CN111154842A

CN111154842A - 检测人阿司匹林抵抗基因多态性的组合物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111154842A
Application number: CN202010105511.5A
Authority: CN
Inventors: 龙凤英; 吴康; 缪为民; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2020-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-02-20
Also published as: CN111154842B

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体的，涉及人阿司匹林抵抗基因多态性检测领域。提供了一种组合物，其检测人阿司匹林抵抗基因多态性；与此同时，还提供了所述组合物用于检测人阿司匹林抵抗基因多态性的用途、包含所述组合物的试剂盒以及用于检测人阿司匹林抵抗基因多态性的方法，使用本发明的组合物以及方法，检测CYP2C19基因、ITGB3基因、PEAR1基因、PTGS1基因的SNP位点，使得检测阿司匹林抵抗的能力更加全面，且灵敏度高，检测周期短。

Description

检测人阿司匹林抵抗基因多态性的组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，更具体的，属于人阿司匹林抵抗基因多态性检测领域。

背景技术

阿司匹林(aspirin)是最为常见的抗血小板治疗药物。最早作为非甾体抗炎药用于解热镇痛，现多用于预防血栓等疾病，是治疗急性冠状动脉综合征和经皮冠状动脉介入术后抗栓的基础药物，其作为心肌梗死、缺血性脑卒中和外周动脉闭塞性疾病的一级和二级预防用药被广泛应用(广泛应用于心脑血管疾病)。阿司匹林经肠道吸收后很快被代谢成为活性产物水杨酸，随血液分布全身。水杨酸可以与血小板内的环氧合酶(cyclooxygenase，COX)活性部分丝氨酸残基发生不可逆的乙酰化反应，使酶失活，抑制花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的代谢，从而抑制血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)的生成，血栓素A2能够诱导血小板使其发生聚集反应，而血栓素生成受到抑制则可以很好地起到抗凝作用。

临床发现并不是所有常规服用阿司匹林的患者都能获得一致的抑制血小板聚集和防止血栓和栓塞事件发生的临床疗效，于是提出阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)这一概念，其发生率约5％～60％，且存在明显种族差异性。关于阿司匹林抵抗(阿司匹林反应低下)的遗传易感性方面的报道有：包括细胞色素P450 2C19(CYP2C19)、COX-1、COX-2、GPIα、GPIbα、GPIIIbα、ADP受体P2RY1和P2RY12、凝血因子XIII(FXIII)基因异常与阿司匹林抵抗相关联，然而，人种差异的存在，使这些基因不完全适合中国人群。根据相关基因与药物剂量、疗效及不良反应的关系，以及中国人群的分布频率，建议检测CYP2C19、GPIIIaPLA2、PEAR1、COX-1相关基因型，以指导阿司匹林的精准治疗。

阿司匹林主要由CYP2C19代谢，CYP2C19酶活性下降会导致阿司匹林的血小板抑制作用减弱，主要检测*2(rs12769205)及*17(rs12248560)(代谢、剂量疗效、毒性/不良反应)。

血小板受体包括特异性结合纤维蛋白原和血管假性血友病因子的糖蛋白(GP)IIb/IIIa(ITGB3)，特异性结合ADP的P2Y受体以及与胶原结合的GPIa-IIa、GPVI和GPIb-IX-V受体。血小板膜糖蛋白IIb/IIIa复合体(GPIIb/IIIa)是纤维蛋白原的受体，它介导血小板的聚集，GPIIIa亚基PLA存在多态性，主要检测ITGB3基因rs5918位点，表现为PLA1/A1和PLA2/A2纯合型、PLA1/A2杂合型。PLA2/A2使得GPIIIb/IIIa受体结构发生改变，使血小板之间发生交叉连接，导致血小板聚集，疗效较差。

表达在血小板和内皮细胞上的I型膜蛋白(PEAR1)。该受体的磷酸化可能促进αIIbβ3信号的激活放大，使大量血小板脱颗粒，引起血小板之间不可逆的聚集反应。主要检测rs12041331位点，GG等位基因对阿司匹林应答好，突变基因型AA或AG的患者使用阿司匹林时的心肌梗死发生率和死亡率会增高。

环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成过程中的重要限速酶，它有两种同工酶：COX-1和COX-2，分别由PTGS1和PTGS2基因编码。阿司匹林是非选择性的COX酶抑制剂，COX-1是其主要底物酶，为组织结构酶，在多种组织中表达，在无核组织血小板中同样有表达。PTGS1基因主要检测rs5794位点，突变单体型CGCGCC显著增加了阿司匹林抵抗的发病风险，野生型CACGCC对阿司匹林抵抗有保护作用。

