CN109628559A

CN109628559A - 一种检测y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN109628559A
Application number: CN201910087972.1A
Authority: CN
Inventors: 陈苗苗; 杨继伟; 罗俊峰; 陈云弟
Original assignee: Review Genetic Technology (suzhou) Co Ltd
Current assignee: Review Genetic Technology (suzhou) Co Ltd
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2039-01-29
Also published as: CN109628559B

Abstract

本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及一种检测Y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒。该方法具体包括：获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA；将所述基因组DNA中Y染色体特异性基因和任意一条常染色体的内参基因进行定量实时扩增；获取并比较扩增过程相同循环下的所述特异性基因和内参基因荧光增加值，与预设的标准品荧光值进行对比，获得Y染色体拷贝数。本发明采用的荧光PCR法相对定量通常采用比较Ct法，本发明结合荧光比值算法和标准品设置，无需靶基因和内参基因扩增效率相等，且检测更加准确、灵敏，能够快速准确的获得Y染色体上拷贝数，确定Y染色体拷贝数的变异情况。

Description

一种检测Y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及一种检测Y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒。

背景技术

拷贝数变异(copy number variation,CNV)是指与参考序列相比，发生在基因组上的长度大于1kb的DNA片段由于重复、缺失等原因造成的微结构变异，是人类疾病的重要致病因素之一。

目前对CNV进行检测的方法很多，包括基于芯片的比较基因组杂交(array-basedcomparative genomic hybridization，aCGH)、单核苷酸多态性-微阵列(SNP-array)、基于二代测序的CNV分析、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA)等。这些技术检测位点多、准确性高、部分方法检测分辨率达到1bp。

但是上述测试方法的检测周期长，检测成本高，无法满足现有技术对拷贝数变异检测的需求。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明所提供的技术方案是：

一种检测Y染色体拷贝数的方法包括以下步骤：

获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA；

将所述基因组DNA中Y染色体特异性基因SRY和任意一条常染色体的内参基因进行定量实时扩增；

获取并比较扩增过程相同循环下的所述特异性基因SRY和内参基因荧光增加值，与预设的标准品荧光值进行对比，获得Y染色体拷贝数。

一种检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，具体包括：引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、探针Ⅰ、探针Ⅱ、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、ROX荧光PCR参比染料和基因组DNA。

有益效果：

本发明通过将Y染色体上的特异性基因和任意一条常染色体进行定量实时扩增，获得两种基因的荧光增加值，通过将两者该荧光增加值的比值与标准品进行对比获得Y染色体拷贝数变异情况。本发明无需靶基因和内参基因扩增效率一致，实验流程简单，检验结果更接近真实值。特别的，本发明设置标准品，使得拷贝数定量更加准确可靠。

还公开了一种检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，利用本发明提供的方法和试剂盒，能够快速准确的获得Y染色体上拷贝数，确定Y染色体拷贝数的变异情况。

附图说明

附图1为不同比例标准品的荧光比值柱状图；

附图2为18例正常男性和4例超雄症患者的拷贝数检测荧光比值柱状图；

附图3为样本A2拷贝数检测Rsry/rabif比值柱状图。

具体实施方式

为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。

名词解释：

SRY(sex-determining region of Y-chromosome)基因：Y染色体性别决定区，是人体Y染色体断臂末端上的一段基因片段，该基因是决定男性睾丸发育的主要基因，通常用作检测Y染色体存在的特异性基因序列。

RABIF(RAB interacting facor)基因：RAB作用因子，用于编码Mss4鸟苷酸交换因子，由于序列保守且特异，发生拷贝数变异频率低，通常用作对照基因。

本申请实施例以RABIF基因作为内参基因，应当理解的是，凡是处于常染色体上的基因，且序列保守且具有一定的特异性，发生拷贝数变异频率低的基因均可以作为检测Y染色体拷贝数变异基因的内参基因。

实施例1

标准品的制备：

在铂尚生物合成RABIF和SRY基因片段，且RABIF和SRY基因片段的3’端携带突出碱基“A”，同时质粒pUC57(大肠杆菌克隆质粒)5’端携带突出碱基“T”，采用连接酶将RABIF和SRY基因片段分别连接至质粒pUC57，获得重组质粒ⅠpUC-SRY和重组质粒ⅡpUC-RABIF。

用TE缓冲液将重组质粒ⅠpUC-SRY和重组质粒ⅡpUC-RABIF稀释至相同摩尔浓度，并配置成摩尔比为1:2、2:2、3:2、4:2、5:2的标准品。

实施例2

本发明通过引物设计原则和多种计算机程序，设计获得Y染色体特异性基因SRY和1号染色体内参基因RABIF的PCR引物组和探针，并通过大量实验筛选出特异性高的引物序列，具体如比1所示。

