CN108913757A

CN108913757A - 一种染色体非整倍体数目异常的引物组与检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108913757A
Application number: CN201810732477.7A
Authority: CN
Inventors: 吴英松; 康小龙; 李明; 杨学习; 周其伟; 何丹
Original assignee: Guangzhou Da Rui Biotechnology Ltd
Current assignee: Guangzhou Da Rui Biotechnology Ltd
Priority date: 2018-07-05
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2018-11-30
Anticipated expiration: 2038-07-05
Also published as: CN108913757B

Abstract

本发明公开了一种染色体非整倍体数目异常的引物组与检测试剂盒及其应用，可同时扩增38个与4、13、15、16、18、21、22、X染色体非整倍体数目异常检测相关的STR位点和2个Y染色体非整倍体数目异常检测相关位点。通过定量荧光PCR(QF‑PCR)技术扩增上述所有位点，对4、13、15、16、18、21、22、X和Y染色体非整倍体数目异常进行检测。本发明试剂盒，检测周期短，获得样本后半天就可以可得到结果，测周期短，每次检测只需纳克级别的DNA，因此需要的样本量少。

Description

一种染色体非整倍体数目异常的引物组与检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及本发明属于基因检测领域，以多重荧光PCR技术结合毛细管电泳技术通过检测STR位点多态性来实现对常见的4、13、15、16、18、21、22三体以及X、Y性染色体非整倍体进行快速准确检测的试剂盒。

背景技术

染色体病通常包括染色体数目异常和染色体结构异常，前者占活产新生儿的1/120～1/150。活产新生儿中最常见的数目异常包括13三体、18三体、21三体和性染色体非整倍体，占与产前诊断有关的染色体异常的2/3。针对13、18、21、X、Y染色体数目异常是产前筛查的重点。此外，染色体数目异常也是导致早期流产的主要原因之一。有研究结果显示50％的早期流产(<12周)是由于胎儿染色体异常引起的，在怀孕中期流产将近三分之一的也是由染色体异常引起。细胞学研究表明绝大多数的这些染色体异常是染色体数目异常(86％)，还有一些是染色体结构异常(6％)和嵌合体(8％)引起的，其中染色体数目异常中X单体、16三体、22三体、15三体和4三体为相对高发性的异常。通过对流产组织进行染色体数目检测，评估自然流产的病因和复发性流产的风险十分必要，它有助于临床医生进一步向患者提供遗传咨询。

细胞遗传学染色体核型分析技术方法准确、可靠，是目前产前诊断的金标准，但是需培养细胞、检测周期长(2-3周)、检测通量低下等诸多问题，不便于大规模的产前普查。荧光原位杂交方法(FISH)作为染色体非整倍体异常常见的辅助诊断方法，该方法较核型分析速度稍快(48小时内)，不需细胞培养，但该方法建立在繁琐的手工操作基础上，依赖人工分析，存在成本较高、检测通量低下等问题。以上两种方法结果都需要人工判断或干预，难以实现自动化和高通量分析。染色体微阵列分析(chromosomal analysis,CMA)和高通量测序(＂Next-generation＂sequencingtechnology，NGS)都能实现高通量检测，但两者的检测成本高，检测周期长(4d以上)，所需的样本量高。QF-PCR基于荧光标记扩增技术和电泳技术对染色体上的STR(短串联重复序列)进行检测，通过定性、定量分析STR的多态性来诊断目标染色体数目，从而实现对STR基因型分析的半自动化、批量检测，可实现快速、高通量诊断目标染色体数目异常。因此，多重荧光PCR技术(QF-PCR)技术适于大规模检测，更客观，可满足孕妇对产前诊断结果的急切需要。

目前，针对人类染色体异常的临床检测主要针对13号、18号、21号以及性染色体染色体开展，例如专利CN201310020780和CN201310116753单独检测21号染色体数目异常，专利CN201410188282、CN201510167230、CN201410188282则选择13、18、21染色体(或X染色体)进行同时检测，而专利CN201410691461和CN201310555078则进一步地开发同时检测13号、18号、21号或X/Y染色体的5种染色体检测试剂盒；此外，法医鉴定检测的染色体则较广泛，例如基于法医鉴定开发的专利201610601841的“基于高通量测序的38个STR等位基因的检测试剂盒”就涵盖了人类所有染色体，但其每个常染色体的STR位点只有1个，且因此不能可用于检出测染色体数目异常，明显地不适用于临床检测，如产前诊断和自然流产原因分析等。

基于此，本发明开发出适用更广泛的人染色体数目异常的检测试剂盒，具体为针对产前诊断和自然流产分析的常见数目异常的染色体，如4、13、15、16、18、21、22号染色体及X、Y染色体出发，应用定量荧光PCR和毛细管电泳技术，开发出适合中国人群的STR基因分型的一种自动化，高通量，低成本，快速检测的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物以及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种染色体非整倍体数目异常的引物组，其特征在于，所述所述引物组包含38个与4、13、15、16、18、21、22、X染色体非整倍体数目异常检测相关的STR基因座和2个Y染色体非整倍体数目异常检测相关基因座，所述基因座的引物，具体如下：