目前，存在一些可以检测人阿司匹林抵抗基因多态性的产品。例如，中国发明公开CN110066868A公开了可以检测GPIIIa P1A1/A2和PEAR1两个基因的多态性的引物组，但其存在由于检测的基因的数目少，导致预测阿司匹林抵抗不准确的缺陷。中国发明公开CN109207583A公开了可以检测PTGS1、ITGA2、ITGB3和PEAR1基因的引物组，但其采用的是sanger测序法，其检测周期长，灵敏度差。

因此，本领域需求根据相关基因与药物剂量、疗效及不良反应的关系，以及中国人群的分布频率检测阿司匹林抵抗基因多态性的产品，其检测周期短、灵敏度高、检测准确。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种能够检测人阿司匹林抵抗基因多态性的组合物，所述组合物包括：

第一组：如SEQ ID NO：1所示的CYP2C19上游引物、如SEQ ID NO：2所示的CYP2C19下游引物、如SEQ ID NO：3所示的CYP2C19的探针和SEQ ID NO：4所示的CYP2C19的探针；

如SEQ ID NO：5所示的ITGB3上游引物、如SEQ ID NO：6所示的ITGB3下游引物、如SEQ ID NO：7示的ITGB3的探针和SEQ ID NO：8所示的ITGB3的探针；

第二组：如SEQ ID NO：9所示的PEAR1上游引物、如SEQ ID NO：10所示的PEAR1下游引物、如SEQ ID NO：11所示的PEAR1的探针和SEQ ID NO：12所示的PEAR1的探针；

如SEQ ID NO：13所示的PTGS1上游引物、如SEQ ID NO：14所示的PTGS1下游引物、如SEQ ID NO：15所示的PTGS1的探针和SEQ ID NO：16所示的PTGS1的探针；

其中，所述第一组内的4种探针的荧光报告基团彼此互不相同，并且第二组内的4种探针的荧光报告基团彼此互不相同。

本发明的组合物能够检测人阿司匹林抵抗基因多态性，特别地，能够检测中国人群的阿司匹林抵抗性。具体地，本发明的能够检测CYP2C19基因rs12769205位点、ITGB3基因rs5918位点、PEAR1基因rs12041331位点、PTGS1基因rs5794位点的多态性，扩展了现有技术检测阿司匹林抵抗性的范围，使得检测阿司匹林抵抗性更加全面准确，且灵敏度高，可以检测低至1ng的核酸样品。本发明的组合物使用荧光探针法和多重荧光PCR法结合，缩短了检测周期。使用本发明的组合物中，能够同时适用口腔拭子样品。本发明基于荧光探针法设计了引物和探针，采用了4种不同的探针，实现一管试剂同时检测两个SNP位点，整个4个SNP使用两管试剂就能够实现检测，使得整个过程的操作都极其简单，结果读取过程通过扩增曲线和CT值即可以判定。本发明的组合物检测准确度高，每一种探针采用不一样的荧光报告基团，避免了背景信号之间的互相干扰叠加；而现有技术如熔解曲线法，多条探针仅采用一种荧光报告基团，使得背景信号之间的互相干扰叠加增加了背景值使得结果的准确性降低，而使用本发明的组合物克服了这一缺点，如实施例6所述，使用本发明组合物的检测结果与二代测序结果一致，表明本发明组合物具有很高的准确性。

在本发明中，探针的荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。

在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO：3所示的CYP2C19的探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO：4所示的CYP2C19的探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO：7所示的ITGB3的探针的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO：8所示的ITGB3的探针的荧光报告基团为CY5。

在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO：11所示的PEAR1的探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO：12所示的PEAR1的探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO：15所示的PTGS1的探针的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO：16所示的PTGS1的探针的荧光报告基团为CY5。

进一步地，所述组合物进一步包括用于获得口腔拭子样品的物质或保存口腔拭子样品的装置。

进一步地，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μmol/L；所述组合物中探针的用量为0.2～0.4μmol/L。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测人阿司匹林抵抗基因多态性的试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种检测人阿司匹林抵抗基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。

进一步地，dNTP的浓度为2～3mmol/L，PCR缓冲液为1.5～2.5μL。在一个具体的实施方案中，PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2％(体积/体积)曲拉通溶液和10％(体积/体积)甲酰胺溶液。

