CN112921082A - 用于检测cyp2c19*2基因多态性的特异性探针及试剂盒 - Google Patents

用于检测cyp2c19*2基因多态性的特异性探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用于检测CYP2C19*2基因多态性的特异性探针以及具有该探针的检测试剂盒，其中CYP2C19*2位点的特异性探针至少包括：CYP2C19*2野生型探针以及CYP2C19*2突变型探针，所述CYP2C19*2野生型探针具有如下式(1)所示：5'‑(R1)‑TTTCCCGGGAACCCX‑(Q)‑3'，其中，式中X代表具有2‑4个碱基的序列，R1表示荧光报告基团，Q表示非荧光猝灭基团，SNP位点G位于探针5'端起的第7位碱基上。本发明通过将CYP2C19*2野生型探针中的碱基序列向3'端延伸一定长度的碱基序列，即使得SNP位点相对偏向5'端，极大提升了CYP2C19*2野生型探针的热稳定性，进一步确保了试剂盒使用过程中的准确性和实用性。

Description

用于检测CYP2C19*2基因多态性的特异性探针及试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断领域，具体而言，本发明涉及用于检测CYP2C19基因多态性的试剂盒。
背景技术
CYP2C19是CYP450家族中重要的药物代谢酶之一,其可影响到氯吡格雷、奥美拉唑、地西泮、苯妥英钠等许多重要临床应用药物的代谢,其基因多态性是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的原因之一。CYP2C19*2型、CYP2C19*3型和CYP2C19*17是中国人群中较常见的等位基因型，其中CYP2C19*2型和CYP2C19*3型可引起CYP2C19基因编码的酶活性丧失，携带者称为弱代谢者，中国人群中的弱代谢者99％为*2和*3型等位基因。
目前临床上检测CYP2C19基因的多态性的方法主要有：Sanger测序法、芯片杂交法、荧光PCR法。其中，测序法虽然结果准确性高，但操作程序复杂，耗时长，对检测人员的操作规范度要求较高；芯片杂交法在操作过程中需要进行开盖后杂交操作，检测时间较长，且容易产生污染，同时检测灵敏度不高；现有荧光PCR法中的SNP探针分型法，可以实现1个反应检测1个位点的多态性，检测结果准确，灵敏度高，操作简单，通量较高。
现有技术CN104988149A公开了基于MGB探针SNP分型检测的CYP2C19检测方法，该方法将单个位点的引物、探针、buffer与酶等成分混合为1管，可以实现在1管中检测1个位点的基因多态性，检测过程操作简单，结果准确。但是该检测试剂盒在使用过程中存在稳定性较差的问题，通过实验测试得到如图1所示结果，CYP2C19*2位点在37℃24小时内，荧光信号值大幅降低，24小时后荧光信号值接近0。众所周知，在进行体外检测过程中，受环境温度、检测条件限制、操作人员熟练度等因素的影响，探针的稳定性程度直接影响着试剂盒检测准确性和实用性，而现有技术中由于CYP2C19*2位点稳定性无法满足上述要求，进而导致操作使用试剂盒的条件更为苛刻。
为了解决以上问题，我们进行了大量验证，建立了一种稳定性良好的CYP2C19检测试剂盒。
发明内容
基于现有技术存在的技术问题，本发明提供一种用于检测CYP2C19基因多态性的特异性探针，其中，CYP2C19*2位点的特异性探针至少包括：CYP2C19*2野生型探针以及CYP2C19*2突变型探针，
所述CYP2C19*2野生型探针具有如下式(1)所示：
5'-(R1)-TTTCCCGGGAACCCX-(Q)-3'(1)
其中，式(1)中X代表具有1-5个碱基的序列，R1表示荧光报告基团，Q表示非荧光猝灭基团(NFQ，Non-FluorescentQuencher)，SNP(单核苷酸多态性)位点G位于探针5'端起的第7位碱基上。
优选地，所述式(1)中X优选具有2-4个碱基，R1为FAM或VIC，Q为MGB。
优选地，所述式(1)所表示的CYP2C19*2野生型探针为
5'-(FAM)-TTTCCCGGGAACCCAT-(MGB)-3'。
优选地，所述式(1)中5'端起的第2-4位任意碱基位具有1或2个LNA修饰，如在5'端起的第3位碱基T上具有一个LNA修饰。
优选地，CYP2C19*2突变型探针为：5'-(R2)-ATTTCCCAGGAACCCAT-(Q)-3'(2)
其中，式(2)中R2为与式(1)中R1不同的荧光报告基团，Q为与式(1)中Q相同的非荧光猝灭基团。
本发明还保护一种用于检测CYP2C19基因多态性的检测试剂盒，其中，该试剂盒具有如上述方案中所述的CYP2C19*2位点的特异性探针。
优选地，所述试剂盒还包括热稳定性酶。
优选地，所述酶为NEB公司的Hot Start Taq DNA聚合酶，货号为M0495S。
