CN104988149A

CN104988149A - 人类cyp2c19基因多态性检测特异性引物和试剂盒

Info

Publication number: CN104988149A
Application number: CN201510428682.0A
Authority: CN
Inventors: 周鹏飞; 蔡从利; 张喆; 王雯静; 薛伟沧; 李丽琼
Original assignee: WUHAN YZY BIOPHARMA CO Ltd
Current assignee: WUHAN YZY BIOPHARMA CO Ltd
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2015-07-20
Publication date: 2015-10-21

Abstract

本发明适用于生物技术以及医学领域，提供了用于人类CYP2C19基因多态性检测特异性引物，所述引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1-9所示。本发明还提供了用于人类CYP2C19基因多态性检测的试剂盒。本发明所提供的引物和试剂盒用于检测人类CYP2C19基因多态性具有特异性强、敏感度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。

Description

人类CYP2C19基因多态性检测特异性引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种人类CYP2C19基因多态性检测特异性引物和试剂盒。

背景技术

CYP2C19是CYP450家族中最重要的药物代谢酶之一,许多内源性底物、以及临床上大约2％的药物都由其催化代谢。研究发现CYP2C19可影响到氯吡格雷、奥美拉唑、地西泮、苯妥英钠等许多重要临床应用药物的代谢,而其基因多态性是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一。2010年美国FDA要求氯吡格雷药物标签上注明CYP2C19与疗效的关系，并建议使用前检测CYP2C19基因型。

CYP2C19基因野生型为CYP2C19*1/*1型，CYP2C19*2型、CYP2C19*3型和CYP2C19*17是中国人群中较常见的等位基因型，其中CYP2C19*2型和CYP2C19*3型可引起CYP2C19基因编码的酶活性丧失，代谢底物的能力减弱，使血药浓度增高，从而引起与血药浓度相关的药物不良反应，携带者称为弱代谢者，中国人群中的弱代谢者99％为*2和*3型等位基因。CYP2C19*17型可引起CYP2C19基因编码的酶活性增强，代谢底物的能力增强，携带者称为快代谢。对于药物代谢慢的人群，长期按正常剂量服用，就会出现严重毒副作用：主要是肝损害、造血系统损害、中枢神经系统损害等，严重时可导致死亡。因此CYP2C19基因多态性在氯吡格雷的治疗中也起着重要的作用，CYP2C19基因多态性如表1所示。

表1

基因	基因多态性	碱基
			CYP2C19	CYP2C19*2	G＞A
CYP2C19	CYP2C19*3	G＞A
			CYP2C19	CYP2C19*17	C＞T

目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本的CYP2C19基因多态性的方法。

发明内容

本发明实施例的目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种人类CYP2C19基因多态性的检测引物和试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果不理想的问题。

本发明提供了一种人类CYP2C19基因多态性检测特异性引物，其中，所述引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1-9所示。

本发明还提供了一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其中，所述试剂盒含有本发明所提供的特异性引物。

所述试剂盒还包括2组特异性探针序列，其中第1组特异性探针序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11所示；第2组特异性探针序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13所示；第3组特异性探针序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14与SEQID NO:15所示，且所述荧光定量PCR探针的5’端有FAM或VIC修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。

本发明人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒采用Taqman探针法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法，本发明CYP2C19基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的模板与SNP探针特异性检测目的模板方法，对特异性检测同一基因两种多态性提供双重保证，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点：1.可以准确检测单个样品的基因型；2.可以准确检测1ng基因组DNA的基因型；3.针对CYP2C19的基因型设计ARMS引物和SNP分型探针，可以特异性扩增识别对应的多态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5..在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测结果判读方法简单客观，便于分析。