表1

其中Y染色体特异SRY探针的5’端和3’端分别用ROX荧光基团和BHQ2淬灭基团进行修饰，获得的Y染色体特异SRY探针为ROX-TCAGTGTGAAACGGGAGAAAACA-BHQ2；其中1号染色体内参基因RABIF探针的5’端和3’端分别用6-FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团进行修饰，获得的1号染色体内参基因RABIF探针为6FAM-AAAGGCCAGTTCTTGTGGGG-BHQ1。

实施例3

本实施例具体公开了标准品荧光增加值的检测，包括具体包括：

标准品定量实时PCR(qPCR)反应体系的配制：

GoldStar TaqDNA聚合酶0.16uL，5×GoldStar PCR缓冲液4ul，dNTP混合物(10mMeach)0.4ul，氯化镁(100mM)0.4ul，RABIF引物1(10mM)0.4ul，RABIF引物2(10mM)0.4ul，RABIF探针(10mM)0.16ul，SRY引物1(10mM)0.4ul，SRY引物2(10mM)0.4ul，SRY探针(10mM)0.16ul，ROX荧光PCR参比染料0.4ul，标准品3ul，加水补齐至20ul。

qPCR排版为：以上述5种标准品为模板的样本检测，同时设置水作为模板的NTC检测，样品检测和NTC(No template control，空白对照组)均设置4个复孔。将上述标准品的qPCR体系至于95℃处理10min，40个循环(95℃15sec，60℃1min收集信号)。

本发明按照以下荧光比值法进行计算：

获取qPCR原始荧光值数据“raw data”。

选定计算baseline荧光值的起始循环数和终止循环数，计算起始和终止之间所有循环的平均荧光值作为baseline荧光值，例如起始循环为3，终止循环为15，则计算3-15循环(共计13个循环)的荧光值的平均值作为baseline荧光值。

根据qPCR曲线(log曲线更优)选定某一循环数，使得RABIF和SRY都处于对数期。

Rsry/rabif等于第n循环SRY荧光增加值除以RABIF荧光增加值，其中荧光增加值等于第n个循环荧光值减去baseline荧光值。计算4个复孔荧光增加值的平均值作为Rsry/rabif平均值，荧光增加值的标准方差作为Rsry/rabif误差。

5种标准比例模板的SRY和RABIF荧光比值结果如附图1所示：荧光比值和Y染色体拷贝数呈现对应关系，随着SRY比例的提高荧光比值随之升高，本专利所述方法明显区分1:2、2:2、3:2这些常规qPCR计算方法难以分辨的拷贝数差异。两种标准品荧光比值的误差值不交叉，计算值准确。

实施例4

本实施例提供了18例正常男性和4例超雄性患者Y染色体拷贝数的检测方法，以验证该方法的准确性，具体包括以下步骤：

基因组DNA提取：

本实施例以从血液中提取基因组DNA为例，本血液抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司，具体步骤如下：

取200μL血液样本到2.0mL的离心管中。若提取小于200μL血液样品时，可加入缓冲液GS补足体积至200μL，再进行下一步实验。

加入200μL Buffer GB和20μL蛋白酶K溶液至上述样品中，充分振荡混匀。

在56℃孵育10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(若溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。

室温放置2-5min后加入350μL Buffer BD，充分颠倒混匀，短暂离心将反应液收集至管底。

将所有溶液分转移到离心柱中(离心柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。

加入500μL Buffer GDB，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。

加入600μL Buffer PWB，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。

重复上一步骤。

12000rpm(～13400×g)离心2min，将离心柱转入一个新的1.5mL离心管中，开盖室温放置5min，以彻底风干吸附膜上的残余的缓冲液。

向离心柱的吸附膜中心悬空加入50μL洗脱液TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.0)，室温放置2min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将洗脱液收集到离心管中。

将所述获得基因组DNA用Nanodrop测定DNA浓度和A260/A280的比值。应当理解的是，本发明公开的扩增人类DPY19L2基因外显子的PCR引物组、试剂盒和扩增体系不仅仅适用于从血液样本中抽提得到的DNA，还包括从唾液，精液，细胞，组织，FFPE(石蜡包埋)等样本中抽提合格的DNA。

