探针):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为BlackHoleQuencher-2；
(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA；
(3)建立荧光实时定量PCR反应体系：
以反应体系总量为20μL计，在同一个反应体系中，分别加入Y537S等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM，以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-250nM、2×RealtimeMastermix10μL、待测样本基因组DNA10-50ng，使用PCR等级的H2O补足体积20μL；
(4)结果判定:
将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增，根据仪器给出的ESR1基因与ALB基因的扩增指标，即FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定。
2.根据权利要求1所述的基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法，其特征在于，扩增过程参数为：
95℃，2～15min，不循环；
95℃，5～15sec；60℃，40-60sec；共计40个循环。
3.一种用于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的试剂盒，其特征在于：包括
1)针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G这四种突变分别设计的等位基因特异性引物，均作为上游引物，序列如下:
Y537S:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’
Y537C:5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’
Y537N:5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’
D538G:5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’
其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性；
2)针对四种突变设计的一条共通的下游引物，序列如下:
Rp:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’
3)针对四种突变设计的一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下:
Probe:5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’
4)针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列如下:
ALBFp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’
ALBRp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’
ALBProbe(探针):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为BlackHoleQuencher-2。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：以试剂盒中的试剂总量20μL计，其中的Y537S等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537C等位基因特异性上游引物250nM-500nM，Y537N等位基因特异性上游引物250nM-500nM，D538G等位基因特异性上游引物250nM-500nM，下游引物(Rp)250nM-500nM，TaqMan荧光探针100nM-250nM，以及ALB基因特异性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM-500nM、探针100nM-250nM，2×RealtimeMastermix10μL、PCR等级的H2O补足体积。
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