CN101354337A - 实时检测单核苷酸多态性的荧光定量pcr方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测单核苷酸多态性的实时荧光定量PCR方法。该方法含两套引物探针的组合，定量的一套引物探针可确定待检样品的初始核酸数量，分型的另一套引物探针与其组合可确定是否发生单核苷酸多态性；体系镁离子浓度为2～10mM，Taq酶用量为5～10U/反应，UNG酶用量为1～2U/反应。根据定量标准品的Ct值制成标准曲线；将待测样品的Ct值代入标准曲线确定其初始模板拷贝数；计算某样品的定量Ct值与分型Ct值的差值，将此差值分别与野生及突变型标准品的相应差值进行比较，可确定该样品是否发生单核苷酸突变。本发明还提供了一种应用该方法的检测乙型肝炎病毒1896突变的荧光定量PCR试剂盒。

Description

实时检测单核苷酸多态性的荧光定量PCR方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及单核苷酸多态性检测领域，属于一种检测遗传物质中基因多态性(如单碱基多态性、单碱基插入或缺失)的方法，具体说是两套引物探针组合，在单管中进行双色荧光PCR反应。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。包括置换、颠换、缺失和插入。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但通常发生的只有两种，即主要的SNP位点是两种基因型。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸突变。

在基因组DNA中，SNP既有可能在基因的编码序列上，也有可能在基因以外的非编码序列上。总之，位于编码区内的SNP位点(cSNP)相对于编码区外的SNP位点比较少，因为在外显子内，其变异率仅为周围序列的1/5，但在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究备受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义SNP，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基编码的氨基酸相同；另一种是非同义SNP，指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的氨基酸序列发生改变，从而可能影响了蛋白质的功能，这种改变是导致生物性状改变的直接原因之一。

个体之间的核苷酸序列都有一定差异，它决定了不同物种和群体的差异。其中许多致病微生物的单核苷酸多态性是一个具有稳定性的遗传学标记，可以成为寻找许多致病相关基因，对疾病诊断、疾病预防和药物筛选提供重要依据。

SNP的检测方法常用的有PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、限制片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)和变性高效能液相层析(Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)等。在某种程度上能实现对SNP位点的检测，但也有不足，部分方法需几步PCR扩增反应，有些需使用多管PCR反应测定SNP。近年来广泛使用的荧光PCR反应可以测定等位基因中已知SNP，与以上方法相比，荧光PCR方法具有高灵敏度、高特异性、不易污染等特点。与电泳法等不同，反应过程完全闭管扩增和检测，无需PCR后处理，同时操作简单、耗时短，结果客观可靠，无需人为判断，仪器自动收集和分析数据。实时定量荧光PCR方法(参见Kenneth J.Lival et al，U.S patent 5,538,848和程钢，CN patent 99100669)在常规PCR基础上，减少了扩增产物的长度，多了一条荧光标记探针，探针在无特异性PCR发生时保持分子结构，荧光信号不变，特异性PCR进行时，在PCR过程中聚合酶剪切探针而引起发光集团荧光值的不断积累。荧光值伴随着PCR产物的增加而增加。在PCR反应的过程中，连续不断地检测反应体系中的荧光的绝对值。当信号增强到某一阈值时，循环次数(Ct值)就被软件记录下来，该循环参数和起始DNA量的对数值之间存在着严格的线形关系[参见Higuchi et al，Biotechnology，11：1026-1030(1993)]，根据循环参数Ct值就可以确定起始DNA的数量。例如使用ABI7300仪器可以将含有荧光探针和从标本中提取的核酸样品加入到PCR反应管，启动PCR反应和并设定荧光检测参数，在仪器中直接实现闭管检测。反应结束后仪器所带软件自动分析检出样品的Ct值；同时通过测定阳性梯度标准品的Ct值，制成标准曲线，根据样品的Ct值，在标准曲线上查出相应的样品核酸的量。本方法采用荧光技术和闭管检测，克服了常规PCR方法的主要缺点，可以检测混合基因型，提高分型的准确性和可靠性，满足高通量的基因多态性检测的应用需求，具有快速、高效、准确、易实现产业化等特点。