优选地，所述检测试剂盒还包括：CYP2C19*2位点的特异性引物对，具体为：
CYP2C19*2上游引物：5'-CTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCA-3'，CYP2C19*2下游引物：5'-CCATTTTGATCAGGAAGCAATCA-3'，
CYP2C19*2ARMS引物：
5'-AGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCTT-3'。
所述检测试剂盒还包括：，内标引物对和内标探针，具体为：
内标正向引物：5'-GGGCCACTAGGCGCTCA-3'，
内标反向引物：5'-AGCCACCCGCGAACTCA-3'，
内标探针：5'-(ROX)-CTCTCCCTCCGCGCAGCCG-(BHQ2)-3'。
优选地，所述试剂盒包括：阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液中至少含有2种质粒DNA，所述2种质粒DNA分别为CYP2C19*2等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。
基于上述技术方案，本发明具有如下优点：
(1)本发明通过将CYP2C19*2野生型探针中的碱基序列向3'端延伸一定长度的碱基序列，即使得SNP位点相对偏向5'端，极大提升了CYP2C19*2野生型探针的热稳定性，进一步确保了试剂盒使用过程中的准确性和实用性。本发明所获得的具体技术效果在具体实施方式部分进行详述。
(2)发明人意外发现，当在探针5'端起的第2-4位任意一个碱基位上进行LNA修饰时，探针的稳定性得以有效改善，尤其是在37℃下0-8小时内体系荧光值能够维持在较高水平而没有明显降低。特别是在第3位碱基位上修饰LNA时，探针稳定性获得最佳。通过实验可知，LNA修饰位点、个数等的选择至关重要，发明人通过创造性的劳动筛选确定了探针的LNA修饰位点、数量等，并得到热稳定性最优的探针序列。
(3)此外，实验中发现，当采用特定的Taq酶时，可以进一步使得体系在37℃下8-24小时时间段内的热稳定性大幅提升，同时仍然能够确保体系具有良好的扩增性能，进而使得试剂盒的热稳定性在24小时内均能维持较高水平，从而进一步地降低了对检测时限、操作熟练度等的严苛要求，降低了整体检测难度。
附图说明
图1为现有技术中CYP2C19*2野生型探针热稳定性变化图；
图2为试验例1中CYP2C19*2野生型探针热稳定性变化图；
图3为试验例6中CYP2C19*2野生型探针热稳定性变化图；
图4为试验例10中CYP2C19*2野生型探针热稳定性变化图。
具体实施方式
结合附图和具体实施例对本发明的技术内容作详细说明。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
(一)技术问题的发现
在大量检测验证过程中发现CYP2C19*2野生型探针是导致试剂盒热稳定性较差的主要原因，举例说明，如图1所示，CYP2C19*2位点体系包含如下所示的2条普通外引物，1条ARMS引物，2条MGB探针：
CYP2C19*2正向引物：5'-CTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCA-3'，CYP2C19*2反向引物：5'-CCATTTTGATCAGGAAGCAATCA-3'，
CYP2C19*2ARMS引物：5'-AGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCTT-3'，
CYP2C19*2野生型探针：5'-(FAM)-TTTCCCGGGAACCC-(MGB)-3'，
CYP2C19*2突变型探针：5'-(VIC)-ATTTCCCAGGAACCCAT-(MGB)-3'，
内标正向引物：5'-GGGCCACTAGGCGCTCA-3'，
内标反向引物：5'-AGCCACCCGCGAACTCA-3'，
内标探针：5'-(ROX)-CTCTCCCTCCGCGCAGCCG-(BHQ2)-3'。
通过引物和PCR反应条件筛选，保证引物对F1和R1对模板进行扩增，CYP2C19*2野生型探针和CYP2C19*2突变型探针能够分别结合到野生、突变模板上，产生相应荧光，反应体系中均加入内标引物及探针。对上述CYP2C19*2检测体系进行稳定性验证，稳定性验证实验设计荧光定量检测条件为：向反应管中加入23μL PCR预混反应液和2μL待测样本DNA；PCR反应程序为：37℃反应10分钟，95℃反应5分钟预变性；40个循环：95℃反应5秒，62℃反应60秒，分别收集CYP2C19*2反应液检测野生型模板在37℃下0、4、8、24小时产生的FAM通道荧光信号值。结果如图1所示，可以看出，4小时时荧光值下降至1/2，8小时时下降至1/4，而在24小时时FAM通道整个信号几乎完全消失。