附图说明

图1为CYP2C19*2G/G纯合野生样本30例，其中一个检测结果；

图2为CYP2C19*2A/A纯合突变样本5例，其中一个检测结果；

图3为CYP2C19*2G/A杂合突变样本15例，其中一个检测结果；

图4为CYP2C19*3G/G纯合野生样本28例，其中一个检测结果；

图5为CYP2C19*3A/A纯合突变样本6例，其中一个检测结果；

图6为CYP2C19*3G/A杂合突变样本16例，其中一个检测结果；

图7为CYP2C19*17C/C纯合野生样本36例，其中一个检测结果；

图8为CYP2C19*17T/T纯合突变样本1例，其中一个检测结果；

图9为CYP2C19*17C/T杂合突变样本3例，其中一个检测结果。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅仅用以解释本发明，并不限定本发明。

本发明的一个方面提供了一种人类CYP2C19基因多态性检测特异性引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-9所示。

本发明还提供了一种用于人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其中，所述试剂盒含有本发明所提供的特异性引物，该试剂盒还包括PCR缓冲液，特异性探针和内标系统，HotStart Taq酶，UNG酶。

在本发明的一种实施方式中，所述PCR缓冲液中含有1.0～5.0mM的MgCl₂，1.0～5.0mM的dNTPs，即dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0～5.0mM。

所述3组特异性引物序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2与SEQID NO:3；SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6；SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:9；其中SEQ ID NO:1与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8为普通PCR引物，分别扩增包含CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17基因多态性的DNA片段；其中SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:6与SEQ ID NO:9为ARMS引物，用于分别特异性扩增含有CYP2C19*2密码子CCG的DNA片段、CYP2C19*3密码子TGG与CYP2C19*17C变成T的DNA片段。3条ARMS引物分别在3’模板碱基与待扩增类型的碱基配对。

各引物序列列举如下：

在本发明所提供的试剂盒中，可选的，所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有非荧光淬灭基团NFQ(Non-FluorescentQuencher)，该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。

优选地，所述2组特异性探针序列分别为SEQ ID NO:10与SEQID NO:11；SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14与SEQID NO:15且其中SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11探针分别特异性检测CYP2C19*2G、CYP2C19*2A模板DNA；SEQ ID NO:12与SEQ IDNO:13探针分别特异性检测CYP2C19*3G、CYP2C19*3A模板DNA；SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15探针分别特异性检测CYP2C19*17C、CYP2C19*17T模板DNA；

各探针序列列举如下：

在本发明的具体实施方式中，由于待检测的样品中的某些成分可能导致PCR出现部分或完全抑制，故使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异；另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明实施例中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物和内标探针，本发明实施例中也可采用本领域技术人员熟知的其它内标系统。

优选地，所述内标系统包含内标引物、内标探针和内标模板。序列为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17,所述内标探针序列为SEQID NO:18，所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。

优选地，本发明实施例中的内标系统针对人类基因组序列设计，其中包含的内标引物序列和内标探针如下所示：

本发明实施例中的内标探针5′端标记有报告基团，为ROX，3′端标记有不发光荧光淬灭基团，如BHQ2等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。

优选地，本发明实施例中的酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需，且该酶溶液还含有UNG酶，其中UNG(uracil-N-glycosylase)酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性PCR扩增和污染。

优选地，本发明实施例中的检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液中含有本发明中涉及的CYP2C19*2两种多态性CYP2C19*2G，CYP2C19*A，CYP2C19*3两种多态性CYP2C19*3G，CYP2C19*3A,CYP2C19*17两种多态CYP2C19*17C,CYP2C19*17T，6种质粒DNA混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这6种质粒浓度相同，均为2500拷贝/μl；所述空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

本发明实施例的另一目的在于提供一种人类CYP2C19基因多态性的检测方法，该检测方法包括以下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)利用特异性引物、特异性探针和内标系统进行荧光定量PCR反应。

优选地，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：

上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

具体地，在上述25μl反应体系中，所述各条引物包括所述特异性引物和内标引物，所述各条探针包括所述特异性探针和内标探针，所述样品为基因组DNA。

具体地，所述荧光定量PCR反应的程序为：37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，60℃1分钟。

在上述PCR反应后，所得结果按表2进行结果判定：

表2.结果判定

本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在100分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。