进一步地，所述试剂盒还可以包括Mg²⁺、糖基化酶、dUTP。

在一个具体的实施方案中，所述核酸释放试剂包括0.01～0.5mmol/L莎梵婷(surfactin)、100～200mmol/L氯化钾、50～200mmol/L氯化锂、质量/体积比为0.1％～1％十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1％～1％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、质量/体积比为0.01％～2％十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05％～1％乙醇等组分中的一种或几种。

通过使用这种核酸释放试剂，不需要进行核酸提取，方法及其简单，不需要纯化离心也不需要高温加热，仅需要加入核酸释放试剂进行吹打即可，同时使得核酸释放非常完全，便于后续的PCR扩增操作，提高了检测的准确度，并且也使得能够同时适用全血和口腔拭子的样品检测，可直接检测指尖血样品和口腔拭子样品，口腔拭子样品对人体没有伤害，仅用拭子刮取口腔内壁脱落细胞即可，样品常温保存，输送方便，可真正达到无创取样的目的。

在具体的实施方案中，所述DNA聚合酶为5U/μL～15U/μL；所述糖基化酶为0.05U/μL～0.2U/μL。

通过设置尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)+dUTP防污染体系，利用UNG酶将可能存在的PCR产物污染充分降解，以排除由此可能引起的假阳性结果，使检测结果更准确。

在具体的实施方案中，所述试剂盒还具有阴性对照和阳性对照，其中，阳性对照包含8种SNP靶序列在内的质粒DNA混合液，具体如下：

CYP2C19基因rs12769205野生型质粒序列(SEQ ID NO：17)：

TACAATATATTTTATTTATATTTATAGTTTTAAATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCGGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGTAAAATGTTAA

CYP2C19基因rs12769205突变型质粒序列(SEQ ID NO：18)：

TACAATATATTTTATTTATATTTATAGTTTTAAATTACAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCAGGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTGCTTTTATGGAAAGTGATATTTTGGAGAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCGATGGACATCAACAACCCTCGGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAGAAGGTAAAATGTTAA

ITGB3基因rs5918野生型质粒序列(SEQ ID NO：19)：

AGGAAAGACCACAACAATTTGTTTATGCTCCAATGTACGGGGTAAACTCTTAGCTATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCTGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGT

ITGB3基因rs5918质粒序列(SEQ ID NO：20)：

AGGAAAGACCACAACAATTTGTTTATGCTCCAATGTACGGGGTAAACTCTTAGCTATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTCCGGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCCGAGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGT

PEAR1基因rs12041331野生型质粒序列(SEQ ID NO：21)：

GTGAGGGAACTGCAGGCTGGGATTCACACCCAGGCTTGAACTTGGGCAGGGGTTGGGGGTGCAGAGGTGAGGGGTTATCCTATGCTACATGACTTCCCAGAGAAGCTGGAAGGGAGCCCGTGGGGAAGTCCCTTCTGCTGTCTCACTTCCGTCACCCTTACTCTCTGCTTTCTATAGAAATGGATCCTCTTGTCCACCAGGAACTCTAATCCCCCCCACCCCTGCTCCCCTAGAGCCCACACTCAATTCCTTCCTCCTAGGAGGGGTTGGGGCACAGTGAGGGTAGGGGGGCTCCCCACCA

PEAR1基因rs12041331突变型质粒序列(SEQ ID NO：22)：

GTGAGGGAACTGCAGGCTGGGATTCACACCCAGGCTTGAACTTGGGCAGGGGTTGGGGGTGCAGAGGTGAGGGGTTATCCTATGCTACATGACTTCCCAGAGAAGCTGGAAGGGAGCCCGTGGGGAAGTCCCTTCTGCTGTCTCACTTCCATCACCCTTACTCTCTGCTTTCTATAGAAATGGATCCTCTTGTCCACCAGGAACTCTAATCCCCCCCACCCCTGCTCCCCTAGAGCCCACACTCAATTCCTTCCTCCTAGGAGGGGTTGGGGCACAGTGAGGGTAGGGGGGCTCCCCACCA