本方法可应用于疾病预防、临床诊断、个性化治疗、药物开发和合理用药等，虽然它还处在快速发展阶段，但已显示出良好的应用前景。

三、附图说明

下面结合附图对本发明的实施例作进一步的详细描述。

附图说明：

图1是显示荧光PCR的原理的图，R：荧光报告基团；Q：荧光淬灭基团。

其中：

(1)5’--3’外切核酸酶活性

用于荧光定量PCR的Tag酶不仅有延伸DNA引物的活性(DNA聚合酶活性)，还有5’--3’外切核酸酶活性，可以在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的单链切断。

(2)荧光标记引物

这条探针的5’端和3’端分别标记了一个特殊基团，5’端的基团称为荧光指示基团(R)，3’端的基团称为荧光抑制基团(Q)。当这条探针保持完整时，Q基团将抑制R基团的荧光信号，一旦探针被切断，抑制作用消失，R基团的荧光信号就可以被检测到。

(3)荧光PCR反应的实现

上述荧光标记探针根据碱基配对原理和扩增产物核酸序列结合。PCR反应开始后，随着链的延伸，Tag酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥它的5’--3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出R基团的荧光信号。被释放的游离R基团的数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此R基团的荧光信号强弱就于PCR产物的数量成正比关系，测定出前者就可以测算出后者。这就是荧光定量PCR的原理。

图2是分型引物设计原理图。

图3是检测野生型样品得到的定量探针荧光值变化和分型探针荧光值变化

图(定量深红色，分型浅绿色)。红线代表基线，基线上定量分型的差值即为ΔCt值。

图4是检测突变型样品得到的定量探针荧光值变化和分型探针荧光值变化

图(定量深红色，分型浅绿色)。红线代表基线，基线上定量分型的差值即为ΔCt值。

四、发明内容

本发明的目的是在单管反应中实现定量检测和单核苷酸多态性检测，单管反应即可以定量又可以进行单核苷酸检测，为各种疾病的辅助诊断提供一种经济、快速、准确的检测方法及应用该方法的检测试剂盒。

本发明的单核苷酸多态性的实时荧光定量PCR方法包括以下步骤：

a、根据待检测靶基因的特异性的序列合成一对人工引物和一条探针，其中引物之间的距离应大于35个碱基；

b、根据待检测单核苷酸多态性位点附近的特异性的序列合成一对人工引物和一条探针，其中一条特殊人工引物3’末端包含待检测单核苷酸多态性位点，其中引物之间的距离应大于35个碱基。上面所述的特殊人工引物3’末端两个碱基由以下16种碱基组合代替，但是与原两个碱基相同的组合除外。这些组合是：CC、GC、AC、TC、CG、GG、AG、TG、CA、GA、AA、TA、CT、GT、AT和TT；

c、使用步骤a中的引物探针组合、步骤b中的引物探针组合及其他PCR反应成份组成双重荧光PCR反应体系，体系中镁离子浓度为2～10mM，Taq酶用量为5～10单位/反应，UNG酶用量为1～2单位/反应；

d、从待检测物中提取DNA，或者提取RNA然后反转录成cDNA，加入到c中的反应体系中去，然后放置到双色或双色以上荧光PCR仪上准备反应；

e、步骤d中的反应体系经过30～50个循环结束，循环的过程中分别收集双色荧光探针荧光增值和相对应的循环次数，记录下来；

f、利用系列阳性和阴性样品，经过步骤e中的样品处理和PCR反应，将定量用探针的荧光增值结合样品的初始模板量的自然对数值做图，并制成标准曲线；

g、用上述步骤e中获得的样品的步骤a中探针的荧光增值，在标准曲线上查到样品的初始模板拷贝数；

h、上述步骤e中获得的各个样品的步骤a中探针的循环次数的Ct值与步骤b中获得的样品的步骤d中探针的循环次数的Ct值的差值，即ΔCt值，将此ΔCt值分别与野生标准品的ΔCt_w值及突变标准品的ΔCt_M值比较，可以判断样品的该单核苷酸位点是否突变。

在本发明的方法中，靶基因的特异性核酸序列是指仅存在于该靶基因中的核酸序列，该核酸序列的存在与所述靶基因的存在之间是具有一一对应的关系。

本发明方法的PCR反应体系与常规PCR反应体系类似，包括高温聚合酶，核酸提取试剂，荧光PCR反应液，阳性模板系列，阴性模板和覆盖剂等。参见Bevan等的上述文献。

高温聚合酶是指具有3’--5’DNA聚合酶活性、5’--3’DNA外切核酸活性和可耐高温的聚合酶。所述的高温聚合酶最好是95度半衰期＞45分钟的高温聚合酶.