由于在进行体外检测过程中，受环境温度、检测条件限制、操作人员熟练度等因素的影响，探针的稳定性程度直接影响着试剂盒检测准确性和实用性，然而通过上述实验验证结果可以看出，现有的CYP2C19*2位点稳定性无法满足上述要求，进而导致操作使用试剂盒的条件更为苛刻。故需要对探针结构进行优化改进，具体地，由于CYP2C19*2野生型探针是导致体系稳定性降低的主要因素，故本发明主要针对CYP2C19*2野生型探针进行设计改进。
(二)特异性探针设计
由于现有CYP2C19*2野生型探针的稳定性较低，故需要对其进行重新设计，而众所周知，影响CYP2C19*2野生型探针热稳定性的因素较多，例如碱基序列长度、碱基类型、SNP位点位置、碱基修饰形态、荧光物类型等等，任何因素的变化均可能对探针的稳定性造成较大影响
发明人重新设计了CYP2C19*2野生型探针，通过大量试验发现，探针序列SNP位点相对位置以及探针具体碱基类型对稳定性的变化影响相对最大，出乎预料地发现当碱基序列中SNP位点位于靠近CYP2C19*2野生型探针的5’端时，探针的热稳定性大幅提升。
接下来结合如下试验例和对比例以对本发明中所保护的技术方案的技术效果进行详述。
试验例和对比例采用相同的扩增体系及扩增反应条件，具体如下：
(1)PCR预混反应液中包括探针引物体系(如表1所示)、PCR缓冲液、UNG酶(尿嘧啶DNA糖苷酶)、Taq酶，具体成分如下表2：
表1 CYP2C19*2野生型探针引物体系
Figure BDA0003001834900000071
PCR反应体系中核心试剂组成如下表2所示：
表2 PCR反应液试剂组成
Figure BDA0003001834900000072
(2)荧光定量检测：向反应管中加入步骤(1)中制备的PCR预混反应液，并进行PCR反应；PCR反应程序为：37℃下10分钟，95℃下5分钟预变性；40个循环：95℃下5秒，62℃下60秒，收集FAM和ROX通道的荧光。
在本测试过程中，表1中SEQ ID NO:10具体表示的CYP2C19*2野生型探针结构具体如表3所示。
表3各实施例CYP2C19*2野生型探针结构式
Figure BDA0003001834900000073
Figure BDA0003001834900000081
其中，①表格中下划线碱基为SNP位点；②在本次测试过程中荧光报告基团和非荧光猝灭基团分别采用FAM和MGB，而现有技术中其他常规类型的荧光报告基团和非荧光猝灭基团也能够适用于本发明，对测试结果不带来实质性影响，故将上述表格中探针序列中的荧光报告基团和非荧光猝灭基团替换为现有常规的荧光报告基团和非荧光猝灭基团均属于本发明的发明构思和保护范围内。
基于前述反应条件，在37℃条件下收集各实施例对应体系放置0、8、24小时的FAM和ROX通道荧光值，具体测试结果如表4所示：
表4各实施例CYP2C19*2野生型探针稳定性测试结果
Figure BDA0003001834900000082
通过上述表格可以看出，相对于对比例1-5而言，本发明优选的试验例1-5在放置前8个小时后，荧光值降低幅度大幅减小，8小时的荧光值均维持在4*105以上，且放置24小时后荧光值至少也能维持在2*105左右。可见，通过对探针序列进行优化设计后，发明人意外地发现，通过在现有CYP2C19*2野生型探针的基础上，在靠近3'端一侧设计具1-5个碱基时，能够极大地提升该探针的热稳定性，进一步地，发明人发现，如表4中试验例1-3当增加2-4个碱基时，CYP2C19*2野生型探针的稳定性明显优于其他，当0-8小时这一时间段内，荧光值降低趋势明显减缓，尤其是如试验例1对应的CYP2C19*2野生型探针结构，即在靠近3'端一侧设计具2个碱基时，提升热稳定性能的效果最为显著(示例性的，试验例1扩增曲线如图2所示)。由于0-8小时这一阶段在实际操作过程中也是操作者对体系荧光值稳定性要求相对较高的时间段，通过本发明的特定设计大大提升了这一阶段CYP2C19*2野生型探针的稳定性，提升了试剂盒整体的准确性，并且基于稳定性能的提升，从而降低了对检测时限、操作熟练度等的严苛要求，降低了整体检测难度。
进一步，发明人尝试通过对探针进行修饰的方式来提升探针的稳定性，表1中SEQID NO:10具体表示的CYP2C19*2野生型探针结构具体如表5所示。
表5各实施例CYP2C19*2野生型探针结构式
实施例 探针编码 CYP2C19*2野生型探针结构式
对比例6 SEQ ID NO:28 5'-(FAM)-TTTCCC+GGGAACCCAT-(MGB)-3'
对比例7 SEQ ID NO:29 5'-(FAM)-TTTCCCGGGAACC+CAT-(MGB)-3'
对比例8 SEQ ID NO:30 5'-(FAM)-TTTCCC+GGG+AACCCAT-(MGB)-3'