PTGS1基因rs5794野生型质粒序列(SEQ ID NO：23)：

CGGCAGATCGGTGGGGGCAGGAACATGGACCACCACATCCTGCATGTGGCTGTGGATGTCATCAGGGAGTCTCGGGAGATGCGGCTGCAGCCCTTCAATGAGTACCGCAAGAGGTTTGGCATGAAACCCTACACCTCCTTCCAGGAGCTCGTAGGTGAGCAGCTGTTTCCTGGATGCAGTCCCTGCCCTTGAGGGACTGGCAGCAAAGTCAGGGAGACATCAAGGAAATAGAACGGGACAATACATGCGGCAATGTGTAACAACCAGACTTATAATGGGCGTGGAAGTGCTGTGCCAGGGT

PTGS1基因rs5794突变型质粒序列(SEQ ID NO：24)：

CGGCAGATCGGTGGGGGCAGGAACATGGACCACCACATCCTGCATGTGGCTGTGGATGTCATCAGGGAGTCTCGGGAGATGCGGCTGCAGCCCTTCAATGAGTACCGCAAGAGGTTTGGCATGAAACCCTACACCTCCTTCCAGGAGCTCATAGGTGAGCAGCTGTTTCCTGGATGCAGTCCCTGCCCTTGAGGGACTGGCAGCAAAGTCAGGGAGACATCAAGGAAATAGAACGGGACAATACATGCGGCAATGTGTAACAACCAGACTTATAATGGGCGTGGAAGTGCTGTGCCAGGGT

阴性对照：0.9％生理盐水。

第四方面，提供了一种用于检测人阿司匹林抵抗基因多态性的方法，所述方法包括以下步骤：

1)释放待测样品的核酸；

2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样品可以是全血、口腔拭子等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

，前十个循环不采集荧光，后三十个循环采集荧光，这样可以是荧光PCR的曲线更为挺拔，分析结果更加准确。

附图说明

图1为本发明组合物检测阳性质粒扩增图；

图2为本发明组合物检测阳性质粒扩增图；

图3为本发明组合物检测CYP2C19杂合子、ITGB3野生型、PEAR1杂合子、PTGS1野生型的口腔拭子样品扩增图；

图4为本发明组合物检测CYP2C19杂合子、ITGB3野生型、PEAR1杂合子、PTGS1野生型的口腔拭子样品扩增图；

图5为本发明组合物的灵敏度测试；

图6为本发明组合物的灵敏度测试；

图7为对比例组合物检测口腔拭子样品扩增图；

图8为对比例组合物检测口腔拭子样品扩增图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于CYP2C19基因rs12769205位点、ITGB3基因rs5918位点、PEAR1基因rs12041331位点、PTGS1基因rs5794位点前后150bp分别作为靶区域。

确定CYP2C19基因rs12769205引物探针序列如下：

CYP2C19-F：5′-GCAATAATTTTCCCACTATCATTGATT-3′(SEQ ID NO：1)；

CYP2C19-R：5′-CCATAAAAGCAAGGTTTTTAAGTAATTTG-3′(SEQ ID NO：2)；

CYP2C19-P1：5′-TTCCCGGGAACCCA-3′(SEQ ID NO：3)；

CYP2C19-P2：5′-TTCCCAGGAACCCA-3′(SEQ ID NO：4)；

确定ITGB3基因rs5918引物探针序列如下：

ITGB3-F：5′-CTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAG-3′(SEQ ID NO：5)；

ITGB3-R：5′-ACTGGGAACTCGATGGATTCTG-3′(SEQ ID NO：6)；

ITGB3-P1：5′-ROX-CCTGCCTCTGGGCTCA-MGB-3′(SEQ ID NO：7)；

ITGB3-P2：5′-CY5-CCTGCCTCCGGGCTCA-MGB-3′(SEQ ID NO：8)；

确定PEAR1基因rs12041331物探针序列如下：

PEAR1-F：5′-CCCAGAGAAGCTGGAAGGGAG-3′(SEQ ID NO：9)；

PEAR1-R：5′-GGACAAGAGGATCCATTTCTATAGAAAG-3′(SEQ ID NO：10)；

PEAR1-P1：5′-FAM-CTGTCTCACTTCCGTCA-MGB-3′(SEQ ID NO：11)；

PEAR1-P2：5′-HEX-CTGTCTCACTTCCATCA-MGB-3′(SEQ ID NO：12)；

确定PTGS1基因rs5794引物探针序列如下：

PTGS1-F：5′-GGTTTGGCATGAAACCCTACAC-3′(SEQ ID NO：13)；

PTGS1-R：5′-CTCAAGGGCAGGGACTGCA-3′(SEQ ID NO：14)；

PTGS1-P1：5′-ROX-TCCTTCCAGGAGCTCGTA-MGB-3′(SEQ ID NO：15)；

PTGS1-P2：5′-CY5-TCCTTCCAGGAGCTCATA-MGB-3′(SEQ ID NO：16)；

其中，如SEQ ID NO：3所示的CYP2C19的探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO：4所示的CYP2C19的探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO：7所示的ITGB3的探针的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO：8所示的ITGB3的探针的荧光报告基团为CY5；如SEQ ID NO：11所示的PEAR1的探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO：12所示的PEAR1的探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO：15所示的PTGS1的探针的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO：16所示的PTGS1的探针的荧光报告基团为CY5，探针的3′端还连有MGB。