荧光PCR反应液是含dNTPs，缓冲体系，PCR扩增引物和荧光探针的体系。

所述的PCR扩增引物是经过设计，特异性针对某一种待测核酸序列的特异序列的引物，长度15～40碱基(bases)，最好是18～25碱基(bases).

所述的荧光探针是标记了两个荧光基团的DNA探针，其中一个标记在探针的5’端，另一个荧光基团和它的相距在7bases或以上，两者可构成能量传递结构，即5’端荧光基团所发出的荧光可被另一荧光基团吸收或抑制.探针的3’端羟基(-OH)已被去除或封闭，不具有延伸能力；长度为15～50bases；最好是18～35bases.

所述的缓冲液体系是由pH＝5.0～10.0之间的稳定缓冲对，Mg离子和其它促进反应的离子组成，pH值最适选择是pH＝7.0～9.0。

阳性模板系列，是指予先经过数量标定的阳性质控标准品。阳性模板的最好是含有已知数量目的基因的临床标本；阳性模板的另一选择是经过提取、纯化，预先测定好数量的核酸标本；阳性模板的再一选择是经过基因工程克隆、纯化和定量的目的基因。

阴性模板是指阴性质控标准品。阴性模板的较好选择是经过确证为阴性的临床标本；阴性模板的另一选择是经过提取、纯化，并经确证为阴性的核酸标本；阴性模板的再一选择是纯净H2O。

在反应体系上最好用覆盖剂覆盖，覆盖剂是指用语覆盖于反应体系液面，防止蒸发，与水不相溶的油性覆盖剂。较好选择是固体或液体石蜡。

本发明中，PCR最好是二步法PCR，包括变性和退火/延伸两步。变性的温度是85℃～99℃，时间10秒～300秒；退火/延伸的温度37℃～75℃，时间是10秒～600秒，循环次数是15～60次，最好的变性温度是89℃～95℃，时间是20秒～120秒；退火延伸的温度是50℃～70℃，时间30秒～200秒，循环次数30～50次。

本发明中，荧光激光光是采用双色光，波长为300～700nm，检测波长为350～800nm。荧光激光光较好的波长是450～600nm，检测波长为480～650nm。

本发明中，可定量的核酸起始拷贝数范围为1～1011拷贝/ml，可定量的核酸起始拷贝数较好的范围是103～109拷贝/ml。

本发明还提供了一种用于荧光定量PCR方法的试剂盒，它包括DNA聚合酶，荧光PCR反应液，阳性模板，阴性模板，以及根据待测核酸的特异性序列设计的PCR引物和荧光引物，其中该荧光PCR反应液中镁离子的浓度为15～20mM，Tag酶用量为8～10单位/反应。

本发明的试剂盒的另一使用方法，是用核酸提取试剂从临床标本中提取核酸(如果是RNA标本，须经过逆转录，转成cDNA)，加入一管荧光PCR反应液中，再加入高温聚合酶，覆盖剂等，经离心混合后，放入PCR荧光检测-电脑分析-体化仪器，开始PCR过程并进行实时荧光检测，测定信号达到检测设定阈值时的循环参数Ct值；同时用系列阳性和阴性模板Ct测值为纵坐标，阳性模板的初始核酸量的自然对数值为横坐标，制成标准曲线，机可从标准曲线上查得样品的起始拷贝数。

本试剂盒是针对临床疾病进行的特异性设计，是根据已知的疾病特异性基因系列，经过基因库检索、分析和设计，选择了特异、高效的目的

将需要检测的突变位点放在一条普通引物的3’末端，该引物可以是前引物，也可以是后引物。这样的设计可以使该引物3’末端的碱基能与被检测的突变位点互补或不互补，引物的数目与SNP位点的基因型种类相同，如该位点有A、G、T和C四种基因型，需要设计四条引物与之相匹配，已达到区分四种基因型的目的。同时设计引物的3’次末端与模板上相对应的碱基不匹配(见附图1)。图中模板上SNP位点为C/G，设计两条引物，3’末端分别是C(与模板上的G匹配)和G(与模板上的C匹配)。附图1中模板3’次末端为A，引物3’末端的倒数第二个碱基可以设计成与之错配的碱基，可以是A，G、C中的任何一个，图中设计成了A。在突变引物的3’末端和次末端的碱基跟野生型等位基因都不匹配时，在DNA聚合酶的作用下引物的延伸就比正常的慢很多或者不能进行。而突变引物跟突变型模板结合时，即使在3’次末端有一个错配，在DNA聚合酶的作用下的扩增引物的延伸能以正常速度或低于正常速度进行，能够达到区分突变性和野生型的要求。