优选地，将所述基因座的引物组分为四组，每组引物带有不同的荧光标记物，四组引物分别在每一对的其中一条引物的5’末端带有荧光标记物，所述第一组为D21S1433、21q11.2、D21S226、D21S1444、D21S1437、D21S1270、D4S2381、D4S2620、D4S3248、D4S3351、D16S526、D22S1045，所述第二组为D18S536、D18S847、D18S541、D18S542、D15S195、D15S657、D15S642、D15S818；所述第三组引物为：D13S257、D13S1492、D13S1810、D13S627、D15S1513、D22S689、D22S686、D22S532、D22S1686；所述第四组引物为：SRY、AMXY、DXS6854、DXS6785、DXS996、DXS1283E、D16S675、D16S753、D16S767、D16S771、D16S3255。

优选地，所述荧光染料标记采用以下四组：(a)FAM或荧光素、(b)HEX或JOE、(c)TMR或VIC、(d)ROX或PET。

优选地，所述第一组引物采用的所述荧光标记物为(a)组，所述第二组引物采用的所述荧光标记物为(b)组，所述第三组引物采用的所述荧光标记物为(c)组，所述第四组引物采用的荧光标所述记物为(d)组。

针对上述引物组，PCR扩增时进行相应组合，其中组合如下：A管组合包括以下基因座：21q11.2、D21S1270、D21S1433、D21S1437、D21S1444、D21S226、D18S536、D18S541、D18S542、D18S847、D13S1492、D13S1810、D13S257、D13S627、DXS1283E、DXS6854、DXS6785、DXS996、AMXY、SRY；B管组合包括以下基因座：D4S2381、D4S2620、D4S3248、D4S3351、D15S1513、D15S195、D15S642、D15S657、D15S818、D16S3255、D16S526、D16S675、D16S753、D16S767、D16S771、D22S1045、D22S1686、D22S532、D22S686、D22S689。

本发明还提供一种如上述所述的检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒，所述试剂盒还包含21三体阳性质控品、XXY阳性质控品、16三体阳性质控品、STR阴性质控品。

优选地，所述检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒还包含PCR反应酶系、无核酸酶水和PCR反应混合液。

优选地，所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs，其具体反应体积比例为20:10:1；所述PCR反应混合液浓度为其2.5倍工作液浓度，扩增预混液为2.5倍工作液浓度。

优选地，所述检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒包括：10.0μL的2.5×PCRMIX预混液，2.5μL的10×引物混合液，0.5μL PCR反应酶系，2.0μL DNA模板(1-10ng)以及5μL的灭菌水。

本发明的另一目的还提供一种如上述引物组在制备用于检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒中的应用。

作为本发明的优选实施方式，所述检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒的多重扩增反应条件为：37℃，5分钟；95℃预变性5分钟；然后95℃，30秒；58℃，40秒；72℃，50秒；共25个循环，最后72℃，10分钟。

进一步地，为了提高体系配制效率和引物保藏时间，优选为引物混合液采用储藏液形式，优选为10倍工作浓度进行保藏，使用前稀释10倍使用即可。

进一步地，为了提高PCR反应的准确性和特异性，本发明还采用dUTP/UDG防污染技术，具体通过以下方案实现：(1)PCR反应酶系，由热启动Taq酶和尿嘧啶-DNA糖基酶(UDG)按20:1活性比配制而成；(2)在PCR反应液中加入dUTP:dATP:dTTP:dCTP:dGTP，摩尔比例为1:1:1:1:1(3)PCR扩增条件在最开始增加37℃保温5分钟使dUTP/UDG防污染体系发挥作用。

进一步地，为了检测结果的准确性，本发明提供一种对引物的质控步骤，即利用Nanodrop2100等微量紫外分光光度计对引物浓度进行定量分析和校准，具体为：a)合成引物在高速离心5分钟；b)根据厂家标识的总nmoL值选择加入TE(pH8.0)溶液量，分2次梯度稀释，使其测定溶液，稀释倍数为1000；c)吸取2μL“b)”中第二步稀释的溶液在微量分光光度计上测出其A260(使用微量分光光度计时，单链核酸值改为33)；d)根据稀释物所需的终浓度选择相应的公式计算溶液总体积：

终浓度(100μM)公式为：

终浓度(200μM)公式为：

e)由“d”算的体积和已加入体积进行计算，确定需要补加入的TE体积。

本试剂盒根据毛细管电泳后的等位基因荧光峰的数目和荧光信号强度值来分析染色体特异性STR位点扩增产物的基因剂量，其中荧光信号强度值用荧光峰面积表示。进一步根据STR位点扩增产物等位基因的数目和等位基因扩增产物的相对荧光峰面积比值来分析所选染色体的数目是否存在异常。本试剂盒选用的STR位点和性别基因位点是存在于人类基因组4、13、15、18、21、22和X、Y染色体上的遗传物质，在中国汉族人群中存在高多态性，多态性均大于0.7，所扩增的产物片段在100-540bp之间。根据对中国人群应用荧光PCR毛细管电泳法对STR位点和性别基因位点进行检测，检测STR位点和性别基因位点等位基因数目的差别和基因剂量的差别，为染色体非整倍体疾病的分析提供依据。

本发明的有益效果在于：

高效分析人染色体数目异常情况：本试剂盒包括多重荧光PCR扩增引物；选用样本基因组DNA作为模板；将染色体特异性的STR位点进行防污染多重荧光PCR扩增；应用高分辨率的毛细管电泳技术进行扩增片段的分离；利用群体研究数据构建针对性结果判断Panel，实现自动化数据分析。