实施例2、检测人阿司匹林抵抗基因多态性的方法

1、试剂准备：

根据待测样品、阴性对照、阳性对照的数量，按比例(反应液18～21μL/人份+酶混合液1～3μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，分别充分混匀成PCR反应液1(随后加入组合物中的第一组)和PCR反应液2(随后加入组合物中的第二组)，瞬时离心后备用。

2、样品处理

口腔拭子样品采集

用拭子采样头擦拭两侧口腔壁25次左右，将采样头折断放入保存管，拧紧管盖即完成一次采样。

每个PCR反应管中加入核酸释放剂3～7μL，并分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各3～7μL，吸打混匀；

取4～6μL样品混合液至PCR反应管中，各管反应液18～21μL/人份和酶混合液1～3μL/人份，吸打混匀2-3次，盖上管盖，瞬时离心。

3、荧光PCR反应与结果分析

(1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样品名称。

(2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere：FAM，Quencher：None)检测CYP2C19-G和PEAR1-G；选择HEX通道(Reportere：CY5，Quencher：None)检测CYP2C 19-A和PEAR1-A；选择ROX通道(Reportere：HEX，Quencher：None)检测ITGB3-T和PTGS1-G；选择CY5通道(Reportere：ROX，Quencher：None)检测ITGB3-C和PTGS1-A。

(3)荧光定量PCR反应条件为：

(4)结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，也可以利用仪器自带的结果解读软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样品Ct值从而得出分型结果。仪器软件可根据各样品Ct值值自动判读分型结果。具体如下：

阴阳性判断方法

实施例3、本发明组合物测试阳性对照的检测结果

按照本发明提供的组合物检测阳性对照质粒，阳性对照为包含四个SNP位点的8种质粒混合液，其检测的方法按照实施例2中所述的检测方法，除不需要进行核酸提取。其PCR反应液1和PCR反应液2的扩增结果分别如图1和图2所示，从图中可以看出，本发明的组合物能够很好的检测出阳性对照质粒，表明本发明的组合物能够用于检测人阿司匹林抵抗基因多态性。

实施例4、本发明组合物测试口腔拭子样品的检测结果

按照本发明提供的组合物检测CYP2C19杂合子、ITGB3野生型、PEAR1杂合子、PTGS1野生型的口腔拭子样品，其检测的方法按照实施例2中所述的检测方法。其PCR反应液1和PCR反应液2的扩增结果分别如图3和图4所示，从图中可以看出，本发明的组合物能够很好的检测出口腔拭子样品中人阿司匹林抵抗基因多态性。

实施例5、检测结果与二代测序结果对比测试

按照实施例2所述的方法测试检测结果未知的20例口腔拭子样品，并将其与Sanger测序结果进行对比，结果如下表1所示：

表1对比测试结果

本发明测试口腔拭子样品各种基因型均能很好地检出，包含CYP2C19、ITGB3、PEAR1和PTGS1四个基因检测的人阿司匹林基因多态性核酸检测试剂盒PCR检测结果与CYP2C19基因rs12769205、ITGB3基因rs5918、PEAR1基因rs12041331和PTGS1基因rs5794基因多态性检测Sanger测序检测结果完全一致。

实施例6、本发明组合物的灵敏度测试

用核酸提取与纯化试剂提取样品17的核酸，并稀释至1ng/μL，用本发明中的组合物按照实施例2所述的方法进行检测，测试结果如图5和图6所示，从图中可以看出，PCR反应液1和PCR反应液2在样品核酸仅为1ng/μL下都能够进行扩增，因此，本发明组合物的灵敏度为1ng/μL。