实施例-乙型肝炎病毒(HBV)实时检测1896突变的荧光定量PCR方法及其试剂盒

引物设计：设计一条长度在16～25个碱基的序列，将与突变位点相对应的碱基固定在其3’末端，引物的3’次末端，控制该序列的Tm值(一个完整的双链DNA序列裂解一半时所需的温度)达到PCR要求，再应用相关引物设计软件选择另一条引物和探针，可以在双链模板上设计正反两套引物。另一条引物和探针设计相关的要求与一般荧光PCR相同，引物和探针设计软件为如Premier primer 5.0、OLIGO 6.0、Primer Express3.0和DNAStar等。实验结果证明，实施该方案可很好地进行SNP检测，同时可以避免样品检测中假阳性，获得结果最为稳定。

一、乙型肝炎病毒(HBV)实时检测1896突变的荧光定量PCR试剂盒

1、乙型肝炎病毒定量引物和探针位于乙型肝炎病毒保守区域，并且为特异性序列，可以与其他物种区别开。分型引物和探针位于1896突变位点附近，也为特异性引物。荧光探针位于两条引物中间。

定量引物为：

引物1：5’agccaactcaaacaatccagatt 3’23bp

引物2：5’gctcccgctcctacctgat 3’19bp

定量探针为：

5’caaccccaacaaggatcactggcc 3’24bp

分型引物为：

引物1：5’ccctctgcctaatcatctcatgt3’23bp

引物2：5’acgggtcaatgtccatgcctg3’21bp

分型探针为：

5’tcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtg 3’36bp

体系优化：

样品：               2uL

10×buffer：         5uL

Mg²⁺：               1.5-4.5mM

BSA：                0.1-1.5mg/mL

dATP/dCTP/dGTP/dUTP：各0.1-0.3mM

引物：               各0.1-0.4uM

探针：                 0.05-0.15uM

Taq酶：                0.25uL

最后加PCR用水至总体积为50uL.

二、使用乙型肝炎病毒(HBV)实时检测1896突变的荧光定量PCR试剂盒进行检测

1、模板：

按医院临床抽取血样的要求抽取受检者静脉血1毫升，注入无菌1.5毫升Eppendoff管，于室温静置2小时，转入4℃静置1小时，8000rpm离心10分钟，吸取200ul血清(勿带入红细胞)转入另一只无菌Eppendoff管，此血样即为血清标本。然后各取50uL血清标本与浓缩液(核酸浓缩试剂盒)，充分混匀后离心，13000rm/min，5min。离心后弃上清，再加入25uL提取液，充分混匀后瞬间离心，100℃煮沸10min，再次高速离心，13000rm/min，5min。取上清作为模板。

2、DNA聚合酶：

使用带有5’-3’外切酶活性的DNA热启动聚合酶或者使用带有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。

3、体系优化：

样品：                 2uL

10×buffer：           5uL

Mg²⁺：                 1.5-4.5mM

BSA：                  0.1-1.5mg/mL

dATP/dCTP/dGTP/dUTP：  各0.1-0.3mM

引物：                 各0.1-0.4uM

探针：                 0.05-0.15uM

Taq酶：                0.25uL/well，

最后加PCR用水至总体积为50uL.

4、扩增条件：

使用ABI 7300扩增仪进行扩增，反应条件按一般的荧光PCR反应条件进行。例如95℃，10min；(95℃，30sec；55℃，30sec)35循环。

5、实时检测结果：

扩增仪在引物延伸阶段实时收集荧光信号，然后根据扩增曲线分析结果。定量结果可以在标准曲线上找到未知样品的初始模板量。突变位点的判定可以根据标准野生样品的ΔCt_w值和突变标准品的ΔCt_M值判断，我们设定的ΔCt_M值为5，ΔCt_w值为7。当未知样品的ΔCt值小于5时，判断样品为突变型样品，如附图4中样品检测的结果；当未知样品的ΔCt值大于7时，判断样品为野生型样品，如附图3中样品检测的结果；当未知样品的ΔCt值大于5且小于7时，判断样品为野生突变混合型样品。