检测通量高，检测染色体范围广，对人常见的9种染色体数目异常类型的染色体(4号、13号、15号、16号、18号、21号、22号、X染色体和Y染色体)分成2组进行单管多重扩增。适用范围广，适用产前筛查和染色体数目异常引起流产原因分析等。本试剂盒的A管主要针对产前筛查中最常见染色体异常类型(95％)开发，可检测产前筛查中常见染色体类型；B管的检测的染色体的数目异常类型在产前筛查中较少见(相对A管检测的染色体数目异常类型)，可作A管的补充，另外可应用到染色体数目异常引起的自然流产分析；A管和B管配合检测，则可针对产前筛查和染色体数目异常导致的流产原因分析中大部分染色体数目异常类型进行全面检测。

附图说明

图1是本发明显示优化前后杂峰情况(以16号染色体D16S767位点杂峰为例)分析图。

图2a至2d是本发明显示男性DNA检测结果(A管的13、18、21、X、Y染色体)分析图。

图3a至图3d是本发明显示男性DNA检测结果(B管的4、15、16、22染色体)分析图。

图4是本发明正常女性DNA检测结果分析图。

图5是本发明21三体综合征检测结果分析图。

图6是本发明18三体综合征检测结果分析图。

图7是本发明13三体综合征检测结果分析图。

图8是本发明Klinefelter综合征(47，XXY)检测结果分析图。

图9是本发明超雄综合征(47，XYY)检测结果分析图。

图10是本发明4-三体检测结果分析图。

图11是本发明15-三体检测结果分析图。

图12是本发明16-三体检测结果分析图。

图13是本发明22-三体检测结果分析图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

本实施例优选具有汉族人群多态性STR基因座。

本发明的试剂盒针对中国人群进行开发，通过下述的实施步骤筛选获得具有中国汉族人群多态性的STR位点并对其序列设计、优化引物：

1.STR基因座初筛

选择中国知网以及NCBI等文献库中得到的4号、13号、15号、16号、18号、21号、21号以及X/Y染色体的STR基因座，在NCBI库中查找STR基因座的核苷酸序列，利用SSRHunter软件进行序列分析，通过如下原则进行筛选获得备选STR基因座：(1)STR易于扩增、分析、稳定性好(2)同一染色体的STR位点尽量分布在整条染色体(3)STR重复单元为4bp以上，以减少或避免滑移情况；(4)STR重复单元G/C在3个以内，以保证G/C量适中。

2.汉族人群STR基因座的杂合度分析

初筛获得的STR基因座，通过正常汉族人群样本进行杂合度测试，筛选杂合度高的STR序列，优选得到的STR基因座杂合度尽量保证大于等于0.75。

3.扩增引物优化

根据杂合度，结合核心序列长度和检测范围等，在STR位点上下游适合设计引物，调整STR基因座的引物位置，剔除杂峰、滑移峰、双头峰等影响判读的峰型，对最终的引物组进行多重体系优化，达到各目标峰峰高一致，无明显杂带，从而确定引物和位点。以16号染色体上的D16S767位点峰图为例，其正向引物的3’端增加“TTG”提高引物特异性，另优化加入Mg²⁺浓度和提高Tm值等措施，如图1所示，图1-A为优化前，图1-B为优化后，由图可知经上述优化后箭头所指的杂峰的峰高明显降低，说明上述优化措施有效地减少了杂峰情况。

实施例2

本实施例是对本发明的检测试剂盒具体使用方法。

1.制备的本发明试剂盒包括下列组成成分：PCR反应液A，1管(1100μL/管)；PCR反应液B，1管(1100μL/管)；引物混合液A，1管(275μL/管)；引物混合液B，1管(275μL/管)；PCR反应酶系，1管(110μL/管)；21三体阳性质控品，1管(50μL/管)；XXY阳性质控品，1管(50μL/管)；16三体阳性质控品，1管(50μL/管)；STR阴性质控品，1管(100μL/管)。

2.标本采集、运送和保存

2.1标本采集：标本为血液、羊水、绒毛组织。血液为常规取静脉血2mL或者胎儿脐带血0.5-1mL，EDTA抗凝处理；经穿刺获羊水2-5mL或者绒毛组织数条(100-500mg)。

2.2保存：标本可立即检测，4℃保存一周，-20±5℃保存期可达一年。

2.3运输：标本应在2～8℃条件下运送，运输时间不超过5天。

3.检测方法

3.1DNA提取：按照市售的相应的核酸提取试剂盒说明书进行操作，收集到80-200μLDNA溶液，用紫外分光光度计定量，并稀释成1-10ng/μL，为了确保结果准确性，样本DNA纯度要求为OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0之间。

3.2多重PCR扩增

3.2.1检测体系分A、B管PCR反应体系，对于每管PCR反应体系，按照下表进行配制，涡旋混匀，并瞬时离心，以使液体聚集在管底。

注：X最大体积为5ul

3.2.2PCR反应条件：37℃5分钟，95℃预变性5分钟，然后95℃30秒，58℃40秒，72℃50秒，共25个循环；最后72℃10分钟。

3.2.3在A管反应中必须有一个21三体阳性质控品、一个XXY阳性质控品、一个STR阴性质控品；在B管反应中必须有一个16三体阳性质控品、一个STR阴性质控品。

3.3扩增产物电泳

3.3.1上样操作

每份检测取1μL PCR产物和13.5μL甲酰胺、0.5μL GeneScanTM 600LIZ Sizestandard v2.0(内标)混合。将混合物95℃加热变性5分钟。放置冰上至少1分钟，瞬时离心混合物。在ABI 3500Dx基因分析仪上样进行毛细管电泳，具体操作参照ABI 3500Dx基因分析仪用户手册进行。