对比例9 SEQ ID NO:31 5'-(FAM)-+TT+TCCCGGG+AACC+CAT-(MGB)-3'
试验例6 SEQ ID NO:32 5'-(FAM)-TT+TCCCGGGAACCCAT-(MGB)-3'
试验例7 SEQ ID NO:33 5'-(FAM)-TTT+CCCGGGAACCCAT-(MGB)-3'
试验例8 SEQ ID NO:34 5'-(FAM)-T+TTCCCGGGAACCCAT-(MGB)-3'
试验例9 SEQ ID NO:35 5'-(FAM)-T+TT+CCCGGGAACCCAT-(MGB)-3'
其中，①表格中下划线碱基为SNP位点，+号后碱基为LNA修饰；②在本次测试过程中荧光报告基团和非荧光猝灭基团分别采用FAM和MGB，而现有技术中其他常规类型的荧光报告基团和非荧光猝灭基团也能够适用于本发明，对测试结果不带来实质性影响，故将上述表格中探针序列中的荧光报告基团和非荧光猝灭基团替换为现有常规的荧光报告基团和非荧光猝灭基团均属于本发明的发明构思和保护范围内。
基于前述扩增反应体系及反应条件，在37℃条件下收集各实施例对应体系放置0、8、24小时的FAM和ROX通道荧光值，具体测试结果如表6所示：
表6各实施例CYP2C19*2野生型探针稳定性测试结果
Figure BDA0003001834900000101
通过上表可以看出，通过LNA(锁核酸)修饰后的CYP2C19*2野生型探针的稳定性存在显著的变化。基于本领域的认知，LNA修饰具有提高序列的热稳定性和Tm值的能力，但是在研发中发现，将LNA修饰在本领域常规设计的SNP位点时(对应对比例6)，并未对提升探针稳定性带来任何有益作用，即并非增加锁核酸LNA修饰就一定导致探针热稳定性的提高；相反地，基于对比例6的测试结果可以看出，相对于试验例1中未修饰的探针，增加LNA修饰反而使得探针稳定性有所降低，尤其是在0-8小时时间段内，探针热稳定性降幅较大，这是本领域技术人员所不期望的，发明人通过大量试验发现探针热稳定性与LNA修饰位点和个数、SNP位点的位置、探针碱基序列长度等众多因素存在关联性，而由于各个因素间存在的关联对于本领域技术人员没有规律可循，故这些因素对探针热稳定性的影响是复杂且不可预期的。
通过上述表格可以看出，探针的稳定性和碱基修饰位置、碱基修饰个数没有明显的规律性可循，如对比例6-9所显示的，无论采用一个或多个LNA修饰、或者调整LNA位置靠近或远离SNP位点，均未明显提升探针的稳定性。而基于不断深入研究，发明人意外发现，如试验例6-9所示，当在探针5'端起的第2-4位的碱基位上进行LNA修饰时，探针的稳定性才得以有效改善，尤其是0-8小时内体系荧光值能够维持在较高水平而没有明显降低。优选地，如试验例6所示，仅在第3位碱基位上修饰LNA时，探针稳定性获得最佳(示例性的，试验例6扩增曲线如图3所示)。通过上述实验可以明确获知，LNA修饰位点、个数等的选择至关重要，发明人正是通过付出创造性的劳动筛选确定了探针的LNA修饰位点、数量等，并得到热稳定性最优的探针序列。
基于上述探针设计的改进，发明人进一步获得了含有上述探针的试剂盒，具体试剂盒的设计如下节所述。
(三)试剂盒设计
众所周知，试剂盒在使用过程中，众多因素均能够影响探针的稳定性，例如引物组成、探针自身结构，反应体系中的酶、缓冲液组成(种类、浓度等)、保存条件等等，通过大量试验，发明人最终发现，CYP2C19*2野生型探针的稳定性与试剂盒体系中酶的选择密切关联，接下来通过试验例和对比例的方式以进行详细阐述。
本节中试验例和对比例采用相同的扩增体系及扩增反应条件，具体如下：
(1)PCR预混反应液中包括探针引物体系(如表7所示)、PCR缓冲液、UNG酶、Taq酶。
表7 CYP2C19*2位点探针引物体系
Figure BDA0003001834900000111
Figure BDA0003001834900000121
PCR反应体系中核心试剂组成如下表8所示：
表8 PCR反应液试剂组成
Figure BDA0003001834900000122
(2)荧光定量检测：向反应管中加入步骤(1)中制备的PCR预混反应液，并进行PCR反应；PCR反应程序为：37℃下10分钟，95℃下5分钟预变性；40个循环：95℃下5秒，62℃下60秒，收集FAM、VIC和ROX通道的荧光。
试剂盒的设计过程中发明人通过测试，对试剂盒中Taq酶进行筛选，进而确定优选的Taq酶种类，具体选择的Taq酶如表9所示。需要说明的是，本发明说明书仅示意性地例举对比例，以证明本发明筛选的Taq酶具有更优的技术效果，并非试验中仅选择了如表9中的几种Taq酶进行试验。
表9各实施例Taq酶
实施例 Taq酶
对比例10 TaKaRa Taq<sup>TM</sup>热启动酶(货号：R007Q)
对比例11 invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(货号14966001)