Claims (20)

1、一种实时检测单核苷酸多态性的荧光定量PCR方法及其试剂盒，包含以下步骤：

a、根据待检测靶基因的特异性的序列合成一套引物探针组合，该组合包含一对正常引物和一条探针，其中探针以该对引物之间的靶序列设计而成；

b、根据待检测单核苷酸位点附近特异性序列合成的一条人工分型引物，该分型引物3’末端包含检测位点；

c、根据待检单核苷酸位点附近特异性序列合成另一条对应的单核苷酸多态性PCR检测引物，所述的引物与步骤b中包含待检测单核苷酸位点的人工分型引物为一对引物；

d、根据步骤b、c中两条引物中间的特异性靶序列合成一条特异性的探针，该探针荧光标记基团与步骤a中荧光标记基团具有不同波长；

e、使用步骤a中的引物探针组合、步骤b中的引物、步骤c中的引物和步骤d中的探针及其他PCR反应成份组成双重荧光PCR反应体系，其中体系中镁离子浓度为2～10mM，Taq酶用量为5～10单位/反应，UNG酶用量为1～2单位/反应；

f、从待检测物中提取DNA，或者提取RNA然后反转录成cDNA，加入到e中的反应体系中去，混匀离心后放置到双色或双色以上荧光PCR仪上，准备反应；

g、步骤f中的反应体系按荧光PCR反应条件经过30～50个循环结束，每个循环的延伸过程中荧光扫描设备会收集反应过程中步骤a中合成探针以及步骤d中合成探针的荧光增值和相对应的循环次数，并记录下来；

h、同时用系列阳性和阴性样品，经过步骤f中的样品处理和PCR反应，根据步骤g中得到的标准品的步骤a中探针的荧光增值，将该荧光增值结合样品的初始模板量的自然对数值做图，并制成标准曲线；

i、用上述步骤g中获得的各个样品的步骤a中合成探针的荧光增值，可以在标准曲线上查到各样品的初始模板拷贝数；

j、上述步骤g中获得的各个样品的步骤a中合成探针的循环次数的Ct值与步骤g中获得的各个样品的步骤d中合成探针的循环次数的Ct值的差值，即ΔCt值，将此ΔCt值分别与野生标准品的ΔCt_w值及突变标准品的ΔCt_M值比较，可以判断样品的该单核苷酸位点是否突变甚至突变基因占在总检测样品中的比例。

2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中的两个引物之间相距50～500个碱基，步骤b中和步骤c中的两个引物之间相距50～500个碱基。

3、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤g中所述的PCR反应进行30～50个循环。

4、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物、步骤b中所述的引物和步骤c中所述的引物长度是15～28个碱基。

5、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的探针、步骤d中所述的探针长度是13～38个碱基。

6、按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述的人工分型引物的设计方法为：

模板为：

1   ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat

51  attttcctgc tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact

101 actgcctcac ccatatcgtc aatcttctcg aggactgggg accctgcacc

151 gaacatggag agcacaacat caggattcct aggacccctg ctcgtgttac

201 aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc acagagtcta

251 gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc3’

正常的引物：5′aggactggggaccctgcaccg 3′21bp

人工分型引物设计方法为：将正常的引物3’端两个碱基用下面的任何两个碱基组合替换，这些碱基组合有：CC、GC、AC、TC、CG、GG、AG、TG、CA、GA、AA、TA、CT、GT、AT和TT，3’末端两个碱基可以用以上两个碱基组合中除与正常引物末端两个碱基相同的组合，此序列中引物3’端两个碱基可以用除了GC外其它15个组合中的任意一个，例如：

aggactggggaccctgcaccc和 aggactgggg accctgcactg。

7、按照权利要求6所述的方法，其特征在于，这种人工分型引物的设计可以是反向的：

模板为：

1  ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat

51  attttcctgc tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact

101 actgcctcac ccatatcgtc aatcttctcg aggactgggg accctgcacc

151 gaacatggag agcacaacat caggattcct aggacccctg ctcgtgttac

201 aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc acagagtcta

251 gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc3’