3.3.2质控标准

(1)GeneScan 600LIZ Size standard v2.0在ABI 3500Dx电泳后显示36条均匀的橙色荧光峰，说明毛细管电泳成功。

(2)A管：21三体阳性质控品检测结果为21三体阳性，XXY阳性质控品检测结果为XXY阳性，STR阴性质控品检测结果为阴性；

B管：16三体阳性质控品检测结果为16三体，STR阴性质控品检测结果为阴性。

以上标准(1)、(2)需要同时满足(若选择单独A管或单独B管扩增检测，则(2)只需满足对应该管的质控品检测结果即可)，否则需重新实验。

4.结果分析

对于每一个经电泳得到的数据都用ABI公司GeneMapper软件进行数据收集和分析。GeneMapper分析软件的进一步信息请参阅GeneMapper Analysis Software用户手册。PCR产物中等位基因剂量通过相应位置的荧光峰面积比值间接反应出来，从而确定21号、18号、13号以及性染色体的数目，参照ACC/CMGS年会(2012)关于应用QF-PCR方法诊断非整倍体染色体病的实验指南，规定判断标准如下：如果STR位点上等位基因扩增后显示为三个荧光峰，峰值面积比接近于1:1:1，可直接判断为三体型，若只显示为两个峰，则计算两个峰的峰面积比值(Area rate，AR)，双峰面积比值＞1.8或者＜0.65则可判定为三体，正常双峰面积比值区间为：0.8～1.4，介于两个区间之间的值无法判断，需重新检测。

4.1.正常结果判定：

至少有两个STR位点为正常位点(表现为双峰，前后峰高比值在0.8-1.4之间，两峰分子量间隔超过24bp时，前后峰高比值在0.8-1.5之间)，其余为无效位点(单峰或双峰峰高比值在1.4-1.8之间)。

4.2异常结果判定：

染色体上STR位点，至少两个为异常位点(表现为三峰，且峰高比值0.8-1.4之间；或双峰，且峰高比值在0.45-0.65或1.8-2.4之间)，其余为无效位点(单峰，三峰或双峰峰高比值在1.4-1.8之间，双峰峰高比值小于0.45或大于2.4)。

4.3.22、21、18、16、15、13和4号染色体非整倍体结果判定

利用阴性质控品对检测试剂盒进行检测分析，其中正常男性人DNA(阴性质控品)检测结果如图3和图3所示，按照荧光标记(相同的染色体上STR位点基本采用相同荧光标记，除部分位点扩增产物大小较接近时采用不同荧光标记)，图2a至图2d依次为13号、18号、21号染色体以及性染色的基因座结果；图3a至图3d依次为4号、15号、16号染色体以及22号染色的基因座结果。

图2a的13号染色体STR结果中，D13S257、D13S1492、D13S1810位点显示双峰(峰高比值0.8-1.4之间)，而D13S627为单峰，符合正常判定结果；图2b的18号染色体STR结果中，D18S536、D18S847、D13S541、D18S542位点均显示双峰(峰高比值0.8-1.4之间)，符合正常判定结果；图2c的21号染色体STR结果中，D21S1433、21q11.2、D21S226、D21S1444、D21S1437、D21S1270位点均显示双峰(峰高比值0.8-1.4之间)，符合正常判定结果；图3a中的4号染色体的D4S3351、D4S2620、D4S3248、D4S381位点均显示双峰(峰高比值0.8-1.4之间)，符合正常判定结果；图3b中的15号染色体STR结果中，D15S642、D15S195、D15S1513、D15S3818、D15S657位点均显示双峰(峰高比值0.8-1.4之间)，符合正常判定结果；图3c的16号染色体上D16S771、D16S767、D16S675、D16S3255、D16S753以及图3a中的D16S526为均显示双峰峰高比值0.8-1.4之间)，符合正常结果判定；图3d的22号染色体上的D22S532、D22S689、D22S686、D22S1686以及图3a中的D22S1405均为显示双峰峰高比值0.8-1.4之间)，符合正常结果判定。综合说明，本试剂盒能够有效地根据22、21、18、16、15、13和4号染色体等7种常染色体上所选STR位点对其非整倍体情况进行判定。

4.4正常男性、正常女性的性别染色体结果判定

如图2d，图4所示，其中图2d所示STR结果图中，AMXY基因位点(分别在X和Y染色体上)显示双峰(峰高比值0.8-1.4之间)，且SRY基因位点(Y染色体上)、DXS6854、DXS6785、DXS996等X染色体上STR位点均为单峰，综上说明该样本在性染色上为正常男性；其中图4所示的STR结果图中，AMXY基因显示单峰，且为102bp(属于X染色体上)，SRY基因位点未出峰，DXS6854、DXS6785、DXS996等X染色体上STR位点均为双峰(峰高比值0.8-1.4之间)，综上说明该样本在性染色上为正常女性。结合上述结果说明本试剂盒可根据所选择的性染色STR位点和性别基因对性染色体的非整倍体情况进行判定。