对比例12 天根Taq Platinum DNA聚合酶(货号：ET104)
对比例13 菲鹏Hotstar Taq DNA聚合酶(货号MD003)
试验例10 NEBHot Start Taq DNA聚合酶(货号M0495S)
基于前述反应条件，在37℃条件下收集各实施例对应的反应体系放置0、8、24小时的FAM通道荧光值，具体测试结果如表10所示：
表10各实施例反应体系稳定性测试结果
Figure BDA0003001834900000131
通过上表可以看出，不同的Taq酶对体系的稳定性影响不同，如对比例10-13，虽然酶的种类不同，但对体系中8-24小时时间段的热稳定性影响不大，体系的热稳定性能仍然存在降幅较大的问题；此外如对比例12(天根Taq Platinum DNA聚合酶)所示测试结果，部分Taq酶甚至会导致体系在0-8小时时间段内的稳定性降幅增加，因此由此可知，不同的Taq酶对本发明中CYP2C19*2野生型探针热稳定性能的影响大不相同。进一步，通过上述表格中扩增性能评价情况可以看出，不同Taq酶会影响体系的扩增性能，如对比例13(菲鹏HotstarTaq DNA聚合酶)，虽然0-8小时内稳定性能够维持在一定范围内，但会导致体系的扩增性能降低，可见，在Taq酶选择的过程中不能仅考虑酶对体系的稳定性影响，同时酶的类型可能还会造成体系其他性能的变化，进而大大增加了Taq酶选择的难度。
通过大量试验，发明人意外发现，当采用实施例10中采用的NEB(New EnglandBiolabs)公司的HotStart Taq DNA聚合酶(货号M0495S)作为热启动酶，可以使得体系在8-24小时时间段内的热稳定性大幅提升(示例性的，试验例10扩增曲线如图4所示)，同时仍然能够确保体系具有良好的扩增性能，进而使得试剂盒的热稳定性在24小时内均能维持较高水平，从而进一步地降低了对检测时限、操作熟练度等的严苛要求，降低了整体检测难度。
(三)CYP2C19试剂盒制备工艺
将本发明中设计的CYP2C19*2野生型探针应用于CYP2C19多样态检测试剂盒中，具体的制备工艺可以如下步骤。
(1)CYP2C19探针引物体系的合成
基于下表11所示结构，合成探针引物体系。
表11 CYP2C19探针引物体系
探针/引物名称 探针/引物编码 结构式/名称
*2上游引物F SEQ ID NO:1 5'-CTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCA-3'
*2下游引物R SEQ ID NO:2 '-CCATTTTGATCAGGAAGCAATCA-3'
*2ARMS引物 SEQ ID NO:3 5'-AGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCTT-3'
*3上游引物F SEQ ID NO:4 5'-TGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGC-3'
*3下游引物R SEQ ID NO:5 5'-AAGTGGTTTCTCAGGAAGCAAAAA-3'
*3ARMS引物 SEQ ID NO:6 5'-CCCCTGGATCCAGGTAAGGC-3'
*17上游引物F SEQ ID NO:7 5'-AAACGATTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCT-3'
*17下游引物R SEQ ID NO:8 5'-CCATCGTGGCGCATTATCTC-3'
*17ARMS引物 SEQ ID NO:9 5'-CGCATTATCTCTTACATCAGAGACG-3'
*2野生型探针 SEQ ID NO:32 5'-(FAM)-TT+TCCCGGGAACCCAT-(MGB)-3'
*2突变型探针 SEQ ID NO:11 5'-(VIC)-ATTTCCCAGGAACCCAT-(MGB)-3'
*3野生型探针 SEQ ID NO:12 5'-(FAM)-CCCCCTGGATCCAGGTA-(MGB)-3'
*3突变型探针 SEQ ID NO:13 5'-(VIC)-CCCCCTGAATCCAGGT-(MGB)-3'
*17野生型探针 SEQ ID NO:14 5'-(FAM)TCTCAAAGCATCTCTG-(MGB)-3'
*17突变型探针 SEQ ID NO:15 5'-(VIC)-TGTTCTCAAAGTATCTCTG-(MGB)-3'
内标上引物 SEQ ID NO:16 5'-GGGCCACTAGGCGCTCA-3'
内标下引物 SEQ ID NO:17 5'-AGCCACCCGCGAACTCA-3'
内标探针 SEQ ID NO:18 5'-(ROX)-CTCTCCCTCCGCGCAGCCG-(BHQ2)-3'
备注：表格中*前省略CYP2C19。