正常的引物：5’cctgatgttgtgctctccatgttc 3’24 bp

人工分型引物设计是将正常的引物3’端两个碱基用下面的任何两个碱基组合替换，这些碱基组合有：CC、GC、AC、TC、CG、GG、AG、TG、CA、GA、AA、TA、CT、GT、AT和TT，人工分型引物3’末端的两个碱基除与正常引物末端两个碱基相同的组合除外可以用以上两个碱基组合中任意一个，例如本例中引物3’端可以用除了CG其它15个组合中的任意一个，例如：

cctgatgttgtgctctccatgtac和cctgatgttgtgctctccatgtgc。

8、一种用于检测单核苷酸多态性的实时荧光PCR试剂盒，它包括DNA聚合酶，荧光PCR反应液，阳性模板，阴性模板，以及根据待测模板的特异性核酸序列设计的一套普通荧光定量PCR引物探针组和一套特殊的用于单核苷酸多态性PCR分型引物探针组，其特征在于，该荧光PCR反应液中镁离子终浓度为2～10mM，Taq酶Taq酶用量为5～10单位/反应，UNG酶用量为1～2单位/反应。

9、按权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的待检测核酸为乙肝病毒DNA，所述的用于普通荧光定量PCR检测的特异性核酸序列为：

1    tgcccggcaa cggtcaggtc tctgccaagt gtttgctgac gcaaccccca

51   cgggttgggg cttggccata ggccatcggc gcatgcgtgg aacctttgtg

101  gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagcagctt gttttgctcg

151  cagccggtct ggagcgaaac ttatcggaac cgacaactca gttgtcctct

201  ctcggaaata cacctccttt ccatggctg

用于单核苷酸多态性PCR检测的特异性核酸序列为：

1   ccaggtcttg cccaaggtct tacacaagag gactcttgga ctctcagcaa

51  tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaagac

101 tgggaggagt tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg

151 ctgtaggcat aaattggtct gttcaccagc accatgcaac tttttcccct

201 ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac tgttcaagcc tccaagctgt

251 gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa agaatttgga

301 gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat

351 tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt

401 ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg

451 tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga

501 agacccagca tccagggaat tagtagtcag

10、按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于普通荧光定量PCR检测的引物序列为：

引物1：5’ggcgcatgcgtggaa 3’15 bp

引物2：5’gcgagcaaaacaagctgcta 3’20 bp

所述的用于单核苷酸多态性PCR检测的引物序列为：

引物1：5’ccctctgcctaatcatctcatgt3’23 bp

引物2：5’acgggtcaatgtccatgccXX3’21 bp

其中XX可以是GC、AC、TC、CG、GG、AG、TG、CA、GA、AA、TA、CT、GT、AT和TT碱基组合中任意一个。

11、按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于普通荧光定量PCR检测的探针序列为：

5’ctcctctgccgatccatactgcgg 3’24 bp

用于单核苷酸多态性PCR检测的的探针序列为：

5’tcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgg，g 3’3 6 bp

12、按权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的待检测核酸为乙肝病毒DNA，所述的用于普通荧光定量PCR检测的特异性核酸序列为：