实施例3

本实施例应用本试剂盒A管反应体系检测21三体、18三体或13三体。

来自供体的血液、羊水或绒毛组织按照QIAamp DNA Mini Kit提取试剂盒的标准程序进行DNA提取纯化。每个样本DNA溶液的浓度用TE buffer(5mM Tris-HCl pH8.0，1mMEDTApH8.0)调整到10-20ng/μL。应用试剂盒中提供的A管PCR反应体系(PCR反应液体A和引物混合液A)和PCR反应酶系，按照试剂盒检测规程进行扩增反应并上样分析。A管的扩增反应同时扩增21号染色体的21q11.2、D21S1270、D21S1433、D21S1437、D21S1444、D21S226等六个位点，18号染色体体的D18S536、D18S541、D18S542、D18S847位点，13号染色体的D13S1492、D13S1810、D13S257、D13S627位点，性染色体上的DXS1283E、DXS6854、DXS6785、DXS996、AMXY、SRY等六个位点，上样结果的分析图谱如图5(21三体)、如图6(18三体)、图7(13三体)，图8(XXY)、图9(XYY)所示：①如图5结果中，D21S1433、21q11.3、D21S1270等基因座有明显的三峰，且其余位点也符合峰面积比例在1:2或2:1的要求，显示样本符合21三体的检测结果；②图6结果中，位点D18S536和D18S542有明显的三峰，而位点D18S541也符合峰面积比例在1:2或2:1，显示该样本为18-三体；③图7结果中D13S1492、D13S1810、D13S257、D13S627的峰面积比例在1:2或2:1，表明样本符合13-三体；④图8中，X染色体的位点DXS6854、DXS6785以及DXS996是标准的双峰，而Y染色体上的位点AMXY有双峰(且峰面积为1:2或2:1)，且SRY位点有峰，说明该样本有两条X染色体，并且有Y染色体，符合XXY核型；⑤图9所示，X染色体的位点DXS6854、DXS6785以及DXS996是单峰，说明该样本有1条X染色体，而Y染色体上的位点AMXY有双峰(且峰面积为1:2或2:1)，且SRY位点有峰，说明有2条Y染色体，符合XYY核型。

实施例4

本实施例应用本试剂盒B管反应体系检测4三体、15三体、16三体或22号三体。

来自供体的血液、羊水或绒毛组织按照QIAamp DNA Mini Kit提取试剂盒的标准程序进行DNA提取纯化。每个样本DNA溶液的浓度用TE buffer(5mM Tris-HCl pH8.0，1mMEDTApH8.0)调整到10-20ng/μL。应用试剂盒中提供的B管反应体系(PCR反应液体B和引物混合液B)和PCR反应酶系，按照试剂盒检测规程进行扩增反应并上样分析。B管的扩增反应同时扩增4号染色体的D4S2381、D4S2620、D4S3248、D4S3351等位点，15号染色体体的D15S1513、D15S195、D15S642、D15S657、D15S818位点，16号染色体的D16S3255、D16S526、D16S675、D16S753、D16S767、D16S771位点，22号染色体的D22S1045、D22S1686、D22S532、D22S686、D22S689位点，上样结果的分析图谱如图10(4三体)所示，其中4号染色体上的D4S2620和D4S381有明显的三峰，符合三体的判定要求；如图11(15三体)所示，D15S642、D15S195以及D15S818有明显三峰，符合超过2个位点有三峰即可判定为三体的标准，说明样本为15-三体；如图12(16三体)所示，其中位点D16S771、D16S3255有明显三峰，且其余16号染色体的STR位点的峰面积符合1:2或2:1的比例，说明该样本为16-三体；如图13(22三体)所示，22号染色体上的D22S1686、D22S532、D22S686、D22S689的峰面积符合1:2或2:1的比例，说明样本为三体。通过列举上述阳性样本的检测结果，说明试剂盒能够有效地检出相关染色体的染色体数目异常类型。

实施例5

本实施例中将本发明试剂盒和其他同类型STR试剂盒进行对比。

本实施例收集市售常见的3种不同STR试剂盒，利用临床经核型分析确定的4-三体、15三体、18三体、21三体以及XXY各1例样本，在低样本量(5ng)和高样本量(30ng)下进行检测分析，具体检测结果见下表：本发明的试剂盒在两个样本量水平下的检出率均为100％，试剂盒2检出率为20％，试剂盒3检出率为40％，试剂盒4检出率为60％。根据其试剂盒说明书记录，其中试剂盒2的检测范围为21三体，试剂盒3的检测范围为13三体、18三体和21三体，试剂盒4的检测范围为13三体、18三体、21三体以及性染色体，而本试剂盒的检测范围包括4号、13号、15号、16号、18号、21号以及X、Y染色体。因而，可以说明本发明试剂盒的检测的染色体异常类型更广泛，且检测灵敏度优于市售产品。

此外，本发明试剂盒提供了阴阳性质控品用于监控整个检测过程，而其他市售的STR试剂盒均没有质控品。具体表现为，在本次实施例中，试剂盒2和试剂盒3出现了1次未检出情况，无法通过阴阳性质控品结果分析出，是否漏加样本或漏加酶导致，只能重复实验过程，而本发明试剂盒则可通过阴阳性质控品监测出漏加样本或酶系等操作失误。