对比例1、对比引物和探针的检测结果

在引物和探针设计过程中，发明人还设计了其余的引物和探针的组合同样用于检测人阿司匹林抵抗基因多态性。具体如以下序列所示：

确定CYP2C19基因rs12769205引物探针序列如下：

CYP2C19-F：5′-AGCTTGGCATATTGTATCTATACCT-3′(SEQ ID NO：25)；

CYP2C19-R：5′-CCATAAAAGCAAGGTTTTTAAGTAAT-3′(SEQ ID NO：2)；

CYP2C19-P1：5′-FAM-CATTGATTATTTCCCGG-MGB-3′(SEQ ID NO：26)；

CYP2C19-P2：5′-HEX-TTCCCAGGAACCCA-MGB-3′(SEQ ID NO：4)；

确定ITGB3基因rs5918引物探针序列如下：

ITGB3-F：5′-GTGGTAGGGCCTGCAG-3′(SEQ ID NO：27)；

ITGB3-R：5′-ACTGGGAACTCGATGGATTCTG-3′(SEQ ID NO：6)；

ITGB3-P1：5′-ROX-CCTCTGGGCTCACCT-MGB-3′(SEQ ID NO：28)；

ITGB3-P2：5′-CY5-CCTCCGGGCTCACCT-MGB-3′(SEQ ID NO：29)；

确定PEAR1基因rs12041331物探针序列如下：

PEAR1-F：5′-CCCAGAGAAGCTGGAAGGGAG-3′(SEQ ID NO：9)；

PEAR1-R：5′-GGACAAGAGGATCCATTTCTATAGAAAG-3′(SEQ ID NO：10)；

PEAR1-P1：5′-FAM-TCACTTCCGTCACCCT-MGB-3′(SEQ ID NO：30)；

PEAR1-P2：5′-HEX-TCACTTCCATCACCCT-MGB-3′(SEQ ID NO：31)；

确定PTGS1基因rs5794引物探针序列如下：

PTGS1-F：5′-GGTTTGGCATGAAACCCTACAC-3′(SEQ ID NO：13)；

PTGS1-R：5′-CTCAAGGGCAGGGACTGCA-3′(SEQ ID NO：14)；

PTGS1-P1：5′-ROX-CTCCTTCCAGGAGCTCGT-MGB-3′(SEQ ID NO：32)；

PTGS1-P2：5＇-CY5-CTCCTTCCAGGAGCTCAT-MGB-3′(SEQ ID NO：33)；

以17号口腔拭子为样品进行测试，按照实施例2所述的方法进行检测，其具体扩增结果如图7-图8所示，可以看出PCR反应液1和PCR反应液2均不能很好的进行扩增，由此可以得出该组合物并不能很好的检测样品。

Claims

1.一种能够检测人阿司匹林抵抗基因多态性的组合物，所述组合物包括：

如SEQ ID NO：5所示的ITGB3上游引物、如SEQ ID NO：6所示的ITGB3下游引物、如SEQID NO：7所示的ITGB3的探针和SEQ ID NO：8所示的ITGB3的探针；

如SEQ ID NO：13所示的PTGS1上游引物、如SEQ ID NO：14所示的PTGS1下游引物、如SEQID NO：15所示的PTGS1的探针和SEQ ID NO：16所示的PTGS1的探针；

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，如SEQ ID NO：3所示的CYP2C19的探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO：4所示的CYP2C19的探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO：7所示的ITGB3的探针的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO：8所示的ITGB3的探针的荧光报告基团为CY5。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，如SEQ ID NO：11所示的PEAR1的探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO：12所示的PEAR1的探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO：15所示的PTGS1的探针的荧光报告基团为ROX；如SEQ ID NO：16所示的PTGS1的探针的荧光报告基团为CY5。

4.权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物中引物的用量为0.2～0.4μmol/L；所述组合物中探针的用量为0.2～0.4μmol/L。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括用于获得口腔拭子样品的物质或保存口腔拭子样品的装置。

6.权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测人阿司匹林抵抗基因多态性的试剂盒中的用途。

7.一种检测人阿司匹林抵抗基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1～5中任一项所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种；优选的，dNTP为2～3mmol/L、PCR缓冲液为3～7μL、DNA聚合酶为5U/μL～15U/μL。

9.一种用于检测人阿司匹林抵抗基因多态性的方法，所述方法包括以下步骤：

1)释放待测样品的核酸；优选地，所述样品为全血或者口腔拭子；

2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7或8所述试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；

3)获得并分析结果。

10.根据权利要求8～9中任一项所述的方法，其中，所述荧光定量PCR的反应条件为：