1    tgcccggcaa cggtcaggtc tctgccaagt gtttgctgac gcaaccccca

51   cgggttgggg cttggccata ggccatcggc gcatgcgtgg aacctttgtg

101  gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagcagctt gttttgctcg

151  cagccggtct ggagcgaaac ttatcggaac cgacaactca gttgtcctct

201  ctcggaaata cacctccttt ccatggctg

用于单核苷酸多态性PCR检测的特异性核酸序列为：

1   ctgactacta attccctgga tgctgggtct tccaaattac ttcccaccca

51  ggtggccaga ttcatcaact caccccaaca cagaatagct tgcctgagtg

101 ctgtatggtg aggtgaacaa tgttccggag actctaaggc ctcccgatac

151 agagcagagg cggtgtcgag gagatctcga atagaaggaa agaagtcaga

201 aggcaaaaaa gagagtaact ccacagaagc tccaaattct ttatacgggt

251 caatgtccat gccccaaagc cacccaaggc acagcttgga ggcttgaaca

301 gtaggacatg aacatgagat gattaggcag aggggaaaaa gttgcatggt

351 gctggtgaac agaccaattt atgcctacag cctcctagta caaagacctt

401 taacctaatc tcctccccca actcctccca gtctttaaac aaacagtctt

451 tgaagtatgc ctcaaggtcg gtcgttgaca ttgctgagag tccaagagtc

501 ctcttgtgta agaccttggg caagacctgg

13、按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于普通荧光定量PCR检测的引物序列为：

引物1：5’ggcgcatgcgtggaa 3’15bp

引物2：5’gcgagcaaaacaagctgcta 3’20bp

所述的用于单核苷酸多态性PCR检测的引物序列为：

引物1：5’aaggcaaaaaagagagtaactccac 3’25bp

引物2：5’gctgtgccttgggtggcttXX3’21bp

其中XX可以是GC、CC、AC、TC、CG、GG、AG、CA、GA、AA、TA、CT、GT、AT和TT碱基组合中任意一个。

14、按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于普通荧光定量PCR检测的探针序列为：

5’ctcctctgccgatccatactgcgg 3’24bp

用于单核苷酸多态性PCR检测的的探针序列为：

5’gctccaaattctttatacgggtcaatgtcc 3’30bp

15、按权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的待检测核酸为乙肝病毒DNA，所述的用于普通荧光定量PCR检测的特异性核酸序列为：

1    tgcccggcaa cggtcaggtc tctgccaagt gtttgctgac gcaaccccca

51   cgggttgggg cttggccata ggccatcggc gcatgcgtgg aacctttgtg

101  gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagcagctt gttttgctcg

151  cagccggtct ggagcgaaac ttatcggaac cgacaactca gttgtcctct

201  ctcggaaata cacctccttt ccatggctg

用于单核苷酸多态性PCR检测的特异性核酸序列为：

1   ccaggtcttg cccaaggtct tacacaagag gactcttgga ctctcagcaa

51  tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaagac

101 tgggaggagt tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg

151 ctgtaggcat aaattggtct gttcaccagc accatgcaac tttttcccct

201 ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac tgttcaagcc tccaagctgt

251 gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa agaatttgga

301 gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat

351 tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt

401 ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg

451 tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga

501 agacccagca tccagggaat tagtagtcag

16、按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于普通荧光定量PCR检测的引物序列为：

引物1：5’gagccaactcaaacaatccagatt 3’24bp

引物2：5’tcccgctcctacctgatttgc 3’21bp

所述的用于单核苷酸多态性PCR检测的引物序列为：

引物1：5’ccctctgcctaatcatctcatgt3’23bp

引物2：5’acgggtcaatgtccatgccXX 3’21bp

其中XX可以是GC、AC、TC、CG、GG、AG、TG、CA、GA、AA、TA、CT、GT、AT和TT碱基组合中任意一个。

17、按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于普通荧光定量PCR检测的探针序列为：

5’acttcaaccccaacaaggatcactggc 3’27bp

用于单核苷酸多态性PCR检测的的探针序列为：

5’tcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtg 3’3 6bp

18、按权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的待检测核酸为乙肝病毒DNA，所述的用于普通荧光定量PCR检测的特异性核酸序列为：

1   tcgacaaggc atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct

51  ttcccgatca ccagttggac cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca

101 gattgggact tcaaccccaa caaggatcac tggccagagg caaatcaggt

151 aggagcggga gcatttggtc cagggttcac cccaccacac ggaggccttt

201 tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacaacact

用于单核苷酸多态性PCR检测的特异性核酸序列为：

1  ccaggtcttg cccaaggtct tacacaagag gactcttgga ctctcagcaa

51 tgtcaacgac cgaccttgag gcatacttca aagactgttt gtttaaagac

101 tgggaggagt tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg

151 ctgtaggcat aaattggtct gttcaccagc accatgcaac tttttcccct

201 ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac tgttcaagcc tccaagctgt

251 gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccgtataa agaatttgga

301 gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgacttct ttccttctat

351 tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag gccttagagt

401 ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg

451 tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga

501 agacccagca tccagggaat tagtagtcag

19、按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于普通荧光定量PCR检测的引物序列为：

引物1：5’gagccaactcaaacaatccagatt 3’24bp

引物2：5’tcccgctcctacctgatttgc 3’21bp

所述的用于单核苷酸多态性PCR检测的引物序列为：

引物1：5’aaggcaaaaaagagagtaactccac 3’25bp

引物2：5’gctgtgccttgggtggcttXX3’21bp

其中XX可以是GC、CC、AC、TC、CG、GG、AG、CA、GA、AA、TA、CT、GT、AT和TT碱基组合中任意一个。

20、按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于普通荧光定量PCR检测的探针序列为：

5’acttcaaccccaacaaggatcactggc 3’25bp

用于单核苷酸多态性PCR检测的的探针序列为：

5’tcctactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtg 3’3 6bp

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