注：“+”表示检出；“-”表示未检出。

实施例6

本实施例中将本发明试剂盒和其他染色体数目异常检测试剂盒进行对比。

本实施例收集临床的13三体、16三体、21-三体的流产组织样本，提取其基因组DNA，设计低(10ng)、中(50ng)、高(250ng)的初始样本量，分别采用目前主流的检测染色体数目异常(或拷贝数变异)技术进行对比分析，具体为采用试剂盒1(本发明试剂盒)、试剂盒2(染色体微阵列分析试剂盒)、试剂盒3(高通量检测拷贝数变异试剂盒)进行样本检测，检测结果如下表：由下表可知，本发明试剂盒在低(10ng)、中(50ng)均检出，阳性符合率100％，相对应的试剂盒2和试剂盒3因样本量不足，无法进行片段化操作，导致无法后续操作，这说明本发明试剂盒的检测灵敏度明显优于染色体微阵列分析和高通量测序平台；此外，在高(250ng)样本量下，本试剂盒的检出和染色体微阵列分析、高通量测序技术检测出结果符合率为100％。综上，本实施例说明本发明试剂盒在灵敏度、检测周期以及检测成本上明显优于微阵列分析和高通量测序方法；检出结果也完全和染色体微阵列分析技术、高通量测序技术(样本量足够条件下)一致。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司

<120> 一种染色体非整倍体数目异常的引物组与检测试剂盒及其应用

<130> 6.15

<160> 80

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gagggtaata actacttcat tggat 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ccacctacga ccaaagcatg 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atctttgggt tcctcaagtt gct 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

catggagaag ggaaaagagg a 21

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tgagaaaagt tgatatatct gaattgt 27

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gattaggggc agagtcaaaa gtcac 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ttttctgtgt attttggctg ctatc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gtgtgctgtt attttgagtc tgttc 25

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

agaggttgca gtgagctgag at 22

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gtgtctatct atctatccat cttgtg 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tctgcctcct gaagtgttgg 20

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

atatttttat gaaaactgat gtcct 25

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ggccaaggag acagcagata c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cctgggcaac aagagcaaaa 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ccattgtgat gaagccattc tctaa 25

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

tgggaagagc tccccaagg 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ggcaggaaat cagggatcac 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

aattgcctca ctaccttccc t 21

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

aaaacaaaca gaaaggaaac agaag 25

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

tagaagagaa ccctcacgct gc 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

agggaggcaa aggtttcagt 20

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

tgtgaggtta ctggacacga aa 22

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

cactgctaca taggattcca cgat 24

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

taatcccagc actttgagag gc 22

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

ggataagaag gataaaagtc caacc 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

catcctccac gtacgaataa tagaa 25

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

gcgatattgg ctgaggcaca 20

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

accagaaaag ttggagagct agg 23

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

ttcctgggtg ttccttcg 18

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

actcaggagg ctaaggtggg 20

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

tacacatgtt tacgtttttt ctttg 25

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

actgaattac accacaggct tac 23

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

tgtgccttct tgctttcctg 20

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

tgcttctaaa caaaccaaga catg 24

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

ccctggcaaa tcttacacat c 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

gcacctgcct actcacctcc t 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

acactcactg cactgcagcc 20

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

tgcctttatc caccctacct gt 22

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

ctggtgttag tcctctgtat tattc 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

gtccttcata acatatcact ttcta 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

ctctgagagt tctccttaag cactg 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 42

gaacttctca gtctccataa tcaca 25

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 43

ccaaatatgg aatggaatta gat 23

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 44

acaagagcaa aactccatct caaat 25

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 45

tgttcctcag ccttagtggg 20

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 46

actttgtatc agagacttga gcatt 25

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 47

cctgccctcc tttctactct 20

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 48

cagaccagta taggagctga agaac 25

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 49

atttcaacca cattactttc acttt 25

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 50

aatgatgtgt agtcaaaaga ataat 25

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 51

ccactgatgg acatttaggt tga 23

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 52

tggttatttc caccttggct att 23

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 53

ctgttgccaa tgctgtgtta ct 22

<210> 54

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 54

gagccaatcc ttcgtgataa at 22

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 55

caccccttta tacttggctg tgat 24

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 56

cgatctccag aatcacatga gccaa 25

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 57

gcttcctttg ccatctatct at 22

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 58

ttatggcagc cctagcaaac 20

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 59

tagaccctgt cctagccttc ttata 25

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 60

cctgtgccca agttgagaga a 21

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 61

aaaagtcgtt cttcccatca c 21

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 62

gcagcctggg tgacaaagtg 20

<210> 63

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 63

ttgtatcgct ggttagactg ttc 23

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 64

gcagaaggta aactgtagag gc 22

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 65

gaggctgagg cggaagaa 18

<210> 66

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 66

tagttttgag ggttcctttt gg 22

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 67

ctcagagagt tgggaggatt agaa 24

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 68

agtagtaaag cctgactccc aaa 23

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 69

ggctggtccc taggaggag 19

<210> 70

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 70

cagtgagccg agatcgcg 18

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 71

atgagaatcg cttgaatccg 20

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 72

tgaggagggt cagaatcttg tag 23

<210> 73

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 73

attttctggt gtttgttttt ccttg 25

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 74

cgtgggtgac agagtgagac a 21

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 75

ggggacacag ccaaaccata 20

<210> 76

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 76

ttactaggct acttggttct ttgtg 25

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 77

ccctgggctc tgtaaagaat agtg 24

<210> 78

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 78

gcttcccagt ttaagctctg at 22

<210> 79

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 79

cagctgtgca agagaatatt cc 22

<210> 80

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 80

aagcattttc cactggtatc cc 22

Claims

1.一种染色体非整倍体数目异常的引物组，其特征在于，所述引物组包含38个与4、13、15、16、18、21、22、X染色体非整倍体数目异常检测相关的STR基因座和2个Y染色体非整倍体数目异常检测相关基因座，所述基因座及其引物，具体如下：