选择A260/A280为1.8-2.2的基因组DNA，配置22组qPCR体系为：GoldStar TaqDNA聚合酶0.16uL，5×GoldStar PCR缓冲液4ul，dNTP混合物(10mM each)0.4ul，氯化镁(100mM)0.4ul，RABIF引物1(10mM)0.4ul，RABIF引物2(10mM)0.4ul，RABIF探针(10mM)0.16ul，SRY引物1(10mM)0.4ul，SRY引物2(10mM)0.4ul，SRY探针(10mM)0.16ul，ROX荧光PCR参比染料0.4ul，基因组DNA 3ul，加水补齐至20ul。同时配置标准品比例为1：2和2:2的标准品反应体系。

qPCR排版为：上述22例样本检测，标准品1:2和2:2的检测，同时设置水作为模板的NTC检测，样品检测、标准品检测和NTC均设置4个复孔。将上述样品和标准品的qPCR体系至于95℃处理10min，40个循环(95℃15sec，60℃1min收集信号)。应当理解的是，本方法如果基因组的浓度过高或者过低，需要稀释或者浓缩基因组，将样本和标准品稀释至拷贝数大致相同，如此样本和标准品qPCR曲线的对数期位置接近，方便后续计算过程对数期循环数的选择。

根据实施例3荧光比值法，获得各样本和标准品的荧光增值的比值Rsry/rabif，将样本与标准品的Rsry/rabif进行比较，推算样本SRY和RABIF拷贝数比例和样本SRY拷贝数，判断样本Y染色拷贝数的变异情况。

附图2展示了18例正常男性和4例超雄症患者的拷贝数检测Rsry/rabif荧光比值结果，其中M表示正常男性，S表示超雄性患者，可以看出本方法可以区分正常男性和超雄症患者，二者Rsry/rabif明显不同，跟标准品对应，可以推断正常男性SRY为单拷贝数，超雄症SRY为2拷贝数，跟理论相符。

实施例5

本实施例提供了未知样本A2Y染色体拷贝数的检测方法，具体包括以下步骤：

基因组DNA的获取：

以实施例4提供的相同方法，从血液中获得样本基因组DNA。选择A260/A280为1.8-2.2的基因组DNA。并配置样本的qPCR体系和标准品1：2和2:2的qPCR体系，配置方法如实施例4的qPCR体系，并以正常男性基因组和超雄基因组为阳性对照组，同时以水作为扩增模板做4孔NTC，检测实验过程是否存在污染。样本、标准品和NTC检测设置4个复孔。

根据实施例3荧光比值法，获得各样本和标准品的荧光增值的比值Rsry/rabif，将样本与标准品的Rsry/rabif进行比较，推算样本SRY和RABIF拷贝数比例和样本SRY拷贝数，判断样本Y染色拷贝数的变异情况。如附图3提供的样本A2拷贝数检测Rsry/rabif比值柱形图，其中样本的Rsry/rabif比值与标准品2:2相当，可以推测样本基因组含有2条Y染色体。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

序列表

<110> 阅尔基因技术（苏州）有限公司

<120> 一种检测Y染色体拷贝数变异的方法和试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcactgaaa gctgtaactc ta 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcactctat cctggacgtt g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 3

aggcagcgga acagttatac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 4

ttctatgtgg ccttggaacg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagtgtgaa acgggagaaa aca 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaggccagt tcttgtgggg 20

Claims

1.一种检测Y染色体拷贝数变异的方法，其特征在于，所述检测Y染色体拷贝数的方法包括以下步骤：

获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA；

2.根据权利要求1所述的检测Y染色体拷贝数变异的方法，其特征在于，所述预设的标准品包括含有所述Y染色体特异性基因SRY的重组质粒Ⅰ和含有所述内参基因的重组质粒Ⅱ。

3.根据权利要求1所述的检测Y染色体拷贝数变异的方法，其特征在于，所述常染色体的内参基因为1号染色体内参基因RABIF。

4.一种检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，具体包括：

引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、探针Ⅰ、探针Ⅱ、TaqDNA 聚合酶、PCR 缓冲液、dNTPs、ROX荧光PCR参比染料和基因组DNA。

5.根据权利要求4所述的检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，所述引物对Ⅰ为用于扩增Y染色体特异性基因SRY，核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。

6.根据权利要求4所述的检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，所述引物对Ⅱ为用于扩增1号染色体内参基因RABIF，核苷酸序列如序列表SEQ ID:3和SEQ ID:4所示。

7.根据权利要求4所述的检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，所述探针Ⅰ为用于扩增Y染色体特异性基因SRY，核苷酸序列如序列表SEQ ID No:5所示。

8.根据权利要求7所述的检测Y染色体拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述探针Ⅰ的5’端具有ROX荧光基团修饰，3’端具有BHQ2淬灭基团修饰。

9.根据权利要求4所述的检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，所述探针Ⅱ为用于扩增1号染色体内参基因RABIF，核苷酸序列如序列表SEQ ID No:6。

10.根据权利要求9所述的检测Y染色体拷贝数变异的试剂盒，其特征在于，所述探针Ⅱ的5’端具有6-FAM荧光基团修饰，3’端具有BHQ1淬灭基团修饰。