(2)PCR预混反应液配置
PCR预混反应液：包含上述步骤形成的CYP2C19探针引物体系，以及PCR缓冲液、UNG酶、NEB Hot Start Taq DNA聚合酶(货号M0495S)组成，具体成分如表12-1、12-2和12-3所示。
表12-1 CYP2C19*2PCR反应液试剂组成
Figure BDA0003001834900000151
表12-2 CYP2C19*3PCR反应液试剂组成
Figure BDA0003001834900000152
表12-3 CYP2C19*17PCR反应液试剂组成
Figure BDA0003001834900000153
(3)对照品配置
阳性对照品：浓度各为2500/μL的包含内标基因序列的CYP2C19*2位点野生型质粒、CYP2C19*2位点突变型质粒、CYP2C19*3位点野生型质粒、CYP2C19*3位点突变型质粒、CYP2C19*17位点野生型质粒、CYP2C19*17位点突变型质粒和Tris-HCl缓冲液组成。所述质粒序列为本领域人员所熟知，此处不再一一列举其序列。
空白对照品：Tris-HCl缓冲液。
(4)试剂分装
按照表13分装量，将各组分分装到相应可立管中，贴好标签。
表13试剂盒主要成分
Figure BDA0003001834900000161
(5)组装试剂盒
试剂盒包含3管分别检测CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17基因位点多态性的PCR预混反应液，1管阳性对照品，1管空白对照品,一份说明书。
(四)结果验证
接下来对试剂盒的检测性能进行评估测试
(1)准确性验证
收集100例全血样本，提取基因组DNA，吸取一部分基因组DNA样本送测序。采用本发明设计的CYP2C19多态性检测试剂盒对100例全血样本基因组DNA进行检测，将检测结果与Sanger DNA测序结果进行对比，验证试剂盒的准确性。
测试的操作过程如下：
样本处理：全血样本基因组DNA：使用商品化提取试剂盒进行基因组DNA提取，提取完成后使用TE缓冲液洗脱DNA，并测定DNA浓度；将基因组DNA稀释到20ng/μL。
②荧光定量检测：向反应管中加入23μL PCR预混反应液和2μL待测样本DNA；PCR反应程序为：37℃10分钟，95℃5分钟预变性；40个循环：95℃5秒，62℃60秒，收集荧光。
PCR反应结束后按照表14，进行结果判读。
表14结果判读
Figure BDA0003001834900000171
将上述测试结果与Sanger测序结果进行比较，具体比对结果如下表15所示。
表15准确性验证结果
Figure BDA0003001834900000172
Figure BDA0003001834900000181
可见，通过采用本发明设计的试剂盒进行荧光定量检测结果与Sanger测序结果完全一致。这表明本发明所述人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒用于人类CYP2C19基因多态性检测结果非常可靠。采用本发明所述试剂盒检测人类CYP2C19基因多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，此外本发明简化了PCR的反应程序，将常规PCR反应中的退火和延伸步骤(退火30秒延伸1分钟)简化为一个步骤(仅需62度反应60秒)所以可在1.5小时内完成检测，并且本发明可直接根据荧光曲线进行结果判读，结果直观，判读简便。
(2)检测限验证
采用本发明中CYP2C19多态性检测试剂盒对样本中DNA进行检测，以验证本发明中试剂盒的检测限，具体包括如下操作步骤：
①使用上述准确性验证部分采用的已知CYP2C19相应位点基因型的样本，每个位点选取杂合型基因组样本各一例，将上述样本稀释至0.5ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL、0.01ng/μL；
②荧光定量检测：向反应管中加入23μL PCR预混反应液和2μL待测样本DNA；PCR反应程序为：37℃10分钟，95℃5分钟预变性；40个循环：95℃5秒，62℃60秒，收集荧光。每个样本的每个浓度梯度均重复检测20次；
③PCR反应结束后按照表14，进行结果判读；
④统计上述样本各个浓度梯度的检测成功率(分型与已知基因型一致即为检测成功，检测成功率＝检测结果一致结果数量/20×100％)，见表16。
表16 CYP2C19检测成功率统计
Figure BDA0003001834900000191
上述结果显示，本发明可对浓度低至0.05ng/μL的DNA样本进行人类CYP2C19基因多态性检测，检测灵敏度及可靠性均能达到较高水平。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉友芝友医疗科技股份有限公司