扩增D4S2381的引物：

正向引物：5′-GAGGGTAATAACTACTTCATTGGAT-3′，

反向引物：5′-CCACCTACGACCAAAGCATG-3′；

扩增D4S2620的引物：

正向引物：5′-ATCTTTGGGTTCCTCAAGTTGCT-3′，

反向引物：5′-CATGGAGAAGGGAAAAGAGGA-3′；

扩增D4S3248的引物：

正向引物：5′-TGAGAAAAGTTGATATATCTGAATTGT-3′，

反向引物：5′-GATTAGGGGCAGAGTCAAAAGTCAC-3′；

扩增D4S3351的引物：

正向引物：5′-TTTTCTGTGTATTTTGGCTGCTATC-3′，

反向引物：5′-GTGTGCTGTTATTTTGAGTCTGTTC-3′；

扩增D13S257的引物：

正向引物：5′-AGAGGTTGCAGTGAGCTGAGAT-3′，

反向引物：5′-GTGTCTATCTATCTATCCATCTTGTG-3′；

扩增D13S492的引物：

正向引物：5′-TCTGCCTCCTGAAGTGTTGG-3′，

反向引物：5′-ATATTTTTATGAAAACTGATGTCCT-3′；

扩增D13S1810的引物：

正向引物：5′-GGCCAAGGAGACAGCAGATAC-3′，

反向引物：5′-CCTGGGCAACAAGAGCAAAA-3′；

扩增D13S627的引物：

正向引物：5′-CCATTGTGATGAAGCCATTCTCTAA-3′，

反向引物：5′-TGGGAAGAGCTCCCCAAGG-3′；

扩增D15S195的引物：

正向引物：5′-GGCAGGAAATCAGGGATCAC-3′，

反向引物：5′-AATTGCCTCACTACCTTCCCT-3′；

扩增D15S657的引物：

正向引物：5′-AAAACAAACAGAAAGGAAACAGAAG-3′，

反向引物：5′-TAGAAGAGAACCCTCACGCTGC-3′；

扩增D15S642的引物：

正向引物：5′-AGGGAGGCAAAGGTTTCAGT-3′，

反向引物：5′-TGTGAGGTTACTGGACACGAAA-3′；

扩增D15S818的引物：

正向引物：5′-CACTGCTACATAGGATTCCACGAT-3′，

反向引物：5′-TAATCCCAGCACTTTGAGAGGC-3′；

扩增D15S1513的引物：

正向引物：5′-GGATAAGAAGGATAAAAGTCCAAC-3′，

反向引物：5′-CATCCTCCACGTACGAATAATAGAA-3′；

扩增D16S675的引物：

正向引物：5′-GCGATATTGGCTGAGGCACA-3′，

反向引物：5′-ACCAGAAAAGTTGGAGAGCTAGG-3′；

扩增D16S753的引物：

正向引物：5′-TTCCTGGGTGTTCCTTCG-3′，

反向引物：5′-ACTCAGGAGGCTAAGGTGGG-3′；

扩增D16S767的引物：

正向引物：5′-TACACATGTTTACGTTTTTTCTTTG-3′，

反向引物：5′-ACTGAATTACACCACAGGCTTAC-3′；

扩增D16S771的引物：

正向引物：5′-TGTGCCTTCTTGCTTTCCTG-3′，

反向引物：5′-TGCTTCTAAACAAACCAAGACATG-3′；

扩增D16S3255的引物：

正向引物：5′-CCCTGGCAAATCTTACACATC-3′，

反向引物：5′-GCACCTGCCTACTCACCTCCT-3′；

扩增D16S526的引物：

正向引物：5′-ACACTCACTGCACTGCAGCC-3′，

反向引物：5′-TGCCTTTATCCACCCTACCTGT-3′；

扩增D18S536的引物：

正向引物：5′-CTGGTGTTAGTCCTCTGTATTATTC-3′，

反向引物：5′-GTCCTTCATAACATATCACTTTCTA-3′；

扩增D18S847的引物：

正向引物：5′-CTCTGAGAGTTCTCCTTAAGCACTG-3′，

反向引物：5′-GAACTTCTCAGTCTCCATAATCACA-3′；

扩增D18S541的引物：

正向引物：5′-CCAAATATGGAATGGAATTAGAT-3′，

反向引物：5′-ACAAGAGCAAAACTCCATCTCAAAT-3′；

扩增D18S542的引物：

正向引物：5′-TGTTCCTCAGCCTTAGTGGG-3′，

反向引物：5′-ACTTTGTATCAGAGACTTGAGCATT-3′；

扩增21q11.2的引物：

正向引物：5′-CCTGCCCTCCTTTCTACTCT-3′，

反向引物：5′-CAGACCAGTATAGGAGCTGAAGAAC-3′；

扩增D21S226的引物：

正向引物：5′-ATTTCAACCACATTACTTTCACTTT-3′，

反向引物：5′-AATGATGTGTAGTCAAAAGAATAAT-3′；

扩增D21S1437的引物：

正向引物：5′-CCACTGATGGACATTTAGGTTGA-3′，

反向引物：5′-TGGTTATTTCCACCTTGGCTATT-3′；

扩增D21S270的引物：

正向引物：5′-CTGTTGCCAATGCTGTGTTACT-3′，

反向引物：5′-GAGCCAATCCTTCGTGATAAAT-3′；

扩增D21S1433的引物：