以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。

实施例1

制备本发明的人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括以下步骤：

1.引物及探针合成：

设计并合成3组特异性引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2与SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:9；3组特异性探针SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15，并在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:14的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团，在SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μM的母液储存。

2.制备内标系统：设计并合成针对人类基因组DNA的1对内标引物，该引物序列为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；设计并合成内标探针，该探针为SEQ ID NO:18。将该内标引物分别配制成100μM的母液储存，内标探针配制成100μM的母液储存，内标模板配置为2×10⁴copies/μl的母液储存。

3.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有1.0mM的MgCl₂，dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0mM；制备酶混合液，其中含有Taq酶0.5×10³U/ml，UNG酶0.1×10³U/ml。

4.制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有6种质粒DNA，这些质粒DNA中分别含有本发明试剂盒涉及的CYP2C19*2G、CYP2C19*2A、CYP2C19*3G、CYP2C19*3A、CYP2C19*17C、CYP2C19*17T基因6种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500copies/μl；该空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

5.PCR反应液配制：按照下表3-5进行三个不同体系PCR反应液配制。

表3

表4

表5

6.组装试剂盒：试剂盒中包含3管分别检测CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的基因多态性检测PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。

实施例2

用实施例1制备的人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒对待测样品进行检测。

本实施例中收集40例心血管患者的抗凝全血样样品，从其中提取基因组DNA，用实施例1中得到的人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒检测待检样品的CYP2C19的基因多态性情况。

1.血液样品基因组DNA提取

取全血300μl，加入900μl的细胞裂解液CL，颠倒混匀，静置5min，10,000rpm(11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入20μlProteinase K溶液，混匀。加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作步骤7。12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl，分别取2μl加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反应。

2.样本的荧光定量PCR检测

将步骤1中稀释后的DNA样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的CYP2C19*2检测反应体系、CYP2C19*3检测反应体系和CYP2C19*17检测反应体系中，使两种反应体系总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：

95℃5min；

95℃15s，62℃60s，40个循环；每个循环后收集FAM、VIC和ROX的荧光信号。

3.样本的检测结果分析:40例样品的检测结果如下：

CYP2C19*2G/G纯合野生样本30例，其中一个检测结果如图1所示；CYP2C19*2A/A纯合突变样本5例，其中一个检测结果如图2所示；CYP2C19*2G/A杂合突变样本15例，其中一个检测结果如图3所示；CYP2C19*3G/G纯合野生样本28例，其中一个检测结果如图4所示；CYP2C19*3A/A纯合突变样本6例，其中一个检测结果如图5所示；CYP2C19*3G/A杂合突变样本16例，其中一个检测结果如图6所示；CYP2C19*17C/C纯合野生样本36例，其中一个检测结果如图7所示；

CYP2C19*17T/T纯合突变样本1例，其中一个检测结果如图8所示；CYP2C19*17C/T杂合突变样本3例，其中一个检测结果如图9所示；

上述40例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类CYP2C19基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种人类CYP2C19基因多态性检测特异性引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-9所示。

2.一种人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异性引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括3组特异性探针序列，其中第1组特异性探针序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11所示；第2组特异性探针序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13所示；第3组特异性探针序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15所示，且所述荧光定量PCR探针的5’端有FAM或VIC修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标系统，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，所述内标探针序列如SEQ ID NO.18所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内标探针的5’端有ROX修饰，3’端有BHQ2修饰。

6.根据权利要求2-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液中含有6种质粒DNA，所述6种质粒DNA分别含有2种不同的CYP2C19*2等位基因、2种不同的CYP2C19*3等位基因和2种不同的CYP2C19*17等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq酶和UNG酶。

8.利用权利要求1所述的特异性引物或权利要求2-7中任意一项所述的试剂盒检测人类CYP2C19基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获得待测样品基因组DNA；

（2）利用特异性引物、特异性探针和内标系统进行荧光定量PCR反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的体系为：

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的程序为：37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，60℃1分钟。