<120> 用于检测CYP2C19*2基因多态性的特异性探针及试剂盒
<160> 35
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttagatatg caataatttt cccactatca 30
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccattttgat caggaagcaa tca 23
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggtttttaa gtaatttgtt atgggttctt 30
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaatgaaaa catcaggatt gtaagc 26
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagtggtttc tcaggaagca aaaa 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccctggatc caggtaaggc 20
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaacgatttt ttttttcaaa tttgtgtct 29
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccatcgtggc gcattatctc 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgcattatct cttacatcag agacg 25
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tttcccggga acccat 16
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atttcccagg aacccat 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccccctggat ccaggta 17
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccccctgaat ccaggt 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tctcaaagca tctctg 16
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgttctcaaa gtatctctg 19
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gggccactag gcgctca 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agccacccgc gaactca 17
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctctccctcc gcgcagccg 19
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tttcccggga acccata 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tttcccggga acccataa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tttcccggga accca 15
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tttcccggga acccataac 19
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tatttcccgg gaaccc 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
attatttccc gggaacc 17
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tgattatttc ccgggaacc 19
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgattatttc ccgggaac 18
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tttcccggga acccat 16
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tttcccggga acccat 16
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tttcccggga acccat 16
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tttcccggga acccat 16
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tttcccggga acccat 16
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<211> 16
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<213> 人工序列
<400> 33
tttcccggga acccat 16
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tttcccggga acccat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tttcccggga acccat 16

Claims (10)

1.一种用于检测CYP2C19*2基因多态性的特异性探针，其中，CYP2C19*2位点的特异性探针至少包括：CYP2C19*2野生型探针以及CYP2C19*2突变型探针，
其特征在于：
所述CYP2C19*2野生型探针具有如下式(1)所示：
5'-(R1)-TTTCCCGGGAACCCX-(Q)-3' (1)
其中，式(1)中X代表具有1-5个碱基的序列，R1表示荧光报告基团，Q表示非荧光猝灭基团，SNP位点G位于探针5'端起的第7位碱基上。
2.根据权利要求1所述的特异性探针，其特征在于：
所述式(1)中X优选具有2-4个碱基，且R1为FAM或VIC，Q为MGB。
3.根据权利要求2所述的特异性探针，其特征在于：
所述式(1)所表示的CYP2C19*2野生型探针为
5'-(FAM)-TTTCCCGGGAACCCAT-(MGB)-3'。
4.根据权利要求1-3任一项所述的特异性探针，其特征在于：
所述式(1)中5'端起的第2-4位任意碱基位具有1或2个LNA修饰。
5.根据权利要求1-3任一项所述的特异性探针，其特征在于：
CYP2C19*2突变型探针为
5'-(R2)-ATTTCCCAGGAACCCAT-(Q)-3' (2)
其中，式(2)中R2为与式(1)中R1不同的荧光报告基团，Q为与式(1)中Q相同的非荧光猝灭基团。
6.一种用于检测CYP2C19基因多态性的检测试剂盒，其特征在于：
该试剂盒具有如权利要求1-5任一项所述的CYP2C19*2位点的特异性探针。
7.根据技术方案6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括热稳定性酶。
8.根据技术方案7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶为NEB公司的Hot Start TaqDNA聚合酶。
9.根据权利要求6-8任一项所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括：CYP2C19*2位点的特异性引物对，以及内标引物对和内标探针，具体为：
CYP2C19*2上游引物：5'-CTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCA-3'，
CYP2C19*2下游引物：5'-CCATTTTGATCAGGAAGCAATCA-3'，
CYP2C19*2ARMS引物：5'-AGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCTT-3'，
内标正向引物：5'-GGGCCACTAGGCGCTCA-3'，
内标反向引物：5'-AGCCACCCGCGAACTCA-3'，
内标探针：5'-(ROX)-CTCTCCCTCCGCGCAGCCG-(BHQ2)-3'。
10.根据技术方案6-8任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液中至少含有CYP2C19*2位点野生型质粒、CYP2C19*2位点突变型质粒，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。
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