正向引物：5′-CACCCCTTTATACTTGGCTGTGAT-3′，

反向引物：5′-CGATCTCCAGAATCACATGAGCCAA-3′；

扩增D21S1444的引物：

正向引物：5′-GCTTCCTTTGCCATCTATCTAT-3′，

反向引物：5′-TTATGGCAGCCCTAGCAAAC-3′；

扩增D22S1045的引物：

正向引物：5′-TAGACCCTGTCCTAGCCTTCTTATA-3′，

反向引物：5′-CCTGTGCCCAAGTTGAGAGAA-3′；

扩增D22S689的引物：

正向引物：5′-AAAAGTCGTTCTTCCCATCAC-3′，

反向引物：5′-GCAGCCTGGGTGACAAAGTG-3′；

扩增D22S686的引物：

正向引物：5′-TTGTATCGCTGGTTAGACTGTTC-3′，

反向引物：5′-GCAGAAGGTAAACTGTAGAGGC-3′；

扩增D22S532的引物：

正向引物：5′-GAGGCTGAGGCGGAAGAA-3′，

反向引物：5′-TAGTTTTGAGGGTTCCTTTTGG-3′；

扩增D22S1686的引物：

正向引物：5′-CTCAGAGAGTTGGGAGGATTAGAA-3′，

反向引物：5′-AGTAGTAAAGCCTGACTCCCAAA-3′；

扩增DXS6854的引物：

正向引物：5′-GGCTGGTCCCTAGGAGGAG-3′，

反向引物：5′-CAGTGAGCCGAGATCGCG-3′；

扩增DXS6785的引物：

正向引物：5′-ATGAGAATCGCTTGAATCCG-3′，

反向引物：5′-TGAGGAGGGTCAGAATCTTGTAG-3′；

扩增DXS996的引物：

正向引物：5′-ATTTTCTGGTGTTTGTTTTTCCTTG-3′，

反向引物：5′-CGTGGGTGACAGAGTGAGACA-3′；

扩增DXS1283E的引物：

正向引物：5′-GGGGACACAGCCAAACCATA-3′，

反向引物：5′-TTACTAGGCTACTTGGTTCTTTGTG-3′；

扩增AMXY的引物：

正向引物：5′-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3′，

反向引物：5′-GCTTCCCAGTTTAAGCTCTGAT-3′；

扩增SRY的引物：

正向引物：5′-CAGCTGTGCAAGAGAATATTCC-3′，

反向引物：5′-AAGCATTTTCCACTGGTATCCC-3′。

2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，将所述基因座的引物组分为四组，每组引物带有不同的荧光标记物，四组引物分别在每一对的其中一条引物的5’末端带有荧光标记物，所述第一组为：D21S1433、21q11.2、D21S226、D21S1444、D21S1437、D21S1270、D4S2381、D4S2620、D4S3248、D4S3351、D16S526、D22S1045；所述第二组为：D18S536、D18S847、D18S541、D18S542、D15S195、D15S657、D15S642、D15S818；所述第三组引物为：D13S257、D13S1492、D13S1810、D13S627、D15S1513、D22S689、D22S686、D22S532、D22S1686；所述第四组引物为：SRY、AMXY、DXS6854、DXS6785、DXS996、DXS1283E、D16S675、D16S753、D16S767、D16S771、D16S3255。

3.如权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述荧光染料标记采用以下四组：(a)FAM或荧光素、(b)HEX或JOE、(c)TMR或VIC、(d)ROX或PET。

4.如权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述第一组引物采用的荧光标记物为(a)组，所述第二组引物采用的荧光标记物为(b)组，所述第三组引物采用的荧光标记物为(c)组，所述第四组引物采用的荧光标记物为(d)组。

5.一种包含如权利要求1-4任一项所述的引物组的检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含21三体阳性质控品、XXY阳性质控品、16三体阳性质控品、STR阴性质控品。

6.如权利要求5所述的检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR反应酶系、无核酸酶水和PCR反应混合液。

7.如权利要求5所述的检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs，其具体反应体积比例为20:10:1；所述PCR反应混合液浓度为其2.5倍工作液浓度，扩增预混液为2.5倍工作液浓度。

8.如权利要求7所述的检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：10.0μL的2.5×PCR MIX预混液，2.5μL的10×引物混合液，0.5μL PCR反应酶系，2.0μL 1～10ng DNA模板以及5μL的灭菌水。

9.一种如权利要求1-4任一项所述引物组在制备用于检测染色体非整倍体数目异常的试剂盒中的应用。